(12) OPIS PATENTOWY (19) PL

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/EP97/04326 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , W098/05355, PCT Gazette nr 06/98 (11) (13) B1 (5 1) IntCl7 A61K 39/015 A61K 39/002 A61K 39/29 A61K 39/39 A61P 33/06 (54) Kompozycja szczepionki i jej zastosowanie (30) Pierwszeństwo: ,GB, (73) Uprawniony z patentu: SMITHKLINE BEECHAM BIOLOGICALS SA., Rixensart, BE (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 15/99 (72) Twórcy wynalazku: Joseph Cohen, Rixensart, BE (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 04/05 (74) Pełnomocnik: Kossowska Janina, PATPOL Sp. z o.o. PL B1 (57) 1. Kompozycja szczepionki, znamienna tym, że obejmuje przynajmniej dwa antygeny malarii w kombinacji z adiuwantem, który jest wybiórczym stymulatorem reakcji limfocytów TH1, zaś przynajmniej dwa antygeny malarii wybrane są z grupy obejmującej: a. białko hybrydowe obejmujące zasadniczo całość części końca C białka CS, cztery albo więcej powtórzeń tandemowych regionu immunodominującego oraz antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu C (HBsAg); b. TRAP klonowanego izolatu P. falciparum z Tajlandii, znanego jako T/9/96, oraz białka wykazujące przynajmniej 80% homologii z nim, oraz immunogenne pochodne, obejmujące jego fragmenty; c. MSP-1 P. falciparum albo P. vivax oraz białka wykazujące co najmniej 80% homologię z nim, oraz pochodne immunogenne obejmujące jego fragmenty. 2. Kompozycja szczepionki według zastrz. 1, znamienna tym, że adiuwant obejmuje MPL, monofosforylolipid A. 3. Kompozycja szczepionki według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, ze adiuwant obejmuje QS21, oczyszczoną przez HPLC nietoksyczną frakcję otrzymaną z kory Quillaja Saponaria Molina.

2 Kompozycja szczepionki i jej zastosowanie Zastrzeżenia patentowe 1. Kompozycja szczepionki, znamienna tym, że obejmuje przynajmniej dwa antygeny malarii w kombinacji z adiuwantem, który jest wybiórczym stymulatorem reakcji limfocytów TH1, zaś przynajmniej dwa antygeny malarii wybrane są z grupy obejmującej: a. białko hybrydowe obejmujące zasadniczo całość części końca C białka CS, cztery albo więcej powtórzeń tandemowych regionu immunodominującego oraz antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu C (HBsAg); b. TRAP klonowanego izolatu P. falciparum z Tajlandii, znanego jako T/9/96, oraz białka wykazujące przynajmniej 80% homologii z nim, oraz immunogenne pochodne, obejmujące jego fragmenty; c. MSP-1 P. falciparum albo P. vivax oraz białka wykazujące co najmniej 80% homologię z nim, oraz pochodne immunogenne obejmujące jego fragmenty. 2. Kompozycja szczepionki według zastrz. 1, znamienna tym, że adiuwant obejmuje MPL, monofosforylolipid A. 3. Kompozycja szczepionki według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że adiuwant obejmuje QS21, oczyszczoną przez HPLC nietoksyczną frakcję otrzymaną z kory Quillaja Saponaria Molina. 4. Kompozycja szczepionki według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że adiuwant obejmuje emulsję oleju w wodzie. 5. Kompozycja szczepionki według zastrz. 3, znamienna tym, że adiuwant obejmuje emulsję oleju w wodzie. 6. Kompozycja szczepionki według zastrz. 1 albo 2, albo 5, do zastosowania w terapii. 7. Kompozycja szczepionki według zastrz. 3 do zastosowania w terapii. 8. Kompozycja szczepionki według zastrz. 4 do zastosowania w terapii. 9. Zastosowanie kompozycji szczepionki, obejmującej przynajmniej dwa antygeny malarii w kombinacji z adiuwantem, który jest wybiórczym stymulatorem reakcji limfocytów TH1, zaś przynajmniej dwa antygeny malarii wybrane są z grupy obejmującej: a. białko hybrydowe obejmujące zasadniczo całość części końca C białka CS, cztery albo więcej powtórzeń tandemowych regionu immunodominującego oraz antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu C (HBsAg); b. TRAP klonowanego izolatu P. falciparum z Tajlandii, znanego jako T/9/96, oraz białka wykazujące przynajmniej 80% homologii z nim, oraz immunogenne pochodne, obejmujące jego fragmenty; c. MSP-1 P. falciparum albo P. vivax oraz białka wykazujące co najmniej 80% homologię z nim, oraz pochodne immunogenne obejmujące jego fragmenty; do wytwarzania leku do zastosowania w leczeniu i profilaktyce malarii. * * * Przedmiotem wynalazku jest kompozycja szczepionki i jej zastosowanie. W ogólności rozwiązania według wynalazku m ają na celu zapobieganie zakażeniom malarią. Malaria, jest jednym z głównych problemów zdrowotnych świata powodując od 2 do 4 milionów zgonów rocznie. Jedna z najostrzejszych postaci choroby powodowana jest przez pierwotniaka Plasmodium falciparum, który jest odpowiedzialny za większość śmiertelności z powodu malarii. Cykl życiowy P. falciparum jest złożony i wymaga do spełnienia dwóch gospodarzy, człowieka i komara. Zakażenie człowieka rozpoczyna się przez wszczepienie sporozoitów wraz ze śliną zakażonego komara. Sporozoity wędrują do wątroby i zakażają hepatocyty, w których różnicują się, przez pozaerytrocytamy etap wewnątrzkomórkowy, w merozoity,

3 które zakażają erytrocyty (RBC) rozpoczynając cykliczną repłikację w bezpłciowym etapie we krwi. Cykl kończy się przez różnicowanie wielu merozoitów w RBC w gametocyty etapu płciowego, które są pobierane przez komary, w których rozwija się szereg etapów w jelicie z wytworzeniem sporozoitów, które wędrują do gruczołów ślinowych. Etap sporozoitów R fałciparum jest, jak stwierdzono, potencjalnym celem szczepionki przeciwko malarii. Wiadomo, że głównym białkiem powierzchniowym sporozoitu jest białko circumsporozoitu (białko CS). Sklonowano to białko ze szczepu 7G8, wyrażono i sekwencjonowano (Dame i in., Science 225 (1984), str. 593). Białko ze szczepu 7G8 charakteryzuje się centralnym immunodominującym regionem powtórzeń obejmującym tetrapeptyd Asn-Ala- -Asn-Pro powtórzonym 37 razy, ale oddzielonym czterema mniejszymi powtórzeniami Asn- -Val-Asp-Pro. W innych szczepach ilość powtórzeń głównych i mniejszych jak również ich względne położenie jest różne. Ta centralna część otoczona jest przez części końca N i C obejmujące nie powtarzające się sekwencje amino kwasowe oznaczone jako części nie zawierające powtórzeń białka CS. Wykazano, że napromieniowane sporozoity mogą zapewnić istotną ochronę przeciwko doświadczalnej ludzkiej malarii (Am. J. Trop. Med. Hyg. 24: , 1975). Jednakże, trudności z wytworzeniem czynią napromieniowywanie sporozoitów niepraktycznym z punktu widzenia wytwarzania szczepionki. Kilka grup proponowało szczepionki podjednostkowe, oparte na białku circumsporozoitu. Niektóre z tych szczepionek poddano badaniu klinicznemu; jedna z nich jest peptydem syntetycznym, inna zaś szczepionką rekombinowaną (Ballou i in., Lancet 1277 (1987) i Herrington i in., Nature 328:257 (1987). Szczepionki te są skuteczne do pobudzania reakcji przeciwko sporozoitom. Jednakże, wielkość reakcji jest nieodpowiednia, zaś niektórzy ze szczepionych nie wykształcają jej w ogóle. Ponadto, brak wzrostu poziomu przeciwciał bez przypominania kolejnymi wstrzyknięciami i wyniki testów proliferacji limfocytów in vitro wskazuje, że limfocyty T większości tych ochotników nie rozpoznają immunodominujących powtórzeń. Mimo to, jeden ze szczepionych w tym badaniu nie rozwinął parazytemii. Międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO 93/10152 (SmitKline Beecham Biologicals) opisuje i zastrzega białko hybrydowe obejmujące zasadniczo całość części końca C białka CS, cztery albo więcej powtórzeń tandemowych regionu immunodominującego, oraz antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B (HBsAg). Korzystnie, białko hybrydowe obejmuje sekwencję, która zawiera przynajmniej 160 aminokwasów, które są zasadniczo homologiczne z częścią końca C białka CS. Białko CS może być pozbawione ostatnich 12 aminokwasów końca C. W szczególności, opisano białko, które obejmuje część białka CS P. fałciparum zasadniczo odpowiadającą aminokwasom P. fałciparum 7G8, poddanych fuzji w ramce odczytu przez liniowy łącznik z końcem N HBsAg. Łącznik może obejmować część pres2 HBsAg. Konkretnym wykonaniem opisanym w WO 93/10152 jest białko hybrydowe określone jako RTS. Obejmuje ono: - resztę metioniny, kodowaną przez nukleotydy 1059 do 1061, pochodzącą z sekwencji genu TDH3 Saccharomyces cerevisiae (nukleotydy w ramce odczytu tworzą promotor TDH3) (Musti i in., Gene 1983, 25: ), - trzy aminokwasy Met-Ala-Pro, pochodzące z sekwencji nukleotydowej ( ) wytworzone przez procedurę klonowania zastosowaną do konstruowania genu hybrydowego, - ciąg 189 aminokwasów, kodowanych przez nukleotydy stanowiące aminokwasy białka circumsporozoitu (CSP) Plasmodium fałciparum szczepu 7G8 (Dame i in., wyżej), - aminokwas (Arg) kodowany przez nukleotydy , wytworzony przez procedurę klonowania zastosowaną do skonstruowania genu hybrydowego, - cztery aminokwasy Pro-Val-Thr-Asn, kodowane przez nukleotydy i stanowiące cztery reszty końca karboksylowego białka pres2 wirusa zapalenia wątroby typu B (serotyp adw) (9), - ciąg 226 aminokwasów, kodowanych przez nukleotydy stanowiące białko S wirusa zapalenia wątroby typu B (serotyp adw).

4 WO 93/10152 dalej opisuje ekspresję białka hybrydowego w szczepie drożdży, który niesie w swoim genomie szereg zintegrowanych kopii kasety ekspresji wirusa zapalenia wątroby typy B. Powstały szczep syntetyzuje dwa polipeptydy, S i RTS (albo inne geny hybrydowe według wynalazku), które spontanicznie łączą się w mieszane (przykładowo RTS,S) cząstki lipoproteiny. Cząstki te, korzystnie prezentują sekwencje CSP hybrydy na swej powierzchni. Celem niniejszego wynalazku jest zapewnienie odporności przeciwko inwazji P. falciparum i/lub P. vivax przez immunizację kompozycją obejmującą wiele antygenów w kombinacji z adiuwantem, który jest wybiórczym stymulatorem reakcji limfocytów TH1. Przedmiotem wynalazku jest zatem kompozycja szczepionki obejmująca przynajmniej dwa antygeny malarii w kombinacji z adiuwantem, który jest wybiórczym stymulatorem reakcji limfocytów TH1. Antygeny malarii w kompozycji według wynalazku są wybrane z grupy obejmującej: a. białko hybrydowe obejmujące zasadniczo całość części końca C białka CS, cztery albo więcej powtórzeń tandemowych regionu immunodominującego oraz antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu C (HBsAg); b. TRAP klonowanego izolatu P. falciparum z Tajlandii, znanego jako T/9/96, oraz białka wykazujące przynajmniej 80% homologii z nim, oraz immunogenne pochodne, obejmujące jego fragmenty; c. MSP-1 P. falciparum albo P. vivax oraz białka wykazujące co najmniej 80% homologię z nim, oraz pochodne immunogenne obejmujące jego fragmenty. Ilość antygenu występująca w dawce szczepionki powinna być ilością, która wywołuje reakcję ochronną bez istotnych, niepożądanych objawów ubocznych u typowego szczepionego. Ilość taka będzie różna w zależności od tego, które konkretne immunogeny są stosowane. Ogólnie, oczekuje się, że każda dawka obejmować będzie od 1 do 100 (j.g białka, korzystnie ig, najkorzystniej ig. Optymalną dawkę dla konkretnego szczepionego można określić standardowym badaniem obejmującym obserwację reakcji odpornościowej biorcy. Po początkowym szczepieniu, biorcy korzystnie otrzymują dawkę przypominającą po około 4 tygodniach, a następnie kolejne dawki przypominające co sześć miesięcy, jak długo istnieje niebezpieczeństwo zakażenia. Szczepionka według wynalazku może znaleźć zastosowanie w leczeniu pacjenta podatnego na zakażenia plazmodium, przez podawanie skutecznej ilości szczepionki jak to opisano wyżej. Przedmiotem wynalazku jest zatem zastosowanie opisanej powyżej kompozycji szczepionki według wynalazku do wytwarzania leku do zastosowania w leczeniu i profilaktyce malarii. Adiuwanty, które są zdolne do wybiórczego pobudzania reakcji limfocytów TH1 opisano w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym nr WO 94/00153 i WO 95/ Korzystnie w kompozycji według wynalazku adiuwant obejmuje QS21, oczyszczoną przez HPLC nietoksyczną frakcję pochodzącą z kory Quillaja Saponaria Molina. W innej korzystnej postaci wykonania, w kompozycji według wynalazku adiuwant obejmuje MPL, monofosforylolipid A. Również korzystnie, w kompozycji według wynalazku adiuwant obejmuje emulsję oleju w wodzie. 3 de-o-acylowany monofosforylolipid A znany jest z GB (Ribi). Chemicznie stanowi mieszaninę 3 de-o-acylowanego monofosforylolipidu A z 4-, 5- ałbo 6-acylowanymi łańcuchami i jest wytwarzany przez Ribi Immunochem Montana. Korzystną postać 3 de-oacylowanego monofosforylolipidu A ujawniono w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym nr 92/ QS21 jest oczyszczoną przez HPLC nietoksyczną frakcją pochodzącą z kory Quillaja Saponaria Molina, zaś sposób jej wytwarzania (jako QA21) ujawniono w opisie patentowym USA nr Emulsja oleju w wodzie może obejmować olej zdolny do metabolizowania, taki jak skwalen, tokoferol-alfa i Tween 80. Oprócz tego, emulsja oleju w wodzie może obejmować span 85 i/lub lecytynę. Stosunek QS21 do 3D-MPL zwykle wynosi od 1:10 do 10:1; korzystnie od 1:5 do 5:1, zaś zwykle 1:1. Zakresem dla optymalnego synergizmu jest stosunek 3D-MPL do QS21 wynoszący od 2,5:1 do 1:1. Zazwyczaj gdy podawane ludziom, QS21 i 3D-MPL występują

5 w szczepionce w zakresie od 1 fig do 200 jag, jak np (ig, w szczególności 10 (ig - 50 (ig na dawkę. Zazwyczaj emulsja oleju w wodzie obejmuje od 2 do 10% skwalenu, od 2 do 10% tokoferolu alfa i od 0,3 do 3% Tween 80. W szczególności stosunek skwalenu do tokoferolu alfa jest równy albo mniejszy od 1, ponieważ daje to stabilną emulsję. Span 85 może również występować w ilości około 1%. W niektórych przypadkach kompozycje szczepionki mogą ponadto zawierać stabilizator. Preparat szczepionki opisano zasadniczo w The New Trends and Developments in Vaccines, wyd. Voller i in., University Park Press, Baltimore, Maryland, USA, Kapsułkowanie w liposomach opisano, przykładowo, w opisie patentowym USA (Fullerton). Koniugację białek z makrocząsteczkami ujawniono, przykładowo w opisach patentowych USA (Likhite) i USA (Armor). Poniżej wymienione zostały antygeny malarii przydatne do wykonania kompozycji szczepionki: 1. Białko hybrydowe, takie jak RTS, szczególnie w postaci cząsteczek mieszanych np. RTS,S. 2. TRAP klonowanego izolatu P. falciparum z Tajlandii, znanego jako T/9/96, oraz białka wykazujące przynajmniej 80% homologii z nim, oraz immunogenne pochodne, obejmujące jego fragmenty (opisane w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym nr WO 90/01496 i WO 91/11516 (3i Exploitation Limited) i W 092/11868 (US Navy)). 3. Białko 16 kda opisane w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym nr WO 91/18922 oraz białka wykazujące co najmniej 80% homologię z nim, oraz pochodne immunogenne obejmujące jego fragmenty. 4. Antygen błonowy 1 (AMA-1) P. falciparum albo P. vivax, oraz białka wykazujące co najmniej 80% homologię z nim, oraz pochodne immunogenne obejmujące jego fragmenty. 5. Białko circumsporozoitu (csp) P. falciparum albo P. vivax, oraz białka wykazujące co najmniej 80% homologię z nim, oraz pochodne immunogenne obejmujące jego fragmenty. 6. MSP-1 P. falciparum albo P. vivax (opis patentowy USA nr ) oraz białka wykazujące co najmniej 80% homologię z nim, oraz pochodne immunogenne obejmujące jego fragmenty. 7. Inne białka stadium egzoerytrocytamego oraz pochodne immunogenne obejmujące jego fragmenty. 8. Ewentualnie, białka stadium we krwi oraz pochodne immunogenne obejmujące jego fragmenty. Określenie pochodna immunogenna obejmuje dowolną cząsteczkę takąjak cząsteczka okrojona albo inna pochodna białka, które zachowuje zdolność do wywoływania reakcji odpornościowej na białko po podaniu wewnętrznym człowiekowi. Takie pochodne można wytwarzać przez addycję, delecję, substytucję albo rearanżację aminokwasów albo ich chemiczną modyfikację. Immunogenne fragmenty białka, które mogą być przydatne do wytwarzania szczepionek podjednostkowych można wytworzyć przez ekspresję odpowiedniego fragmentu genu albo syntezę peptydową, przykładowo z użyciem syntezy Merrifielda (The Peptides, vol. 2, Academic Press, NY, str. 3). Pochodna immunogenna może być hybrydą, tj. polipeptydem fuzyjnym obejmującym dodatkowe sekwencje, które mogą nieść jeden albo wiele epitopów dla innych immunogenów Plasmodium albo immunogenów innych niż Plasmodium. Alternatywnie, pochodną immunogenną można poddać fuzji z polipeptydem nośnikowym takim jak antygen powierzchniowy albo rdzeniowy wirusa zapalenia wątroby typu B albo innym nośnikiem, który posiada właściwości immunostymulujące, jak ma to miejsce w przypadku adiuwantu, albo które w inny sposób zwiększa reakcję odpornościową na białko albo jego pochodną, albo które jest przydatne do ekspresji, oczyszczania albo formułowania białka albo jego pochodnej. Białka albo ich pochodne immunogenne, które są przydatne do wynalazku można chemicznie sprzęgać z makrocząsteczką stosując konwencjonalne czynniki sieciujące, takie jak glutaraldehyd (Geerlings i in., (1988) J. Immunol. Methods 106: ). Poniższe Przykłady ilustrują wynalazek:

6 Przykład Konstruowanie i ekspresja rekombinowanego TRAP Przeprowadzono to jak to opisano w WO 90/ Konstruowanie i ekspresja RTS,S Przeprowadzono to jak to opisano w WO 93/ Adiuwantacja Wytworzono dwie kompozycje adiuwantu, zawierające następujące składniki emulsji oleju w wodzie: SB26: 5% skwalenu; 5% tokoferolu; 0,4% Tween 80; wielkość cząsteczek wynosiła 500 nm. SB62: 5% skwalenu; 5% tokoferolu; 2,0% Tween 80; wielkość cząsteczek wynosiła 180 nm. Wytwarzanie emulsji SB62 (2-krotny koncentrat) Tween 80 rozpuszczono w roztworze soli buforowanym fosforanem (PBS) otrzymując 2% roztwór w PBS. W celu otrzymania 100 ml 2-krotnie stężonego koncentratu, emulsję 5 g DL tokoferolu alfa i 5 ml skwalenu wytrząsano w celu dokładnego zmieszania. Dodano 90 ml roztworu PBS/Tween i dokładnie wymieszano. Powstałą emulsję przepuszczono przez strzykawkę i na koniec mikrofluidyzowano przez zastosowanie urządzenia M110S Microfluidics Machine. Powstałe kropelki oleju miały wielkość około 180 nm. Wytwarzanie emulsji SB26 Emulsję tę wytworzono w analogiczny sposób wykorzystując 0,4% Tween 80. Inne emulsje jak pokazane na tabeli wytworzono w analogiczny sposób. Do każdych 100 ml emulsji dodano dwa antygeny (10 mg każdego antygenu, równoważnik 50 µg na dawkę) i zmieszano. Połączono to z 100 µg/ml 3D-MPL i 100 µg/ml QS21 otrzymując końcową formulację. Bufor dodano do odpowiedniego stężenia soli i ph. Tabela Nośniki dwukrotnie stężone Emulsje SB Tokoferol% Skwalen% Tween80% Span85% Lecytyna% Wielkość , nm % 800 nm 10-0% 26, ,4 0 0,1 500 nm , nm , nm nm nm , nm % 800 nm 20-0% 40, ,4 1 0,1 500 nm nm ,4 1, nm , nm

7 Przykład odniesienia Różne formulacje RTS,S RTS,S opisano w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym nr WO 93/10152 i formułowano do szczepienia myszy Balb/c. Do każdej grupy zastosowano pięć zwierząt. 7 grup myszy otrzymało następujące formulacje: Grupa 1 RTS,S SB62 Grupa 2 RTS,S QS21 3D-MPL Grupa 3 RTS,S QS21 3D-MPL SB62 Grupa 4 RTS,S 3D-MPL Al(OH)3 Grupa 5 R TS,S Al(OH)3 Grupa 6 prosta Grupa 7 Kontrola negatywna (RTS,S - 5 µg/dawkę, 3D-MPL - 5 µg/dawkę, QS21-5 µg/dawkę) Zwierzęta szczepiono i skrwawiano w 15 dni po pierwszej immunizacji oraz w 7 i 15 dni po drugiej immunizacji i badano pod względem podtypu przeciwciał przeciwko HBsAg. Emulsja SB62 formułowana z QS21 i 3D-MPL zwiększała wybiórczo i w synergistyczny sposób reakcję przeciwciał IgG2a w porównaniu z samym SB62. Zwiększona reakcja przeciwciał IgG2a u myszy jest miarą zdolności układu adiuwanta do pobudzania reakcji limfocytów TH1.

8 Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 2,00 zł.