(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (13) (51) T3 Int.Cl. C12N 15/63 ( ) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2015/34 EP B1 (54) Tytuł wynalazku: SYSTEMY CRISPR-CAS I SPOSOBY ZMIENIANIA EKSPRESJI PRODUKTÓW GENÓW (30) Pierwszeństwo: US P US P US P US P US P US (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2014/33 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2016/05 (73) Uprawniony z patentu: The Broad Institute, Inc., Cambridge, US Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, US (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 FENG ZHANG, Cambridge, US (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Anna Grzelak WTS RZECZNICY PATENTOWI WITEK, ŚNIEŻKO I PARTNERZY ul. R. Weigla Wrocław Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 PZ/3317/AGR 1 EP B1 Opis DZIEDZINA WYNALAZKU [0001] Niniejszy wynalazek zasadniczo odnosi się do systemów, sposobów i kompozycji stosowanych do kontrolowania ekspresji genów obejmującego celowanie sekwencyjne, takiego jak zaburzenia genomowe lub redagowanie genów, które mogą wykorzystywać systemy wektorowe związane ze Zgrupowanymi Regularnie Rozmieszczonymi Krótkimi Powtórzeniami Palindromowymi (CRISPR, ang. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) i ich elementami. OŚWIADCZENIE W ZWIĄZKU Z BADANIAMI SPONSOROWANYMI PRZEZ RZĄD FEDERALNY [0002] Niniejszy wynalazek powstał ze wsparciem rządowym przydzielonym w ramach NIH Pioneer Award DP1MH przez National Institutes of Health (Narodowe Instytuty Zdrowia). Rząd posiada pewne prawa do tego wynalazku STAN TECHNIKI [0003] Ostatnie postępy w technikach sekwencjonowania i metodach analizy genomu znacząco przyspieszyły możliwość katalogowania i mapowania czynników genetycznych związanych ze zróżnicowanym zakresem biologicznych funkcji i chorób. Precyzyjne techniki celowania genomowego wymagane są w celu umożliwienia systematycznej odwrotnej inżynierii dla przyczynowej zmienności genetycznej poprzez umożliwienie selektywnego zaburzania poszczególnych elementów genetycznych, jak również do rozwijania zastosowań biologii syntetycznej, biotechnologicznych i medycznych. Chociaż dostępne są do tworzenia celowanych zaburzeń genomowych techniki redagowania genomu, takie jak projektowane palce cynkowe, efektory podobne do aktywatorów transkrypcji (TALE, ang. Transcription Activator-Like Effectors) lub naprowadzane meganukleazy, pozostaje zapotrzebowanie na nowe technologie inżynierii genomowej, które są przystępne finansowo, łatwe do ustawienia, skalowalne i podatne na celowanie do wielu pozycji w obrębie genomu eukariotycznego. KRÓTKI OPIS WYNALAZKU [0004] Istnieje naglące zapotrzebowanie na alternatywne i solidne systemy oraz techniki do celowania sekwencyjnego z szerokim zakresem zastosowań. Niniejszy wynalazek odpowiada na to zapotrzebowanie i zapewnia powiązane z tym korzyści. CRISPR/Cas lub system CRISPR-Cas (obydwa terminy są stosowane zamiennie w całym niniejszym zgłoszeniu) nie wymaga wytwarzania dostosowanych białek w celu celowania w konkretne sekwencje, można natomiast zaprogramować pojedynczy enzym Cas, z pomocą krótkiej cząsteczki RNA, do rozpoznawania specyficznego docelowego DNA, innymi słowy enzym Cas może być rekrutowany do specyficznego docelowego DNA, z zastosowaniem wymienionej krótkiej cząsteczki RNA. Dodanie systemu CRISPR-Cas do repertuaru technik sekwencjonowania i metod analizy genomu może istotnie uprościć metodologię i przyspieszyć możliwość katalogowania i mapowania czynników genetycznych związanych ze zróżnicowanym zakresem biologicznych funkcji i chorób. W celu skutecznego wykorzystywania systemu CRISPR-Cas do redagowania genomu bez szkodliwych skutków, niezbędne jest zrozumienie aspektów inżynierii oraz optymalizacji tych narzędzi inżynierii genomu, które stanowią aspekty niniejszego ujawnienia.

3 PZ/3317/AGR 2 EP B1 [0005] Według niniejszego wynalazku, zapewniony jest skonstruowany, niewystępujący naturalnie system wektorowy CRISPR-Cas według zastrz. 1. Dalsze aspekty wynalazku ujawniono w zastrzeżeniach zależnych. Wynalazek zapewnia też zastosowania systemu, według zastrz. 13 do 15. [0006] W jednym z aspektów, ujawnienie zapewnia sposób zmieniania lub modyfikacji ekspresji jednego lub więcej produktów genów, który może obejmować wprowadzanie do komórki zawierającej i wyrażającej cząsteczki DNA kodujące jeden lub więcej produktów genów, skonstruowanego, niewystępującego naturalnie systemu CRISPR-Cas, który może obejmować białko Cas i jeden lub więcej kierujących RNA (ang. guide RNA), które celują w cząsteczki DNA, przy czym jeden lub więcej kierujących RNA celują w genomowe loci cząsteczek DNA kodujących jeden lub więcej produktów genów, a białko Cas tnie genomowe loci cząsteczek DNA kodujących jeden lub więcej produktów genu, przy czym ekspresja jednego lub więcej produktów genów jest zmieniana lub modyfikowana; i przy czym białko Cas i kierujący RNA naturalnie nie występują razem. Ujawnienie obejmuje sytuację, gdy zmieniana lub modyfikowana może być ekspresja dwóch lub więcej produktów genów. Ujawnienie ponadto obejmuje sytuację, gdy kierujący RNA obejmuje sekwencję kierującą połączoną z sekwencją tracr. W korzystnym przykładzie wykonania, komórką jest komórka eukariotyczna, w korzystniejszym przykładzie wykonania, komórką jest komórka ssaka, a w jeszcze korzystniejszym przykładzie wykonania komórką ssaka jest komórka ludzka. Ujawnienie obejmuje też sytuację, gdy białko Cas może obejmować jeden lub więcej sygnałów lokalizacji jądrowej (NLS). W niektórych przykładach wykonania, białkiem Cas jest enzym systemu CRISPR typu II. W niektórych przykładach wykonania białkiem Cas jest białko Cas9. W niektórych przykładach wykonania, białkiem Cas9 jest Cas9 z S. pneumoniae, S. pyogenes, lub S. thermophilus, co może obejmować zmutowane Cas9 pochodzące z tych organizmów. Białkiem może być homolog lub ortolog Cas9. W niektórych przykładach wykonania, białko Cas jest optymalizowane pod względem kodonów do ekspresji w komórce eukariotycznej. W niektórych przykładach wykonania, białko Cas kieruje cięciem jednej lub dwóch nici w miejscu sekwencji docelowej. W dalszym aspekcie ujawnienia, ekspresja produktu genu jest zmniejszana, a produktem genu jest białko. Ujawnienie obejmuje sytuację, gdy wprowadzenie do komórki następuje z pomocą systemu dostarczającego, który może obejmować cząstki wirusowe, liposomy, elektroporację, mikroiniekcję lub koniugację. [0007] W innym aspekcie ujawnienie zapewnia sposób zmieniania lub modyfikacji ekspresji jednego lub więcej produktów genów, obejmujący wprowadzanie do komórki zawierającej i wyrażającej cząsteczki DNA kodujące jeden lub więcej produktów genów, skonstruowanego, niewystępującego naturalnie systemu wektorowego, który może obejmować jeden lub więcej wektorów, obejmujących: a) pierwszy element regulatorowy połączony funkcjonalnie z jednym lub więcej kierujących RNA systemu CRISPR- Cas, które hybrydyzują z sekwencjami docelowymi w genomowych loci cząsteczek DNA kodujących jeden lub więcej produktów genów, b) drugi element regulatorowy połączony funkcjonalnie z białkiem Cas, przy czym elementy (a) i (b) znajdują się na tych samych lub różnych wektorach systemu, przy czym kierujące RNA celują w genomowe loci cząsteczek DNA kodujących jeden lub więcej produktów genów, a białko Cas tnie genomowe loci cząsteczek DNA kodujących jeden lub więcej produktów genu, przy czym ekspresja jednego lub więcej produktów genów jest zmieniana lub modyfikowana; i przy czym białko Cas i kierujące RNA naturalnie nie występują razem. Ujawnienie obejmuje sytuację, gdy zmieniana lub modyfikowana może być ekspresja dwóch lub więcej produktów genów. Ujawnienie ponadto obejmuje sytuację, gdy kierujący RNA obejmuje sekwencję kierującą połączoną z sekwencją tracr. W korzystnym

4 PZ/3317/AGR 3 EP B1 przykładzie wykonania, komórką jest komórka eukariotyczna, w korzystniejszym przykładzie wykonania, komórką jest komórka ssaka, a w jeszcze korzystniejszym przykładzie wykonania komórką ssaka jest komórka ludzka. Ujawnienie obejmuje też sytuację, gdy wektory systemu mogą ponadto obejmować jeden lub więcej NLS. W niektórych przykładach wykonania, białkiem Cas jest enzym systemu CRISPR typu II. W niektórych przykładach wykonania białkiem Cas jest białko Cas9. W niektórych przykładach wykonania, białkiem Cas9 jest Cas9 z S. pneumoniae, S. pyogenes, lub S. thermophilus, co może obejmować zmutowane Cas9 pochodzące z tych organizmów. Białkiem może być homolog lub ortolog Cas9. W niektórych przykładach wykonania, białko Cas jest optymalizowane pod względem kodonów do ekspresji w komórce eukariotycznej. W niektórych przykładach wykonania, białko Cas kieruje cięciem jednej lub dwóch nici w miejscu sekwencji docelowej. W dalszym aspekcie ujawnienia, ekspresja produktu genu jest zmniejszana, a produktem genu jest białko. Ujawnienie obejmuje sytuację, gdy wprowadzenie do komórki następuje z pomocą systemu dostarczającego, który może obejmować cząstki wirusowe, liposomy, elektroporację, mikroiniekcję lub koniugację. [0008] Wynalazek zapewnia skonstruowany, niewystępujący naturalnie system wektorowy według zastrz. 1, który może obejmować jeden lub więcej wektorów obejmujących: a) pierwszy element regulatorowy połączony funkcjonalnie z jednym lub więcej kierujących RNA systemu CRISPR-Cas, które hybrydyzują z sekwencjami docelowymi w genomowych loci cząsteczek DNA kodujących jeden lub więcej produktów genów, b) drugi element regulatorowy połączony funkcjonalnie z białkiem Cas, przy czym elementy (a) i (b) znajdują się na tych samych lub różnych wektorach systemu, przy czym kierujące RNA celują w genomowe loci cząsteczek DNA kodujących jeden lub więcej produktów genów w komórce, a białko Cas tnie genomowe loci cząsteczek DNA kodujących jeden lub więcej produktów genu, przy czym ekspresja jednego lub więcej produktów genów jest zmieniana lub modyfikowana; i przy czym białko Cas i kierujące RNA naturalnie nie występują razem. Wynalazek obejmuje sytuację, gdy zmieniana lub modyfikowana może być ekspresja dwóch lub więcej produktów genów. Wynalazek ponadto obejmuje sytuację, gdy kierujący RNA obejmuje sekwencję kierującą połączoną z sekwencją tracr. W korzystnym przykładzie wykonania, komórką jest komórka eukariotyczna, w korzystniejszym przykładzie wykonania, komórką jest komórka ssaka, a w jeszcze korzystniejszym przykładzie wykonania komórką ssaka jest komórka ludzka. Wynalazek obejmuje też sytuację, gdy wektory systemu mogą ponadto obejmować jeden lub więcej NLS. Białkiem Cas jest białko Cas9. W niektórych przykładach wykonania, białkiem Cas9 jest Cas9 z S. pneumoniae, S. pyogenes, lub S. thermophilus, co może obejmować zmutowane Cas9 pochodzące z tych organizmów. Białkiem może być homolog lub ortolog Cas9. W niektórych przykładach wykonania, białko Cas jest optymalizowane pod względem kodonów do ekspresji w komórce eukariotycznej. W niektórych przykładach wykonania, białko Cas kieruje cięciem jednej lub dwóch nici w miejscu sekwencji docelowej. W dalszym aspekcie wynalazku, ekspresja produktu genu jest zmniejszana, a produktem genu jest białko. Wynalazek obejmuje sytuację, gdy wprowadzenie do komórki następuje z pomocą systemu dostarczającego, który może obejmować cząstki wirusowe, liposomy, elektroporację, mikroiniekcję lub koniugację. [0009] W jeszcze innym aspekcie, ujawnienie zapewnia skonstruowany, programowalny, niewystępujący naturalnie system CRISPR-Cas, który może obejmować białko Cas i jeden lub więcej kierujących RNA, które celują w genomowe loci cząsteczek DNA kodujących jeden lub więcej produktów genów w komórce, a białko Cas tnie genomowe loci cząsteczek DNA kodujących jeden lub więcej produktów

5 PZ/3317/AGR 4 EP B1 genów, przy czym ekspresja jednego lub więcej produktów genów jest zmieniana lub modyfikowana; i przy czym białko Cas i kierujące RNA naturalnie nie występują razem. Ujawnienie obejmuje sytuację, gdy zmieniana lub modyfikowana może być ekspresja dwóch lub więcej produktów genów. Ujawnienie ponadto obejmuje sytuację, gdy kierujący RNA obejmuje sekwencję kierującą połączoną z sekwencją tracr. W korzystnym przykładzie wykonania, komórką jest komórka eukariotyczna, w korzystniejszym przykładzie wykonania, komórką jest komórka ssaka, a w jeszcze korzystniejszym przykładzie wykonania komórką ssaka jest komórka ludzka. Ujawnienie obejmuje też sytuację, gdy system CRISPR-Cas może ponadto obejmować jeden lub więcej NLS. W niektórych przykładach wykonania, białkiem Cas jest enzym systemu CRISPR typu II. W niektórych przykładach wykonania białkiem Cas jest białko Cas9. W niektórych przykładach wykonania, białkiem Cas9 jest Cas9 z S. pneumoniae, S. pyogenes, lub S. thermophilus, co może obejmować zmutowane Cas9 pochodzące z tych organizmów. Białkiem może być homolog lub ortolog Cas9. W niektórych przykładach wykonania, białko Cas jest optymalizowane pod względem kodonów do ekspresji w komórce eukariotycznej. W niektórych przykładach wykonania, białko Cas kieruje cięciem jednej lub dwóch nici w miejscu sekwencji docelowej. W dalszym aspekcie ujawnienia, ekspresja produktu genu jest zmniejszana, a produktem genu jest białko. Ujawnienie obejmuje sytuację, gdy wprowadzenie do komórki następuje z pomocą systemu dostarczającego, który może obejmować cząstki wirusowe, liposomy, elektroporację, mikroiniekcję lub koniugację. [0010] W jednym z aspektów, ujawnienie zapewnia system wektorowy obejmujący jeden lub więcej wektorów. W niektórych przykładach wykonania, system obejmuje: (a) pierwszy element regulatorowy połączony funkcjonalnie z sekwencją parującą tracr oraz jedno lub więcej miejsc insercji do wprowadzania jednej lub więcej sekwencji kierujących powyżej sekwencji parującej tracr, przy czym przy ekspresji sekwencja kierująca kieruje specyficznym wobec sekwencji wiązaniem się kompleksu CRISPR do sekwencji docelowej w komórce eukariotycznej, przy czym kompleks CRISPR obejmuje enzym CRISPR w kompleksie z (1) sekwencją kierującą, która hybrydyzuje z sekwencją docelową i (2) sekwencją parującą tracr, która hybrydyzuje z sekwencją tracr; oraz (b) drugi element regulatorowy połączony funkcjonalnie z sekwencją kodującą enzym, która koduje wymieniony enzym CRISPR obejmujący sekwencję lokalizacji jądrowej; przy czym elementy (a) oraz (b) znajdują się na tych samych lub różnych wektorach systemu. W niektórych przykładach wykonania, element (a) ponadto zawiera sekwencję tracr poniżej sekwencji parującej tracr pod kontrolą pierwszego elementu regulatorowego. W niektórych przykładach wykonania, element (a) ponadto zawiera dwie lub więcej sekwencji kierujących połączonych funkcjonalnie z pierwszym elementem regulatorowym, przy czym przy ekspresji, każda z dwóch lub więcej sekwencji kierujących kieruje specyficznym wobec sekwencji wiązaniem się kompleksu CRISPR z inną sekwencją docelową w komórce eukariotycznej. W niektórych przykładach wykonania, system obejmuje sekwencję tracr pod kontrolą trzeciego elementu regulatorowego, takiego jak promotor polimerazy III. W niektórych przykładach wykonania, sekwencja tracr wykazuje przynajmniej 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% lub 99% komplementarności sekwencyjnej wzdłuż długości sekwencji parującej tracr przy optymalnym dopasowaniu. Określanie optymalnego dopasowania mieści się w zakresie umiejętności specjalisty w dziedzinie. Na przykład, są publicznie i komercyjnie dostępne algorytmy i programy, takie jak, ale nie wyłącznie, ClustalW, Smith-Waterman w ramach matlab, Bowtie, Geneious, Biopython i SeqMan. W niektórych przykładach wykonania, kompleks CRISPR zawiera jedną lub więcej sekwencji lokalizacji jądrowej o sile wystarczającej do napędzania akumulacji wymienionego kompleksu

6 PZ/3317/AGR 5 EP B1 CRISPR w wykrywanej ilości w jądrze komórki eukariotycznej. Bez wiązania się teorią, uważa się, że jądrowa sekwencja lokalizacji nie jest konieczna dla aktywności kompleksu CRISPR u eukariontów, jednak włączenie takich sekwencji wzmacnia aktywność systemu, zwłaszcza pod kątem celowania w cząsteczki kwasu nukleinowego w jądrze. W niektórych przykładach wykonania, enzym CRISPR jest enzymem systemu CRISPR typu II. W niektórych przykładach wykonania, enzymem CRISPR jest enzym Cas9. W niektórych przykładach wykonania, enzymem Cas9 jest Cas9 z S. pneumoniae, S. pyogenes, lub S. thermophilus, co może obejmować zmutowane Cas9 pochodzące z tych organizmów. Enzymem może być homolog lub ortolog Cas9. W niektórych przykładach wykonania, enzym CRISPR jest optymalizowany pod względem kodonów do ekspresji w komórce eukariotycznej. W niektórych przykładach wykonania, enzym CRISPR kieruje cięciem jednej lub dwóch nici w miejscu sekwencji docelowej. W niektórych przykładach wykonania, pierwszym elementem regulatorowym jest promotor polimerazy III. W niektórych przykładach wykonania, drugim elementem regulatorowym jest promotor polimerazy II. W niektórych przykładach wykonania, sekwencja kierująca ma przynajmniej 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 nukleotydów lub między lub między lub między nukleotydów długości. Zasadniczo i w całym niniejszym opisie, termin wektor odnosi się do cząsteczki kwasu nukleinowego zdolnej do transportowania innego kwasu nukleinowego, z którym została połączona. Wektory obejmują, ale nie wyłącznie, cząsteczki kwasu nukleinowego, które są jednoniciowe, dwuniciowe lub częściowo dwuniciowe; cząsteczki kwasu nukleinowego, które zawierają jeden lub więcej wolnych końców, żadnych wolnych końców (np. koliste); cząsteczki kwasu nukleinowego, które zawierają DNA, RNA lub obydwa; oraz inne rodzaje polinukleotydów znane w dziedzinie. Jednym z typów wektora jest plazmid, co odnosi się do kolistej dwuniciowej pętli DNA, do której można wprowadzić dodatkowe segmenty DNA, np. za pośrednictwem standardowych technik klonowania molekularnego. Innym typem wektora jest wektor wirusowy, w którym pozyskane z wirusa sekwencje DNA lub RNA są obecne w wektorze w celu pakowania do wirusa (np. retrowirusów, retrowiursów niezdolnych do replikacji, adenowirusów, adenowirusów niezdolnych do replikacji oraz wirusów towarzyszących adenowirusom). Wektory wirusowe obejmują też polinukleotydy przenoszone przez wirusa w celu transfekcji do komórki gospodarza. Pewne wektory są zdolne do autonomicznej replikacji w komórce gospodarzu, do której są wprowadzane (np. wektory bakteryjne mające bakteryjne miejsce inicjacji replikacji oraz episomalne wektory ssacze). Inne wektory (np. nie-episomalne wektory ssacze) są integrowane z genomem komórki gospodarza przy wprowadzaniu do komórki gospodarza, i tym samym ulegają replikacji wraz z genomem gospodarza. Co więcej, pewne wektory są zdolne do kierowania ekspresją genów, z którymi są połączone funkcjonalnie. Takie wektory są tu określane jako wektory ekspresyjne. Typowe wektory ekspresyjne mające zastosowanie w technikach rekombinacji DNA mają często postać plazmidów. [0011] Rekombinowane wektory ekspresyjne mogą zawierać kwas nukleinowy według ujawnienia, w postaci odpowiedniej do ekspresji kwasu nukleinowego w komórce gospodarza, co oznacza, że rekombinowane wektory ekspresyjne obejmują jeden lub więcej elementów regulatorowych, które mogą być wybrane w oparciu o komórki gospodarzy mające być stosowane do ekspresji, które są połączone funkcjonalnie z sekwencją kwasu nukleinowego, który ma ulegać ekspresji. W obrębie rekombinowanego wektora ekspresyjnego, połączony funkcjonalnie ma w zamierzeniu oznaczać, że dana sekwencja nukleotydowa jest połączona z elementem (/-ami) regulatorowym (/-i) w sposób, który umożliwia

7 PZ/3317/AGR 6 EP B1 ekspresję sekwencji nukleotydowej (np. w układzie transkrypcji/translacji in vitro lub w komórce gospodarzu, gdy wektor jest wprowadzony do komórki gospodarza). [0012] Termin element regulatorowy ma w zamierzeniu obejmować promotory, enhancery, wewnętrzne miejsca wiązania rybosomu (IRES) i inne elementy kontroli ekspresji (np. sygnały terminacji transkrypcji, takie jak sygnały poliadenylacyji oraz sekwencje poli-u). Takie elementy regulatorowe są opisane, na przykład, w Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Elementy regulatorowe obejmują takie, które kierują konstytutywną ekspresją sekwencji nukleotydowej w wielu typach komórek gospodarzy i takie, które kierują ekspresją sekwencji nukleotydowej jedynie w pewnych komórkach gospodarzach (np. sekwencje regulatorowe specyficzne dla tkanki). Specyficzny dla tkanki promotor może kierować ekspresją głównie w danej pożądanej tkance, takiej jak mięśniowa, nerwowa, kość, skóra, krew, konkretne narządy (np. wątroba, trzustka) lub konkretne typy komórek (np. limfocyty). Elementy regulatorowe mogą również kierować ekspresją w sposób zależny od czasu, taki jak sposób zależny od cyklu komórkowego lub od stadium rozwoju, który może też być lub nie być specyficzny dla tkanki lub typu komórek. W niektórych przykładach wykonania, wektor obejmuje jeden lub więcej promotorów pol III (np. 1, 2, 3, 4, 5 lub więcej promotorów pol III), jeden lub więcej promotorów pol II (np. 1, 2, 3, 4, 5 lub więcej promotorów pol II), jeden lub więcej promotorów pol I (np. 1, 2, 3, 4, 5 lub więcej promotorów pol I) lub ich kombinacje. Przykłady promotorów pol III obejmują, ale nie wyłącznie, promotory U6 i H1. Przykłady promotorów pol II obejmują, ale nie wyłącznie, retrowirusowy promotor LTR wirusa mięsaka Rousa (RSV) (opcjonalnie z enhancerem RSV), promotor wirusa cytomegalii (CMV) (opcjonalnie z enhancerem CMV) [zobacz, np. Boshart et al, Cell, 41: (1985)], promotor SV40, promotor reduktazy dihydrofolianowej, promotor β-aktynowy, promotor kinazy fosfoglicerolowej (PGK) oraz promotor EF1α. Również objęte terminem element regulatorowy są elementy wzmacniające, takie jak WPRE; enhancery CMV; segment R-U5' w LTR z HTLV-1 (Mol. Cell. Biol., Vol. 8(1), str , 1988); enhancer SV40; sekwencja intronowa pomiędzy egzonami 2 i 3 króliczej β-globiny (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol. 78(3), str , 1981). Specjaliści w dziedzinie zauważą, że konstrukcja wektora ekspresyjnego może zależeć od takich czynników jak wybór komórki gospodarza do transformacji, poziom pożądanej ekspresji, itd. Wektor może być wprowadzony do komórek gospodarzy, aby wytwarzać tam transkrypty, białka lub peptydy, w tym białka lub peptydy fuzyjne, kodowane przez kwasy nukleinowe jak opisano tutaj (np. transkrypty, białka, enzymy zgrupowanych regularnie rozmieszczonych krótkich powtórzeń palindromowych, ich postacie zmutowane, ich białka fuzyjne itd.). [0013] Korzystne wektory obejmują lentiwirusy i wirusy towarzyszące adenowirusom, a rodzaje takich wektorów można wybierać też do celowania w konkretne typy komórek. [0014] W jednym z aspektów, ujawnienie zapewnia eukariotyczną komórkę gospodarza obejmującą (a) pierwszy element regulatorowy połączony funkcjonalnie z sekwencją parującą tracr oraz jedno lub więcej miejsc insercji do wprowadzania jednej lub więcej sekwencji kierujących powyżej sekwencji parującej tracr, przy czym przy ekspresji sekwencja kierująca kieruje specyficznym wobec sekwencji wiązaniem się kompleksu CRISPR do sekwencji docelowej w komórce eukariotycznej, przy czym kompleks CRISPR obejmuje enzym CRISPR w kompleksie z (1) sekwencją kierującą, która hybrydyzuje z sekwencją docelową i (2) sekwencją parującą tracr, która hybrydyzuje z sekwencją tracr; i/lub (b) drugi element

8 PZ/3317/AGR 7 EP B1 regulatorowy połączony funkcjonalnie z sekwencją kodującą enzym, która koduje wymieniony enzym CRISPR obejmujący sekwencję lokalizacji jądrowej. W niektórych przykładach wykonania, komórka gospodarz obejmuje elementy (a) i (b). W niektórych przykładach wykonania, element (a), element (b) lub elementy (a) i (b) są stabilnie zintegrowane z genomem eukariotycznej komórki gospodarza. W niektórych przykładach wykonania, element (a) ponadto obejmuje sekwencję tracr poniżej sekwencji parującej tracr pod kontrolą pierwszego elementu regulatorowego. W niektórych przykładach wykonania, element (a) ponadto obejmuje dwie lub więcej sekwencji kierujących, połączonych funkcjonalnie z pierwszym elementem regulatorowym, przy czym przy ekspresji, każda z dwóch lub więcej sekwencji kierujących kieruje specyficznym wobec sekwencji wiązaniem się kompleksu CRISPR z inną sekwencją docelową w komórce eukariotycznej. W niektórych przykładach wykonania, komórka gospodarz ponadto zawiera trzeci element regulatorowy, taki jak promotor polimerazy III, połączony funkcjonalnie z wymienioną sekwencją tracr. W niektórych przykładach wykonania, sekwencja tracr wykazuje przynajmniej 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% lub 99% komplementarności sekwencyjnej wzdłuż długości sekwencji parującej tracr przy optymalnym dopasowaniu. Enzymem może być homolog lub ortolog Cas9. W niektórych przykładach wykonania, enzym CRISPR jest optymalizowany pod względem kodonów do ekspresji w komórce eukariotycznej. W niektórych przykładach wykonania, enzym CRISPR kieruje cięciem jednej lub dwóch nici w miejscu sekwencji docelowej. W niektórych przykładach wykonania, enzym CRISPR nie ma aktywności cięcia nici DNA. W niektórych przykładach wykonania, pierwszym elementem regulatorowym jest promotor polimerazy III. W niektórych przykładach wykonania, drugim elementem regulatorowym jest promotor polimerazy II. W niektórych przykładach wykonania, sekwencja kierująca ma przynajmniej 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 nukleotydów lub między lub między lub między nukleotydów długości. W jednym z aspektów, ujawnienie zapewnia organizm eukariotyczny niebędący człowiekiem; korzystnie wielokomórkowy organizm eukariotyczny, obejmujący eukariotyczną komórkę gospodarza według dowolnego z opisanych przykładów wykonania. W innych aspektach, ujawnienie zapewnia organizm eukariotyczny; korzystnie wielokomórkowy organizm eukariotyczny, obejmujący eukariotyczną komórkę gospodarza według dowolnego z opisanych przykładów wykonania. Organizmem w niektórych przykładach wykonania tych aspektów może być zwierzę; na przykład ssak. Ponadto, organizmem może być stawonóg, taki jak owad. Organizmem może być też roślina. Ponadto, organizmem może być grzyb. [0015] W jednym z aspektów, ujawnienie zapewnia zestaw zawierający jeden lub więcej opisanych tu elementów. W niektórych przykładach wykonania, zestaw zawiera system wektorowy i instrukcje do stosowania zestawu. W niektórych przykładach wykonania, system wektorowy obejmuje (a) pierwszy element regulatorowy połączony funkcjonalnie z sekwencją parującą tracr oraz jedno lub więcej miejsc insercji do wprowadzania jednej lub więcej sekwencji kierujących powyżej sekwencji parującej tracr, przy czym przy ekspresji sekwencja kierująca kieruje specyficznym wobec sekwencji wiązaniem się kompleksu CRISPR do sekwencji docelowej w komórce eukariotycznej, przy czym kompleks CRISPR obejmuje enzym CRISPR w kompleksie z (1) sekwencją kierującą, która hybrydyzuje z sekwencją docelową i (2) sekwencją parującą tracr, która hybrydyzuje z sekwencją tracr; i/lub (b) drugi element regulatorowy połączony funkcjonalnie z sekwencją kodującą enzym, która koduje wymieniony enzym CRISPR obejmujący sekwencję lokalizacji jądrowej; przy czym elementy (a) oraz (b) znajdują się na tych samych lub różnych wektorach systemu. W niektórych przykładach wykonania, element (a) ponadto

9 PZ/3317/AGR 8 EP B1 zawiera sekwencję tracr poniżej sekwencji parującej tracr pod kontrolą pierwszego elementu regulatorowego. W niektórych przykładach wykonania, element (a) ponadto zawiera dwie lub więcej sekwencji kierujących połączonych funkcjonalnie z pierwszym elementem regulatorowym, przy czym przy ekspresji, każda z dwóch lub więcej sekwencji kierujących kieruje specyficznym wobec sekwencji wiązaniem się kompleksu CRISPR z inną sekwencją docelową w komórce eukariotycznej. W niektórych przykładach wykonania, system obejmuje sekwencję tracr pod kontrolą trzeciego elementu regulatorowego, takiego jak promotor polimerazy III. W niektórych przykładach wykonania, sekwencja tracr wykazuje przynajmniej 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% lub 99% komplementarności sekwencyjnej wzdłuż długości sekwencji parującej tracr przy optymalnym dopasowaniu. W niektórych przykładach wykonania, kompleks CRISPR zawiera jedną lub więcej sekwencji lokalizacji jądrowej o sile wystarczającej do napędzania akumulacji wymienionego kompleksu CRISPR w wykrywanej ilości w jądrze komórki eukariotycznej. W niektórych przykładach wykonania, enzym CRISPR jest enzymem systemu CRISPR typu II. W niektórych przykładach wykonania, enzymem CRISPR jest enzym Cas9. W niektórych przykładach wykonania, enzymem Cas9 jest Cas9 z S. pneumoniae, S. pyogenes, lub S. thermophilus, co może obejmować zmutowane Cas9 pochodzące z tych organizmów. Enzymem może być homolog lub ortolog Cas9. W niektórych przykładach wykonania, enzym CRISPR jest optymalizowany pod względem kodonów do ekspresji w komórce eukariotycznej. W niektórych przykładach wykonania, enzym CRISPR kieruje cięciem jednej lub dwóch nici w miejscu sekwencji docelowej. W niektórych przykładach wykonania, pierwszym elementem regulatorowym jest promotor polimerazy III. W niektórych przykładach wykonania, drugim elementem regulatorowym jest promotor polimerazy II. W niektórych przykładach wykonania, sekwencja kierująca ma przynajmniej 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 nukleotydów lub między lub między lub między nukleotydów długości. [0016] W jednym z aspektów, ujawnienie zapewnia sposób modyfikacji docelowego polinukleotydu w komórce eukariotycznej. W niektórych przykładach wykonania, sposób obejmuje umożliwianie kompleksowi CRISPR związanie się z docelowym polinukleotydem, do przeprowadzenia cięcia wymienionego docelowego polinukleotydu, ze zmodyfikowaniem tym samym docelowego polinukleotydu, przy czym kompleks CRISPR zawiera enzym CRISPR w kompleksie z sekwencją kierującą hybrydyzującą z sekwencją docelową w obrębie wymienionego docelowego polinukleotydu, przy czym wymieniona sekwencja kierująca jest połączona z sekwencją parującą tracr, która z kolei hybrydyzuje z sekwencją tracr. W niektórych przykładach wykonania wymienione cięcie obejmuje cięcie jednej lub dwóch nici w miejscu sekwencji docelowej przez wymieniony enzym CRISPR. W niektórych przykładach wykonania, wymienione cięcie skutkuje obniżoną transkrypcją genu docelowego. W niektórych przykładach wykonania, sposób ponadto obejmuje naprawę wymienionego przeciętego docelowego polinukleotydu przez rekombinację homologiczną z egzogennym polinukleotydem matrycowym, przy czym wymieniona naprawa skutkuje mutacją obejmującą insercję, delecję lub substytucję jednego lub więcej nukleotydów wymienionego docelowego polinukleotydu. W niektórych przykładach wykonania, wymieniona mutacja skutkuje jedną lub więcej zmianami aminokwasów w białku ulegającym ekspresji z genu zawierającego sekwencję docelową. W niektórych przykładach wykonania, sposób ponadto zawiera dostarczanie jednego lub więcej wektorów do wymienionej komórki eukariotycznej, przy czym jeden lub więcej wektorów kieruje ekspresją jednego lub więcej spośród: enzymu CRISPR, sekwencji kierującej połączonej z sekwencją parującą tracr oraz sekwencji tracr. W niektórych przykładach wykonania,

10 PZ/3317/AGR 9 EP B1 wymienione wektory są dostarczane do komórki eukariotycznej w osobniku. W niektórych przykładach wykonania, wymieniona modyfikacja odbywa się we wspomnianej komórce eukariotycznej w hodowli komórkowej. W niektórych przykładach wykonania, sposób ponadto obejmuje izolowanie wymienionej komórki eukariotycznej od osobnika przed wymienioną modyfikacją. W niektórych przykładach wykonania, sposób ponadto obejmuje zwracanie wymienionej komórki i/lub komórek eukariotycznych stamtąd pochodzących do wymienionego osobnika. [0017] W jednym z aspektów, ujawnienie zapewnia sposób modyfikacji ekspresji polinukleotydu w komórce eukariotycznej. W niektórych przykładach wykonania, sposób obejmuje umożliwianie kompleksowi CRISPR wiązanie się z polinukleotydem tak, że wymienione wiązanie skutkuje zwiększoną lub zmniejszoną ekspresją wymienionego polinukleotydu; przy czym kompleks CRISPR zawiera enzym CRISPR w kompleksie z sekwencją kierującą hybrydyzującą z sekwencją docelową w obrębie wymienionego polinukleotydu, przy czym wymieniona sekwencja kierująca jest połączona z sekwencją parującą tracr, która z kolei hybrydyzuje z sekwencją tracr. W niektórych przykładach wykonania, sposób ponadto obejmuje dostarczanie jednego lub więcej wektorów do wymienionych komórek eukariotycznych, przy czym jeden lub więcej wektorów kieruje ekspresją jednego lub więcej spośród: enzymu CRISPR, sekwencji kierującej połączonej z sekwencją parującą tracr oraz sekwencji tracr. [0018] W jednym z aspektów, ujawnienie zapewnia sposób tworzenia modelowej komórki eukariotycznej zawierającej zmutowany gen warunkujący chorobę. W niektórych przykładach wykonania, genem warunkującym chorobę jest dowolny gen powiązany ze zwiększonym ryzykiem choroby lub jej pojawienia się. W niektórych przykładach wykonania, sposób obejmuje (a) wprowadzanie jednego lub więcej wektorów do komórki eukariotycznej, przy czym jeden lub więcej wektorów kieruje ekspresją jednego lub więcej spośród: enzymu CRISPR, sekwencji kierującej połączonej z sekwencją parującą tracr oraz sekwencji tracr; oraz (b) umożliwienie kompleksowi CRISPR wiązania się z docelowym polinukleotydem, do przeprowadzenia cięcia wymienionego docelowego polinukleotydu w obrębie wspomnianego genu warunkującego chorobę, przy czym kompleks CRISPR obejmuje enzym CRISPR w kompleksie z (1) sekwencją kierującą, która hybrydyzuje z sekwencją docelową i (2) sekwencją parującą tracr, która hybrydyzuje z sekwencją tracr, z wytworzeniem tym samym modelowej komórki eukariotycznej zawierającej zmutowany gen warunkujący chorobę. W niektórych przykładach wykonania, wymienione cięcie obejmuje cięcie jednej lub dwóch nici w miejscu sekwencji docelowej przez wymieniony enzym CRISPR. W niektórych przykładach wykonania, wymienione cięcie skutkuje obniżoną transkrypcją genu docelowego. W niektórych przykładach wykonania, sposób ponadto obejmuje naprawę wymienionego przeciętego docelowego polinukleotydu przez rekombinację homologiczną z egzogennym polinukleotydem matrycowym, przy czym wymieniona naprawa skutkuje mutacją obejmującą insercję, delecję lub substytucję jednego lub więcej nukleotydów wymienionego docelowego polinukleotydu. W niektórych przykładach wykonania, wymieniona mutacja skutkuje jedną lub więcej zmianami aminokwasów w białku ulegającym ekspresji z genu zawierającego sekwencję docelową. [0019] W jednym z aspektów, ujawnienie zapewnia sposób opracowania biologicznie aktywnego środka, który moduluje zdarzenie sygnalizacji komórkowej powiązane z genem warunkującym chorobę. W niektórych przykładach wykonania, genem warunkującym chorobę jest dowolny gen powiązany ze zwiększonym ryzykiem choroby lub jej pojawienia się. W niektórych przykładach wykonania, sposób

11 PZ/3317/AGR 10 EP B1 obejmuje (a) kontaktowanie związku testowego z modelową komórką z dowolnego z opisanych przykładów wykonania; i (b) wykrywanie zmiany w odczycie, która wskazuje na zmniejszenie lub wzmocnienie zdarzenia sygnalizacji komórkowej powiązanego z wymienioną mutacją w wymienionym genie warunkującym chorobę, z opracowaniem tym samym wymienionego biologicznie aktywnego środka, który moduluje wymienione zdarzenie sygnalizacji komórkowej powiązane ze wymienionym genem warunkującym chorobę. [0020] W jednym z aspektów, ujawnienie zapewnia rekombinowany polinukleotyd obejmujący sekwencję kierującą powyżej sekwencji parującej tracr, przy czym sekwencja kierująca przy ekspresji kieruje specyficznym wobec sekwencji wiązaniem się kompleksu CRISPR z odpowiednią sekwencją docelową obecną w komórce eukariotycznej. W niektórych przykładach wykonania, sekwencją docelową jest sekwencja wirusowa obecna w komórce eukariotycznej. W niektórych przykładach wykonania, sekwencją docelową jest protoonkogen lub onkogen. [0021] W jednym z aspektów, ujawnienie zapewnia sposób selekcji jednej lub więcej komórki (komórek) przez wprowadzenie jednej lub więcej mutacji w genie w jednej lub więcej komórce (komórkach), przy czym sposób obejmuje: wprowadzenie jednego lub więcej wektorów do komórki (komórek), przy czym jeden lub więcej wektorów kieruje ekspresją jednego lub więcej spośród: enzymu CRISPR, sekwencji kierującej połączonej z sekwencją parującą tracr, sekwencji tracr oraz matrycy redagującej; przy czym matryca redagująca obejmuje jedną lub więcej mutacji, które znoszą cięcie przez enzym CRISPR; umożliwienie rekombinacji homologicznej matrycy redagującej z docelowym polinukleotydem w komórce (komórkach), które mają podlegać selekcji; umożliwienie kompleksowi CRISPR związanie się z docelowym polinukleotydem, do przeprowadzenia cięcia docelowego polinukleotydu w obrębie wymienionego genu, przy czym kompleks CRISPR obejmuje enzym CRISPR w kompleksie z (1) sekwencją kierującą, która hybrydyzuje z sekwencją docelową i (2) sekwencją parującą tracr, która hybrydyzuje z sekwencją tracr, przy czym związanie się kompleksu CRISPR z docelowym polinukleotydem indukuje śmierć komórki, tym samym umożliwiając selekcję jednej lub więcej komórek, z wprowadzoną jedną lub więcej mutacjami W niektórych przykładach wykonania, enzym CRISPR jest enzymem systemu CRISPR typu II. W niektórych przykładach wykonania, enzymem CRISPR jest białko Cas9. W niektórych przykładach wykonania, białkiem Cas9 jest Cas9 z S. pneumoniae, S. pyogenes, lub S. thermophilus, co może obejmować zmutowane Cas9 pochodzące z tych organizmów. Enzymem może być homolog lub ortolog Cas9. W niektórych przykładach wykonania, enzym jest optymalizowany pod względem kodonów do ekspresji w komórce eukariotycznej. W niektórych przykładach wykonania, enzym kieruje cięciem jednej lub dwóch nici w miejscu sekwencji docelowej. W korzystnym przykładzie wykonania, enzymem CRISPR jest Cas9. W innym korzystnym przykładzie wykonania ujawnienia, komórką, która ma podlegać selekcji, może być komórka eukariotyczna. Aspekty ujawnienia pozwalają na selekcję konkretnych komórek bez wymogu markera selekcyjnego lub dwu-etapowego procesu, który może obejmować system anty-selekcji. [0022] Aspekty wynalazku obejmują specyficzny wobec miejsca knockout genu w endogennym genomie: Niniejszy wynalazek jest korzystny w stosunku do technologii nukleaz specyficznych wobec miejsca, opartych o palce cynkowe i efektory TAL, jako że nie wymaga rozbudowanego projektowania i może być stosowany do wykonywania równoczesnego knockoutu wielu genów w obrębie tego samego genomu. W

12 PZ/3317/AGR 11 EP B1 kolejnym aspekcie, wynalazek obejmuje redagowanie genomu w sposób specyficzny wobec miejsca. Niniejszy wynalazek jest korzystny w stosunku do stosowania naturalnych nukleaz lub rekombinaz specyficznych wobec miejsca, jako że może być zdolny do wprowadzania dwuniciowych pęknięć nici specyficznych wobec miejsca dla ułatwienia rekombinacji homologicznej docelowego loci genomowego. W innym aspekcie wynalazek obejmuje interferencję DNA specyficzną wobec miejsca. Wynalazek może być stosowany do inaktywowania genomu szkodliwych organizmów opartych na DNA, takich jak drobnoustroje, wirusy czy nawet komórki nowotworowe, poprzez bezpośrednie wprowadzanie pęknięć w specyficznych miejscach genomu tych organizmów. Wynalazek zapewnia sposoby i kompozycje do multipleksowego modyfikowania genomu, jako że system CRISPR-Cas według wynalazku można łatwo kierować do wielu miejsc w genomie przez stosowanie wielu specyficznych wobec miejsca elementów przerywników (ang. spacer) lub sekwencji kierujących CRISPR. KRÓTKI OPIS FIGUR [0023] Lepsze zrozumienie cech i korzyści niniejszego wynalazku uzyskane będzie przez odniesienie się do następującego szczegółowego opisu, przedstawiającego ilustrujące przykłady wykonania, w których wykorzystywane są zasady wynalazku oraz na towarzyszących rysunkach, na których: Figura 1 przedstawia schematyczny model systemu CRISPR. Nukleaza Cas9 ze Streptococcus pyogenes (żółty) jest kierowana do genomowego DNA przez syntetyczny kierujący RNA (sgrna) składający się z 20-nt sekwencji kierującej (niebieski) oraz zrębu (czerwony). Pary zasad sekwencji kierującej z DNA docelowym (niebieski), bezpośrednio powyżej niezbędnego motywu przylegającego do protoprzerywnika 5'-NGG (PAM;magenta) oraz Cas9 pośredniczą w dwuniciowym pęknięciu (DSB) ~3 pz powyżej PAM (czerwony trójkąt). Figura 2A-F przedstawia przykładowy system CRISPR, możliwy mechanizm działania, przykładowe dostosowanie do ekspresji w komórkach eukariotycznych, i wyniki testów oceniających lokalizację jądrową i aktywność CRISPR. Figura 2C ujawnia SEQ ID NO: 23-24, odpowiednio w kolejności występowania. Figura 2E ujawnia SEQ ID NO: 25-27, odpowiednio w kolejności występowania. Figura 2F ujawnia SEQ ID NO: 28-32, odpowiednio w kolejności występowania. Figura 3A-D przedstawia wyniki oceny specyficzności SpCas9 dla przykładowego celu. Figura 3A ujawnia SEQ ID NO: 33, 26 i 34-44, odpowiednio w kolejności występowania. Figura 3C ujawnia SEQ ID NO: 33. Figura 4A-G przedstawia przykładowy system wektorowy i rezultaty jego zastosowania w kierowaniu rekombinacją homologiczną w komórkach eukariotycznych. Figura 4E ujawnia SEQ ID NO: 45. Figura 4F ujawnia SEQ ID NO: 46-47, odpowiednio w kolejności występowania. Figura 4G ujawnia SEQ ID NO: 48-52, odpowiednio w kolejności występowania. