(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: ,PCT/EP97/00520

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19)PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: ,PCT/EP97/00520 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: ,WO97/28820, PCT Gazette nr 35/97 (13) B1 (51) IntCl7 A61K 39/245 C07K 14/04 A61P 31/00 (54) Kompozycje farmaceutyczne, białko genu IE63 oraz jego zastosowanie (30) Pierwszeństwo: ,GB, (73) Uprawniony z patentu: SMITHKLINE BEECHAM BiOLOGICALS S.A., Rixensart, BE UNIVERSITY OF LIEGE, Liege, BE (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 02/99 (72) Twórcy wynalazku: Bernard Rentier, Liege, BE Catherine Sadzot, Liege, BE (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 02/05 (74) Pełnomocnik: Kossowska Janina, PATPOL Sp. z o o PL B1 (57) 1. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera białko IE63 wirusa Varicella Zoster i zaróbkę dopuszczalną farmaceutycznie. 2. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że obejmuje kwas nukleinowy kodujący IE Białko genu IE63 do zastosowania w medycynie. 4. Zastosowanie białka IE63 do wytwarzania leku do zapobiegania albo łagodzenia ospy wietrznej albo półpaśca. 5. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1, znamienna tym, że dodatkowo obejmuje inne antygeny VZV.

2 Kompozycje farmaceutyczne, białko genu IE63 oraz jego zastosowanie Zastrzeżenia patentowe 1. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tyra, że zawiera białko IE63 wirusa Varicella Zoster i zaróbkę dopuszczalną farmaceutycznie. 2. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, ze obejmuje kwas nukleinowy kodujący IE Białko genu IE63 do zastosowania w medycynie. 4. Zastosowanie białka IE63 do wytwarzania leku do zapobiegania albo łagodzenia ospy wietrznej albo półpaśca. 5. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1, znamienna tym, że dodatkowo obejmuje inne antygeny VZV. 6. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 5, znamienna tym, że drugie białko wirusa Varicella Zoster wybrane jest z grupy obejmującej gpl, gpll, gpiii, gpiv, gpv albo IE Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1, 2, 5 albo 6, znamienna tym, ze dodatkowo obejmuje adiuwant. 8. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 7, znamienna tym, że adiuwant wybiórczo wywołuje reakcję TH1. 9. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 8, znamienna tym, że antygen występuje w emulsji oleju w wodzie w a z z QS21 i 3D-MPL. * * * Przedmiotem wynalazku są kompozycje farmaceutyczne, białko genu IE63 oraz jego zastosowanie. Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku przeznaczone są do leczenia albo zapobiegania półpaścowi u osobników zakażonych wirusem Varicella Zoster (VZV) oraz zapobiegania i leczenia zakazeń ospą wietrzną. Kompozycje według wynalazku obejmują białko kodowane przez gen 63 VZV albo kwas nukleinowy kodujący IE63. Wynalazek dotyczy również białka IE63 do zastosowania w medycynie oraz jego zastosowania do wytwarzania leku do zapobiegania albo łagodzenia ospy wietrznej albo półpaśca. Wirus ospy wietrznej jest ludzkim wirusem herpes alfa, który powoduje u ludzi dwie choroby: podczas pierwotnego zakażenia VZV powoduje dziecięcą ospę wietrzną (Varicella), po której wirus staje się latentny i często reaktywuje się (często dziesięciolecia później) powodując półpasiec (Zoster). Podczas ospy wietrznej, wirus penetruje obwodowy układ nerwowy, gdzie pozostaje latentny do momentu reaktywacji w postaci bolesnego półpaśca. Podczas pozostawania wirusa w postaci latentnej, ekspresja większości genów wirusowych jest stłumiona. Uważa się, ze odporność komórkowa odgrywa kluczową rolę w kontrolowaniu stanu latencji, ponieważ reaktywacja jako Zoster (półpasiec) jest częsta u osób starszych albo u osobników poddanych na immunosupresję. Zakażenia VZV charakteryzuje się minimalną obecnością wirusa w postaci wolnej. Podczas latencji i reaktywacji wirus pozostaje głównie wewnątrzkomórki. W związku z tym, chorobie nawrotowej nie jest w stanie zapobiec nawet wysoki poziom przeciwciał neutralizujących, zaś kontrola wirusa zalezy od odporności komórkowej. W celu uzyskania ochrony przez szczepienie, pożądane jest wywołanie nie tylko reakcji przeciwciał, ale również reakcji CTL. Skuteczna szczepionka powinna uczulać CTL zdolne do działania tak prędko, jak tylko pojawią się objawy reaktywacji latentnego wirusa. Ponieważ mechanizm rozpoznawania antygenu przez cytotoksyczne limfocyty T CTL obejmuje rozkład natywnego antygenu na peptydy, wiązanie fragmentów rozkładu proteolitycznego z cząsteczkami MHC i eksport kompleksu na powierzchnię komórki, dowolny polipeptyd kodowany przez wirusa, nie tylko białka integralne błony takie jak glikoproteiny, mogą być potencjalnymi celami reakcji limfocytów T. Jednakże, ponieważ genom VZV oprócz ze-

