Acta Haematologica Polonica 2009, 40, Nr 3, str

Transkrypt

1 PRACA POGLĄDOWA Review Article Acta Haematologica Polonica 2009, 40, Nr 3, str OLGA GRZYBOWSKA-IZYDORCZYK, PIOTR SMOLEWSKI Białka inhibitorowe apoptozy z rodziny inhibitorów apoptozy (IAP) i ich antagoniści: rola biologiczna oraz potencjalne znaczenie w karcinogenezie i celowanej terapii przeciwnowotworowej Inhibitor of apoptosis protein (IAP) and their antagonists: the role in cell biology and potential significance for carcinogenesis or targeted antitumor treatment Z Zakładu Hematologii Doświadczalnej Katedry Hematologii, Uniwersytetu Medycznego w Łodzi Kierownik Zakładu: Prof. dr hab. med. Piotr Smolewski STRESZCZENIE Zaburzenia apoptozy, czyli programowanej śmierci komórki, uznawane są za jedną z przyczyn rozwoju wielu zaburzeń hematologicznych. W regulacji tego procesu biorą udział białka o działaniu pro- i antyapoptotycznym, głównie z rodziny Bcl-2 i p53 oraz stosunkowo niedawno poznana rodzina białka inhibitora apoptozy (inhibitor of apoptosis protein, IAP), z naleŝącymi do niej białkami XIAP, ciap1, ciap2, surwiwiną, liwiną, ILP-2, NAIP oraz BRUCE/Apollon. Niezwykle istotną rolę w kontrolowaniu aktywności głównych enzymów apoptozy kaspaz odgrywa takŝe grupa białek wykazujących antagonistyczne działanie w stosunku do rodziny IAP (tj. Smac/DIABLO, HtrA2/Omi oraz XAF1). W pracy przedstawiono aktualny stan wiedzy na temat struktury i funkcji tych białek zarówno w procesie apoptozy, jak i cyklu komórkowym oraz ich potencjalne znaczenie w karcinogenezie i celowanej terapii przeciwnowotworowej. SŁOWA KLUCZOWE: ciap1 ciap2 XIAP Surwiwina Smac/DIABLO HtrA2/Omi regulacja apoptozy SUMMARY The apoptotic mode of the cell death is a major regulatory process in all complex organisms. Furthermore, some defects in apoptosis regulation may play an important role in the pathogenesis of many hematologic malignancies. Apoptosis, defined as a programmed cell death, is executed through activity of caspases, cysteine proteases which are regulated by a number of pro- and antiapoptotic proteins. One of such checkpoints is a control of caspase activation by the family of inhibitor of apoptosis proteins (IAPs). Eight IAP proteins have been identified in human so far. They were XIAP, ciap1, ciap2, ILP-2, livin, NAIP, survivin and BRUCE/Apollon. Moreover, three other proteins, which bind to IAPs and inhibit their activity, seem to play an important role in this process. They are Smac/DIABLO, HtrA2/Omi and XAF1. In this review we described a current state of knowledge about these newly identified groups of pro- and antiapoptotic pro-

2 594 O. GRZYBOWSKA-IZYDORCZYK i wsp. teins, their role in cell biology, potential significance for carcinogenesis or targeted antitumor treatment. KEY WORDS: ciap1 ciap2 XIAP- Survivin Smac/DIABLO HtrA2/Omi apoptosis regulation WSTĘP Białka z rodziny IAP (inhibitor of apoptosis protein), są polipeptydami zaliczanymi do grupy inhibitorów apoptozy, występującymi zarówno u ssaków, jak równieŝ w wirusach owadów, tzw. bakulowirusach [1]. Tworząc kompleksy z innymi białkami uczestniczącymi w procesie programowanej śmierci komórki (tj. kaspazy, białka adaptorowe, czynniki transkrypcyjne, antagoniści IAP) prowadzą one do zakłóceń w przekazywaniu sygnału apoptotycznego. W większości przypadków białka IAP mają zdolność bezpośredniego wiązania prokaspazy 3 i 7, zapobiegając ich proteolizie i hamując aktywność odpowiednich kaspaz. Niektóre z IAP zapobiegają równieŝ aktywacji inicjatorowej kaspazy 9. Ponadto działając jako ligazy ubikwitynowe mogą prowadzić do degradacji kaspaz [2]. Wykazano takŝe, Ŝe niektóre z białek IAP regulują takŝe cytokinezę i powstanie wrzeciona podziałowego oraz modulują transdukcję sygnałów biegnących z powierzchni receptorów [3]. Struktura i funkcja IAP Białka IAP są zbudowane z łańcuchów o długości około aminokwasów, których charakterystyczną cechą jest obecność dwóch motywów sekwencyjnych domeny BIR (baculoviral IAP-like repeats) w N-końcu cząsteczki oraz domeny RING (really interesting new gene). Ta ostatnia ma strukturę palca cynkowego (RING zinc finger, RZF) i jest umiejscowiona w C-końcu polipeptydu, wykazując aktywność ligazy E3 ubikwityna-białko [2]. O przynaleŝności do rodziny IAP decyduje obecność domeny BIR, stąd alternatywna nazwa białek BIRPs (BIR-containing proteins). Domeny BIR, występujące w niektórych białkach IAP w powtórzeniach (nawet do 3 powtórzeń), zbudowane są z około 70 reszt aminokwasowych, wśród których obecne są motywy sekwencji CysX2Cys i CysX6His, sugerując, Ŝe białka te mogą wiązać jon cynkowy. Domeny BIR dwóch białek IAP surwiwiny i BRUCE są większe niŝ u pozostałych i liczą około 100 aminokwasów. W opisanych dotąd białkach IAP, domeny BIR połączone są za pomocą tzw. łączników (Ryc. 1). Jak wspomniano powyŝej domena RZF wykazująca aktywność ligazy E3 ubikwityna białko odgrywa rolę w autoubikwitynacji IAP i ubikwitynacji docelowych białek [2]. Ubikwitynacja jest procesem modyfikującym białka przez kowalentne sprzęŝenie z pojedynczą cząsteczką ubikwityny (Ub) monoubikwitynacja, albo licznymi cząsteczkami Ub połączonymi wiązaniami izopeptydowymi (poliubikwitynacja). Białka połączone z kilkoma łańcuchami Ub są zwykle degradowane w proteasomie 26S. Natomiast monoubikwitynacja mediuje aktywności nieproteolityczne, takie jak wycisze-

3 Białka inhibitorowe apoptozy 595 nie genu, przenoszenie sygnału i naprawa DNA. Ubikwitynacja jest procesem zaleŝnym od ATP, w którym biorą udział kolejne trzy enzymy (E1, E2, E3) charakteryzujące się obecnością domeny UBC (Ub-conjugating domain) z resztami cysteinowymi [4]. Ryc. 1. Schemat budowy strukturalnej białek z rodziny IAP. Wspólnym elementem budowy cząsteczki poszczególnych IAP jest tzw. domena BIR (szczegóły w tekście i w legendzie do ryciny) Fig. 1. Schematic structure of IAP family proteins. The common element of their molecules is so called BIR domain (details in the text and the figure legend)

