Dr n. med. Magdalena Zawada

Transkrypt

1 Dr n. med. Magdalena Zawada Szpital Uniwersytecki w Krakowie Zakład Diagnostyki Hematologicznej

2 Nowotwory układu krwiotwórczego według klasyfikacji Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) 1. Nowotwory mieloproliferacyjne (MPN) 1.1. Przewlekła białaczka szpikowa BCR-ABL dodatnia(cml) 1.2. Czerwienica prawdziwa (PV) 1.3. Nadpłytkowość samoistna (ET) 1.4. Pierwotna mielofibroza (PMF) 1.5. Przewlekła białaczka neutrofilowa (CNL) 1.6. Przewlekła białaczka ezozynofilowa niesklasyfikowana(cel-noc) 1.7. Zespół hipereozynofilowy (HES) 1.8. Mastocytoza (MCD) 1.9. MPN niesklasyfikowane 2. Nowotwory mieloidalne lub limfoidalne z eozynofilią i nieprawidłowościami PDGFRA, PDGFRB i FGFR1 3. Nowotwory mielodysplastyczno-mieloproliferacyjne MDS/MPN 4. Zespoły mielodysplastyczne (MDS) 5. Ostra białaczka szpikowa z powtarzalnymi nieprawidłowościami genetycznymi (AML) 6. Ostra białaczka szpikowa 7. Ostre białaczki o nieokreślonym pochodzeniu liniowym 8. B komórkowa białaczka limfoblastyczna/chłoniak 9. T komórkowa białaczka limfoblastyczna/chłoniak James W. Vardiman Blood, 2009

3 Najczęstsze aberracje molekularne występujące w schorzeniach hematologicznych u osób dorosłych Znaczenie wykrycia zaburzenia na poziomie molekularnym: ustalenie jednostki chorobowej potwierdzenie wstępnego rozpoznania określenie profilu ryzyka Zawada M et al. Acta Haematologica Polonica 2011

4 Nowotwory układu krwiotwórczego według klasyfikacji Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) 1. Nowotwory mieloproliferacyjne (MPN) 1.1. Przewlekła białaczka szpikowa BCR-ABL dodatnia (CML) 1.2. Czerwienica prawdziwa (PV) 1.3. Nadpłytkowość samoistna (ET) 1.4. Pierwotna mielofibroza (PMF) 1.5. Przewlekła białaczka neutrofilowa (CNL) 1.6. Przewlekła białaczka ezozynofilowa niesklasyfikowana (CEL-NOC) 1.7. Zespół hipereozynofilowy (HES) 1.8. Mastocytoza (MCD) 1.9. MPN niesklasyfikowane 2. Nowotwory mieloidalne lub limfoidalne z eozynofilią i nieprawidłowościami PDGFRA, PDGFRB i FGFR1 3. Nowotwory mielodysplastyczno-mieloproliferacyjne MDS/MPN 4. Zespoły mielodysplastyczne (MDS) 5. Ostra białaczka szpikowa z powtarzalnymi nieprawidłowościami genetycznymi (AML) 6. Ostra białaczka szpikowa 7. Ostre białaczki o nieokreślonym pochodzeniu liniowym 8. B komórkowa białaczka limfoblastyczna/chłoniak 9. T komórkowa białaczka limfoblastyczna/chłoniak James W. Vardiman Blood, 2009

5 Przewlekła białaczka szpikowa (CML Chronic Myeloid Leukemia): wynik mutacji hematopoetycznych komórek macierzystych szpiku kostnego stanowi ok. 15% wszystkich białaczek występuje we wszystkich grupach wiekowych (najczęściej u osób pomiędzy 55 a 60 rokiem życia) częstość występowania 1-1,5: osób rocznie Klinicznie CML charakteryzuje się trójfazowym przebiegiem: Faza przewlekła Faza akceleracji Faza kryzy blastycznej

6 U chorych na przewlekłą białaczkę szpikową występuje charakterystyczna anomalia chromosomowa: tzw. chromosom Philadelphia (Ph). Powstaje on w wyniku wzajemnej translokacji pomiędzy długimi ramionami chromosomu 9 oraz 22 Molekularnym odpowiednikiem chromosomu Ph jest gen fuzyjny BCR-ABL. Jego podwyższona ekspresja prowadzi do niekontrolowanej proliferacji komórek hematopoetycznych oraz zahamowania procesu apoptozy i różnicowania

7 e1a2 (521) b2a2 (342) RT-PCR Multipleks b2a3 b3a2 (168) (417) RT-PCR gniazdowy (nested)

8 Faza plateau Przyrost wykładniczy Linia odcięcia Fluorescencja tła Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction Real-time Q-PCR RQ-PCR ilościowa PCR PCR w czasie rzeczywistym

9 Problem mutacji w domenie ABL genu BCR-ABL

10 Nadekspresja genu BCR-ABL ze względu na zwiększoną amplifikację genu Nabycie lub wyselekcjonowanie specyficznej mutacji punktowej wewnątrz ważnego regionu domeny kinazowej ABL Nadekspresja genów należących do rodziny transporterów ABC (ABCB1, ABCG2, ABCC1) i hoct1

11 aa włączone a.a bezpośrednio a.a. bliskie domeny a.a. kontrolujące w wiązanie kontaktujące się z katalitycznej aktywację/ reszt fosoranowych Imatinibem przez inaktywację kinazy wiązania wodorowe lub van deer Waalsa

12

13 RQ-PCR, jeżeli poziom ekspresji genu BCR-ABL nie ulega zmianie i utrzymuje się na poziomie wskazującym na brak CCyR lub utrata MolR to test na obecność mutacji w genie ABL Sekwencjonowanie określenie typu mutacji

14 T315I

15 T315I

16 System GeneXpert w codziennej praktyce laboratoryjnej krótki czas przygotowania próbki i oczekiwania na wynik zintegrowany system zamknięty ujednolicona metodyka niskie ryzyko kontaminacji wynik w skali międzynarodowej [IS] certyfikat IVD wykrywa tylko typowe BCR-ABL brak możliwości stosowania testu w chwili diagnozy

17 Nowotwory układu krwiotwórczego według klasyfikacji Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) 1. Nowotwory mieloproliferacyjne (MPN) 1.1. Przewlekła białaczka szpikowa BCR-ABL dodatnia (CML) 1.2. Czerwienica prawdziwa (PV) 1.3. Nadpłytkowość samoistna (ET) 1.4. Pierwotna mielofibroza (PMF) 1.5. Przewlekła białaczka neutrofilowa (CNL) 1.6. Przewlekła białaczka ezozynofilowa niesklasyfikowana (CEL-NOC) 1.7. Zespół hipereozynofilowy (HES) 1.8. Mastocytoza (MCD) 1.9. MPN niesklasyfikowane 2. Nowotwory mieloidalne lub limfoidalne z eozynofilią i nieprawidłowościami PDGFRA, PDGFRB i FGFR1 3. Nowotwory mielodysplastyczno-mieloproliferacyjne MDS/MPN 4. Zespoły mielodysplastyczne (MDS) 5. Ostra białaczka szpikowa z powtarzalnymi nieprawidłowościami genetycznymi (AML) 6. Ostra białaczka szpikowa 7. Ostre białaczki o nieokreślonym pochodzeniu liniowym 8. B komórkowa białaczka limfoblastyczna/chłoniak 9. T komórkowa białaczka limfoblastyczna/chłoniak James W. Vardiman Blood, 2009

18 Ostra białaczka szpikowa (Acute Myeloid Leukemia) jest chorobą silnie zróżnicowaną ze względu na podtypy cytogenetyczne uzupełnione o obecność aberracji molekularnych Good risk korzystne zmiany cytogenetyczne t(15;17) t (8;21) inv/del 16 Intermediate risk Prawidłowy kariotyp, inne zmiany Poor risk niekorzystne zmiany cytogenetyczne 11q23, del 5/5q-, del 7/7q+, translokacja of 3q, kariotyp złożony

19 Standard diagnostyczny AML wg Schiller GJ FISH dla typowych nieprawidłowości: t(8;21) RUNX1-RUNX1T1 (AML1-ETO); inv(16) lub t(16;16); CBFB-MYH11; t(15;17) PML-RAR; t(9;11) MLLT3-MLL; inv(3) lub t(3;3) RPN1-EVI1 Testy molekularne w kierunku: FLT3, NPM-1, Kit, CEBP CCAAT/enhancer binding protein alpha Potencjalnie użyteczne: Testy molekularne w kierunku: DNMT3a, TET2, MLL, IDH1, i/lub IDH2 Schiller GJ, Hematology 2013

20 Standard diagnostyczny AML - aktualnie w Polsce Badania molekularne dla typowych nieprawidłowości: t(8;21) RUNX1-RUNX1T1 (AML1-ETO); inv(16) lub t(16;16); CBFB-MYH11; t(15;17) PML-RAR; MLL-PTD; EVI1 Testy molekularne w kierunku: FLT3, NPM-1, Kit, CEBP CCAAT/enhancer binding protein alpha Potencjalnie użyteczne: Testy molekularne w kierunku: DNMT3a, TET2, MLL, IDH1, i/lub IDH2 Schiller GJ, Hematology 2013

21 Stratyfikacja ryzyka Flt3 ITD wyraźnie koreluje ze złą prognozą Alternatywnie, pojedyncze mutacje w genie NPM1 (nucleophosmin1 gene) (najczęstsza mutacja identyfikowana w AML o prawidłowym kariotypie) jest związana z korzystnym rokowaniem Analiza co najmniej NPM1 i FLT3 ma wystarczające znaczenie w ocenie ryzyka Badania te są niezbędne dla wszystkich chorych na AML w momencie diagnozy Schiller GJ, Hematology 2013

22 Stratyfikacja ryzyka inne markery molekularne Mutacja w genie CEBP (CCAAT/enhancer binding protein alpha) świadczy o korzystnej prognozie w przypadku braku niekorzystnych zmian Mutacje w genach IDH1 (białko cyklu Krebsa) i IDH2 (białko mitochondrialne) identyfikowanych u ok. 20% pacjentów z prawidłowym kariotypem świadczą o złej prognozie Mutacja w onkogenie TET2 (najczęściej stwierdzana w momencie progresji zespołów mielodysplastycznych lub mieloproliferacyjnych do AML) koreluje z krótszym przeżyciem Mutacja w genie RUNX jest niezależnym czynnikiem prognostycznym korelującym z krótszym przeżyciem

23

24 Analizy aberracji genetycznych w oparciu o RNA I II 395 bp 260 bp RUNX1-RUNX1T1 (dawniej AML-ETO) 381 bp 289 bp PML-RAR Bcr 1, 2, bp 376 bp 418 bp 271 bp CBF -MYH11 Odmiana A Pozostałe: D-H

25 Zastosowanie terapii celowanej w ostrych białaczkach Leczenie AML z charakterystycznymi zmianami cytogenetycznomolekularnymi może być uzupełnione o leczenie celowane ukierunkowane na konkretną aberrację genetyczną. W badaniach klinicznych AML z mutacją FLT3-ITD (30% OBS) wykorzystuje się inhibitory kinazy Flt3 np. Lestaurtinib, Midostaurin czy Sunitynib. Nie mają one jednak zadowalającej skuteczności w monoterapii, jednak jako dodatek do chemioterapii pozwalają na znaczne zwiększenie jej skuteczności.

26 Nowotwory układu krwiotwórczego według klasyfikacji Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) 1. Nowotwory mieloproliferacyjne (MPN) 1.1. Przewlekła białaczka szpikowa BCR-ABL dodatnia(cml) 1.2. Czerwienica prawdziwa (PV) 1.3. Nadpłytkowość samoistna (ET) 1.4. Pierwotna mielofibroza (PMF) 1.5. Przewlekła białaczka neutrofilowa (CNL) 1.6. Przewlekła białaczka ezozynofilowa niesklasyfikowana(cel-noc) 1.7. Zespół hipereozynofilowy (HES) 1.8. Mastocytoza (MCD) 1.9. MPN niesklasyfikowane 2. Nowotwory mieloidalne lub limfoidalne z eozynofilią i nieprawidłowościami PDGFRA, PDGFRB i FGFR1 3. Nowotwory mielodysplastyczno-mieloproliferacyjne MDS/MPN 4. Zespoły mielodysplastyczne (MDS) 5. Ostra białaczka szpikowa z powtarzalnymi nieprawidłowościami genetycznymi (AML) 6. Ostra białaczka szpikowa 7. Ostre białaczki o nieokreślonym pochodzeniu liniowym 8. B komórkowa białaczka limfoblastyczna/chłoniak 9. T komórkowa białaczka limfoblastyczna/chłoniak James W. Vardiman Blood, 2009

27 Ostra białaczka limfoblastyczna (Acute Lymphoblastic Leukemia) jest schorzeniem często występującym u chorych przed 30 rokiem życia i stanowi 20% wszystkich ostrych białaczek u ok. 30% chorych na ALL występuje gen fuzyjny BCR-ABL. Stanowi on wysoce niekorzystny czynnik rokowniczy, jednak daje możliwość monitorowania choroby resztkowej (MRD Minimal Residual Disease)

28 ALL - inne markery molekularne Aberracja E2A-PBX1 odpowiada translokacji t(1;19). Koreluje z obecnością znanych niekorzystnych czynników klasyfikujących pacjentów do grupy wysokiego ryzyka, takich jak: podwyższona liczba leukocytów, wysoki poziom LDH i zajęcie centralnego systemu nerwowego Gen fuzyjny TCRD-TAL1 jest następstwem pojawienia się translokacji t(1;14). Występuje u około 16% dorosłych z T-ALL. Nie określono jednoznacznie wartości prognostycznej tego czynnika jak i możliwości jego wykorzystania do monitorowania choroby resztkowej van Dongen J, Leukemia 1999

29 ALL - inne markery molekularne Gen fuzyjny TEL-AML1 (znany również jako ETV6/RUNX1 lub ETV6-CBFA2) jest dobrym czynnikiem prognostycznym i wiąże się z opóźnieniem nawrotu choroby CALM-AF10 koreluje z translokacją t(10;11). Znaczenie prognostyczne tego czynnika zależy od stadium rozwoju białaczki. Jest to dobry czynnik prognostyczny w przypadku T- ALL wywodzącej się z limfocytów T dojrzałych o zrearanżowanych receptorach Tδγ, natomiast jego ekspresja w ALL wywodzącej się niedojrzałych komórek T, w których nie doszło do rearanżacji receptorów TCRδγ jest niekorzystnym czynnikiem rokowniczym. Obecne standardy międzynarodowe prezentowane przez WHO wymagają oznaczania powyższych markerów w grupie chorych na ALL Wrzesień-Kuś A i wsp, Ann Hematol Pais AP i wsp, Pediatr Hematol Oncol. 2008