3 wnętrznych glikoprotein koduje kilka białek nie strukturalnych i wewnętrznych białek wirionu, daje to potencjalnie znaczną liczbę celów dla CTL i nie wiadomo, które białko będzie najodpowiedniejsze. Genom wirusa VZ obejmuje 71 ramek odczytu, kodujących 68 białek. Znana jest sekwencja DNA wirusa (J. Gen. Virol. 67: ). Gen 63 wirusa koduje białko bezpośrednio wczesne o przewidywanym ciężarze cząsteczkowym 30,5 kda (Debrus i in., J. Vrol. 69(5), 1995, 3240). Gen rozpoczyna się w pozycji (kodon start) i ciągnie się do pozycji (kodon stop). Drugą kopię genu w orientacji odwrotnej spotyka się pomiędzy zasadami i Raczej nieoczekiwanie wykazano na modelu szczurzym, że białka IE63 są wyrażane w neuronach w stanie latencji. Białko to poddano ekspresji jako białko fuzyjne w E. coli. Obecnie ujawniono, że białko VZV IE63 wykrywane jest wyłącznie w cytoplazmie latentnie zakazonych neuronów ludzkich zwojów, trójdzielnego i piersiowego. Jest to pierwsza identyfikacja białka wirusa herpes alfa wyrażanego podczas latencji w ludzkim układzie nerwowym. Ponadto twórcy ujawnili, ze białko to jest istotnym celem dla układu odpornościowego, w szczególności jest celem odpowiedzi limfocytów T, a więc przydatnym w zapobieganiu i leczeniu zakazeń VZV, w szczególności w zapobieganiu półpaśca u pacjentów zakażonych juz VZV. Zatem przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca białko IE63 wirusa Varicella Zoster i farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę. Korzystnie przedmiotem wynalazku jest szczepionka, która dodatkowo obejmuje inne antygeny VZV. Korzystniej, przdmiotem wynalazku jest szczepionka, w której dodatkowe białko wirusa Varicella Zoster wybrane jest z grupy obejmującej gpl, gpll, gpiii, gpiv, gpv albo IE62. gpl, gpll, gpiii, gpiv albo gpv VZV albo ich okrojone pochodne albo inne bezpośrednio wczesne białka, takie jak białko IE62 stanowią dodatkowe składniki antygenowe. Okrojone gpl, gpll albo gpiii ujawnione zostały w europejskim zgłoszeniu patentowym opublikowanym pod nr gpl w kombinacji z IE63 może występować w postaci niezakotwiczonej. Przez określenie niezakotwiczone rozumie się pochodną glikoproteiny VZV, która pozbawiona jest zasadniczo całości regionu kotwiczącego końca C oraz możliwą do wydzielenia podczas ekspresji w komórkach ssaków. Białka takie opisane są w EP-A Białko IE63 może występować w postaci białka fuzyjnego obejmującego sekwencję aminokwasową IE63 albo jej pochodną i sekwencję aminokwasową obejmującą jedno spośród gpl, gpll, gpiii, gpiv albo gpv albo ich pochodną albo inne białko bezpośrednio wczesne, takie jak IE62. Ilość białka w każdej dawce kompozycji farmaceutycznej według wynalazku powinna być wybrana w taki sposób, aby wywoływała ochronną reakcję odpornościową bez istotnych, niepożądanych efektów ubocznych typowych szczepionek. Ilość taka będzie różna w zależności od tego, który konkretny immunogen zostanie zastosowany i w jaki sposób będzie on zaprezentowany. W ogólności, oczekuje się, że każda dawka powinna obejmować od 1 do 1000 ig białka, korzystnie od 2 do 100 \xg, najkorzystniej od 4 do 40 (ig. Optymalną ilość dla konkretnej kompozycji farmaceutycznej można określić standardowymi badaniami obejmującymi obserwację odpowiedniej reakcji odpornościowej u osobników. Po wstępnym zastosowaniu kompozycji farmaceutycznej, osobnicy mogą otrzymać jedną albo kilka dawek przypominających w odpowiednich odstępach czasu. Ze względu na fakt, że jest to pierwsze zastosowanie medyczne białka IE63, przedmiotem wynalazku jest zatem białko genu IE63 do zastosowania w medycynie., Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie białka IE63 do wytwarzania leku do zapobiegania albo łagodzenia ospy wietrznej albo półpaśca. Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna obejmująca kwas nukleinowy kodujący IE63. Zastosowanie polinukleotydu w immunizacji genetycznej wykorzystuje odpowiedni sposób dostarczania, taki jak bezpośrednie wstrzyknięcie plazmidowego DNA do mięśni (Wolff i in., Hum. Mol. Genet., 1992, 1:363, Manthorpe i in., Hum. Gene Ther., 1963:4, 419), dostarczanie DNA skompleksowanego ze swoistym nośnikiem białkowym (Wu i in., J. Biol.