4 596 O. GRZYBOWSKA-IZYDORCZYK i wsp. Podział białek IAP U człowieka wykryto osiem białek IAP, które na podstawie homologii domen BIR i obecności, lub braku RZF podzielono na trzy klasy [5] (Ryc. 1). Do klasy I naleŝy pięć białek. Są to: XIAP (X-chromosome binding IAP; inna nazwa BIRC4 BIR containing protein4; inhibitor apoptozy sprzęŝony z chromosomem X; ILP-1), ciap1 (cellular inhibitor of apoptosis 1; inna nazwa BIRC2; pierwszy komórkowy inhibitor apoptozy), ciap2 (cellular inhibitor of apoptosis 2; BIRC3; drugi komórkowy inhibitor apoptozy), ILP-2 (IAP like protein 2 lub BIRC8) i liwina (BIRC7). Do klasy II naleŝy jedno białko NAIP (neuronal apoptosis inhibitory protein; inna nazwa BIRC1; białko pochodzenia neuronalnego hamujące apoptozę). Do klasy III zaliczono dwa białka: surwiwinę (inna nazwa BIRC5) i BRUCE (inne nazwy Apollon, BIRC6). Klasa I białek IAP Cechą charakterystyczną klasy I jest obecność domeny RZF, która występuje we wszystkich białkach (Ryc. 1). Ponadto niektóre z IAP (XIAP, ciap1 i ciap2) cechuje obecność trzech domen BIR. Pozostałe białka, ILP2 i liwina, charakteryzują się obecnością tylko jednej domeny BIR, która jednak wykazuje znaczną homologię z domeną BIR3 XIAP, ciap1 i ciap2. Pozwoliło to na zaliczenie tych dwóch białek do tej samej Klasy I. XIAP. Dotychczas najlepiej poznano strukturę i sposób działania najefektywniejszego inhibitora apoptozy komórek ludzkich białka XIAP. To charakteryzujące się cytoplazmatyczną lokalizacją białko po raz pierwszy zostało zidentyfikowane w 1996 roku [6]. Polipeptyd XIAP zawiera trzy domeny BIR i moŝe hamować niezaleŝnie inicjatorową kaspazę 9 oraz kaspazy wykonawcze. Ponadto analiza właściwości opisanego inhibitora wskazuje, Ŝe domena BIR-2 hamuje aktywność kaspas 3 i 7, ale wymaga równieŝ obecności łącznika poprzedzającego tę domenę. Wiadomo, Ŝe region łącznikowy między domenami BIR1 i BIR2 białka XIAP tworzy przeszkodę przestrzenną zakrywającą przed substratami aktywne miejsca kaspaz efektorowych, kaspazy 3 i 7 [7]. Badania oddziaływań pomiędzy białkiem XIAP a kaspazą 7 sugerują, Ŝe fragment między 124 a 240 aminokwasem wiąŝe się z katalitycznym miejscem enzymu, w pełni go wypełniając, co uniemoŝliwia wiązanie innych substratów. Podobne wyniki otrzymano w odniesieniu do interakcji XIAP z kaspazą 3. Określono, Ŝe 4- aminokwasowy motyw XIAP, tj. Gly144-Val146-Val147-Asp148 oddziałuje z kaspazą 7 poprzez wiązania wodorowe czy za pomocą sił van der Waalsa w miejscach interakcji enzymu z substratami. Kluczową funkcję w tych oddziaływaniach pełni Asp148. Domena BIR stabilizuje ponadto interakcje pomiędzy XIAP a kaspazami wykonawczymi, a takŝe pośredniczy w oddziaływaniu z innymi polipeptydami, np. Smac/DIABLO [8]. Natomiast domena BIR3 XIAP bezpośrednio wiąŝe monomer

5 Białka inhibitorowe apoptozy 597 inicjatorowej kaspazy 9, co uniemoŝliwia powstanie aktywnego homodimeru tej kaspazy [9]. Mimo odmienności funkcjonalnej między domenami BIR2 i BIR3 wykazują one 60% sekwencyjnego podobieństwa. Niewiele wiadomo natomiast na temat roli domeny BIR1. Prawdopodobnie uczestniczy ona w stabilizacji XIAP lub oddziałuje w łączeniu z białkami o powinowactwie do inhibitora, np. XAF1 (XIAP-associated factor 1, czynnik 1. związany z XIAP), bądź z kaspazami czy innymi białkami, dotąd niezidentyfikowanymi [9]. XIAP nie wpływa natomiast na aktywność kaspazy 8 [7]. Hamowanie kaspaz 3 i 7 Hamowanie kaspazy 9 Wiązanie TAB1 / Aktywacja NFκB BIR1 BIR2 BIR3 RZF Hamowanie przez XAF1, Smac/DIABLO i HtrA2/Omi XIAP Wiązanie TRAF1i TRAF2 / Aktywacja NFκB BIR1 BIR2 BIR3 CARD RZF Hamowanie przez XAF1, Smac/DIABLO i HtrA2/Omi ciap1, ciap2 BIR Coiled coil Surwiwina Ryc. 2. Schematyczne przedstawienie funkcji najwaŝniejszych białek rodziny IAP Fig. 2. Function of the most important IAP proteins

6 598 O. GRZYBOWSKA-IZYDORCZYK i wsp. Okazuje się, Ŝe XIAP moŝe hamować apoptozę w mechanizmie niezaleŝnym od jego zdolności wiązania kaspaz. Tworzy on bowiem kompleks z kinazą TAK1 i jej kofaktorem, TAB1, co prowadzi do aktywacji kinazy JNK (Jun-N-terminal kinase). Ta z kolei inicjuje kaskadę fosforylacji kinazy MAP prowadząc do zaktywowania czynnika NF-κB [10]. XIAP aktywuje więc NF-κB przez promowanie jego translokacji do jądra i degradację inhibitora I-κB. Aktywacja NF-κB i JNK przez XIAP wymaga aktywności ligazy E3 Ub białko domeny RING i jest niezaleŝna od hamującego kaspazy efektu XIAP (Ryc. 2). Dotychczasowe badania wskazują na ekspresję XIAP w wielu róŝnych tkankach. Białko to ma zdolność hamowania apoptotycznej śmierci komórki indukowanej np. promieniowaniem radioaktywnym, TNF (tumor necrosis factor; czynnik martwicy nowotworu), Fas (FS-7 associated surface antigen; antygen powierzchniowy związany z FS-7) czy wieloma lekami. Ponadto ostatnie badanie Kairisalo i wsp. [11] sugeruje nową rolę XIAP w kontrolowaniu stresu oksydacyjnego. ciap1 i ciap2. Zaliczane równieŝ do klasy I białka ciap1 i ciap2 charakteryzują się obecnością domeny rekrutacji kaspaz CARD (caspase recruitment domain) połoŝonej pomiędzy domeną BIR i RZF. Oba te białka, strukturalnie podobne do XIAP, równieŝ hamują kaspazę 3 i 7, chociaŝ w porównaniu z XIAP działają słabiej. Wykazano równieŝ, Ŝe ciap1 i ciap2 nie mają zdolności do wiązania i hamowania kaspazy 1, 6 czy 8. Okazuje się takŝe, Ŝe ciap1 i ciap2 mogą wiązać się z TRAF1 i TRAF2 (TNF receptor-associated factors 1 i 2, białka adaptorowe wiąŝące się do TNF-R) hamując w ten sposób apoptozę na poziomie receptorów błonowych. Wynikiem tego jest brak proteolizy prokaspazy 8 [12]. Ponadto sugeruje się, Ŝe czynność ciap1 interferuje z czynnością innego białka IAP surwiwiny. Wykazano takŝe, Ŝe w regulacji ekspresji białka ciap2 odgrywa rolę jądrowy czynnik transkrypcyjny NFκB, który w odpowiedzi na stres komórkowy indukuje ekspresję licznych genów antyapoptotycznych [13] (Ryc. 2). Liwina i ILP-2. Jak wspomniano powyŝej cechą wyróŝniającą te dwa białka jest obecność zaledwie jednej domeny BIR (Ryc. 1). Jednak jej znaczne podobieństwo do domeny BIR3 białka XIAP pozwoliło na zaliczenie zarówno liwiny jaki i ILP-2 do tej klasy. Liwina, białko kodowane przez gen zlokalizowany w obrębie ramienia długiego chromosomu 20, występuje w postaci dwóch lizoform α i β [14]. Prowadzone dotychczas badania nie wykazały obecności mrna tego białka w większości dojrzałych tkanek u człowieka, poza łoŝyskiem. Stwierdzono natomiast jej obecność w rozwijających się tkankach i kilku nowotworowych liniach komórkowych [15]. Okazuje się, Ŝe liwina hamuje apoptozę zarówno na drodze receptorowej jak i mitochondrialnej, przez blokowanie kaspazy 3 i 7 [14]. Kasof i wsp. [15] wykazali równieŝ zdolność tego białka do blokowania zaktywowanej przez Apaf-1 (apoptotic protease activating factor 1; czynnik 1. aktywujący proteazy podczas apoptozy) czy cytochrom c kaspazy 9, co odbywa się głównie dzięki obecności domeny BIR.

