Dr hab. Anna Bębenek Warszawa,

Transkrypt

1 Dr hab. Anna Bębenek Warszawa, Instytut Biochemii i Biofizyki PAN Ul. Pawińskiego 5a Warszawa Recenzja pracy doktorskiej Pana mgr Michała Płachty Pod Tytułem Regulacja funkcjonowania DNA polimerazy eta w cyklu komórkowym Saccharomyces cerevisiae. Replikacja DNA w komórkach eukariotycznych jak i prokariotycznych odbywa się z wysoką wiernością. Na straży tej wysokiej wierności stoją główne polimerazy replikacyjne, ale także polimerazy TLS, których rolą jest replikacja DNA uszkodzonego, zawierającego zmodyfikowane zasady, które stanowią przeszkodę replikacyjną dla głównych polimeraz. W komórkach drożdży Saccharomyces cerevisiae występują tylko trzy polimerazy TLS, dwie z rodziny Y Rad30 odpowiednik ludzkiej polimerazy η oraz polimeraza Rev1, a także polimeraza ζ, która należy do rodziny B. Polimerazy rodziny Y mogą wstawiać właściwe nukleotydy naprzeciwko uszkodzonej matrycy natomiast charakteryzują się niską wiernością replikacji na nieuszkodzonej matrycy DNA, niską procesywnością, niską aktywnością katalityczną oraz nie posiadają aktywności korektorskiej 3-5. Zaobserwowano, że zarówno obniżona jak i podwyższona ekspresja tych polimeraz w komórce może prowadzić do podwyższenia mutagenezy, dlatego też poziom syntezy jak i dostęp polimeraz TLS do widełek replikacyjnych jest ściśle kontrolowany i regulowany w cyklu komórkowym. Celem przedstawionej do recenzji pracy było pokazanie mechanizmów regulacji komórkowego poziomu polimerazy eta w komórkach modelowego organizmu jakim są drożdże S. cerevisiae. Praca doktorska mgr Michała Płachty zawiera typowy dla prac doświadczalnych układ obejmujący Wstęp, Cel, Materiały i Metody, Wyniki, Dyskusję oraz Bibliografię. W pierwszej części wstępu w sposób bardzo przejrzysty opisany został eukariotyczny system tolerancji uszkodzeń DNA (DDT), który umożliwia komórce replikację 1

2 uszkodzonego DNA i pomyślne zakończenie replikacji. W komórkach eukariotycznych istnieją dwa szlaki DDT, bezbłędny oraz szlak mutagenny. Oba te szlaki regulowane są na poziomie modyfikacji czynnika procesywności replikacji białka PCNA i zależą od modyfikacji tego białka poprzez ubikwitynację. Duża część wstępu omawia udział białka Rad6, enzymu koniugującego ubikwitynę, w kontroli stabilności genetycznej komórek eukariotycznych. Białko to pełni w komórce wiele ważnych funkcji. Między innymi pełni ważną rolę w regulacji odpowiedzi komórki na uszkodzenia w DNA. Białko Rad6 tworzy stabilny kompleks z ligazą ubikwityny, białkiem Rad18, który pełni funkcje regulatorowe w odpowiedzi DDT i odpowiada za ubikwitynację PCNA. Do tej pory pokazano, że poza białkiem Rad18, białko Rad6 tworzy kompleksy z innymi ligazami ubikwityny jak Ubr1 i Ubr2 obie ligazy ubikwitynowe zaangażowane są w proces proteasomalnej degradacji białek oraz Bre1, które w kompleksie z Rad6 odpowiada za ubikwitynację histonu H2B. Część wstępu poświęcona jest powiązaniu odpowiedzi komórek na stres replikacyjny i związaną z tym aktywację punktów kontrolnych replikacji, które poprzez kontrolowanie jakości replikowanego DNA wpływają na długość faz cyklu komórkowego. Ostatnia część poświęcona jest omówieniu budowy drożdżowych polimeraz TLS oraz ich rekrutacji do widełek replikacyjnych. Wstęp dobrze wprowadzana w zagadnienia, które są przedmiotem rozprawy doktorskiej. Materiały i Metody zawierają opisy wszystkich metod używanych w trakcie przeprowadzanych badań. Oprócz metod w rozdziale tym zamieszczono spis szczepów drożdżowych używanych w czasie badań oraz spis starterów wykorzystanych zarówno do konstrukcji szczepów jak również stosowanych w ilościowym qrt-pcr. Wyniki. Wcześniejsze prace prowadzone w zespole profesor Ewy Śledziewskiej- Gójskiej pokazały, że poziom ekspresji polimerazy eta jest obniżony w komórkach z delecją genu rad6, co również zostało potwierdzone przez doktoranta. Jednym z celów tej pracy była próba pokazania w jaki sposób białko Rad6 może wpływać na poziom ekspresji polimerazy eta. Poziom białka w komórce może być regulowany na poziomie transkrypcji lub translacji. W związku z tym w pracy w pierwszej kolejności zbadano te dwie ścieżki regulacji. 2

3 Pokazano, że obniżony komórkowy poziom polimerazy eta w mutantach rad6δ nie jest związany z regulacją transkrypcji tego genu. Poziom transkrypcji genu RAD30 badano metodą qrt-pcr. Otrzymane wyniki poziomu mrna transkryptu RAD30 ustalano w relacji do transkryptu β-aktyny (ACT1). Pokazano także, że komórkowy poziom polimerazy eta nie jest regulowany na poziomie translacji. Poziom translacji badany był we frakcji polisomalnej na podstawie analizy zawartości mrna RAD30, które były normalizowane do transkryptów referencyjnych genów aktyny (ACT1) i 18s RNA. Poszukiwania innej ścieżki z udziałem białka Rad6 zostały skierowane na badanie szlaku Rad6-Bre1, który odpowiada za ubikwitynacje histonu H2B. Zaobserwowano, że w mutantach rad6δ za obniżenie komórkowego poziomu Pol eta odpowiada brak ubikwitynacji histonu H2B w pozycji K123. Taką interpretację wyników umożliwiło porównanie komórkowego poziomu polimerazy eta w mutancie Bre1Δ oraz htb1k123a. BRE1 jest jedną z czterech ligaz ubikwitynowych, która tworzy kompleks z Rad6. Kompleks Rad6/Bre1 bierze udział w ubikwitynacji K123 białka histonowego H2B. Innym białkiem, biorącym udział w ubikwitynacji histonu H2B jest białko Lge1, które oddziałuje z kompleksem Rad6/Bre1. Mutanty pozbawione genu LGE1 wykazują fenotyp Large, który charakteryzuje się dużymi niepoczączkującymi komórkami. Fenotyp ten spowodowany jest zahamowaniem progresji cyklu komórkowego w fazie G1 i spowolnionym przejściem do fazy S. W czasie swoich badań doktorant zwrócił uwagę, że część populacji komórek z delecją Rad6 a także Bre1 oraz mutant htb1k123a wykazuje fenotyp Large charakterystyczny dla mutantów pozbawionych genu LGE1. Ta obserwacja pozwoliła zaproponować bardzo ciekawą hipotezę, że synteza polimerazy eta może być regulowana w cyklu komórkowym, wskazując też na rolę Rad6 w kontroli cyklu komórkowego. Obserwacja, że w mutantach Rad6 synteza polimerazy eta może być regulowana w cyklu komórkowym skłoniła doktoranta do zbadania czy poziom Pol eta ulega zmianie w różnych fazach cyklu komórkowego. Przed przystąpieniem do badania poziomu polimerazy eta w cyklu komórkowym opracowano metodę oznaczania poziomu natywnej drożdżowej polimerazy eta i określono czas półtrwania dla tego enzymu. Wcześniejsze badania opierano na badaniu poziomu i czasu półtrwania 3

4 polimerazy eta ze znacznikiem TAP na C-końcu. Obecność tego znacznika wpływała na stabilność polimerazy eta. Poziom ekspresji polimerazy eta badano w synchronizowanych w fazie G1 hodowlach drożdżowych monitorując progresję cyklu komórkowego poprzez pomiar zawartości DNA za pomocą analizy FACS w odpowiednich punktach czasowych. Poziom polimerazy eta badano z użyciem przeciwciał anty-rad30. Zaobserwowano, że poziom ekspresji polimerazy eta kumuluje się w miarę progresji cyklu komórkowego i osiąga maximum na granicy faz G2/M. W celu określenia czy zmiany poziomu polimerazy eta zależą od poziomu ekspresji genu RAD30 określono poziom mrna RAD30 w różnych etapach cyklu komórkowego. Analiza RT-qPCR nie wykazała istotnych różnic w poziomie mrna RAD30 w komórkach znajdujących się w fazie G1, S czy G2 oraz w komórkach zatrzymanych w fazie G2/M. Wyniki te wskazywały, że regulacja poziomu polimerazy eta odbywa się na poziomie posttraskrypcyjnym. Dla potwierdzenia, że regulacja odbywa się na etapie posttraskrypcyjnym przeprowadzono dodatkowo analizę stabilności polimerazy eta w cyklu komórkowym. Określano czas półtrwania polimerazy w poszczególnych etapach cyklu komórkowego. Najniższy czas półtrwania zaobserwowano w fazie G1. W fazie S widoczny był wzrost stabilizacji i stabilizacja ta wzrastała w późnej fazie cyklu, utrzymując się na wysokim poziomie w fazie G2/M. Pokazano także, że za poziom stabilności Pol eta odpowiada degradacja proteosomalna. W komórkach naświetlanych UV nie zaobserwowano różnic w stabilności polimerazy w fazach G1 i S. W fazie G2 stabilność polimerazy była niższa aniżeli w komórkach nienaświetlanych. Dyskusja jest krótka ale w sposób bardzo przystępny poddaje analizie otrzymane wyniki. Nawiązując do Dyskusji chciałabym żeby Pan rozwinął bardziej tezę dlaczego uważa Pan, że procesy reperacji uszkodzeń indukowanych UV nie preferują Pol eta w naprawie DNA w fazie G2? Inne Uwagi. Rysunek 15.Zdjęcia przedstawiające wyniki analizy western blot poziomu Pol eta w szczepach mutantów pozbawionych aktywności ligaz 4

5 ubikwitynowych zależnych od Rad 6. Ostania ścieżka pokazuje oddziaływania Rad6 z mutantami bre1δ i htb1δ. W tym ostatnim chyba chodziło o pokazanie, że brak modyfikacji lizyny w pozycji K123 w mutancie htb1k123a w takim samym stopniu obniża poziom ety w komórce jak brak odpowiedniej ligazy ubikwitynowej Bre1. Zakładam, że jest to pomyłka w podpisie pod rysunkiem. W pracy pojawiły się też nieliczne błędy językowe, czy niewłaściwe nazewnictwo, ale w żaden sposób nie wpływają one na ogólne dobre wrażenie całej rozprawy. Uważam, że otrzymane przez mgr Michała Płachtę wyniki są bardzo ciekawe, wnoszą duży wkład w poznanie mechanizmów regulacji syntezy polimerazy eta, kluczowej dla replikacji uszkodzonego DNA w komórkach. Na pokreślenie zasługuje także opracowanie metody oznaczania natywnej polimerazy eta w komórkach drożdży i ustalenie czasu półtrwania dla tej polimerazy. W podsumowaniu stwierdzam, że praca doktorska Pana mgr Michała Płachty spełnia wszystkie wymogi stawiane pracom doktorskim określone w ustawie o tytule i stopniach naukowych. W związku z powyższym wnoszę do Rady Naukowej Instytutu Biochemii i Biofizyki Polskiej Akademii Nauk o dopuszczenie Pana mgr Michała Płachty do dalszych etapów przewodu doktorskiego. Biorąc pod uwagę wysoką ocenę rozprawy i opracowanie nowatorskiej metody oznaczania natywnej polimerazy eta w komórkach drożdży wnoszę o przyznanie tej pracy wyróżnienia. Dr hab. Anna Bębenek 5