4 Chem., 1989:264, 1985), precypitację DNA fosforanem wapnia (Benvenisty i Reshef, PNAS, 1986:83, 9551) albo innymi substancjami ułatwiającymi kapsułkownie DNA w różnych postaciach liposomów (Kaneda i in., Science 1989:243,375), bombardowanie cząstkami (Tang i in., Naturę 1992:356:152; Eisenbaum i in., DNA Cell Biol., 1993, 12:791) i zakażanie in vivo z użyciem klonowanych wektorów retrowirusowych (Seegar i in., PNAS 1984:81, 5849) albo nie zakaźnych, rekombinowanych wektorów wirusowych, takich jak układ pomocniczy 2 wirusa Semliki (Berglund i in., Bio/Technology 1993, 11: ). Odpowiednie promotory do transfekcji mięśni obejmują promotory CMV, RSV, Sra, aktyny, MCK, alfa globiny, adenowirusa i reduktazy dihydrofolianu. Korzystny sposób dostarczania polinukleotydu wykorzystuje cząstki złota dostarczane urządzeniem gene gun US 5,100,792, US 5,036,006 i 4,945,050. Kompozycje zawierające kwas nukleinowy według wynalazku można podawać stosując dawki i drogi podania opisane w WO 90/ Oczywiste jest jednak, że dokładne dawki zalezeć będą od takich czynników jak ciężar, płeć, sposób podania, stan ogólny pacjenta oraz leczony stan. Niemniej jednak, do zastosowania domięśniowego stosowane dawki zawierać się będą zwykle w zakresie od 0,05 (ag/kg do około 50 mg/kg, częściej od około 0,1 do 10 mg/kg. Sposoby podawania obejmują podawanie podskórne, naskórkowe, śródskóme albo śluzówko we, z powodu zdolności do indukcji wysokiego poziomu CTL. Polinukleotyd zdolny do wyrażania IE63 albo jego pochodnej można zastosować bezpośrednio jako szczepionkę kwasu nukleinowego. Polinukleotydem może być DNA. W takim wypadku, polinukleotyd znajduje się pod kontrolą odpowiedniego promotora. Można również stosować immunizację RNA. RNA można w takim wypadku wytworzyć według sposobów WO 92/ Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku mogą znaleźć zastosowanie w sposobie leczenia człowieka podatnego albo cierpiącego na zakażenie VZV, poprzez podawanie jemu bezpiecznej i skutecznej ilości kompozycji według wynalazku. Oprócz szczepienia osobników podatnych na zakażenia VZV, kompozycje farmaceutyczne według wynalazku można zastosować do immunoterapeutycznego leczenia pacjentów cierpiących na zakażenie VZV, w celu zapobieżenia albo istotnego zmniejszenia choroby nawrotowej, częstości, ciężkości i czasu trwania epizodów półpaśca. W kompozycji farmaceutycznej według wynalazku można zastosować bezpośrednio wodny roztwór białka (białek) VZV IE63. Alternatywnie, białko (białka) IE63 VZV, z uprzednią liofilizacją albo bez, można mieszać ze sobą, albo z dowolnym spośród różnych znanych adjuwantów. Takie adjuwanty obejmują, choć nie są ograniczone do wodorotlenku glinu, dipeptydu muramylowego i saponin, takich jak Quil A, w szczególności QS21, oczyszczoną przez HPLC, nie toksyczną frakcję otrzymaną z kory Quillaja Saponaria Molina, albo 3-dezacylomonofosforylo-lipidu A (3D-MPL). Korzystne są adjuwanty albo układy adjuwantów, które preferencyjnie indukują reakcję TH1. Adjuwanty, które są zdolne do wybiórczego pobudzania reakcji limfocytów TH1 opisane są w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym nr WO 94/00153 i WO 95/ Tak więc przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna, która dodatkowo obejmuje adiuwant. Korzystnie adiuwant zawarty w kompozycji według wynalazku wybiórczo wywołuje reakcję typu TH1. W szczególności, przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna, w której antygen występuje w emulsji oleju w wodzie wraz z QS21 i 3D-MPL. 3 De-O-acylo-monofosforylo-lipid A znany jest z GB (Ribi). Chemicznie stanowi mieszaninę 3 De-O-acylo-monofosforylo-lipidu A z 4-, 5- albo 6-acylowanymi łańcuchami i jest wytwarzany przez Ribi Immunochem Montana. Korzystna postać 3 De-O-acylomonofosforylo-lipidu A ujawniona jest w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym nr 92/ QS21 jest oczyszczoną przez HPLC, nie toksyczną frakcję otrzymaną z kory Quillaja Saponaria Molina, zaś jego sposób wytwarzania (jako QS21) ujawniono w opisie patentowym USA nr 5,057,540.

5 Emulsja oleju w wodzie może obejmować możliwy do metabolizowania olej, taki jak skwalen, alfa-tokoferol i tween 20. Dodatkowo, emulsja oleju w wodzie może zawierać span 85 i/lub lecytynę. Stosunek QS21 do 3D-MPL zwykle zawierać się będzie w zakresie od 1:10 do 10:1; korzystnie od 1:5 do 5:1, zaś często zasadniczo 1:1. Korzystny zakres 3D-MPL do QS21 dla optymalnego synergizmu wynosi 2,5:1 do 1:1. Zwykle, do podawania ludziom QS21 i 3D-MPL występować będzie w szczepionce w zakresie od 1 μg do 100 μg, korzystnie 10 μg do 50 μg na dawkę. Zwykle, emulsja oleju w wodzie będzie obejmować od 2 do 10% skwalenu, od 2 do 10% alfa-tokoferolu i od 0,3 do 3% Tween 80. Korzystnie, stosunek skwalenu do alfatokoferolu jest równy albo mniejszy od 1, ponieważ zapewnia to najbardziej stabilną emulsję. Span 85 może występować w stężeniu 1%. W niektórych przypadkach może być korzystne, żeby szczepionka według wynalazku dalej zawierała stabilizator. Alternatywnie, białko według wynalazku można kapsułkować w mikrocząstkach takich jak liposomy, a nawet sprzęgać z makrocząsteczkami immunostymulującymi, takimi jak zabite Bordetella albo toksoid tężca. Preparaty szczepionek opisano ogólnie w New Trends and Developments in Vaccines, Voller i in., (wyd.), University Park Press, Baltimere, Maryland, Kapsułkowanie w liposomach opisano w Fullerton i in., patent USA nr 4,235,877. Sprzęganie białek z makrocząsteczkami ujawniono, przykładowo, w Likhite, patent USA 4,372,954 i Armor i in., patent USA 4,474,757. Zastosowanie Quill A ujawniono w Dalsgaard i in., Acta Vet. Scand. 18:349 (1977). 3D-MPL dostępny jest z Ribi Immunochem, USA, i ujawniony w brytyjskim zgłoszeniu patentowym nr i patencie USA 4,912,094. QS21 ujawniono w patencie USA nr 5,057,540. Przykład 1: Kompozycja szczepionki obejmująca białko IE63 VZV Wytworzono dwie kompozycje adjuwantu, z których każda zawierała poniższy składnik emulsji oleju w wodzie. SB 62: 5% skwalenu, 5% tokoferolu, 2% tween 80; wielkość cząstek wynosiła 180 nm. 1(a) Preparaty emulsji SB62 (stężenie dwukrotne) Tween 80 rozpuszczono w roztworze soli buforowanym fosforanem (PBS) otrzymując roztwór 2% w PBS. W celu otrzymania 100 ml dwukrotnie stężonej emulsji, 5 g DL alfa tokoferolu i 5 ml skwalenu wytrząsano w celu dokładnego wymieszania. Dodano 90 ml roztworu PBS/Tween i dokładnie wymieszano. Powstałą emulsję przepuszczono przez strzykawkę i na koniec mikrofluidyzowano przy użyciu urządzenia M110S Microfluidics. Powstałe kropelki oleju miały wielkość około 180 nm. 1(b) Antygen wytworzono według metody Debrus i in. (wyżej). 1(c) Wytwarzanie kompozycji białka IE63 QS21/3D MPL w emulsji oleju w wodzie. Do emulsji według 1a) dodano równą objętość dwukrotnie stężonego antygenu (20 μg albo 100 μg) i wymieszano. Połączono to z 50 fig/ml 3D-MP1 i 20 fig/ml QS21 otrzymując stężenie końcowe. Bufor zastosowano zależnie od stężenia soli i ph. Przykład 2: Charakterystyka immunologiczna IEP Materiały Pobrano krew od 11 dawców, spośród których jeden był szczepiony. Wszyscy dawcy byli dorośli, z przebytą ospą wietrzną w dzieciństwie. W każdym przypadku pobierano 30 ml krwi w heparynizowaną probówkę, zaś 5 ml pobierano na skrzep w celu pobrania surowicy. 2.2 Humoralna reakcja odpornościowa Przy użyciu całego VZV i antygenów kontrolnych wykonano testy ELISA w celu wykrycia w próbkach krwi IgG przeciwko VZV, dostarczając w ten sposób dowodów na przechorowanie ospy wietrznej w dzieciństwie. Poszukiwano obecności przeciwciał przeciwko IE63 analiza W estern biot, w której zastosowano IE63, klonowany w pgex5x i wyrażany w E. coli jako białko fuzyjne (GST-IE63) i oczyszczony przez chromatografię powinowactwa (Debrus i in., J. Virol. 69: ). Białko GST, wyrażane i oczyszczane w taki sam sposób zastosowano jako kontrolę negatywną. We wszystkich badanych próbkach krwi, oczyszczone białko fuzyjne IE63 było rozpoznawane, wskazując na obecność w surowicy przeciwciał przeciwko IE63. Białko kontrolne nie było nigdy rozpoznawane przez przeciwciała. 2.3 Komórkowa reakcja odpornościowa