7 Białka inhibitorowe apoptozy 599 ILP-2 ostatnie białko tej klasy, kodowane jest przez gen, którego ekspresję wykazano u człowieka jedynie w obrębie tkanki jąder [16]. Badania dowiodły, Ŝe ILP-2 w warunkach in vitro hamuje apoptozę przez oddziaływanie z kaspazą 9 czy białkiem Bax (Bcl-2 associated X protein; białko X związane z Bcl-2) [16]. Nadekspresja ILP-2 nie wpływa natomiast na proces apoptozy indukowany prze Fas czy TNF. Jednak Shin i wsp. [17] wykazali znaczną niestabilność konformacyjną tego białka spowodowaną prawdopodobnie brakiem elementu łączącego domenę BIR z N-końcem proteiny. Okazało się, Ŝe ILP-2 jest na tyle niestabilnym związkiem, Ŝe w warunkach fizjologicznych nie jest w stanie hamować kaspazy 9. Autorzy przypuszczają, Ŝe elementem warunkującym tę aktywność w warunkach in vivo jest obecność niezidentyfikowanego dotąd czynnika komórkowego (17). Klasa II białek IAP: NAIP Jedyne białko zaliczane do klasy II to NAIP, którego obniŝoną ekspresję wykazano po raz pierwszy w neuronach rdzenia kręgowego pacjentów cierpiących na rdzeniowy zanik mięśni (SMA spinal muscular atrophy) [18]. Pod względem strukturalnym charakteryzuje się ono obecnością trzech domen BIR, ale pozbawione jest domeny RZF (Ryc. 1). Przy C-końcu NAIP posiada natomiast szczególną domenę oligomeryzacji NOD (nucleotide binding oligomeryzation domain) z następującym po niej skupiskiem 14 powtórzeń leucynowych LRRs (leucine rich repeats). Wszystkie białka typu LRRs wiąŝą wewnątrzkomórkowe lipopolisacharydy wydzielane przez bakterie i uczestniczą w odpowiedzi gospodarza związanej z wytwarzaniem cytokin i aktywacją NFκB. Liston i wsp. [19] sugerują rolę NAIP w odpowiedzi gospodarza na wewnątrzkomórkowe zakaŝenia bakteryjne. Prawdopodobnie aktywacji prozapalnych kaspaz, takich jak Kaspara 1, moŝe towarzyszyć aktywacja NAIP konieczna do stłumienia kaspaz efektorowych uaktywnionych przez prozapalną kaspazę inicjatorową. Klasa III białek IAP Do klasy III zaliczamy dwa białka: surwiwinę i BRUCE (Apollon). Charakteryzują się one obecnością tylko jednej domeny BIR oraz brakiem domeny RZF. Domeny BIR obu tych białek są podobne do siebie i do BIRs, jakie występują u muszek, nicieni i droŝdŝy, u których IAP odgrywają zasadniczą rolę równieŝ przy kończeniu podziałów komórkowych. Sugeruje się więc, Ŝe domena BIR surwiwiny i BRUCE w mniejszym stopniu niŝ w białkach klasy I hamuje apoptozę, a odpowiada raczej za reguluję podziałów komórkowych [20]. Surwiwina. Surwiwina została odkryta w 1997 roku przez Ambrosini i wsp. [21], dzięki homologii strukturalnej z innymi białkami IAP w ludzkim chłoniaku B- komórkowym. Jest ona najmniejszym białkiem z rodziny IAP u ssaków. Gen dla surwiwiny zlokalizowany jest w długich ramionach chromosomu 17 (17q25), a struktura tego białka jest ściśle związana ze zdolnością do hamowania apoptozy. Ekspresja surwiwiny bezpośrednio wiąŝe się z cyklem komórkowym ze szczytem przypadającym w fazie G 2 /M [22].

8 600 O. GRZYBOWSKA-IZYDORCZYK i wsp. Struktura surwiwiny wykazuje około 25% podobieństwa z najlepiej poznanym białkiem XIAP. JednakŜe w przeciwieństwie do XIAP, przy N-końcu jej cząsteczka zawiera tylko jedną domenę BIR, która wydaje się najbardziej podobna do trójwymiarowej struktury BIR3 XIAP. MoŜe to wskazywać na zdolność surwiwiny do hamowania kaspazy 9 [23]. Marusawa i wsp. [24] wykazali takŝe, Ŝe surwiwina tworząc kompleksy z innymi białkami moŝe pośrednio hamować kaspazę 9. Hamowanie aktywności kaspazy 3 przez surwiwinę budzi natomiast wiele kontrowersji. Nie posiada ona przecieŝ regionu łącznikowego (jak np. białko XIAP) odpowiedzialnego za interakcje z kaspazą 3. Są jednak prace, które wskazują, Ŝe surwiwina moŝe regulować apoptozę przez ścieŝkę cyklino-zaleŝnego inhibitora kinazy p21 WAF1/Cip1 i pośrednio hamować aktywność kaspazy 3 [25]. Nie moŝna jednak wykluczyć, Ŝe surwiwina hamuje aktywność tej kaspazy przy pomocy zupełnie innego mechanizmu, co obecnie stanowi przedmiot wielu badań. Inaczej niŝ u większości białek IAP, surwiwina nie posiada takŝe przy C-końcu domeny RING o strukturze palca cynkowego. Interesujący jest jednak fakt, Ŝe chociaŝ surwiwina nie wykazuje aktywności ligazy E3, to ulega ubikwitynacji i degradacji w proteasomie [26]. Cechą charakterystyczną tego białka jest natomiast obecność przy C- końcu długiego motywu alfa-helikalnego (alfa-helical coiled-coil), który wchodzi w interakcję z mikrotubuliną. Usunięcie tej C-końcowej helisy uniemoŝliwia lokalizację surwiwiny na mikrotubulach [22] (Ryc. 2). MoŜe się równieŝ okazać, Ŝe hamowanie kaspaz nie jest jedynym mechanizmem antyapoptotycznej aktywności surwiwiny. Liu i wsp. [27] wykazali bowiem, Ŝe po zahamowaniu aktywności surwiwiny najwcześniej obserwowanym efektem proapoptotycznym była jądrowa translokacja białka AIF (apoptosis inducing factor; czynnik indukcji apoptozy), odpowiedzialnego za niezaleŝną od kaspaz fragmentację DNA. Suzuki i wsp. [28] wykazali ponadto, Ŝe surwiwina moŝe hamować apoptozę pośrednio, poprzez zahamowanie przejścia komórki przez fazy G 1 i S cyklu komórkowego. Surwiwina, obok zdolności hamowania apoptozy, posiada jeszcze drugą, unikalną w rodzinie IAP właściwość regulowania podziałów komórkowych, zaleŝną od zmieniającej się podczas mitozy lokalizacji surwiwiny. Przez niektórych autorów surwiwina zaliczana jest do tzw. pasaŝerskich białek chromosomowych (chromosomal passenger proteins) zlokalizowanych przy kinetochorze, które w metafazie przenoszone są do środka komórki w płaszczyźnie przyszłej bruzdy podziałowej i odgrywają zasadniczną rolę w segregacji chromosomów i cytokinezie [29]. Wydaje się więc, Ŝe udział surwiwiny zarówno w apoptozie, jak i w regulacji podziałów komórkowych zaleŝy od jej zmiennej lokalizacji w strukturach subkomórkowych. W prawidłowych komórkach białko to występuje w jądrze komórkowym. JednakŜe podczas mitozy surwiwina gromadzi się w róŝnych komponentach aparatu mitotycznego [29, 30]. Niezwykle istotnym jest fakt, Ŝe silną ekspresję surwiwiny wykryto w większości ludzkich nowotworów, podczas gdy w prawidłowych, całkowicie zróŝnicowanych tkankach osób dorosłych surwiwina jest praktycznie niewykrywalna [31]. Sugeruje to potencjalną rolę tego białka w rozwoju klonu nowtoworowego.

