PL B1. Zastosowanie Lactobacillus casei ŁOCK 0900, Lactobacillus casei ŁOCK 0908 i Lactobacillus paracasei ŁOCK 0919

Transkrypt

1 PL B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (51) Int.Cl. A61K 35/74 ( ) A23L 1/30 ( ) A61P 37/08 ( ) C12N 1/20 ( ) C12R 1/245 ( ) C12R 1/225 ( ) (54) Zastosowanie Lactobacillus casei ŁOCK 0900, Lactobacillus casei ŁOCK 0908 i Lactobacillus paracasei ŁOCK 0919 (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 07/09 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 08/12 (73) Uprawniony z patentu: INSTYTUT BIOTECHNOLOGII SUROWIC I SZCZEPIONEK BIOMED SPÓŁKA AKCYJNA, Kraków, PL POLITECHNIKA ŁÓDZKA, Łódź, PL (72) Twórca(y) wynalazku: ILONA MOTYL, Łódź, PL ELŻBIETA KLEWICKA, Łódź, PL KATARZYNA ŚLIŻEWSKA, Łódź, PL BOŻENA CUKROWSKA, Warszawa, PL ZDZISŁAWA LIBUDZISZ, Łódź, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Alina Magońska

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie nowych szczepów Lactobacillus casei ŁOCK 0900, Lactobacillus casei ŁOCK 0908 i Lactobacillus paracasei ŁOCK 0919 w profilaktyce i leczeniu chorób alergicznych. Znane jest z amerykańskiego opisu patentowego US 2004/ zastosowanie szczepów bakteryjnych z rodzaju Lactobacillus casei dla przygotowania kompozycji, która może być stosowana doustnie w celu wzmocnienia reakcji specyficznego systemu immunologicznego na czynnik patogenny. Wymieniony czynnik patogenny jest patogenem układu oddechowego w szczególności patogenicznym wirusem należącym do rhinowirusów, scyntialnych wirusów układu oddechowego i myxowirusów. Wspomniany szczep Lactobacillus casei jest szczepem CNCM , który jest składnikiem pokarmu lub suplementu diety. Znane są szczepy Lactobacillus casei i paracasei, których charakterystyka przedstawiona jest w polskich zgłoszeniach patentowych P szczep Lactobacillus casei nr depozytu ŁOCK 0900, P Lactobacillus casei nr depozytu ŁOCK 0908, P Lactobacillus paracasei nr depozytu ŁOCK Nieoczekiwanie stwierdzono, że przedstawione w tych zgłoszeniach szczepy Lactobacillus casei i paracasei mają wpływ na produkcję cytokin, to jest białek odgrywających podstawową rolę w patogenezie chorób o podłożu alergicznym. W alergii IgE- zależnej (w chorobach atopowych) dochodzi do zaburzenia równowagi cytokinowej w kierunku aktywacji tzw. cytokin proalergicznych (IL-4, IL-5) produkowanych przez limfocyty TH2. Stan ten wynika z braku pobudzenia produkcji cytokin prozapalnych, takich jak IFN-gamma, TNF-α, IL-12. Cytokiny proalergiczne odpowiadają za produkcję IgE oraz aktywację eozynofili bezpośrednio odpowiedzialnych za reakcje atopowe. Istotą wynalazku jest zastosowanie szczepów Lactobacillus casei nr depozytu ŁOCK 0900, Lactobacillus casei nr depozytu ŁOCK 0908 i Lactobacillus paracasei nr depozytu ŁOCK 0919 wykazujących zdolność aktywowania prozapalnego profilu cytokinowego oraz zdolność hamowania proalergicznej cytokiny IL-5 do wytwarzania kompozycji odżywczej lub farmaceutycznej do profilaktyki i/lub leczenia chorób alergicznych. I Badanie translokacji szczepów Lactobacillus casei ŁOCK 0908 i ŁOCK 0900 i Lactobacillus paracasei ŁOCK 0919 do krwi i organów wewnętrznych Eksperymentalny model mysi Mieszaninę bakterii Lactobacillus casei i paracasei podawano 2-miesięcznym myszom Balb/c (n=5) przez 7 dni. Bakterie rozcieńczone w buforze fosforanowym o ph 7,4 podawano przez sondę dożołądkowo dwa razy dziennie w 0,5 ml w dawce dziennej 10 9 jtk. Myszy kontrolne (n=5) otrzymały nośnik, w którym zawieszono bakterie. Ocena translokacji przez barierę jelitową W celu zbadania translokacji bakterii przez barierę jelitową oceniano obecność bakterii Lactobacillus w krezkowych węzłach chłonnych, krwi i organach wewnętrznych (śledziona, wątroba). Krew pobierano poprzez wkłucie dosercowe, a następnie wysiewano na MRS agar. Organy wewnętrzne (cała wątroba, połowa śledziony z każdej myszy) i połączone wszystkie węzły chłonne wyizolowane z poszczególnych grup myszy zważono, wykonano homogenat, rozcieńczono w stosunku 1:5 w buforze fosforanowym i wysiano na MRS agar. Płytki inkubowano przez 72 h w 37 C, a następnie liczono ilość bakterii tworzących kolonie. Hodowle limfocytów Limfocyty izolowano ze śledziony, którą rozdrobniono w RPMI medium (Sigma). Homogenat przefiltrowano przez siatkę nylonową, komórki przemyto 3-krotnie w RPMI medium i zawieszono w ilości 5x10 7 jtk/ml w kompletnym. RPMI medium z dodatkiem 10% płodowej surowicy cielęcej (Sigma) oraz penicyliny ze streptomycyną (Sigma). Żywotność komórek oceniona przy pomocy błękitu trypanu (Sigma) była >90%. Hodowle wykonano w 96-dołkowych płytkach (Nunc). Do 100 μl komórek dodawano 100 μl mieszaninę bakterii inaktywowanych ciepłem (inkubowanych przez 60 minut w temp. 96 C) w stężeniu 10 7 ml oraz 100 μl medium. Jako kontrolę pozytywną użyto konkanawalinę A (Con A) (Sigma) w stężeniu 5 μg/ml, natomiast jako kontrolę negatywną medium hodowlane. Założono po 10 hodowli dla mieszaniny, ConA i samego medium hodowlanego. Hodowle inkubowano w wilgotnej atmosferze zawierającej

3 PL B1 3 5%(v/v) CO 2 przez 72h w 37 o C. Po tym okresie zebrano nadsącze hodowlane, zmieszano hodowle powtórzone i zamrożono w temperaturze -56 o C do dalszych badań. Detekcja poziomu cytokin w nadsączach hodowlanych W nadsączach oceniano poziom interleukiny (IL)-5, czynnika martwicy nowotworów (TNF)-alfa, interferonu (IFN)-gamma. Poziom poszczególnych cytokin oznaczano metodą immunoenzymatyczną (ELISA) z zastosowaniem komercyjnych zestawów DuoSet firmy R&D Systems zgodnie z zaleceniami podanymi przez producenta. Wyniki Translokacja bakterii przez barierę jelitową Nie obserwowano żadnych objawów patologicznych po podaniu mieszaniny bakterii Lactobacillus; myszy przybierały na wadze porównywalnie w obu badanych grupach. Nie wyhodowano bakterii z krwi i organów wewnętrznych (wątroby i śledziony). Natomiast w krezkowych węzłach chłonnych znaleziono 250 jednostek tworzących kolonie (jtk) Lactobacillus w grupie otrzymującej bakterie. Nie wyizolowano bakterii z węzłów chłonnych wyizolowanych z grupy kontrolnej. Wnioski Bakterie jelitowe są bezpieczne, nie ulegają translokacji do krwi i organów wewnętrznych. W nieznacznym stopniu bakterie Lactobacillus casei i paracasei selektywnie przechodzą do krezkowych węzłów chłonnych, gdzie stanowią rezerwuar antygenowy swoiście aktywujący układ immunologiczny. II Badanie wpływu szczepów Lactobacillus casei i paracasei na produkcję cytokin. Produkcja cytokin ConA i bakterie Lactobacillus casei i paracasei stymulowały produkcję cytokin w hodowlach komórkowych. Nie obserwowano różnic w produkcji IL-5, TNF-alfa i IFN- gamma pomiędzy grupami, gdy oceniano hodowle stymulowane ConA. Bakterie Lactobacillus stymulowały natomiast znamiennie statystycznie produkcję prozapalnych cytokin TNF-alfa i IFN-gamma w hodowlach limfocytów izolowanych z myszy zasiedlonych mieszaniną bakterii Lactobacillus w porównaniu do hodowli otrzymanych z myszy kontrolnych. W odróżnieniu od cytokin prozapalnych, proalergiczna IL-5 po stymulacji bakteriami Lactobacillus była produkowana w znacznie mniejszych ilościach w grupie otrzymującej bakterie w porównaniu do grupy kontrolnej (Tabela 1). T a b e l a 1 Produkcja cytokin w hodowlach limfocytów stymulowanych mieszaniną bakterii Lactobacillus casei i paracasei (Bm) i konkanawaliną A (ConA) w grupie myszy zasiedlonej bakteriami i w grupie kontrolnej Myszy zasiedlone bakteriami TNF-alfa Myszy kontrolne Bm 1012±223* 881±132 ConA 449±85 444±93 INF-gamma Bm 442±98* 151±23 ConA 4054± ±987 IL-5 Bm 29±3 # 37±3 ConA 1146± ±298 * znamiennie statystycznie większa produkcja cytokin prozapalnych w grupie myszy zasiedlonych w porównaniu do kontrolnych dla TNF-alfa p=0,04, dla IFN-gamma p=0,01. # znamiennie statystycznie niższa produkcja proalergiczmej IL-5 w grupie myszy zasiedlonych w porównaniu do kontrolnych (p=0,04). Wnioski Bakterie Lactobacillus casei i paracasei aktywują prozapalny profil cytokinowy, hamują natomiast proalegiczną cytokinę IL-5. Uzyskane wyniki potwierdzają probiotyczne cechy mieszaniny bakterii Lactobacillus, z możliwością wykorzystania szczepów w profilaktyce i/lub leczeniu chorób atopowych.

4 4 PL B1 III Wpływ bakterii Lactobacillus casei i paracasei na profil cytokinowy komórek krwi izolowanych od dzieci z alergią IgE-zależną i IgE-niezależną W celu zbadania wpływu mieszaniny szczepów bakterii Lactobacillus casei i paracasei na produkcję cytokin u dzieci z alergią zastosowano model in vitro wykorzystujący hodowle komórkowe z całej krwi. Badano aktywację profilu cytokinowego oceniając poziom cytokin prozapalnych (interleukina (IL)-12, IL-18, interferon (IFN)-gamma, czynnik martwicy nowotworów (TNF)-alfa), proalergicznych (IL-5) i regulujących odpowiedź immunologiczną (czynnik transformujący wzrost (TGF)-beta1) w supernatantach hodowlanych. Do badań włączono 22 dzieci z objawami wyprysku atopowego na tle alergii na białka mleka krowiego w wieku od 3-15 miesięcy (średnia wieku 9 miesięcy). Na podstawie poziomu IgE w surowicy oraz oznaczania swoistych przeciwciał w klasie IgE skierowanych przeciwko panelowi alergenów wziewnych i pokarmowych, dzieci podzielono na 2 grupy: z wypryskiem IgE-zależnym (obecność swoistych przeciwciał i podwyższony poziom IgE) i IgE-niezależnym (poziom IgE w normie, brak swoistych przeciwciał). U 12-ga stwierdzono alergię IgE-zależną, u pozostałych 10-ga alergię IgE- niezależną. Hodowle komórkowe przygotowano z całej krwi. Krew pobraną na heparynę rozcieńczono 1:5 w medium hodowlanym RPMI-1640 (Sigma) pozbawionym cielęcej surowicy, a zawierającym streptomycynę/penicylinę (Sigma). 150 μg rozcieńczonej krwi nałożono na 96-dołkową płytkę hodowlaną (Nunc), a następnie dodano po 150 μl inaktywowanych wysoką temperaturą bakterii w rozcieńczeniu końcowym 2,5 x 10 6 ml. Jako kontrolę pozytywną zastosowano poliklonalny aktywator produkcji cytokin - fitohemaglutyninę (PHA) (Disco Laboratories, Detroit, USA) w ilości 150 μl/dołek w dawce końcowej 10 μg/ml. Jako kontrolę negatywną zastosowano 150 μl/dołek medium hodowlanego (komórki niestymulowane). Dla każdego dziecka założono po 5 hodowli dla mieszaniny szczepów, PHA i samego medium hodowlanego. Hodowle inkubowano w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% (v/v)co 2 przez 72h w 37 0C. Po tym okresie zebrano supernatanty hodowlane, zmieszano hodowle powtórzone i zamrożono w temperaturze -56 o C do dalszych badań. Oznaczanie cytokin w supernatantach Poziom poszczególnych cytokin oznaczano w supernatantach metodą immunoenzymatyczną (ELISA) z zastosowaniem komercyjnych zestawów DuoSet firmy R&D Systems zgodnie z zaleceniami podanymi przez producenta. Czułość testu DuoSet dla poszczególnych cytokin przedstawiono w tabeli 2. Poziom IL-18 oceniono stosując zestaw odczynnikowy firmy MBL (Nagoja) zgodnie z zaleceniami podanymi przez producenta. Czułość testu wynosiła > 12,5 pg/ml. Rodzaj testu T a b e l a 2 Czułość testu DuoSet dla poszczególnych cytokin Czułość (pg/ml) IL-5 > 11,7 IL-12 > 15,5 IFN-gamma > 7,8 TNF-alfa > 7,8 TGF-beta1 > 15,5 Analiza statystyczna Analizę statystyczną wykonano przy pomocy testu Mann-Whitneya, p<0,05 uznano za znamienne statystycznie. Wyniki Produkcja cytokin proalergicznych Poziom IL-5 w hodowlach aktywowanych mieszaniną bakterii pozostawał poniżej czułości testu, podczas gdy PHA stymulował sekrecję tej cytokiny zarówno u dzieci z alergią IgE-zależną, jak i IgE-niezależną (Tabela 3).

5 PL B1 5 T a b e l a 3 Poziom IL-5 w supernatantach uzyskanych z hodowli komórek krwi stymulowanych bakteriami Lactobacillus cesei i paracasei (Bm) i fitohemaglutyniną (PHA) u dzieci z alergią IgE-zależną i IgE- niezależną Aktywator Alergia IgE- zależna (n=12) Alergia IgE-niezależna (n=10) PHA 2617± ±369 Bm *N.D. N.D. Medium hodowlane N.D. N.D. Wyniki przedstawiono jako średnią arytmetyczną ± odchylenie standardowe. * Poziom IL- 5 niemierzalny (poniżej czułości testu). Produkcja cytokin prozapalnych Bakterie Lactobacillus casei i paracasei znamiennie statystycznie w porównaniu do kontroli negatywnej aktywowały produkcję wszystkich cytokin prozapalnych zarówno w grupie dzieci z alergią IgE-zależną, jak i IgE-niezależną z wyjątkiem IL-18 u dzieci z alergią IgE-niezależną. Nie znaleziono różnic znamiennych statystycznie pomiędzy grupą IgE-zależną i IgE- niezależną w aktywacji TNF-alfa (Tabela 4) i IFN-gamma (Tabela 5), chociaż w obu grupach mieszanina bakterii stymulowała produkcję tych cytokin znacznie silniej niż PHA (nie uzyskując znamienności statystycznej). W odróżnieniu od w/w cytokin bakterie aktywowały znamiennie statystycznie silniej produkcję IL-12 niż PHA, głównie w grupie dzieci z alergią IgE-zależną (p<0,0001), w mniejszym stopniu z alergią IgE-niezależną (p=0,0426) (Tabela 6). T a b e l a 4 Poziom TNF-alfa w supernatantach uzyskanych z hodowli komórek krwi u dzieci z alergią IgE-zależną i IgE-niezależną Aktywator Alergia IgE- zależna (n=12) Alergia IgE - niezależna (n=10) Bm 2559± ±846 PHA 1508± ±597 Medium hodowlane *N.D. N.D. Wyniki przedstawiono jako średnią arytmetyczną odchylenie standardowe. * Poziom TNF-alfa niemierzalny (poniżej czułości testu). T a b e l a 5 Poziom IFN-gamma w supernatantach uzyskanych z hodowli komórek krwi u dzieci z alergią IgE-zależną i IgE-niezależną Aktywator Alergia IgE- zależna (n=12) Alergia IgE-niezależna (n=10) Bm 1752± ±283 PHA 632± ±223 Medium hodowlane *N.D. N.D. Wyniki przedstawiono jako średnią arytmetyczną odchylenie standardowe. * Poziom INF-gamma niemierzalny (poniżej czułości testu). T a b e l a 6 Poziom IL-12 w supernatantach uzyskanych z hodowli komórek krwi u dzieci z alergią IgE-zależną i IgE-niezależną. Aktywator Alergia IgE-zależna (n=12) Alergia IgE-niezależna (n=10) Bm 1337±228 # 1605±716 # PHA 182±23 173±18 Medium hodowlane N.D.* N.D. Wyniki przedstawiono jako średnią arytmetyczną odchylenie standardowe. * Poziom IL-12 niemierzalny (poniżej czułości testu). # znamienność statystyczna Bm versus PHA; p<0,0001 dla alergii IgE-zależnej, p=0,0426 dla alergii IgE- niezależnej.

6 6 PL B1 Bakterie stymulowały również znamiennie statystycznie produkcję IL-18, ale tylko w grupie dzieci z alergią IgE-zależną zarówno w porównaniu do PHA (p=0,03), jak i komórek niestymulowanych (p=0,02). Wydaje się, że dzieci z alergią IgE-zależną mają znacznie obniżoną zdolność produkcji IL-18, gdyż poliklonalna stymulacja PHA doprowadza do znamiennie statystycznie mniejszego wydzielania IL-18 w porównaniu do niestymulowanych komórek kontrolnych. Takiego efektu nie obserwowano w grupie dzieci z alergia IgE-niezależną. W grupie dzieci z alergią IgE-niezależną bakterie powodowały podwyższoną produkcję IL-18, ale różnica w porównaniu do kontroli niestymulowanej nie osiągnęła znamienności statystycznej (Tabela 7). T a b e l a 7 Poziom IL-18 w supernatantach uzyskanych z hodowli komórek krwi u dzieci z alergią IgE-zależną i IgE- niezależną. Aktywator Alergia IgE-zależna (n=12) Alergia IgE-niezależna (n=10) Bm 78±25,6* # 65±22,5 PHA 47,8±13,3 57,8±15,2 Medium hodowlane 49,8±12,4 53,3±14,6 Wyniki przedstawiono jako średnią arytmetyczną odchylenie standardowe. * znamienność statystyczna Bm versus PHA tylko w alergii IgE-zależnej, p=0,03; # znamienność statystyczna Bm versus medium hodowlane (kontrola) tylko w alergii IgE-zależnej, p=0,02. Produkcja cytokin regulujących Bakterie Lactobcillus casei i paracasei znamiennie statystycznie w porównaniu do kontroli negatywnej aktywowały produkcję TGF-beta1 zarówno u dzieci z alergią IgE-zależną, jak i IgE-niezależną. Poziom TGF-beta1 był znamiennie statystycznie wyższy w hodowlach stymulowanych bakteriami niż PHA (Tabela 8). T a b e l a 8 Poziom TGF-betal w supernatantach uzyskanych z hodowli komórek krwi u dzieci z alergią IgE-zależną i IgE-niezależną Aktywator Alergia IgE- zależna (n=12) Alergia IgE-niezależna (n=10) Bm 3711±803* # 3535±1200* # PHA 1834± ±691 Medium hodowlane 1145± ±155 Wyniki przedstawiono, jako średnią arytmetyczną ± odchylenie standardowe. * znamienność statystyczna Bm versus PHA w alergii IgE-zależnej (p=0,04), jak i IgE-niezależnej (p=0,04). # znamienność statystyczna Bm versus medium hodowlane (kontrola) w alergii IgE-zależnej, (p=0,01), jak i w alergii IgE-niezależnej (p=0,001). Wyniki Mieszanina bakterii niezależnie od rodzaju alergii (IgE-zależnej i niezależnej) stymuluje komórki krwi do produkcji głównie prozapalnych cytokin oraz czynnika regulującego odpowiedź immunologiczną TGF-beta1. Mieszanina bakterii tylko w grupie dzieci z alergią IgE-zależną aktywuje produkcję prozapalnej IL-18. Mieszanina bakterii nie powoduje aktywacji proalergicznej IL-5 niezależnie od rodzaju alergii. Wnioski Mieszanina bakterii Lactobacillus casei i paracasei posiada cechy aktywujące profil cytokinowy układu immunologicznego w kierunku odpowiedzi prozapalnej w grupie dzieci z alergią IgE-zależną i IgE-niezależną, co wskazuje na możliwość wykorzystania w/w bakterii w leczeniu i/lub profilaktyce chorób alergicznych. Biorąc pod uwagę patomechanizm alergii mieszanina szczepów może mieć efekt kliniczny głównie u dzieci z alergią IgE-zależną (z atopią). Ze względu na zdolność aktywacji cytokiny regulującej odpowiedź immunologiczną szczepy bakteryjne mogą być stosowane zarówno u osób z alergią IgE-zależną, jak i IgE-niezależną.

7 PL B1 7 Przykłady wykonania. P r z y k ł a d I Kompozycja zawiera liofilizowaną zawiesinę 10 9 bakterii Lactobacillus casei ŁOCK 0900, Lactobacillus casei ŁOCK 0908, Lactobacillus paracasei ŁOCK 0919 oraz maltodekstrynę i kwas askorbinowy. Kompozycja jest konfekcjonowana w saszetkach lub w kapsułkach. P r z y k ł a d II Kompozycja zawiera liofilizowaną zawiesinę 10 9 bakterii Lactobacillus casei ŁOCK 0900, Lactobacillus casei ŁOCK 0908, Lactobacillus paracasei ŁOCK 0919, maltodekstrynę, inozytol i kwas askorbinowy. Kompozycja jest konfekcjonowana w saszetkach lub w kapsułkach. Kompozycja przeznaczona jest do stosowania u niemowląt i dzieci z podwyższonym ryzykiem reakcji alergicznych, w tym z atopowym zapaleniem skóry. Zastrzeżenie patentowe Zastosowanie Lactobacillus casei nr depozytu ŁOCK 0900, Lactobacillus casei nr depozytu ŁOCK 0908 i Lactobacillus paracasei nr depozytu ŁOCK 0919 wykazujących zdolność aktywowania prozapalnego profilu cytokinowego oraz zdolność hamowania proalergicznej cytokiny IL-5 do wytwarzania kompozycji odżywczej lub farmaceutycznej do profilaktyki i/lub leczenia chorób alergicznych.

8 8 PL B1 Departament Wydawnictw UP RP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)