(62) Numer zgłoszenia, z którego nastąpiło wydzielenie: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/EP03/014562

Transkrypt

1 PL B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (62) Numer zgłoszenia, z którego nastąpiło wydzielenie: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/EP03/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO04/ (13) B1 (51) Int.Cl. A61K 39/12 ( ) A61P 35/00 ( ) Opis patentowy przedrukowano ze względu na zauważone błędy (54) Zastosowanie kompozycji zawierającej VLP HPV 16 i HPV 18 oraz kompozycja szczepionkowa (30) Pierwszeństwo: , US, 60/435, , US, 60/496,653 (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 03/06 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 11/13 (73) Uprawniony z patentu: GlaxoSmithKline BIOLOGICALS S.A., Rixensart, BE (72) Twórca(y) wynalazku: GARY DUBIN, King of Prussia, US BRUCE INNIS, King of Prussia, US MONCEF MOHAMMED SLAOUI, King of Prussia, US MARTINE ANNE CECILE WETTENDORFF, Rixensart, BE (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Zofia Sulima

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie kompozycji zawierającej cząstki wirusopodobne (VLP) wirusa brodawczaka ludzkiego (HPV) do wytwarzania leku do zapobiegania zakażeniu i/lub chorobie spowodowanej heterologicznymi typami HPV oraz kompozycja szczepionkowa do stosowania w tym celu. Wirusy brodawczaka są małymi wirusami DNA, powodującymi powstawanie nowotworów, które wykazują wysoką swoistość gatunkową. Dotychczas opisano ponad 100 poszczególnych genotypów wirusów brodawczaka ludzkiego (HPV). HPV są ogólnie swoiste albo dla skóry (np. HPV-1 i -2), albo dla powierzchni śluzówkowych (np. HPV-6 i -11) i zazwyczaj powodują łagodne nowotwory (brodawki), które utrzymują się przez kilka miesięcy lub lat. Takie łagodne nowotwory mogą być kłopotliwe dla dotkniętych osobników, ale poza kilkoma wyjątkami nie mają tendencji do zagrażania życiu. Niektóre HPV, zwane onkogennymi typami HPV, są także związane z rakiem. Najsilniejszy dodatni związek między HPV a rakiem u człowieka występuje pomiędzy HPV-16 i HPV-18 a rakiem szyjki macicy. Rak szyjki macicy jest najczęstszym nowotworem złośliwym w krajach rozwijających się - co roku występuje około nowych zachorowań. Innymi szczególnie interesującymi HPV pod względem raka są typy 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 i 68. Sugerowano, że cząstki wirusopodobne (VLP) HPV mogą być potencjalnymi szczepionkami w leczeniu HPV. Badania przeprowadzone na zwierzętach wykazały, że VLP nie wywołują ochrony krzyżowej przed zakażeniem innymi typami HPV - patrz np. Suzich, J. A. i in., Proc. Natl. Acad. Sci., 92: , 1995 i Breitburd, Seminars in Cancer Biology, tom 9, 1999, str Istnieje w dalszym ciągu zapotrzebowanie na szczepionkę, która chroniłaby przed wieloma typami HPV. Wynalazek odpowiada na to zapotrzebowanie. Wynalazek dotyczy zastosowania kompozycji zawierającej VLP HPV 16 i HPV 18 w połączeniu z adiuwantem zawierającym sól glinu i 3D-MPL do wytwarzania leku do zapobiegania zakażeniu i/lub chorobie spowodowanej jednym lub większą liczbą typów z grupy onkogennych HPV, z wykluczeniem z grupy typów HPV 16 i HPV 18. Korzystne jest zastosowanie do zapobiegania zakażeniu i/lub chorobie spowodowanej jednym lub większą liczbą typów z grupy HPV 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 i 68. Korzystniejsze jest zastosowanie do zapobiegania zakażeniu i/lub chorobie spowodowanej jednym lub większą liczbą typów z grupy HPV 31, HPV 33, HPV 35, HPV 52 i HPV 58. Jeszcze korzystniejsze jest zastosowanie do zapobiegania zakażeniu i/lub chorobie spowodowanej jednym lub większą liczbą typów z grupy HPV 31, HPV 35 i HPV 58. Korzystne jest zastosowanie, w którym stopień zapobiegania jest określany przez porównanie szczepionej populacji z nieszczepioną populacją placebo) pod względem wszystkich elementów grupy typów HPV. Korzystne jest zastosowanie, w którym adiuwant stanowi połączenie wodorotlenku glinu i 3D-MPL. Korzystne jest zastosowanie, w którym VLP zawiera białko L1 lub jego immunogenny fragment, a białko L2 jest nieobecne. Wynalazek dotyczy także zastosowania kompozycji zawierającej VLP HPV 16 i HPV 18 w połączeniu z adiuwantem zawierającym sól glinu i 3D-MPL do wytwarzania leku do wywoływania odpowiedzi odpornościowej przeciw jednemu lub większej liczbie typów z grupy onkogennych HPV, z wykluczeniem typów HPV 16 i HPV 18. Wynalazek dotyczy również zastosowania mieszaniny VLP HPV 16 i HPV 18 w połączeniu z adiuwantem zawierającym sól glinu i 3D-MPL do wytwarzania leku do zapobiegania zakażeniu i/lub chorobie w grupie ludzi grupą onkogennych typów HPV, z wykluczeniem typów HPV 16 i HPV 18, przy czym poziom zakażenia i/lub choroby obserwowany w tej grupie jest istotnie niższy niż obserwowany w grupie placebo. Wynalazek dotyczy ponadto kompozycji szczepionkowej zawierającej VLP HPV 16 i VLP HPV 18, w połączeniu z adiuwantem zawierającym sól glinu i 3D-MPL, charakteryzującej się tym, że prowadzi do ochrony krzyżowej przed zakażeniem i/lub chorobą spowodowaną onkogennymi typami HPV innymi niż typ 16 i 18. Nieoczekiwanie stwierdzono, że zastosowanie VLP HPV 16 i HPV 18 według wynalazku zapewnia ochronę krzyżową przed zakażeniem jednym lub większą liczbą typów z grupy onkogennych

3 PL B1 3 HPV (poza typami 16 i 18), przy czym onkogennymi typami są typy zdolne do powodowania raka. Grupa onkogennych typów obejmuje lub składa się z typów 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, 82, 26, 53 i 66. W szczególności, zastosowanie VLP HPV 16 i HPV 18 zapewnia ochronę krzyżową przed zakażeniem i/lub chorobą spowodowaną przez grupę typów HPV 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 i 68, w dalszej części M nazywaną grupą typów z wysokim ryzykiem raka. Zidentyfikowano ochronę przed całą grupą typów z wysokim ryzykiem raka i przed niektórymi swoistymi typami i połączeniami typów. Działanie to występuje oprócz homologicznego działania ochronnego obserwowanego wobec HPV 16 i HPV 18 przy zastosowaniu VLP odpowiednio HPV 16 i HPV 18. W związku z tym VLP HPV 16 i VLP HPV 18 mogą być stosowane w szczepionce zarówno przeciw HPV 16, HPV 18, jak i przeciw innym typom HPV. Określenie ochrona krzyżowa w opisie oznacza, że częstość występowania zakażenia dla grupy onkogennych typów HPV (zakażenie oznacza zakażenie jawne lub przetrwałe) i/lub onkogennych chorób spowodowanych zakażeniem HPV jest niższa w grupie osobników szczepionych VLP HPV 16 i/lub 18, korzystnie typami 16 i 18 niż w grupie nieszczepionej. Pełna ochrona krzyżowa przeciw typowi lub grupie typów nie jest niezbędna w wynalazku - w rzeczywistości każdy poziom ochrony krzyżowej przynosi korzyść. Korzystnie, obserwowany poziom ochrony krzyżowej jest taki, że w grupie szczepionej występuje o 5% mniej zakażeń i/lub chorób niż w porównywalnej nieszczepionej grupie, korzystniej do 10%, do 15%, do 20%, do 25%, do 30%, do 35%, do 40%, do 45%, do 50%, do 55%, do 60%, do 65%, do 70%, do 80%, do 90% lub nawet do 100% mniej zakażeń i/lub chorób. Ochronę krzyżową można ocenić wykrywając obecność kwasu nukleinowego swoistego dla różnych onkogennych typów w grupie szczepionych i kontrolnych osobników. Wykrywanie można przeprowadzić stosując np. takie techniki, jak opisane w WO nr i podanych tam pozycjach literaturowych, w szczególności dla nieswoistej amplifikacji DNA HPV, a następnie wykrywania typów DNA przy użyciu systemu LiPA, jak opisano w WO nr 99/ i w Kleter i in. [Journal of Clinical Microbiology (1999), 37(8): ]. Jednakże, do wykrywania DNA HPV W próbce można zastosować dowolny odpowiedni sposób, taki jak swoista dla danego typu PCR z użyciem starterów swoistych dla każdego z interesujących typów HPV. Odpowiednie startery są znane specjaliście lub mogą być z łatwością skonstruowane, gdyż znane są sekwencje onkogennych typów HPV. Odpowiednią ochronę krzyżową obserwuje się w populacji, korzystnie, które są seronegatywne na obecność zakażenia HPV lub seronegatywne na obecność HPV 16 i 18, korzystnie dorastających dziewcząt przed rozpoczęciem aktywności seksualnej. Korzystnie, obserwuje się ochronę krzyżową (ocenianą na podstawie ochrony obserwowanej w grupie szczepionej w porównaniu z grupą kontrolną) przed dowolnym onkogennym typem innym niż 16 i 18, np. przed dowolnym typem z grupy z wysokim ryzykiem raka 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 lub 68, albo łącznie przed grupami typów z wysokim ryzykiem raka, takimi jak dowolne 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 lub 11 typów lub w rzeczywistości przed wszystkimi typami z wysokim ryzykiem raka. Zgodnie z wynalazkiem uzyskuje się ochronę przeciw wszystkim możliwym połączeniom 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 lub 11 typów z wysokim ryzykiem raka i jako takie istnieją różne odmienne grupy typów VLP wyszczególnione w opisie, dla których można analizować poziom ochrony krzyżowej w porównaniu z grupą placebo. Korzystne jest zastosowanie VLP HPV 16 i/lub HPV 18 dla zapewnienia ochrony przed zakażeniem HPV przez dowolną taką grupę typów HPV. Tak więc kompozycja według wynalazku zapewnia ochronę krzyżową przed zakażeniem i/lub chorobą spowodowaną następującymi korzystnymi grupami typów HPV: A) grupą obejmującą jeden lub większą liczbę typów HPV 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68; B) grupą A, obejmującą typ 31 i jeden lub większą liczbę typów HPV 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68; C) grupą A lub B, obejmującą typ 33 i jeden lub większą liczbę typów HPV 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68; D) grupą A-C, obejmującą typ 35 i jeden lub większą liczbę typów HPV 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68; E) grupą A-D, obejmującą typ 39 i jeden lub większą liczbę typów HPV 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68; F) grupą A-E, obejmującą typ 45 i jeden lub większą liczbę typów HPV 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68;

4 4 PL B1 G) grupą A-F, obejmującą typ 51 i jeden lub większą liczbę typów HPV 52, 56, 58, 59, 66, 68; H) grupą A-G, obejmującą typ 52 i jeden lub większą liczbę typów HPV 56, 58, 59, 66, 68; I) grupą A-H, obejmującą typ 56 i jeden lub większą liczbę typów HPV 58, 59, 66, 68; J) grupą A-I, obejmującą typ 58 i jeden lub większą liczbę typów HPV 59, 66, 68; K) grupą A-J, obejmującą typ 59 i jeden lub większą liczbę typów HPV 66, 68; L) grupą A-K, obejmującą typ 66 i jeden lub większą liczbę typów HPV 68. W szczególności ustalono, że w populacji, w grupie placebo istniało o 38% wyższe prawdopodobieństwo zakażenia co najmniej jednym typem z grupy z wysokim ryzykiem raka w porównaniu z obiektami szczepionymi szczepionką zawierającą VLP HPV 16 i 18. W związku z tym, wynalazek dotyczy w szczególności zastosowania kompozycji zawierającej VLP HPV 16 i 18 do zapobiegania w populacji zakażeniu jednym lub większą liczbą typów z wysokim ryzykiem raka. Korzystnie, kompozycja jest do 20% lub co najmniej o 20% bardziej skuteczna niż placebo w zapobieganiu w populacji zakażeniu grupą obejmującą typy z wysokim ryzykiem raka, korzystnie do 25% lub co najmniej o 25% bardziej skuteczna, najkorzystniej do 30% lub co najmniej o 30% bardziej skuteczna, odpowiednio do 34% lub co najmniej o 34% bardziej skuteczna w zapobieganiu zakażeniu, najkorzystniej do 38% lub co najmniej o 38% bardziej skuteczna w zapobieganiu zakażeniu. Korzystnie, wynalazek dotyczy zastosowania kompozycji zawierającej VLP HPV 16 i 18 do wytwarzania leku do zapobiegania zakażeniu jednym lub większą liczbą HPV 31, 33, 35, 52 i 58. Ustalono, że w populacji, w grupie placebo istniało o 43% wyższe prawdopodobieństwo zakażenia co najmniej jednym z grupy typów HPV 31, 33, 35, 52 i 58 w porównaniu z ami szczepionymi VLP HPV 16 i 18. Dlatego wynalazek dotyczy w szczególności zastosowania kompozycji zawierającej VLP HPV 16 i 18 do zapobiegania w populacji zakażeniu jednym lub większą liczbą typów HPV 31, 33, 35, 52 i 58. Korzystnie, kompozycja jest do 10% lub co najmniej o 10% bardziej skuteczna niż placebo w zapobieganiu zakażeniu w populacji grupą obejmującą HPV 31, 33, 35, 52 lub 58, korzystniej do 15% lub co najmniej o 15% bardziej skuteczna, korzystniej do 20% lub co najmniej o 20% bardziej skuteczna, o 25% bardziej skuteczna, o 30% bardziej skuteczna, o 37% bardziej skuteczna lub odpowiednio do 43% lub co najmniej o 43% bardziej skuteczna w zapobieganiu zakażeniu. Korzystnie, wynalazek dotyczy zastosowania kompozycji zawierającej VLP HPV 16 i 18 do wytwarzania leku do zapobiegania zakażeniu jednym lub większą liczbą HPV 31, 35 i 58. Ustalono, że w populacji, w grupie placebo istniało o 58% wyższe prawdopodobieństwo zakażenia co najmniej jednym z grupy typów HPV 31, 33 i 58 w porównaniu z ami szczepionymi VLP HPV 16 i 18. Dlatego wynalazek dotyczy w szczególności zastosowania kompozycji zawierającej VLP HPV 16 i 18 do zapobiegania w populacji zakażeniu jednym lub większą liczbą HPV 31, 33 i 58. Korzystnie, kompozycja jest do 15% lub co najmniej o 15% bardziej skuteczna niż placebo w zapobieganiu zakażeniu w populacji grupą obejmującą HPV 31, 33 lub 58, korzystniej do 20% lub co najmniej o 20% bardziej skuteczna, korzystniej do 25% bardziej skuteczna, do 30%, do 35%, do 40%, do 45%, do 49%, do 55% lub nawet bardziej skuteczna, odpowiednio do 58% lub co najmniej o 58% bardziej skuteczna w zapobieganiu zakażeniu. Korzystnie, wynalazek dotyczy zastosowania kompozycji zawierającej VLP HPV 16 i 18 do wytwarzania leku do zapobiegania zakażeniu jednym lub większą liczbą HPV 45 i 59. W szczególności ustalono, że w populacji, w grupie placebo istniało o 33% wyższe prawdopodobieństwo zakażenia co najmniej jednym (lub większą liczbą) z grupy HPV typów 45 i 59 w porównaniu z ami szczepionymi szczepionką zawierającą VLP HPV 16 i 18. Dlatego wynalazek dotyczy w szczególności zastosowania kompozycji zawierającej VLP HPV 16 i 18 do zapobiegania w populacji zakażeniu jednym lub większą liczbą HPV 45 i HPV 59. Korzystnie, kompozycja jest do 20% lub co najmniej o 20% bardziej skuteczna niż placebo w zapobieganiu zakażeniu w populacji grupą obejmującą HPV 45 i HPV 59, korzystnie do 25% lub co najmniej o 25% bardziej skuteczna, korzystniej do 30% lub co najmniej o 30% bardziej skuteczna, korzystniej do 33% lub co najmniej o 33% bardziej skuteczna w zapobieganiu zakażeniu. Zatem, możliwe jest zapobieganie w populacji zakażeniu HPV, przy czym szczepienie VLP HPV 16, VLP HPV 18 lub ich mieszaniną zapewnia odporność krzyżową przed zakażeniem następującymi grupami typów HPV: wszystkimi onkogennymi typami HPV (poza typami 16 i 18), dowolną grupą wyszczególnioną w powyższych punktach A-L, grupą typów z wysokim ryzykiem raka, grupą HPV 31, 35, 58; grupą HPV 31, 33, 35, 52, 58; grupą HPV 45 i 59, ochrona uzyskiwana przed wszystkimi elementami tej grupy jest łącznie większa niż obserwowana przy podawaniu placebo.

5 PL B1 5 Korzystnie, kompozycja zawierająca VLP HPV 16 i HPV 18 zapewnia ochronę krzyżową przed co najmniej jednym zakażeniem HPV 35 i HPV 52. Korzystnie, kompozycja VLP HPV 16 i HPV 18 zapewnia także ochronę przed zakażeniem HPV 16 i/lub HPV 18, korzystnie zarówno HPV 16, jak i HPV 18. Ponadto, można stosować VLP HPV 16 do zapobiegania zakażeniu jednym lub większą liczbą elementów z grupy typów z wysokim ryzykiem raka, korzystnie grupy obejmującej HPV 31, 33, 35, 52, 58 lub grupy obejmującej 31, 35, 58. Ponadto, można stosować VLP HPV 16 do wytwarzania leku do zapobiegania zakażeniu jednym lub większą liczbą elementów z grupy typów z wysokim ryzykiem raka, korzystnie grupy obejmującej HPV 31, 33, 35, 52, 58 lub grupy obejmującej 31, 35, 58. Można stosować również VLP HPV 18 do zapobiegania zakażeniu jednym lub większą liczbą elementów z grupy typów z wysokim ryzykiem raka, korzystnie grupy obejmującej HPV 45 i 59 VLP HPV 16 można stosować przy braku VLP któregokolwiek innego typu HPV lub mogą być stosowane w połączeniu z VLP innego typu HPV. Zgodnie z wynalazkiem VLP HPV 16 stosuje się w połączeniu z VLP HPV 18. Podobnie, VLP HPV 18 można stosować przy braku VLP któregokolwiek innego typu HPV lub mogą być stosowane w połączeniu z VLP innego typu HPV. Zgodnie z wynalazkiem VLP HPV 18 stosuje się w połączeniu z VLP HPV 16. Korzystnie, połączenie VLP HPV 16 i VLP HPV 18 stosuje się w celu zapewnienia ochrony przed poszczególnymi typami onkogennymi, korzystnie typami z wysokim ryzykiem raka, w szczególności typami HPV 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68. Poza efektem ochrony krzyżowej korzystnie immunogenną kompozycję według wynalazku, zawierającą połączenie VLP HPV 16 i HPV 18, stosuje się w czynnej immunizacji dorosłych dorastających dziewcząt w wieku co najmniej 10 lat, w celu zapobiegnięcia jednemu lub większej liczbie zakażeń HPV-16 i HPV-18, przetrwałemu zakażeniu HPV-16 i HPV-18 i związanemu z HPV-16 i HPV- -18 nowotworowi szyjki macicy. Zgodnie z korzystnym zastosowaniem immunogennej kompozycji według wynalazku wykorzystuje się ja do zapobiegania nowotworowi szyjki macicy związanemu z zakażeniem innym onkogennym typem wirusa (nie HPV 16, 18). VLP HPV i sposoby wytwarzania VLP są dobrze znane. VLP zazwyczaj tworzy się z białek strukturalnych L1 i ewentualnie L2 wirusa, patrz np. WO nr i WO nr W wynalazku można stosować dowolne odpowiednie VLP HPV, które zapewnia ochronę krzyżową, takie jak VLP L1 lub L1 + L2. Korzystnie, VLP oznacza VLP wyłącznie L1. VLP może zawierać pełnej długości białko L1. Korzystnie, białko L1 stosowane do utworzenia VLP jest skróconym białkiem L1. Korzystnie, skrócenie usuwa sygnał lokalizacji jądrowej. Korzystnie, skrócenie jest skróceniem C-końcowym. Korzystnie, skrócenie C-końcowe usuwa poniżej 50 aminokwasów, korzystniej poniżej 40 aminokwasów. Gdy VLP jest VLP HPV 16, to korzystnie skrócenie C-końcowe usuwa 34 aminokwasy z L1 HPV 16. Gdy VLP jest VLP HPV 18, wtedy korzystnie skrócenie C-końcowe usuwa 35 aminokwasów z L1 HPV 18. Skrócone białka L1 są dogodnie funkcjonalnymi pochodnymi białka L1. Funkcjonalne pochodne białka L1 są zdolne do wywoływania odpowiedzi odpornościowej (w razie potrzeby po dodaniu odpowiedniego adiuwanta), przy czym ta odpowiedź odpornościowa jest zdolna do rozpoznawania VLP składającego się z białka L1 pełnej długości i/lub HPV typu, z którego pochodzi białko L1. VLP do stosowania zgodnie z wynalazkiem mogą także zawierać inne typy funkcjonalnych pochodnych białek, obejmujące pełnej długości lub skrócone mutanty białek L1 HPV, takie jak mutanty z delecją, substytucją lub insercją. Odpowiednie pochodne obejmują także sekwencje optymizowane względem kodonów. Białkiem L1 lub pochodną może być także białko fuzyjne, takie jak fuzja białka L1 z L2 lub z wczesnym białkiem. Białko L1 lub funkcjonalna pochodna białka może tworzyć VLP, a tworzenie VLP można oceniać standardowymi technikami, takimi jak np. mikroskopia elektronowa i dynamiczne rozpraszanie światła laserowego. VLP mogą być wytwarzanie w dowolnym odpowiednim substracie komórkowym, takim jak komórki drożdży lub komórki owadzie, np. komórki w układzie bakulowirusowym, a techniki wytwarzania VLP są dobrze znane, np. z WO nr i US nr i podanych w nich pozycjach literaturowych.

6 6 PL B1 VLP są korzystnie wytwarzane technikami rozkładania i ponownego składania, które mogą dostarczyć trwalsze i/lub bardziej jednorodne VLP wirusa brodawczaka. Przykładowo, McCarthy i in., 1998 Quantitative Disassembly and Reassembly of Human Papillomavirus Type 11 Viruslike Particles in Vitro J. Virology 72 (1): 33-41, opisują rozkładanie i ponownie składanie rekombinowanych VLP L1 HPV 11, oczyszczonych z komórek owadzich w celu uzyskania jednorodnego preparatu VLP. W WO nr i US nr także opisano procesy rozkładania/ponownego składania do wytwarzania VLP HPV. Korzystnie, VLP HPV do stosowania zgodnie z wynalazkiem wytwarza się w sposób opisany w WO nr lub US nr VLP zgodnie z wynalazkiem stosuje się w połączeniu z adiuwantem. Szczepionki mogą zawierać odpowiedni adiuwant lub immunostymulant, taki jak, lecz nie wyłącznie, detoksykowany lipid A z dowolnego źródła i nietoksyczne pochodne lipidu A, saponiny i inne odczynniki zdolne do pobudzenia odpowiedzi typu TH1. Od dawna wiadomo, że lipopolisacharyd (LPS) pałeczek jelitowych jest silnym stymulatorem układu odpornościowego, aczkolwiek jego stosowanie w adiuwantach jest ograniczane przez jego działania toksyczne. Nietoksyczna pochodna LPS, monofosforylolipid A (MPL), wytwarzana przez usunięcie grupy węglowodanowej rdzenia i fosforanu z glukozaminy na końcu redukującym, została opisana przez Ribi i in. (1986, Immunology and Immunopharmacology of bacterial endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY, str ) i ma następującą budowę: Kolejną detoksykowaną odmianą MPL otrzymuje się przez usunięcie łańcucha acylowego z pozycji 3 szkieletu disacharydowego i określana jest ona jako 3-O-deacylowany monofosforylolipid A (3D-MPL). Można go oczyszczać i wytwarzać sposobami podanymi w GB nr B, gdzie ujawniono także wytwarzanie difosforylolipidu A i jego 3-O-deacylowanych wariantów. Korzystną postacią 3D-MPL jest postać emulsji zawierająca małe cząstki o średnicy poniżej 0,2 μm, a sposób jej wytwarzania ujawniono w WO nr 94/ Wodne preparaty zawierające monofosforylolipid A i środek powierzchniowo czynny opisano w WO nr A2. Adiuwanty będące pochodnymi bakteryjnego lipopolisacharydu do formułowania w kompozycje mogą być oczyszczane i przetwarzane ze źródeł bakteryjnych lub alternatywnie mogą być syntetyczne. Oczyszczony monofosforylolipid A opisali np. w Ribi i in., 1986 (patrz wyżej), a 3-O-deacylowany monofosforylo- lub difosforylolipid A, otrzymane z Salmonella sp., opisano w GB nr i US nr Opisano inne oczyszczone i syntetyczne lipopolisacharydy (Hilgers i in., 1986, Int. Arch. Allergy. Immunol., 79 (4): 392-6; Hilgers i in., 1987, Immunology, 60 (1): i EP nr B1). Szczególnie korzystnym adiuwantem będącym bakteryjnym lipopolisacharydem jest 3D-MPL.

7 PL B1 7 Odpowiednio, pochodnymi LPS, które można stosować, są te immunostymulanty, które mają budowę podobną do LPS lub MPL lub 3D-MPL. W innej postaci pochodną LPS może być acylowany monosacharyd, który stanowi część powyższej struktury MPL. Saponiny opisano w Lacaille-Dubois, M. i Wagner, H. (1996, A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine, tom 2, str ). Saponiny są glikozydami steroidowymi lub triterpenowymi szeroko rozpowszechnionymi w królestwie roślin i zwierząt morskich. Stwierdzono, że saponiny tworzą koloidalne roztwory w wodzie, który pienią się przy wstrząsaniu oraz strącają cholesterol. Gdy saponiny znajdą się w pobliżu błon komórkowych, tworzą w błonie struktury poropodobne, co powoduje pękanie błony. Przykładem tego zjawiska jest hemoliza erytrocytów, będąca właściwością niektórych, ale nie wszystkich saponin. Saponiny są znanymi adiuwantami w szczepionkach do podawania układowego. Aktywność adiuwantowa i hemolityczna poszczególnych saponin została wszechstronnie przebadana (Lacaille- -Dubois i Wagner, patrz wyżej). Przykładowo, Quil A (pochodzący z kory południowoamerykańskiego drzewa Quillaja Saponaria Molina) i jego frakcje opisano w US nr oraz w Saponins as vaccine adjuvants, Kensil, C. R., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 1996, 12 (1-2): 1-55 i EP nr B1. Struktury w postaci cząstek, nazywane kompleksami immunostymulującymi (ISCOM), zawierające frakcje Quil A wywierają działanie hemolityczne i zostały zastosowane do wytwarzania szczepionek (Morein, B., EP nr B1; WO nr 96/11 711; WO nr 96/33 739). Opisano hemolityczne saponiny QS21 i QS17 (frakcje Quil A oczyszczone metodą HPLC) jako silne układowe adiuwanty, a sposób ich wytwarzania ujawniono w US nr i w EP nr B1. Inne saponiny, które stosowano w badaniach układowego szczepienia obejmują saponiny pochodzące z innych gatunków roślin, takich jak Gypsophila i Saponaria (Bomford i in., Vaccine, 10 (9): , 1992). Wzmocniony układ zawiera połączenie nietoksycznej pochodnej lipidu A i pochodnej saponiny, w szczególności połączenie QS21 i 3D-MPL, ujawnione w WO nr 94/ lub mniej reaktywna kompozycja, w której QS21 jest zdezaktywowany cholesterolem, ujawniona w WO nr 96/ Szczególnie silny preparat adiuwantowy, zawierający QS21 i 3D-MPL w emulsji olej w wodzie, opisano w WO nr 95/ Możliwe jest wytworzenie szczepionki adiuwantowanej detoksykowanym lipidem A lub nietoksyczną pochodną lipidu A, korzystniej adiuwantowanej monofosforylolipidem A lub jego pochodną. Szczepionka może dodatkowo zawierać saponinę, korzystnie QS21. Preparat może dodatkowo stanowić emulsję olej w wodzie. Preparat szczepionki można wytworzyć przez zmieszanie peptydu L2 z farmaceutycznie dopuszczalną zaróbką, taką jak 3D-MPL. Dodatkowe składniki, które ewentualnie są obecne w adiuwantowanym preparacie szczepionki według wynalazku obejmują niejonowe detergenty, takie jak oktoksynole i estry polioksyetylenu, opisane w opisie, w szczególności oktylofenoksypolietoksyetanol (Triton X-100) i monooleinian polioksyetylenosorbitanu (Tween 80); oraz sole żółciowe lub pochodne kwasu cholowego, opisane w opisie, w szczególności deoksycholan lub taurodeoksycholan sodu. Szczególnie korzystny preparat zawiera 3D-MPL, Triton X-100, Tween 80 i deoksycholan sodu i można go połączyć z preparatem antygenu L2 w celu otrzymania odpowiedniej szczepionki. Szczepionka może zawierać preparat pęcherzykowego adiuwantu, zawierający cholesterol, saponinę i pochodną LPS. W tym względzie korzystny preparat adiuwantu zawiera jednowarstewkowy pęcherzyk, zawierający cholesterol, z podwójną warstwą lipidową korzystnie zawierającą dioleoilofosfatydylocholinę, przy czym saponina i pochodna LPS są połączone z podwójną warstwą lipidową lub osadzone w niej. Korzystniej, takie preparaty adiuwantowe zawierają QS21 jako saponinę i 3D-MPL jako pochodną LPS, przy czym stosunek wagowy QS:cholesterol wynosi 1:1 do 1:100, a najkorzystniej 1:5. Takie preparaty adiuwantowe opisano w EP nr B. Szczepionki zgodnie z wynalazkiem stosuje się w połączeniu z glinem i są one dogodnie zaadsorbowane lub częściowo zaadsorbowane na adiuwantach glinowych. Odpowiednio adiuwantem jest sól glinu, w postaci połączenia z 3D MPL, takiego jak fosforan glinu i 3D MPL. Korzystny jest także wodorotlenek glinu w połączeniu z 3D MPL. Zgodnie z wynalazkiem stosuje się połączenie VLP z solą glinu + 3D MPL. Wodorotlenek glinu jest korzystny jako sól glinu. Szczepionka może także zawierać glin lub związek glinu jako stabilizator. Szczepionki według wynalazku mogą być dostarczane którąkolwiek z szeregu dróg, takich jak droga doustna, miejscowa, podskórna, śluzówkowa (typowo dopochwowa), dożylna, domięśniowa, donosowa, podjęzykowa, śródskórna i w postaci czopka.

8 8 PL B1 Szczepionkę ewentualnie można także formułować lub współpodawać z innymi antygenami HPV, takimi jak wczesne antygeny lub antygenami innymi niż HPV. Odpowiednio takie antygeny inne niż HPV mogą zapewniać ochronę przed innymi chorobami, najkorzystniej chorobami przenoszonymi drogą płciową, takimi jak spowodowanymi wirusem opryszczki pospolitej, EBV, chlamydiami i HIV. Szczególnie korzystnie szczepionka zawiera gd z HSV lub jego postać skróconą. W ten sposób szczepionka zapewnia ochronę zarówno przed HPV, jak i HSV. Dawka składników szczepionki będzie różna w zależności od stanu, płci, wieku i masy ciała osobnika, drogi podawania i HPV szczepionki. Ilość może być także różna w zależności od liczby typów VLP. Dogodnie dostarczana jest ilość szczepionki odpowiednia do wytworzenia odpowiedzi immunologicznie ochronnej. Dogodnie każda dawka szczepionki zawiera po μg każdych VLP, korzystnie 5-80 μg, korzystniej 5-30 μg każdych VLP, najkorzystniej 5-20 μg każdych VLP, przy czym szczególnie korzystne są dawki 5 μg, 6 μg, 10 μg, 15 μg lub 20 μg. W przypadku wszystkich szczepionek według wynalazku korzystnie szczepionkę stosuje się do szczepienia dorastających dziewcząt w wieku lat, korzystnie lat. Szczepionkę można także podawać om po uzyskaniu nieprawidłowego rozmazu Papanicolau lub po chirurgicznym wycięciu zmiany spowodowanej przez HPV lub om seronegatywnym i posiadają ujemny wynik badania na obecność DNA HPV typów związanych z rakiem. Korzystnie, szczepionka jest dostarczana w schemacie 2 lub 3 dawek, np. w schemacie podawania odpowiednio w miesiącu 0, 1 lub schemacie podawania w miesiącu 0, 1 i 6. Odpowiednio, schemat szczepienia obejmuje wstrzykiwanie dawki przypominającej po 5-10 latach, korzystnie po 10 latach. Korzystnie, szczepionkę stanowi ciekły preparat szczepionki, chociaż szczepionka może być liofilizowana i roztwarzana przed podaniem. Korzystnie, immunogen stosowany zgodnie z wynalazkiem (VLP HPV 16 i HPV 18) stosuje się jako szczepionkę i może być on formułowany w szczepionkę przy użyciu odpowiednich zarobek. Dlatego wynalazek w szczególności dotyczy zastosowania szczepionki HPV 16 i HPV 18, takiej jak szczepionka zawierająca jedynie L1, do zapobiegania zakażeniu HPV. Niniejszym wynalazek jest zilustrowany poniższym przykładem. P r z y k ł a d Zdrowe y w wieku lat zaszczepiono mieszaniną VLP HPV 16 i/lub HPV 18. Kobiety w momencie włączenia do badania były: 1) seronegatywne na obecność HPV-16 i HPV-18; 2) miały ujemny wynik badania na obecność zakażenia szyjki macicy HPV z wysokim ryzykiem (wykrywanego za pomocą PCR HPV); 3) dotychczas miały co najwyżej 6 partnerów seksualnych i 4) miały prawidłowe rozmazy PAP. Mieszanina zawierała, na 0,5 ml dawkę, 20 μg VLP L1 HPV-6, 20 μg VLP L1 HPV-18 i była adiuwantowana 500 μg wodorotlenku glinu i 50 μg 3D-MPL. W grupie placebo wstrzykiwano jedynie 500 μg wodorotlenku glinu. Oceniano skuteczność szczepionki (S. S.) przed typami HPV z wysokim ryzykiem raka, przy czym S. S. oznacza procent zwiększenia ochrony przed zakażeniem zapewnianej przez szczepionkę w porównaniu z grupą placebo. Ochronę krzyżową oceniano wykrywając obecność kwasu nukleinowego swoistego dla różnych onkogennych typów w grupie osobników szczepionych i kontrolnych. Wykrywanie przeprowadzano techniką opisaną w WO nr i podanych tam pozycjach literaturowych, w szczególności drogą nieswoistej amplifikacji DNA HPV, a następnie wykrywania typów DNA przy użyciu systemu LiPA, jak opisano w WO nr 99/ oraz Kleter i in. [Journal of Clinical Microbiology (1999), 37 (8): ]. Jednakże, do wykrywania DNA HPV w próbce można zastosować dowolny odpowiedni sposób, taki jak swoista względem typu PCR z użyciem starterów swoistych dla każdego z interesujących typów HPV. Odpowiednie startery są znane fachowcom lub można je z łatwością skonstruować, gdyż znane są sekwencje onkogennych typów HPV. Oceniano skuteczność szczepionki wobec zakażeń dla wszystkich 12 typów z wysokim ryzykiem raka, typów filogenetycznie związanych z HPV-16 (grupy 31, 35 i 58; 31, 33, 35, 52 i 58) i typów filogenetycznie związanych z HPV-16 (45 i 59). Wstępną analizę przeprowadzono na populacji ITT (w kohorcie zgodnej z zaplanowanym leczeniem, obejmującej wszystkie osoby, które otrzymały co najmniej jedną dawkę szczepionki). Dane te przedstawiono w tabeli 1.

9 PL B1 9 Wyniki przedstawione w tabelach 2 i 3 dotyczą grupy ATP (zgodnej z protokołem): pacjentek, które spełniały wszystkie kryteria tego badania. W tabeli 2 przedstawiono analizę w punkcie środkowym badania, przy czym dane uzyskano od wszystkich pacjentek w punkcie czasowym, w którym co najmniej 50% kohorty ukończyło 18 miesięcy po pierwszym szczepieniu. W tabeli 3 podano ostateczne wyniki; wszystkie dane uzyskano od osobników 18 miesięcy po pierwszym szczepieniu (miesiąc 0). W grupie ATP wszystkie pacjentki otrzymały 3 dawki szczepionki w miesiącu 0, 1 i 6 i były seronegatywne w 6 miesiącu. Jak pokazują dane przedstawione w tabeli 1, immunizacja mieszaniną VLP HPV 16 i HPV 18 zapewniała oczywistą ochronę krzyżową przed innymi typami HPV. Na tym etapie wielkości próby są za małe, aby mogły być poddane rygorystycznej analizie statystycznej, jednakże dane wykazują korzystny trend i sugerują, że immunizacja VLP HPV 16 i HPV 18 będzie skuteczna wobec zakażenia innymi typami HPV. Potwierdzono to w trakcie postępu badania. Tabela 2 pokazuje, że HPV 16 i HPV 18 zapewniają statystycznie istotną ochronę krzyżową przed grupą typów z wysokim ryzykiem raka 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 i 68. Tabela 3 pokazuje, że z wyjątkiem typów związanych z HPV-18 (dla których istnieje bardzo silny trend) występuje statystycznie istotna ochrona krzyżowa przed grupami HPV 31, 35, 58; HPV 31, 33, 35, 52, 58; i ocenianymi 12 typami z wysokim ryzykiem (nie HPV-16/18). Analizowane typy HPV Liczba zakażonych szczepionki) % zakażonych szczepionki) = A Liczba zakażonych placebo) T a b e l a 1 % zakażonych placebo) = B % skuteczność szczepionki 1-(A/B) x 100, skorygowana o względną wielkość grup szczepionki i placebo Granice 95% przedziału ufności - dolna granica Granice 95% przedziału ufności - górna granica HPV 31, 35, ,1 11 2,4 55,1-29,1 84,4 0,127 HPV 31, 33, 35, 52, ,8 24 5,4 30,3-29,7 62,6 0,252 HPV 45, ,7 6 1,3 50,6-97,7 87,6 0,309 HPV 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, ,3 40 9,4 34,6-6,5 59,9 0,086 P Próbki od pacjentek pobierano w 9, 12, 15 i 18 miesiącu i badano na obecność zakażenia wyszczególnionymi powyżej typami HPV. Tabela 2 - skuteczność szczepionki po trzech dawkach w zapobieganiu jawnych zakażeń heterologicznych. T a b e l a 2 Skuteczność szczepionki wobec zakażenia typami filogenetycznie związanymi z HPV-16, typami filogenetycznie związanymi z HPV-18, typami filogenetycznie związanymi z HPV-16 i/lub HPV-18 i wszystkimi typami z wysokim ryzykiem poza HPV-16 i HPV-18 - kohorta ATP (miesiąc 6-18) Typ zakażenia Częstość występowania Skuteczność szczepionki Szczepionka Placebo N n CW N n CW % 95% PU Wartość p Związane z HPV , ,5 49,4 0,2 74,4 0,060 Związane z HPV-16* , ,9 37,0 1,6 59,6 0,052

10 10 PL B1 cd. tabeli Związane z HPV , ,6 42,9-27,9 74,5 0,223 Związane z HPV-16/ , ,4 48,2 13,8 68,9 0,012 Związane z HPV-16/18* , ,2 39,3 9,0 59,5 0,019 Z wysokim ryzykiem** , ,8 39,6 17,7 55,7 0,001 N = liczba osobników w konkretnej kohorcie; n = liczba osobników z jawnym zakażeniem HPV; CW = częstość występowania = n/n; 95% PU = 95% przedział ufności; dolna granica = 1 - exp (log(cws/cwp) + 1,96* pierw. kw. (1/nS - 1/NS + 1/nP - 1/NP)); górna granica = 1 - exp (log(cws/cwp) - 1,96 * pierw. kw. (1/nS - 1/NS + 1/nP - 1/NP)); gry liczba przypadków w grupie szczepionki = 0: dolna granica* = 1 - exp (log(cws*/cwp*) + 1,96 * pierw. kw. (1/(nS + 0,5) - 1/(NS + 0,5) + 1/(nP + 0,5) - 1/(NP + 0,5))); górna granica* = 1 - exp (log(cws*/cwp*) - 1,96 * pierw. kw. (1/(nS + 0,5) - 1/(NS + 0,5) + 1/(nP + 0,5) - 1/(NP + 0,5))); przy czym: CWS = częstość występowania u osobników szczepionych, CWP = częstość występowania u osobników otrzymujących placebo, ns = liczba przypadków wśród osobników szczepionych, NS = liczba wszystkich osobników szczepionych, np = liczba przypadków wśród osobników otrzymujących placebo, NP = liczba wszystkich osobników otrzymujących placebo, Związane z HPV-16: typy filogenetycznie związane z HPV-16: 35, 31, 58 bez uwzględniania innych typów HPV Związane z HPV-16*: typy filogenetycznie związane z HPV-16: 35, 31, 58, 33, 52 bez uwzględniania innych typów HPV; Związane z HPV-18: typy filogenetycznie związane z HPV-18: 45, 59 bez uwzględniania innych typów HPV; Związane z HPV-16 i/lub HPV-18: typy filogenetycznie związane z HPV-16 i/lub HPV-18: 35, 31, 58, 45, 59 bez uwzględniania innych typów HPV; Związane z HPV-16 i/lub HPV-18*: typy filogenetycznie związane z HPV-16 i/lub HPV-18: 35, 31, 58, 33, 52, 45, 59 bez uwzględniania innych typów HPV; ** = typy z wysokim ryzykiem, z wyjątkiem HPV-16 i HPV-18. Analizowane typy HPV Całkowita liczba osobników w grupie, dla których dysponowano informacjami Liczba zakażonych szczepionki) % zakażonych szczepionki) = A T a b e l a 3 Liczba zakażonych placebo) % zakażonych placebo) = B % skuteczność szczepionki 1 - (A/B) x 100, skorygowana o względną wielkość grup szczepionki i placebo Granice 95% przedziału ufności - dolna granica Granice 95% przedziału ufności - górna granica HPV 31, 35, ,7 26 6,3 57,9 15,9 78,9 0,012 HPV 31, 33, 35, 52, , ,2 43,0 11,0 63,5 0,015 HPV 45, ,4 15 3,6 33,5-46,3 69,8 0,319 HPV 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, , ,3 27,7 16,2 53,6 0,002 Próbki od pacjentek pobierano w 18 miesiącu i badano na obecność zakażenia wyszczególnionymi powyżej typami HPV. P

11 PL B1 11 Zastrzeżenia patentowe 1. Zastosowanie kompozycji zawierającej VLP HPV 16 i HPV 18 w połączeniu z adiuwantem zawierającym sól glinu i 3D-MPL do wytwarzania leku do zapobiegania zakażeniu i/lub chorobie spowodowanej jednym lub większą liczbą typów z grupy onkogennych HPV, z wykluczeniem z grupy typów HPV 16 i HPV Zastosowanie kompozycji według zastrz. 1 do zapobiegania zakażeniu i/lub chorobie spowodowanej jednym lub większą liczbą typów z grupy HPV 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 i Zastosowanie według zastrz. 2 do zapobiegania zakażeniu i/lub chorobie spowodowanej jednym lub większą liczbą typów z grupy HPV 31, HPV 33, HPV 35, HPV 52 i HPV Zastosowanie według zastrz. 3 do zapobiegania zakażeniu i/lub chorobie spowodowanej jednym lub większą liczbą typów z grupy HPV 31, HPV 35 i HPV Zastosowanie według zastrz. 1-4, w którym stopień zapobiegania jest określany przez porównanie szczepionej populacji z nie szczepioną populacją placebo) pod względem wszystkich elementów grupy typów HPV. 6. Zastosowanie według zastrz. 1-5, w którym adiuwant stanowi połączenie wodorotlenku glinu i 3D-MPL. 7. Zastosowanie według zastrz. 1-6, w którym VLP zawiera białko L1 lub jego immunogenny fragment, a białko L2 jest nieobecne. 8. Zastosowanie kompozycji zawierającej VLP HPV 16 i HPV 18 w połączeniu z adiuwantem zawierającym sól glinu i 3D-MPL do wytwarzania leku do wywoływania odpowiedzi odpornościowej przeciw jednemu lub większej liczbie typów z grupy onkogennych HPV, z wykluczeniem typów HPV 16 i HPV Zastosowanie mieszaniny VLP HPV 16 i HPV 18 w połączeniu z adiuwantem zawierającym sól glinu i 3D-MPL do wytwarzania leku do zapobiegania zakażeniu i/lub chorobie w grupie ludzi grupą onkogennych typów HPV, z wykluczeniem typów HPV 16 i HPV 18, przy czym poziom zakażenia i/lub choroby obserwowany w tej grupie jest istotnie niższy niż obserwowany w grupie placebo. 10. Kompozycja szczepionkowa zawierająca VLP HPV 16 i VLP HPV 18, w połączeniu z adiuwantem zawierającym sól glinu i 3D-MPL, znamienna tym, że prowadzi do ochrony krzyżowej przed zakażeniem i/lub chorobą spowodowaną onkogennymi typami HPV innymi niż typ 16 i 18.

12 12 PL B1 Departament Wydawnictw UPRP Cena 4,92 zł (w tym 23% VAT)