6 Pobudzenie limfocytów T określano przez pobudzanie PBMC (jednojądrzastych komórek krwi obwodowej) izolowanych przez wirowanie na gradiencie Ficoll-Hypague. Wszystkie testy wykonywano w potrójnym powtórzeniu, przez pobudzanie 3x105 PBMC przy użyciu PHA (fitohemaglutynina), w celu określenia wskaźnika pobudzenia nieswoistego, całego VZV i antygenów kontrolnych (wytworzonych przez sonikację zakażonych i nie zakażonych komórek czerniaka) oraz oczyszczonego białka fuzyjnego (GST-IE63 albo samego GST). 6 dnia komórki pulsowano 3H-tymidyną przez 16 godzin, a następnie zbierano. Wskaźnik pobudzenia (SI) obliczano jako stosunek CPM w studzienkach pobudzanych białkiem do studzienek kontrolnych, i uznawano za pozytywny jeżeli wynosił > Wyniki proliferacji limfocytów T Do tej pory wykonano 10 testów proliferacji z określonymi uprzednio parametrami. Wyniki podano w tabeli 1. SI uzyskany po pobudzeniu pełnym antygenem YZV albo IE63 wykreślono na schemacie pokazanym jako fig. 1. Na podstawie danych wywnioskowano: Większość ludzi (6/10) wykazuje reakcję limfocytów T pamięci na IE63 VZV. Dwóch dawców miało bardzo niski SI przy pobudzeniu antygenem pełnym i oczyszczonym białkiem fuzyjnym, a więc powinno się ich uznawać za negatywnych (SI<2). Jednakże, jeden z nich miał bardzo niskie miano przeciwciał, bez wyraźnej historii przebycia ospy wietrznej w wywiadzie, a więc mógł być uznany za dawcę negatywnego. Drugi z nich, którego miano przeciwciał było wysokie, miał lepszy SI gdy test wykonywano z MBP-IE63 (SI=3,4), co wskazuje, że w niektórych przypadkach jedno z białek fuzyjnych było lepiej rozpoznawane przez limfocyty T, oraz że porównanie obu białek może być przydatne w przypadku gdy SI jest bardzo niski, z wysokim odchyleniem standardowym. Dwaj inni dawcy wykazywali negatywną reakcję na IE63, podczas gdy SI z antygenem pełnym był wysoki, ale pobudzenie wykonywano jedynie z białkiem fuzyjnym GST. Przykład 3: Reakcje komórkowe W rozszerzeniu powyższego doświadczenia, PBMC od 19 zdrowych dorosłych badano pod kątem proliferacji limfocytów T w reakcji na pobudzenie antygenami VZV albo oczyszczonym białkiem GST-IE63. Średni SI z antygenami VZV wynosił 15,5±3,3 SE z wartościami pomiędzy 2,1 i 52. Oznacza to, że SI po pobudzeniu GST-IE63 wynosił 3,4±0,48 SE z wartościami od 1,8 do 8. Te dane SI były istotnie wyższe niz obserwowane u nieodpornych pacjentów, których SI wynosił 1,95±0,48 SE dla antygenów VZV i 1,3±0,1 SE dla IE63. Po wykreśleniu SI po pobudzeniu VZV i porównaniu z SI z GST-IE63, dwaj nieodporni pacjenci okazali się wyraźnie negatywni (SI<2,0) z oboma preparatami antygenu (fig. 2). Wszystkich 17 dawców miało SI na antygen VZV wyzszy niż 2,0. Wśród tych pozytywnych dawców 3 (17%), wśród których jeden podawał w wywiadzie liczne wykwity półpaśca, prezentowali bardzo silną reakcję na antygeny YZV, podczas gdy SI z GST-IE63 był poniżej 2,0. Czterech dawców miało SI wynoszące 2,0 dla GST-IE63 z SI dla antygenów VZ w zakresie od 5,4 do 11. Jednakże, wszyscy ci dawcy o SI z GST-IE63 <2 wykazywali istotną reakcję na samo GST (dane nie pokazane), co utrudnia interpretację wyników. Wszyscy pozostali naturalnie odporni osobnicy (59%) wykazywali silną reakcję na GST-IE63, z SI pomiędzy 2, 3 i 8. Jednakże, nie stwierdzono korelacji pomiędzy pobudzeniem antygenami VZ i białkiem fuzyjnym. Przykład 4: Testy na cytokiny Wytwarzanie cytokin przez PBMC pobudzane IE63 badano u 7 osobników: PBMC pobudzano GST albo GST-IE63 i wykrywano IL-2, IL-4 i IFN-y w dniu 2, 4 albo 6 przy użyciu ELISA. Wyniki wyrażano jako różnicę pomiędzy stężeniem cytokin wykrytym po pobudzeniu GST-IE63 i samym GST. Nigdy nie wykryto IL-2 i IL-4, podczas gdy IFN-y był wytwarzany w istotnych ilościach (175 do 1400 pg/ml) przez limfocyty T pobudzane IE63, przy czym maksimum przypadało na 4 dzień. Ilość IFN-y w hodowlach, w których nie obserwowano pobudzenia była istotnie nizsza.

7 Dawca Proliferacja limfocytów T w reakcji na GST-IE63 (SI) IFN-y (pg/ml) IL-4 (pg/ml) 1 2, , , , , , Przykład 5: Testy na cytotoksyczność Reakcje CTL swoiste wobec IE63 i IE62 wykrywano w teście skrajnych rozcieńczeń limfocytów T uzyskanych od 10 dawców odpornych na VZV. Testy te wykonywano z celami autologicznymi nie zakażonymi albo zakażonymi kontrolnym wirusem krowianki, wirusem krowianki-ie62 albo -IE63. Tło tworzone przez kontrolne komórki docelowe przedstawiało znaczną zmienność wśród dawców, ale wyniki uznawano jako ważne jedynie gdy liza celów swoistych dla wirusa wynosiła przynajmniej 10% więcej niz liza celów kontrolnych (nie zakażonych albo zakażonych kontrolnym wirusem krowianki). Gdy stosowano populację limfocytów T pozyskaną z T-Lymphokwik, liza celów wyrażających białka VZV była istotnie wyższa niż obserwowana dla celów nie zakażonych albo kontrolnych jak pokazano w jednym z testów (fig. 3). Liza obserwowana z celami wyrażającymi IE62 nie była istotnie wyższa niż liza celów wyrażających EE63. Podobne wyniki uzyskano w 4 testach wykonanych na pełnej populacji limfocytów T: lizę swoistą wynoszącą 25 do 48% obserwowano dla IE62 i 27 do 43% dla IE63. Średnia częstość występowania prekursorów limfocytów T, które rozpoznawały IE62 albo IE63 wynosiła odpowiednio 44500±22500 SE i SE, ale różnica nie była istotna statystycznie (p=0,8). Wykonano również hodowle w skrajnych rozcieńczeniach stosując oczyszczone populacje limfocytów T CD4+ i CD8+jako komórki efektorowe. Obie populacje niszczyły cele IE62 i IE63. RCF limfocytów T CD8+ rozpoznających IE62 albo IE63 wynosił odpowiednio 28500±10100 SE i 30500±13700, co nie było istotne statystycznie (p=0,9), wskazując, że oba białka wirusowe były rozpoznawane z taką samą skutecznością przez limfocyty T CD8+ (fig. 4). Liczba komórek niszczących cele IE63 była również taka sama w obu populacjach komórek efektorowych: średnia komórek efektorowych CD4+ wynosiła 31450±7500 SE, co stanowiło taką samą częstość co CD8+ (p-0,97). Jednakże, obliczenie częstości występowania limfocytów CD4+ dla rozpoznawania IE62 odrzucono w analizie komputerowej. Przykład 6: Ekspresja IE63 VZV podczas latencji W celu analizowania ekspresji VZV w latentnie zakażonych zwojach, pozyskano jeden trójdzielny i liczne zwoje piersiowe od 9 dorosłych i 3 dzieci w ciągu 24 godzin po śmierci. Żaden z osobników nie był poddany immunosupresji przed śmiercią, zaś podczas sekcji nie stwierdzono skórnych objawów świeżego zakażenia wirusem herpes. Test immunoenzymatyczny wykazał przeciwciała przeciwko VZV w surowicy wszystkich dorosłych. Surowica dostępna od jednego z trzech dzieci nie zawierała przeciwciał przeciwko VZV. Amplifikacja PGR przy użyciu starterów swoistych dla VZV (Mahalingham i in., Engl. J. Med. 323: ) wykazała w DNA ekstrahowanym z małego fragmentu zwojów DNA VZV w zwojach wszystkich dorosłych ale nie w zwojach dzieci. Pozostałe części każdego ze zwojów analizowano immunohistochemicznie przy użyciu przeciwciał wywołanych u królików przeciwko białku IE63 VZV 30,5 kda, wyrażonego jako białko fuzyjne z transferazą S glutationu w E. coli i oczyszczonego jak to opisano (Debrus i in., wyżej). Komórki BSC-1 (komórki nerki małpy afiykańskiej) zakażone VZV i nie zakażone służyły, odpowiednio, jako kontrola pozytywna i negatywna. W komórkach BSC-1 zakazonych VZV obserwowano dwa skupione obszary cytopatologii VZV zawierające białko IE63 VZV. Nie obserwowano sygnału w komórkach nie zakażonych albo komórkach BSC-1 zakażonych HSV. W zwojach pozyskanych 17 godzin po śmierci 47-letniego mężczyzny zmarłego z powodu miażdżycy, charakterystyczny czerwony kolor wykazał białko IE63 VZV

8 wyłącznie w cytoplazmie trzech neuronów. Nie obserwowano sygnału przy nałożeniu normalnej surowicy króliczej na sąsiadujące skrawki innego zwoju piersiowego tego samego osobnika. Jaśniejszy czerwony kolor obserwowano często w licznych neuronach zwojów zakażonych latentnie, co wskazywało na bardziej rozsiane, prawdopodobnie rzadsze zakażenie. Czerwonego zabarwienia swoistego dla białka IE63 VZV nie obserwowano nigdy w komórkach satelitarnych (komórkach torebki), naczyń włośniczkowych, tkanki łącznej, pęczków nerwowych wewnątrz zwoju albo korzonków nerwowych wchodzących do zwoju. Nie obserwowano sygnału po nałożeniu surowicy przeciwko białku IE63 VZV na skrawek zwoju 2-miesięcznego dziecka zmarłego w wyniku posocznicy wikłającej wrodzone wodogłowie i niedorozwój płuc. Podsumowując, białko IE63 VZV stwierdzono w 5 zwojach (4 piersiowych i 1 trójdzielnym) od 2 dorosłych. U tych dorosłych, białko IE63 VZV wykryto we wszystkich 10 skrawkach z 4 z 5 zwojów piersiowych. U drugiego dorosłego, białko IE63 VZV wykryto we wszystkich 4 skrawkach zwoju trójdzielnego. W skrawkach pozytywnych, białko IE63 VZV wykryto w cytoplazmie 2-4 neuronów. Białka IE VZV nie wykryto w żadnym z 4 skrawków wykonanych z każdego z 16 zwojów od 7 innych dorosłych albo 4 skrawkach z każdego z 9 zwojów od 3 dzieci. Wykrycie DNA VZV w niemal wszystkich zwojach, mimo wykrycia białka IE63 VZV tylko w niektórych latentnie zakażonych zwojach może odzwierciedlać błąd próbkowania, tj. analiza każdego skrawka z każdego zwoju zawierającego DNA VZV dla białka IE63 VZV mogłaby wykazać dodatkowe zwoje pozytywne. Alternatywnie, ekspresja wirusa może różnić się w różnych zwojach, przykładowo, w zwojach latentnie zakażonych HSV liczba neuronów zawierających DNA HSV jest znacznie większa niż wykazujących transkrypt związany z latencją. Na koniec, mogła zajść reaktywacja wirusa, jakkolwiek wydaje się to mało prawdopodobne u osobników których zwoje zawierały białko IE63 VZV, ponieważ przed śmiercią nie występowały objawy kliniczne wysypki, brak było wywiadu świadczącego o przewlekłym bólu nerwowym, który może poprzedzać wysypkę (neuralgia preherpetyczna), brak było wywiadu świadczącego o lokalizacji bólu wzdłuz dermatomów bez wysypki (półpasiec bez wysypki) ani historii neuralgii poherpetycznej wskazującej na zapalenie zwojów słabego stopnia. Ponadto, badanie histologiczne zwojów nie wykazało neurofagii, ciałek wtrętowych ani reakcji zapalnej. Wnioski: Z powyższych doświadczeń wywnioskowano że IE63 VZV wywołuje kompletną reakcję odpornościową: o przeciwciała przeciwko IE63 można wykryć analiza metodą Western biot w surowicy większości dawców z ospą wietrzną w wywiadzie; «limfocyty T mogą proliferować po stymulacji in vitro IE63 (oczyszczonym jako białko fuzyjne z GST), ale ograniczona liczba badanych dawców uniemożliwia stwierdzenie bezpośredniej korelacji pomiędzy wskaźnikiem pobudzenia () przez VZV i IE63. Limfocyty T proliferujące w reakcji na po budzenie IE63 są w większości TH1, o czym świadczy ekspresja znacznych ilości IFN-y w nadsączu; wykazano aktywność cytotoksyczną limfocytów T w kontekście rozpoznawania IE63. Limfocyty CD4+ jak i CD8+ biorą udział w procesie lizy, co stwierdzono przy użyciu oczyszczonych komórek efektorowych. Liczba komórek prekursorowych rozpoznających IE63 jest podobna do liczby komórek reagujących na IE62. Jest to pierwsze doniesienie o identyfikacji białka wirusa herpes wyrażanego podczas latencji w ludzkim układzie nerwowym, w połączeniu z jego właściwościami immunologicznymi, które stanowi doskonały antygen wchodzący w skład szczepionki przeciwko wirusowi Varicella Zoster.

9 z całym Ag z GST-IE 63 CS :4 4,1 :16 5,4 :64 6,7 5 μg 1,9 2,5 μg 1,5 1,25 μg 3,2 PHA 11,5 0,6 μg 11,6 MS :4 7,5 : 16 11,9 :64 5,9 5 Hg 1,1 2,5 μg 2,7 1,25 μg 3,2 PHA 8,1 0,6 μg 2,5 VD :4 4,3.16 4,5 :64 5,5 5 μg 2,9 2,5 μg 1,3 1,25 μg 1,5 PHA 12,6 0,6 μg 1,1 JM :4 1,5 :16 2,1 :64 2,0 5 Mg 1,7 2,5 μg 1,4 1,25 μg 2,2 PHA 7,1 0,6 μg 0,9 S I CD :4 4, ,1 64 5,6 5 μg 4,3 2,5 μg 2,8 1,25 μg 7,4 PHA 25,8 0,6 μg 4,4

10 CL :4 7,0 :16 7,0 :64 9,0 5 μg 1,0 2,5 μg 2,0 1,25 μg 2,0 PHA 22,0 0,6 μg 2,0 S I J :4 7,0 :16 7,0 :64 9,0 5 μg 1,0 2,5 μg 2,0 1,25 μg 2,0 PHA 22,0 0,6 μg 2,0 S I. S.I. DJ 4 6,5 16 2,1 64 5,1 5 μg nd 2,5 μg nd 1,25 μg nd PHA 24,0 0,6 μg nd S I. SH :4 1,4.16 2,1 :64 0,4 5 μg 0,8 2,5 μg 1,2 1,25 μg 1,5 PHA 23,4 0,6 μg 1,9 LZ :4 15,0 :16 14, ,0 5 μg 4,0 2,5 μg 8,0 1,25 μg 8,0 PHA 38,0 0,6 μg 8,0

11 S.I. R :4 13, ,4 :64 5,2 5 μg 3,6 2,5 μg 3,4 U 5 μg 2,6 PHA 30,9 0,6 μg 3,8 S.I. S.I. V EIA: >102,4 :4 0,9.16 1,1 :64 0,7 5 μg 0,6 2,5 μg 1,1 1,25 μg 999 PHA 23,5 0,6 μg 0,7 S.I. S.I. E :4 28,2 16 9, ,6 5 μg 0,7 2,5 μg 1,8 1,25 μg 1,2 PHA 46,7 0,6 μg 0,6 S.I. G :4 2,4 :16 2,3 :64 1,3 5 μg 1,2 2,5 μg 0,9 1,25 μg 1,4 PHA 70,9 0,6 μg 1,4 S.I. S 1. M 4 6,1 :16 23,4 :64 29,6 5 μg 2,7 2,5 μg 3,2 1,25 μg 2,3 PHA 79,5 0,6 μg 4,6

12 S. I C El A: >1024 :4 0,8 :16 1,6 :64 1,4 5 μg 0,5 2,5 μg 0,9 1,25 μg 1,0 PHA 113,6 0,6 μg 1,2 S. 1. Z 4 1,5 : 16 0,7 :64 0,7 5 μg 0,9 2,5 μg 1,2 1,25 μg 0,6 PHA 9,3 0,6 μg??? Tabela 1: Reakcja odpornościowa humoralna i komórkowa w odpowiedzi na VZV mierzono po pobudzeniu kompletnym antygenem (sonikowanymi komórkami czerniaka zakażonymi albo nie zakażonymi rozcieńczonymi 4-, 16- albo 64-krotnie) albo białkiem fuzyjnym IE63 (GST albo GST-IE63). Stan odporności humoralnej badano w ELISA z pełnym antygenem (wyrażone jako rozcieńczenie, dla którego OD wynosiło >0,250) albo analiza metodą Western blot z IE63. F ig 1

13 Fig 2 Fig 3

14 Fig 4 Departament Wydawnictw UP RP Nakład 50 egz Cena 4,00 zł