Gdański Uniwersytet Medyczny Wydział Lekarski. Udział mikrorna w procesie starzenia się ludzkich limfocytów T. Joanna Frąckowiak

Transkrypt

1 Gdański Uniwersytet Medyczny Wydział Lekarski Udział mikrorna w procesie starzenia się ludzkich limfocytów T Joanna Frąckowiak Rozprawa doktorska Praca wykonana w Katedrze i Zakładzie Fizjopatologii Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego Promotor: prof. dr hab. Jacek M. Witkowski Promotor pomocniczy: dr hab. Katarzyna Lisowska Gdańsk, 2018

2 STRESZCZENIE Starzeniu organizmu ludzkiego towarzyszy pogorszenie funkcji układu immunologicznego, co przyczynia się do większej podatności na infekcje. Prowadzi to do akumulacji chorób w podeszłym wieku, obniżenia skuteczności szczepień, a także przyczynia się do wzrostu podatności na nowotwory i zwiększa śmiertelność starszej populacji. Jednak w populacji osób starszych wyróżnia się niewielki procent osób dożywających wieku powyżej 95 lat, określanych jako stulatkowie. Zaobserwowano, iż jest to grupa wyróżniająca się pomyślnym procesem starzenia, który charakteryzuje się zmniejszonym występowaniem chorób zależnych od starzenia. Z tego względu jest to interesująca grupa dla badań gerontologicznych, ponieważ jest to populacja wyselekcjonowana z grupy osób starszych, charakteryzująca się sprawniejszym układem immunologicznym. Układ immunologiczny regulowany jest przez komórki CD4 +, zwane limfocytami T pomocniczymi, zarówno poprzez wydzielane przez nie cytokiny, jak też dzięki kontaktowi bezpośredniemu. We krwi obwodowej znajdują się 2 główne subpopulacje komórek CD4 + : naiwne i pamięci, które są komórkami spoczynkowymi. Aktywacja komórek naiwnych i pamięci następuje na skutek związania specyficznego antygenu przez ich receptor TCR (ang. T cell receptor). W wyniku aktywacji, komórki CD4 + naiwne i pamięci proliferują dzięki autokrynnej roli interleukiny IL-2 oraz różnicują się do poszczególnych subpopulacji efektorowych. Każda z tych subpopulacji: Th1 (ang. T helper 1), Th2, Th9, Th17, Th22, Tfh (ang. follicular helper), itreg (ang. induced T regulatory) oraz Tr1 (ang. regulatory type 1) produkuje określony profil cytokin (interleukin, IL). U osób starszych zachodzą zmiany które prowadzą do zaburzeń układu immunologicznego. Po pierwsze, wraz z wiekiem zmniejsza się objętość grasicy, w wyniku czego dochodzi do spadku liczby nowych komórek naiwnych. W rezultacie, zwiększa się proporcja komórek pamięci względem naiwnych w krwi osób starszych. Spadek liczby komórek naiwnych skutkuje zmniejszeniem różnorodności cząsteczek TCR w puli limfocytów obwodowych, a więc swoiste rozpoznawanie pełnej puli nowych pojawiających się antygenów jest ograniczone. Jedna z głównych zmian w fenotypie starzejących się limfocytów CD4 + dotyczy obniżania ekspresji cząsteczki kostymulującej CD28 na powierzchni tych komórek, prawdopodobnie związanego ze stanem podwyższonej gotowości prozapalnej (ang. inflamm-aging) a bezpośrednio z działaniem czynnika martwicy nowotworów TNF.

3 Zaburzenia mające miejsce w komórkach CD4 + wraz ze starzeniem wynikają z licznych zaburzeń na poziomie molekularnym: (i) zaburzenia pułapu aktywacji sygnału z TCR, objawiające się nieprawidłową aktywacją limfocytu, (ii) zaburzeń w obrębie różnych ścieżek sygnalizacyjnych, (iii) skrócenia telomerów i stanu senescencji replikacyjnej, (iv) demetylacją DNA, prowadzącej do nadekspresji niektórych genów, (v) krótszym cyklem komórkowym, a dłuższym czasem potrzebnym do pierwszego podziału komórkowego w odpowiedzi na stymulację antygenową. Do zmian obserwowanych wraz ze starzeniem przyczyniają się proteazy cysteinowe zwane kalpainami (µ- i m-kalpaina, tworzące razem ze swoim endogennym inhibitorem, kalpastatyną, system białkowy zwany, ang. calpain-calpastatin system, CCS), które zmieniają aktywność wybranych białek, poprzez ich ograniczoną proteolizę. Kalpainy są obecne w spoczynkowych limfocytach CD4 + i są w nich aktywne, co sugeruje wymaganą ich obecność w celu utrzymywania w komórce stanu gotowości, umożliwiającego szybką aktywację w razie napotkania antygenu. Są także aktywne w stymulowanych limfocytach. Pośredniczą w regulacji proliferacji jak też apoptozy tych i innych komórek. W starzejących się limfocytach CD4 + wykazano zmiany w ilości mrna dla genów CCS, jak również w ilości i aktywności powstających z nich białek, co może przyczyniać się do ich zaburzonych funkcji. Substratami kalpain są liczne czynniki transkrypcyjne, kinazy, fosfatazy, fosfolipazy, kaspazy i białka cytoszkieletu ważne dla funkcji limfocytów CD4 +. W regulacji procesów zachodzących w komórkach CD4 + zaangażowane są także krótkie (około 20-nukleotydowe), dwuniciowe sekwencje RNA niekodujące białek, zwane mikrorna (ang. microrna, mirna). Cząsteczki te biorą udział w wyciszaniu ekspresji genów, poprzez mechanizm zwany interferencją RNA. Odkryto dotychczas 2588 różnych ludzkich mirna, z których wiele ulega ekspresji w komórkach układu immunologicznego. Część z nich można określić mianem immuno-mir, gdyż regulują ważne procesy związane z funkcją tych komórek, takich jak dojrzewanie, aktywację, różnicowanie, proliferację, a także wpływają na ich rozwój i apoptozę. Jak dotychczas niewiele powstało prac, wiążących zmiany ekspresji mirna ze starzeniem różnych komórek układu immunologicznego. Ponieważ wiele białek, kluczowych dla homeostazy i funkcji limfocytów CD4 +, jest modulowanych przez kalpainy (na poziomie aktywności białek) oraz negatywnie regulowanych przez mirna (na poziomie translacji), podjęto próbę odpowiedzi na pytanie czy zmiany ekspresji

4 genów kalpain oraz ich endogennego inhibitora, kalpastatyny, podlegają regulacji przez mirna w spoczynkowych krążących we krwi limfocytów CD4 +. Celem pracy było w związku z tym zbadanie zmian w poziomie ekspresji cząsteczek mirna wraz ze starzeniem, a także w kontekście korzystnego jego wariantu, długowieczności. Ponadto, celem było znalezienie możliwych powiązań pomiędzy wybranymi mirna, a ekspresją systemu CCS. W pracy zbadano łącznie 86 zdrowych ochotników w szerokim zakresie wieku od 24 do 101 lat. Ze względu na brak mężczyzn w grupie osób długowiecznych, wyniki analiz pomiędzy poszczególnymi grupami wiekowymi przedstawiono wyłącznie dla 67 kobiet. Z krwi pobranej od osób badanych izolowano spoczynkowe komórki CD4 + dla których określano pogłębiony fenotyp powierzchni; oceniano także ilość białek CCS metodą cytometryczną. Z czystych populacji spoczynkowych limfocytów CD4 + izolowano RNA, który posłużył do profilowania mirna oraz do ilościowego pomiaru ekspresji wybranych mirna oraz mrna dla poszczególnych genów CCS. Profilowanie wszystkich mirna obecnych w próbkach RNA 20 kobiet przeprowadzono za pomocą sekwencjonowania krótkich niekodujących RNA (ang. small RNA sequencing, srna- Seq). Dla mirna istotnie różnicujących grupy wiekowe uzyskano listę przewidywanych komputerowo genów, możliwie podlegających regulacji przez te mirna. Dla genów tych wykonano analizę ontologiczną, służącą ocenie zaangażowania poszczególnych ich produktów białkowych w różne procesy zachodzące w komórce. Wśród mirna różnicujących grupy wiekowe znaleziono najliczniej występującą w spoczynkowych komórkach CD4 + cząsteczkę mir-150-5p i występującą w znacznie mniejszej ilości cząsteczkę mir-17-3p. Wśród eksperymentalnie potwierdzonych mrna regulowanych przez mir-17-3p jest transkrypt genu dla µ-kalpainy (CAPN1), natomiast dla mir-150-5p jest to mrna dla genu kalpastatyny (CAST). Ilościowy pomiar ekspresji obydwu wybranych mirna a także ekspresji mrna dla CCS (CAPN1, CAPN2 i CAST) wykonano w reakcji PCR w czasie rzeczywistym (qrt-pcr). Otrzymane w wyniku reakcji qrt-pcr dla CCS i mirna wartości Ct (ang. threshold cycle) analizowano za pomocą metody obliczeń ΔΔCt. Analiza srna-seq wykazała bardzo niską ekspresję (średnia liczba odczytów dla 20 badanych kobiet <100) większości dojrzałych mirna zidentyfikowanych w spoczynkowych

5 limfocytach CD4 +. Dla 36 różnych mirna uzyskano > 100 średnich odczytów. Największą liczbę odczytów (8082) uzyskano dla mir-150-5p. Grupa młodych kobiet (24 35-letnia) wyróżniała się największą liczbą odczytów dla wszystkich mirna w komórkach CD4+, natomiast redukcja liczby odczytów z wiekiem nie była prostoliniowa (najmniej odczytów stwierdzono w grupie latek). Wszystkie statystycznie istotne zmiany ilości mirna związane były ze spadkiem ich ekspresji wraz ze starzeniem kobiet. Na podstawie uzyskanych profili ekspresji mirna w 4 grupach wiekowych, nie znaleziono podobieństw pomiędzy grupą młodych kobiet ( letnich), a grupą kobiet długowiecznych (94 97-letnich). Analiza ontologiczna potencjalnych genów ( targetów ) negatywnie regulowanych przez mirna istotnie obniżonych (w srna-seq) u osób starszych wykazała, iż wśród produktów tych genów, najliczniej występują tak ważne białka jak: czynniki transkrypcyjne, białka wiążące kwasy nukleinowe oraz białka modulujące aktywność enzymów. Białka te są istotnie zaangażowane w ważne procesy: apoptozę, różnicowanie komórek, cykl komórkowy, transdukcję sygnału oraz metabolizm, a więc zmiany ichekspresji w konsekwencji zmian działania odpowiednich mirna mogą mieć znaczenie dla starzenia limfocytów. Wykazano także istotne zaangażowanie produktów białkowych tych genów w ważne dla limfocytów CD4 + ścieżki sygnalizacyjne: transformującego czynnika wzrostu beta (TGF-β) oraz białek Ras. Weryfikacja przez qpcr wykazanej wcześniej w srna-seq ekspresji mir-17-3p i mir p, wykazała niezgodny z wynikami srna-seq zależny od wieku istotny wzrost (p=002) ilości mir-17-3p u kobiet długowiecznych w wieku 91 lat, w porównaniu z młodymi ( 40- letnimi). Wykazano stałą ekspresję mir-150-5p pomiędzy grupami kobiet 40-letnich i letnich, natomiast nieistotny statystycznie spadek ekspresji tego mirna u kobiet długowiecznych. Ilościowa ocena poziomu mrna dla CCS za pomocą qpcr wykazała istotny wzrost ilości mrna dla wszystkich genów CCS u kobiet długowiecznych względem młodych, jak również istotny wzrost mrna CAPN2 i CAST u kobiet letnich, względem młodych. Wykazano istotną pozytywną korelację pomiędzy ilością białka kalpastatyny, a mir-150-5p. Ponadto, wykazano istotną negatywną korelację pomiędzy ilością białka kalpastatyny, a mrna CAST. Przedstawione wyniki wskazują, iż sprawniejszy układ immunologiczny osób długowiecznych w porównaniu z pozostałą starszą populacją ludzką może mieć inne podłoże niż regulacja przez mirna, choć wyniki sugerują możliwe znaczenie mir-17-3p dla kobiet

6 długowiecznych. Natomiast mirna może mieć udział w procesie starzenia limfocytów CD4 +. Ponadto, niski poziom ekspresji mrna CAPN1 i mir-17-3p w spoczynkowych komórkach CD4 + kobiet i wzrost ilości obu cząsteczek pod wpływem aktywacji sugeruje wspólną regulację przez nie funkcji efektorowych. Poza tym, jednoczesny wzrost obu może wynikać z pozytywnej regulacji transkrypcji CAPN1 przez mir-17-3p, na drodze przeciwstawnego do RNAi mechanizmu aktywacji RNA (ang. RNA activation).