9 Białka inhibitorowe apoptozy 601 BRUCE/Apollon. Drugim białkiem zaliczanym do klasy III jest BRUCE, pierwotnie wykryty u myszy przez Jentscha i wsp. [32]. Występujący u ludzi BRUCE jest duŝym (528 kda) białkiem błonowym, z genem zlokalizowanym w krótkich ramionach chromosomu 2. Podobnie do surwiwiny posiada ono tylko jedną domenę BIR i nie ma domeny RZF [32]. Przy C-końcu ma motyw enzymu E2-domenę UBC, która wiąŝe Ub, co sugeruje Ŝe BRUCE działa równieŝ jako ligaza ubikwitynowa E3. BRUCE wykazuje działanie antyapoptotyczne, hamując kaspazy poprzez domenę BIR. Jego aktywność jest jednak około dziesięciokrotnie słabsza w porównaniu z XIAP [33]. Niektóre badania wykazały, Ŝe BRUCE ma zdolność hamowania efektorowej kaspazy 3, co jednak nie zostało potwierdzone w innych obserwacjach [34]. Sugeruje się natomiast, Ŝe białko to działa przede wszystkim jako chimeryczny enzym E2/E3, wywołując ubikwitynację i proteasomową degradację białka Smac/DIABLO (second mitochondria-derived activator of caspase/direct IAP binding protein with low pi, mitochondrialny czynnik 2. aktywujacy kaspazy), proteazy serynowej HtrA2/Omi (high temperature requirement A2) i kaspazy 9 [34, 35]. Prawdopodobnie BRUCE odgrywa równieŝ rolę w utrzymaniu Ŝywotności komórek. Antagoniści IAP WaŜnym krokiem w zrozumieniu mechanizmów kontroli aktywności kaspaz okazało się zidentyfikowanie grupy białek wykazujących działanie antagonistyczne w stosunku do rodziny IAP. Dotychczas poznano trzy proteiny, które podczas apoptozy, XIAP + TAB1 TAK1 Fas-L mitochondrium Smac/Diablo Proliferacja HtrA2/Omi Smac/Diablo ub Aktywacja NFκB AIF Surwiwina Kaspaza-9 ciap1 TNF- HtrA2/Omi Kaspazy-3 i-7 ciap2 XIAP Kompleks ciap1 + TRAF2 Apoptoza ub błona komórkowa jądro komórkowe XAF1 Ryc. 3. Mechanizmy działania białek rodziny IAP i ich antagonistów (opis w tekście) Fig. 3. Mechanisms of action of IAP family and their antagonists

10 602 O. GRZYBOWSKA-IZYDORCZYK i wsp. po uwolnieniu z mitochondriów, mogą bezpośrednio oddziaływać z IAP. NaleŜą do nich Smac/DIABLO, oddziałujący z XIAP, ciap1, ciap2 i surwiwiną oraz HtrA2/Omi i XAF1, które mają zdolność oddziaływania równieŝ z białkiem XIAP (Ryc. 3). Smac/DIABLO. Najlepiej dotychczas poznanym białkiem działającym antagonistycznie w stosunku do IAP jest Smac/DIABLO. Polipeptyd ten ma zdolność hamowania oddziaływań pomiędzy IAP a kaspazami [8]. Smac/DIABLO syntetyzowany jest w postaci wielkich cytozolowych cząsteczek prekursorowych, które w mitochondrium ulegają przemianie proteolitycznej w dojrzałe białka. W odpowiedzi na sygnał śmierci dojrzałe białko zostaje uwolnione do cytozolu razem z cytochromem c i w mitochondrialnym szlaku apoptozy wchodzi w interakcję z białkami z rodziny IAP [36]. Struktura białka Smac/DIABLO charakteryzuje się obecnością specyficznego N- końcowego motywu IBM (IAP binding motif, motyw wiąŝący IAP). UmoŜliwia on wiązanie białka z domeną BIR w IAP, zapobiegając w ten sposób aktywacji kaspaz albo stymulując autoubikwitynację i degradację IAP [37]. Jia i wsp. [38] wykazali, Ŝe Smac/DIABLO moŝe promować apoptozę zarówno na drodze zewnętrznej jak i wewnętrznej. Okazuje się, Ŝe białko to wiąŝąc się z domeną BIR2 i BIR3 XIAP, moŝe zakłócać interakcje pomiędzy XIAP i kaspazami, a przez to obniŝać hamujący efekt XIAP w stosunku do kaspazy 3, 7 i 9. Wykazano, Ŝe Smac/DIABLO wiąŝe się z BIR3 XIAP, hamując przez to dołączenie się kaspazy 9 do domeny BIR3. W efekcie kaspaza 9 zostaje wyparta z pierwotnego miejsca wiązania do XIAP i w ten sposób moŝe aktywnie uczestniczyć w procesie apoptozy [39]. Doświadczenia in vitro pokazały ponadto, Ŝe Smac/DIABLO oddziałuje poza XIAP z białkami ciap1, ciap2 i surwiwiną. WaŜne jest to, Ŝe regulacja aktywności inhibitora apoptozy za pośrednictwem białka Smac/DIABLO przebiega gdy polipeptyd ten występuje w formie homodimeru, zbudowanego z dwóch alfa-helikalnych podjednostek o masie 25kDa. W formie monomerycznej natomiast białko to nie jest w stanie pełnić swoich funkcji proapototycznych [39]. Są równieŝ obserwacje wskazujące, Ŝe nadekspresja Smac/DIABLO zwiększa aktywność kaspazy 3 indukowaną przez ligand Apo-2L/TRAIL i obniŝa aktywność surwiwiny, XIAP oraz ciap1 [40]. RównieŜ surwiwina, przez wiązanie i wpływ na sekwestrację Smac/DIABLO, moŝe zapobiegać wiązaniu innych IAP przez Smac/DIABLO, a tym samym pośrednio hamować apoptozę [40]. Badania Yang i Du [41] sugerują, Ŝe Smac/DIABLO moŝe selektywnie wchodzić w interakcje z ciap1 i ciap2 w Ŝywych komórkach. W badaniu in vitro na komórkach HeLa wykazali oni, Ŝe Smac/DIABLO przyczynia się do autoubikwitynacji ciap1 i ciap2, czego rezultatem jest znaczne obniŝenie poziomu tych białek. Potwierdzono równieŝ, Ŝe Smac/DIABLO przez promowanie aktywności E3 i proteasomalnej degradacji ciap1 i ciap2 moŝe przyspieszać aktywację kaspaz mediowaną TNF-R. Podsumowując, autorzy uznali Smac/DIABLO za kluczową cząsteczkę umoŝliwiającą za pośrednictwem ścieŝki ubikwitynowo-proteasomowej selektywną redukcję in vivo poziomu białek ciap.

11 Białka inhibitorowe apoptozy 603 Jia i wsp. [38] wykazali ponadto, Ŝe Smac/DIABLO moŝe indukować zatrzymanie cyklu komórki w fazie G 0 /G 1 w komórkach białaczkowych. W ostatnich latach Fu i wsp. [42] zidentyfikowali nowy wariant Smac/DIABLO o nazwie Smac3, którego ekspresję mrna wykazano w wielu badanych tkankach (trzustka, płuca, nerki, śledziona, serce, mózg). Nie jest jednak znana ekspresja mrna i białka Smac3 w ludzkich komórkach hematopoetycznych. Smac3 działa antagonistycznie w stosunku do XIAP nie tylko przez przyłączenie do BIR2 i BIR3, ale takŝe przez promowanie ubikwitynacji i destrukcji XIAP, co moŝe sugerować niezaleŝność Smac3 od Smac/DIABLO. Znana jest równieŝ inna odmiana Smac/DIABLO cytozolowa izoforma Smac-Slbeta, która pomimo jej niezdolności do wiązania IAP w komórkach wykazuje równieŝ właściwości proapoptotyczne [43]. Badania Yoo i wsp. [44] wykazały obecność Smac/DIABLO w ponad 60% róŝnych typów nowotworów, ale korelacje ekspresji tego białka ze stanem zawansowania choroby, reakcją na leczenie, przeŝyciem są aktualnie przedmiotem badań. Białko HtrA2/Omi. Kolejnym białkiem regulującym aktywność inhibitora apoptozy jest odkryta przez Hedge i wsp. [45] oraz Suzuki i wsp. [46] proteaza serynowa HtrA2/Omi. Białko to syntetyzowane jest jako prekursor o masie 49/50 kda, zawierający N-końcowy sygnał lokalizacji mitochondrialnej MLS (mitochondrial localization signal). Pod wpływem czynników apoptotycznych HtrA2/Omi przedostaje się z mitochondriów do cytozolu, gdzie (podobnie do Smac) za pośednictwem motywu IBM wchodzi w interakcje z domeną BIR3 białka XIAP. UmoŜliwia to aktywację niezbędnych do przebiegu apoptozy kaspaz [46]. W oddziaływaniu pomiędzy białkiem XIAP a HtrA2/Omi kluczową rolę odgrywa alanina, stanowiąca składnik motywu Ala-Val-Pro- Ser. Mutacja w segmencie genu dla proteazy serynowej, prowadząca do podstawienia alaniny innym aminokwasom, blokuje wiązanie pomiędzy XIAP a HtrA2/Omi a co za tym idzie odłączenie kaspazy od kompleksu z jej inhibitorem. Sugeruje się, Ŝe HtrA2/Omi moŝe być równieŝ odpowiedzialne za proteolityczną degradację XIAP, ciap1 i ciap2. Suzuki i wsp. [46] wykazali, Ŝe HtrA2/Omi prawdopodobnie moŝe promować śmierć komórki nie tylko poprzez bezpośrednie wiązanie i hamowanie IAP, co skutkuje znacznym wzrostem aktywności kaspaz. Autorzy sugerują inny sposób indukowania śmierci komórki, niezaleŝny od IAP i kaspaz, a związany z aktywnością proteazy serynowej badanego białka. Problem ten pozostaje nadal w sferze badań. XAF1. Kolejnym zidentyfikowanym białkiem z grupy antagonistów IAP jest XAF1, zawdzięczający swoją nazwę zdolności przyłączania się do XIAP i bezpośredniej interakcji z tym białkiem [47]. XAF1 jest jądrowym białkiem składającym się z 301 aminokwasów, zawierającym na N-końcu motyw palca cynkowego RZF. Analiza strukturalna wykazała jednak, Ŝe kluczowym dla jego proapoptotycznej funkcji jest fragment C-końcowy, podczas gdy RZF umoŝliwia m.in. interakcje z innymi białkami.

12 604 O. GRZYBOWSKA-IZYDORCZYK i wsp. Dotychczas zidentyfikowane zostały trzy transkrypty białka XAF1 XAF1 A, B i C. Badania in vitro wykazały, ze XAF1 moŝe blokować mediowane przez XIAP hamowanie aktywacji kaspazy 3, przez co odwraca ochronny efekt nadekspresji XIAP w nowotworowych liniach komórkowych i wielu pierwotnych nowotworach [47]. Badania Arora i wsp. [48] potwierdziły równieŝ zdolność wiązania XAF1 nie tylko z XIAP, ale i z ciap1, ciap2, liwiną oraz NAIP. Autorzy ci wykazali równieŝ, ze białko to moŝe pośredniczyć takŝe w obniŝeniu poziomu surwiwiwny przez tworzenie kompleksu zawierającego XIAP (kompleks XIAP-XAF1). Obserwacja ta mogłaby wskazywać na podwójną rolę XAF1 zarówno w apoptozie jak i tzw. katastrofie mitotycznej. WciąŜ prowadzone są badania nad poznaniem mechanizmu działania XAF1. I tak Straszewski-Chavez i wsp. [47] wykazali, Ŝe to zlokalizowane w jądrze białko moŝe przemieszczać się do mitochondrium, gdzie przez indukcję ekspresji Bax jest w stanie aktywować mitochondrialną drogę apoptozy. Mechanizm hamowania antykaspazowej aktywności XIAP nie jest jednak do końca jasny. W badaniu tym autorzy opisali równieŝ nową funkcję XAF1 w pośredniczeniu w procesie apoptozy indukowanej TNF-α. Wykazano takŝe, Ŝe w przeciwieństwie do wcześniejszych danych XAF1 mo- Ŝe równieŝ pośrednio hamować XIAP przez aktywację drogi mitochondrialnej. Interesujące jest to, Ŝe w prawidłowych tkankach ludzkich obserwujemy znamienną ekspresję mrna XAF1, podczas gdy w większości linii nowotworowych poziom ten jest bardzo niski lub niewykrywalny, co sugeruje, Ŝe utrata XAF1 moŝe być częścią procesu kancerogenezy. Potencjalna rola białek IAP i ich antagonistów w rozwoju nowotworów Rola IAP jak i ich antagonistów w regulacji mechanizmów Ŝycia i śmierci komórki mocno sugeruje moŝliwą rolę tych białek w rozwoju choroby nowotworowej. Wynikająca z defektu genetycznego konstytutywna nadekspresja białek IAP i/lub zmniejszona ekspresja ich antagonistów moŝe bowiem prowadzić do wytworzenia się antyapoptotycznego profilu komórki, ułatwiając proliferację powstałego klonu nowotworowego. W istocie, nadekspresję białek IAP wykazano w wielu chorobach nowotworowych układu krwiotwórczego, w tym ostrych białaczkach [49], zespołach mielodysplastycznych [50, 51], przewlekłej białaczce szpikowej [52] oraz chorobach rozrostowych układu chłonnego tj. przewlekła białaczka limfocytowa [53, 54] czy chłoniaki o wysokim stopniu złośliwości [55, 56]. Wysoką ekspresję białek z rodziny IAP zaobserwowoano równieŝ w wielu przypadkach guzów litych. Są prace potwierdzające nadekspresję surwiwiny w nowotworach przewodu pokarmowego, takich jak rak Ŝołądka, jelita grubego, trzustki czy wątroby [57, 58, 59, 60], a takŝe u pacjentek z rakiem piersi [61]. Z kolei XIAP wykrywano między innymi w niedrobnokomórkowym raku płuc [62]. Wysoki poziom białek ciap1 i ciap2 obserwowano natomiast w raku prostaty i raku nerki [63], w przypadku którego potwierdzono równieŝ podwyŝszoną ekspresję liwiny [64].

13 Białka inhibitorowe apoptozy 605 Wielu autorów wykazało znamienną korelację pomiędzy wysokim poziomem IAP, w szczególności XIAP i surwiwiny, a progresją nowotworu [50, 52, 56, 57, 60, 63]. Wydaje się takŝe prawdopodobne, Ŝe nadekspresja XIAP w ostrej białaczce szpikowej (OBS) czy surwiwiny w ostrej białaczce limfoblastycznej (OBL) i chłoniaku wielkokomórkowym z komórek B o rozlanym typie rozrostu (diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL) okaŝe się nowym, niekorzystnym czynnikiem prognostycznym [49, 55, 65]. Przykładem moŝe być praca Tamma i wsp. [49], którzy potwierdzili znamiennie wyŝszą ekspresję XIAP i surwiwiny u chorych na OBS o niekorzystych cytogenetycznych czynnikach ryzyka. Wiązało się to z bardziej agresywnym przebiegiem choroby, a w większości przypadków równieŝ krótszym czasem przeŝycia. Troeger i wsp. [65] zaobserwowali natomiast znacznie wyŝszy poziom surwiwiny w grupie pacjentów z nawrotem OBL, co takŝe moŝe świadczyć w tym przypadku o duŝej dynamice procesu nowotworowego. Interesujące obserwacje poczynili równieŝ Yamamoto i wsp. [50], którzy zauwaŝyli wzrost ekspresji surwiwiny i XIAP w większości, badanych przez siebie, przypadków rozwoju ostrej białaczki na podłoŝu zespołu mielodysplastycznego (ZM). TakŜe Badran i wsp. [52] wykazali znamiennie wyŝszy poziom ekspresji mrna surwiwiny u pacjentów z przewlekłą białaczką szpikową (PBS), będących w okresie bardziej zaawansowanego stadium choroby, jakim jest kryza blastyczna. W innym badaniu, obejmującym liczną (n=222) grupę chorych na chłoniaka DLBCL Adida i wsp. [55] wykazali natomiast wysoką ekspresje surwiwiny w 60% badanych próbek. Co więcej zaobserwowali równieŝ znacząco mniejszy odsetek 5-letniego przeŝycia wśród pacjentów z wysokim poziomem ekspresji surwiwiny stwierdzonym w chwili diagnozy (p=0,02). Znacznie wyŝszy, w porównaniu z grupą kontrolną, poziom liwiny, ILP-2 oraz białka Apollon stwierdzili Abe i wsp. [66] zarówno w grupie chorych z OBS (de novo) jak i chorych na ZM. Autorzy zaobserwowali ponadto spadek ekspresji ILP-2 w przypadku transformacji ZM w OBS oraz znamiennie wyŝszy poziom tego białka w grupie chorych z OBS de novo, co moŝe okazać się dobrym czynnikiem róŝnicującym te dwie grupy pacjentów. RównieŜ w przypadku guzów litych obserwowano zaleŝność pomiędzy wysokim poziomem białek IAP a progresją nowotworu czy krótszym czasem przeŝycia. Kempkensteffen i wsp. [63] wykazali znamiennie wyŝszą w porównaniu z grupą kontrolną ekspresję białek ciap1 i ciap2 u chorych z rakiem nerki. Co więcej, wysoki poziom ciap1 korelował ze stopniem zaawansowania nowotworu i został uznany za niekorzystny czynnik rokowniczy. RównieŜ Kawasaki i wsp. [67] badając chorych z rakiem jelita grubego zaobserwował, Ŝe wysoka ekspresja surwiwiny korelowała z krótszym czasem przeŝycia. Jak dotąd tylko pojedyncze doniesienia dotyczą ekspresji wybranych białek IAP w komórkach jednego z najczęstszych typów białaczek, jakim jest przewlekła białaczka limfocytowa (PBL). Akyurek i wsp. [53] analizując ekspresję poszczególnych białek IAP w komórkach nowotworowych róŝnych chłoniaków nieziarniczych (ChNz) wykazali wysoką ekspresję ciap1 i ciap2, którą obserwowali odpowiednio w 60% i 67% badanych próbek PBL. RównieŜ Nakagawa i wsp. [54] obserwowali znamiennie wyŝszą ekspresję mrna ciap2 i surwiwiny w preparatach szpiku kostnego w grupie 21

14 606 O. GRZYBOWSKA-IZYDORCZYK i wsp. pacjentów z PBL w porównaniu z próbkami szpiku otrzymanymi od 13 zdrowych ochotników. Nie stwierdzili natomiast statystycznie istotnych róŝnic w ekspresji mr- NA XIAP w badanych grupach. De Graff i wsp. [68] próbując ustalić swoisty dla PBL układ ekspresji genów białek rodziny IAP wykazali z kolei wysoką ekspresję mrna XIAP we krwi obwodowej u 9 badanych chorych. Nie stwierdzono istotnych róŝnic w ekspresji mrna tego białka w porównaniu z grupą zdrowych ochotników. Niewiele publikacji dotyczy równieŝ badań nad ekspresją białek antagonistów IAP w PBL. W jednej z prac Schliep i wsp. [69] wykazali ekspresję białka Smac/DIABLO we wszystkich badanych próbkach krwi obwodowej nieleczonych chorych na PBL, które poddali analizie Western Blot. Stwierdzili oni równieŝ, Ŝe poziom tego białka w komórkach nowotworowych jest wyŝszy niŝ ten, który uzyskano prowadząc badania na liniach komórkowych. Odmienne obserwacje poczynili natomiast Ren i wsp. [70]. Badacze analizowali ekspresję białka Smac/DIABLO w duŝej, bo liczącej 247 przypadków, grupie chorych z ChNz. Wykazali oni jego ekspresję w 47% badanych przypadków ChNz (n=117), zwracając uwagę na jej zróŝnicowany poziom w poszczególnych typach chłoniaków. Interesujące jest to, Ŝe autorzy nie stwierdzili ekspresji białka Smac/DIABLO w próbkach otrzymanych od chorych z PBL. Podobny wynik uzyskano w przypadku chorych na chłoniaka Burkitta. Wnioskowano, Ŝe zróŝnicowana ekspresja Smac/DIABLO w badanej grupie ChNz sugeruje prawdopodobnie róŝny stopień zaangaŝowania mechanizmów apoptotycznych w patogenezę nowotworów. Przeprowadzone ostatnio badania własne wykazały, Ŝe w komórkach białaczkowych nieleczonych chorych na PBL stwierdza się antyapoptotyczny układ ekspresji niektórych badanych białek z rodziny IAP: podwyŝszoną ekspresję antyapoptotycznych białek ciap1 i ciap2 oraz obniŝony poziom proapoptotycznego białka Smac/DIABLO w odniesieniu do limfocytów osób zdrowych [71]. MoŜe to potwierdzać pogląd o zahamowaniu apoptozy jako przyczynie nadmiernej kumulacji patologicznych limfocytów w PBL. Ponadto, w komórkach PBL ekspresja wszystkich badanych białek z rodziny IAP ciap1, ciap2, XIAP i surwiwiny była wyŝsza u chorych z progresywnym przebiegiem choroby w porównaniu z komórkami chorych, u których przebieg choroby był stabilny. Fakt ten wskazuje na mniejszą skłonność komórek PBL do spontanicznej apoptozy w przypadku progresywnej, bardziej dynamicznej postaci choroby. Co waŝne, jednoczesna nadekspresja dwóch białek IAP wiązała się z krótszym czasem przeŝycia chorych na PBL, moŝe więc być traktowana jako niekorzystny czynnik prognostyczny [71]. Potencjalna rola IAP/antagonistów IAP jako celu terapii biologicznej Niezwykle waŝne jest dokładne określenie specyficznych zaburzeń ekspresji tych białek w poszczególnych typach nowotworów. Białka IAP/antagoniści IAP mogą bowiem stanowić atrakcyjny cel dla rozwoju nowych strategii terapeutycznych [72, 73]. Podjęto juŝ pierwsze próby klinicznego zastosowania inhibitorów IAP. Wiele zainteresowania budzi moŝliwość wykorzystanie w terapii przeciwnowotworowej związku AEG antysensowego oligonukleotydu (ASO) skierowanego przeciwko białku

15 Białka inhibitorowe apoptozy 607 XIAP. Strategia antysensowych oligonukleotydów zakłada wybiórcze hamowanie biosyntezy niechcianych białek na drodze asocjacji antysensowego konstruktu do wybranych i ściśle określonych sekwencji pre-rna, zaburzając jego składanie. Następuje równieŝ hybrydyzacja z wyselekcjonowanym fragmentem cytoplzmatycznego dojrzałego mrna. Hamowanie ekspresji wybranych genów za pomocą antysensowych oligonukleotydów daje więc nowe moŝliwości w zwalczaniu nowotworu. Okazuje się, Ŝe AEG zmniejszając znacząco ekspresję XIAP uwraŝliwia komórki nowotworowe na cytostatyki doprowadzając ostatecznie do ich zniszczenia. Oczywiście zastosowanie tego związku wydaje się celowe tylko w przypadku chorób nowotworowych charakteryzujących się zwiększoną ekspresję XIAP. W chwili obecnej trwają badania kliniczne I fazy z zastosowaniem AEG w guzach litych, zarówno w monoterapii jak i w połączeniu z docetaxelem w przypadkach bardziej zaawansowanej choroby oraz przy obecności ognisk przerzutowych [74]. Nowy ASO w połączeniu z cytarabiną i idarubicyną wydaje się przynosić zadowalające efekty takŝe u chorych z ostrymi białaczkami [74, 75]. RównieŜ badania I/II fazy klinicznej wskazują na zadowalającą skuteczność stosowania skojarzonej terapii AEG z paclitaxelem w raku piersi, z gemcytabiną w raku trzustki czy z karboplatyną w niedrobnokomórkowym raku płuc [74, 76]. Wyniki dotychczasowych badań nad zastosowaniem ASO w terapii przeciwnowotworowej wskazują raczej na umiarkowana toksyczność tej nowej grupy leków. W zaleŝności od wielkości stosowanej dawki AEG obserwowano przejściowy wzrost poziomu aminotransferaz czy róŝnego stopnia trombocytopenię [74]. Wydaje się jednak, Ŝe ewentualne objawy uboczne nie powinny stanowić przeszkody w stosowaniu ASO w leczeniu onkologicznym. Z uwagi na trwające nadal badania kliniczne I/II fazy brak jest w chwili obecnej ostatecznych dowodów potwierdzających pewną kliniczną skuteczność AEG w leczeniu chorób nowotworowych. Niezbędne do tego celu jest równieŝ prowadzenie obserwacji, porównujących terapię z zastosowaniem tego ASO z innymi dostępnymi strategiami terapeutycznymi, jak to aktualnie ma miejsce w przypadku innego znanego juŝ ASO oblimersenu stosowanego u chorych z PBL czy czerniakiem złośliwym [74]. Nadzieje wzbudza równieŝ moŝliwość wykorzystania w leczeniu chorób nowotworowych ASO skierowanych przeciwko innym białkom IAP, tj. ciap1, który jest obecnie oceniany w przypadku raka prostaty [77] czy surwiwinie badanym m.in. w raku rdzeniastym tarczycy [78]. Na uwagę zasługuje równieŝ inna grupa nowych leków przeciwnowotworowych - niskocząsteczkowe inhibitory IAP. Z uwagi na fakt, iŝ białka z tej rodziny róŝnią się pomiędzy sobą budową i mechanizmami działania, indywidualnego podejścia wymaga równieŝ syntetyzowanie kolejnych związków będących blokerami ich aktywności. W chwili obecnej trwają badania oceniające skuteczność inhibitora białka XIAP w terapii OBS i chłoniaka DLBCL [79, 80].

16 608 O. GRZYBOWSKA-IZYDORCZYK i wsp. PODSUMOWANIE Zaburzenia procesu apoptozy uznawane są za jedną z fundamentalnych przyczyn rozwoju wielu chorób nowotworowych, w tym wywodzących się z układu krwiotwórczego. Ze względu na waŝną rolę w mechanizmach regulujących apoptozę rodzina białek IAP i ich antagoniści mogą być kluczowym elementem w procesie karcinogenezy. Wyniki dotychczasowych badań (głównie w OBS i PBL) sugerują takŝe istotne znaczenie prognostyczne tej grupy białek. Co więcej, biorąc pod uwagę zaburzenia ekspresji IAP i ich antagonistów w róŝnych typach nowotworów białka te mogą stać się celem dla wybiórczej terapii biologicznej. Podsumowując, kompleksowe badania nad rolą białek IAP oraz ich inhibitorów w chorobach nowotworowych wydają się w najwyŝszym stopniu uzasadnione. Praca została zrealizowana w ramach projektu badawczego KBN N N (Nr ). PIŚMIENNICTWO 1. Huang QH, Deveraux QL, Madea S. Evolutionary conservation of apoptosis mechanisms: lepidopteran and baculoviral inhibitor of apoptosis proteins are inhibitors of mammalian caspase-9. Proc Natl Acad Sci USA. 2000; 97: Yang Y, Fang S, Jensen JP, Weissman AM, Ashwell JD. Ubiquitin protein ligase activity of IAPs and their degradation in proteasomes in response to apoptotic stimuli. Science. 2000; 288: Grossman D, McNiff JM, Li F, Altieri DC. Expression of the apoptosis inhibitor, survivin, in nonmelanoma skin cancer and gene targeting in a keratinocyte cell line. Lab Invest. 1999; 79: Irmler M, Thome M, Hahne M i wsp. Deadly encounter: ubiquitin meets apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 2002; 3: Schimmer AD. Inhibitor of apoptosis proteins: translating basic knowledge into clinical practice. Cancer Res. 2004; 64: Duckett CS, Nava VE, Gedrich RW i wsp. A conserved family of cellular genes related to the baculovirus iap gene and encoding apoptosis inhibitors. EMBO J ; 15: Huang Y, Park YC, Rich RL, Segal D, Myszka DG, Wu H. Structural basis of caspase inhibition by XIAP: differential roles of the linker versus the BIR domain. Cell. 2001; 104: Du C, Fang M, Li Y, Wnag X. Smac, a mitochondrial protein that promotes cytochrom c dependent caspase activation during apoptosis. Cell. 2000; 102: Shiozaki EN, Chai J, Rigotti DJ i wsp. Mechanism of XIAP-mediated inhibition of caspase-9. Mol Cell. 2003; 11: Sanna MG, da Silva Correia J i wsp. IAP suppression of apoptosis involves distinct mechanisms: the TAK1/JNK1 signaling cascade and caspase inhibition. Mol Cell Biol. 2002; 22: Kairisalo M, Korhonen L, Blomgren K, Lindholm D. X-linked inhibitor of apoptosis protein increases mitochondrial antioxidants through NF-κB activation. Bioch Bioph Res Comm. 2007; 364: Wang CY, Mayo MW, Korneluk RG, Goeddel DV, Baldwin AS Jr. NF-kappaB antiapoptosis: induction of TRAF1 and TRAF2 and c-iap1 and c-iap2 to suppress caspase-8 activation. Science. 1998; 281:

17 Białka inhibitorowe apoptozy Chu ZL, McKinsey TA, Liu, Gentry JJ, Malim MH, Ballard DW. Suppression of tumor necrosis factor-induced cell death by inhibitor of apoptosis c-iap2 is under NF-kappaB control. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1997; 9: Choi J, Hwang YK, Sung KW. i wsp. Expression of Livin, an antiapoptotic protein, is an independent favorable prognostic factor in childhood acute lymphoblastic leukemia. Blood. 2007; 109: Kasof GM, Gomes BC. Livin, a novel inhibitor of apoptosis protein family member. J Biol Chem. 2001; 276: Richter BW, Mir SS, Eiben LJ. i wsp. Molecular cloning of ILP-2, a novel member of the inhibitor of apoptosis protein family. Mol Cell Biol. 2001; 21: Shin H, Renatus M, Eckelman BP. i wsp. The BIR domain of IAP-like protein 2 is conformationally unstable: implications for caspase inhibition. Biochem J. 2005; 385: Roy N, Mahadevan MS, McLean M. i wsp. The gene for neuronal apoptosis inhibitory protein is partially deleted in individuals with spinal muscular atrophy.cell Jan 13; 80(1): Liston P, Roy N, Tamai K. i wsp. Suppression of apoptosis in mammalian cells by NAIP and a related family of IAP genes. Nature. 1996; 379: Martin SJ. An Apollon vista of death and destruction. Nature Cell Biol. 2004; 6: Ambrosini G, Adida C, Altieri DC.A novel anti-apoptosis gene, survivin, expressed in cancer and lymphoma. Nat Med. 1997; 3: Li F, Ambrosini G, Chu EY i wsp. Control of apoptosis and mitotic spindle checkpoint by survivin. Nature. 1998; 396: Shi Y. Survivin structure: crystal unclear. Nat Struct Biol. 2000; 7: Marusawa H, Matsuzawa S, Welsh K i wsp. HBXIP functions as a cofactor of survivin in apoptosis suppression. EMBO J. 2003; 22: Fukuda S, Mantel CR, Pelus LM. Survivin regulates hematopoietic progenitor cell proliferation through p21waf1/cip1-dependent and -independent pathways. Blood. 2004; 103: Zhao J, Tenev T, Martins LM, Downward J, Lemoine NR. The ubiquitin-proteasome pathway regulates survivin degradation in a cell cycle-dependent manner. J Cell Sci. 2000; 113: Liu T, Brouha B, Grossman D. Rapid induction of mitochondrial events and caspase-independent apoptosis in Survivin-targeted melanoma cells. Oncogene. 2004; 23: Suzuki A, Hayashida M, Ito T i wsp. Survivin initiates cell cycle entry by the competitive interaction with Cdk4/p16(INK4a) and Cdk2/cyclin E complex activation. Oncogene. 2000; 19: Skoufias DA, Mollinari C, Lacroix FB, Margolis RL. Human survivin is a kinetochore-associated passenger protein. J Cell Biol. 2000; 151: Rupniewska Z, Koczkodaj D, Wąsik-Szczepanek E. Biologia surwiwiny (Część I). Acta Haematol Pol. 2005; 36: Gianani R, Jarboe E, Orlicky D i wsp. Expression of survivin in normal, hyperplastic, and neoplastic colonic mucosa. Hum Pathol. 2001; 32: Hauser HP, Bardroff M, Pyrowolakis G, Jentsch S. A giant ubiquitin-conjugating enzyme related to IAP apoptosis inhibitors. J Cell Biol. 1998; 141: Bratke T, Pohl C, Pyrowolakis G, Jentsch S. Dual role of BRUCE as an antiapoptotic IAP and a chimeric E2/E3 ubiquitin ligase. Mol Cell. 2004; 14: Qiu XB, Goldberg AL. The membrane-associated inhibitor of apoptosis protein, BRUCE/Apollon, antagonizes both the precursor and mature forms of Smac and caspase-9. J Biol Chem. 2005; 280: Sekine K, Hao Y, Suzuki Y, Takahashi R, Tsuruo T, Naito M. HtrA2 cleaves Apollon and induces cell death by IAP-binding motif in Apollon-deficient cells. Biochem Biophys Res Commun. 2005; 330:

18 610 O. GRZYBOWSKA-IZYDORCZYK i wsp. 36. Verhagen AM, Ekert PG, Pakusch M i wsp. Identification of DIABLO, a mammalian protein that promotes apoptosis by binding to and antagonizing IAP proteins. Cell. 2000; 102: Srinivasula SM, Hegde R, Saleh A i wsp. A conserved XIAP-interaction motif in caspase-9 and Smac/DIABLO regulates caspase activity and apoptosis. Nature. 2001; 410: Jia L, Patwari Y, Kelsey SM i wsp. Role of Smac in human leukaemic cell apoptosis and proliferation. Oncogene. 2003; 22: Verhagen AM, Vaux DL. Cell death regulation by the mammalian IAP antagonist Diablo/Smac.Apoptosis. 2002; 7: Guo F, Nimmanapalli R, Paranawithana S i wsp. Ectopic overexpression of second mitochondriaderived activator of caspases (Smac/DIABLO) or cotreatment with N-terminus of Smac/DIABLO peptide potentiates epothilone B derivative-(bms ) and Apo-2L/TRAIL-induced apoptosis. Blood. 2002; 99: Yang QH, Du C. Smac/DIABLO selectively reduces the levels of c-iap1 and c-iap2 but not that of XIAP and livin in HeLa cells. J Biol Chem. 2004; 279: Fu J, Jin J, Arend LJ. Smac3, a novel Smac/DIABLO splicing variant, attenuates the stability and apoptosis-inhibiting activity of X-linked inhibitor of apoptosis protein. J Biol Chem. 2003; 278: Roberts DL, Merrison W, MacFarlane M, Cohen GM. The inhibitor of apoptosis protein-binding domain of Smac is not essential for its proapoptotic activity. J Cell Biol. 2001; 153: Yoo NJ, Kim HS, Kim SY I wsp. Immunohistochemical analysis of Smac/DIABLO expression in human carcinomas and sarcomas. APMIS. 2003; 111: Hegde R, Srinivasula SM, Zhang Z, Wassell R, Mukattash R, Alnemri ES. Identification of Omi/HtrA2 as a mitochondrial apoptotic serine protease that disrupts inhibitor of apoptosis proteincaspase interaction. J Biol Chem. 2002; 277: Suzuki Y, Takahashi-Niki K, Akagi T, Hashikawa T, Takahashi R. Mitochondrial protease Omi/HtrA2 enhances caspase activation through multiple pathways. Cell Death Differ. 2004; 11: Straszewski-Chavez SL, Visintin IP, Karassina N i wsp. XAF1 mediates tumor necrosis factor-alphainduced apoptosis and X-linked inhibitor of apoptosis cleavage by acting through the mitochondrial pathway. J Biol Chem. 2007; 282: Arora V, Cheung HH, Plenchette S, Micali OC, Liston P, Korneluk RG. Degradation of survivin by the X-linked inhibitor of apoptosis (XIAP)-XAF1 complex. J Biol Chem. 2007; 282: Tamm I, Kornblau SM, Segall H i wsp. Expression and prognostic significance of IAP-family genes in human cancers and myeloid leukemias. Clin. Cancer Res. 2000; 6: Yamamoto K, Abe S, Nakagawa Y i wsp. Expression of IAP family proteins in myelodysplastic syndromes transforming to overt leukemia. Leuk. Res. 2004; 28: Badran A, Yoshida A, Wano Y i wsp. Expression of the anti-apoptotic gene survivin in myelodysplastic syndrome. Int. J. Oncol. 2003; 22: Badran A, Yoshida A, Wano Y i wsp. Expression of the antiapoptotic gene survivin in chronic myeloid leukemia. Anticancer Res. 2003; 23: Akyurek N, Ren Y, Rassidakis GZ, Schlette EJ, Medeiros LJ. Expression of inhibitor of apoptosis proteins in B-cell non-hodgkin and Hodgkin lymphomas. Cancer. 2006; 107: Nakagawa Y, Yamaguchi S, Hasegawa M i wsp. Differential expression of survivin in bone marrow cells from patients with acute lymphocytic leukemia and chronic lymphocytic leukemia. Leuk. Res, 2004; 28: Adida C, Haioun C, Gaulard P i wsp. Prognostic significance of survivin expression in diffuse large B-cell lymphomas. Blood. 2000; 96:

19 Białka inhibitorowe apoptozy Schlette EJ, Medeiros J, Goy A, Lai R., Rassidakis Z. Survivin expression predicts poorer prognosis in anaplastic large-cell lymphoma. Clin. Oncol. J. 2004; 22: Yie SM, Lou B, Ye SR. i wsp. Detection of survivin-expressing circulating cancer cells (CCCs) in peripheral blood of patients with gastric and colorectal cancer reveals high risks of relapse. Ann Surg Oncol. 2008; 15: Wang TT, Qian XP, Liu BR. Survivin: potential role in diagnosis, prognosis and targeted therapy of gastric cancer. World J Gastroenterol. 2007; 13: Bhanot U, Heydrich R, Möller P, Hasel C. Survivin expression in pancreatic intraepithelial neoplasia (PanIN): steady increase along the developmental stages of pancreatic ductal adenocarcinoma. Am J Surg Pathol. 2006; 30(6): Ye CP, Qiu CZ, Huang ZX, Su QC, Zhuang W, Wu RL, Li XF.Relationship between survivin expression and recurrence, and prognosis in hepatocellular carcinoma.world J Gastroenterol. 2007; 13: Nassar A, Sexton D, Cotsonis G, Cohen C. Survivin expression in breast carcinoma: correlation with apoptosis and prognosis. Appl Immunohistochem Mol Morphol. 2008; 16: Hofmann HS, Simm A, Hammer A, Silber RE, Bartling B. Expression of inhibitors of apoptosis (IAP) proteins in non-small cell human lung cancer. Cancer Res Clin Oncol. 2002; 128: Kempkensteffen C, Hinz S, Christoph F. i wsp. Expression parameters of the inhibitors of apoptosis ciap1 and ciap2 in renal cell carcinomas and their prognostic relevance. Int J Cancer. 2007; 120: Haferkamp A, Bedke J, Vetter C. i wsp. High nuclear Livin expression is a favourable prognostic indicator in renal cell carcinoma. BJU Int. 2008; 102: Troeger A, Siepermann M, Escherich G i wsp. Survivin and its prognostic significance in pediatric acute B-cell precursor lymphoblastic leukemia. Hematol. J. 2007; 98: Abe S, Yamamoto K, Hasegawa M. i wsp. Bone marrow cells of myelodysplastic syndromes exhibit significant expression of apollon, livin and ILP-2 with reduction after transformation to overt leukemia. Leuk Res. 2005; 29: Kawasaki H, Altieri DC, Lu CD, Toyoda M, Tenjo T, Tanigawa N. Inhibition of apoptosis by survivin predicts shorter survival rates in colorectal cancer.cancer Res. 1998; 58: de Graaf AO, van Krieken JH, Tonnissen E. I wsp. Expression of C-IAP1, C-IAP2 and SURVIVIN discriminates different types of lymphoid malignancies. Br. J. Haematol., 2005; 130: Schliep S, Decker T, Schneller F, Wagner H, Hacker G. Functional evaluation of the role of inhibitor of apoptosis proteins in chronic lymphocytic leukemia. Exp. Hematol. 2004; 32: Ren Y, Akyurek N, Schlette E, Rassidakis GZ, Medeiros LJ. Expression of Smac/DIABLO in B-cell non-hodgkin and Hodgkin lymphomas. Hum Pathol. 2006; 37: Grzybowska-Izydorczyk O, Cebula B, Robak T, Smolewski P. Expression and prognostic significance of apoptosis protein (IAPs) family and its antagonists in chronic lymphocytic leukemia. Blood (ASH Annual Meeting Abstracts) 2008; 112: Abstract Fulda S. Targeting inhibitor of apoptosis proteins (IAPs) for cancer therapy. Anticancer Agents Med Chem. 2008; 8: Schimmer AD, Dalili S. Targeting the IAP Family of Caspase Inhibitors as an Emerging Therapeutic Strategy. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2005: Tamm I. AEG-35156, an antisense oligonucleotide against X-linked inhibitor of apoptosis for the potential treatment of cancer. Curr Opin Investig Drugs. 2008; 9: LaCasse EC, Cherton-Horvat GG, Hewitt KE. i wsp. Preclinical characterization of AEG35156/GEM 640, a second-generation antisense oligonucleotide targeting X-linked inhibitor of apoptosis. Clin Cancer Res. 2006; 12: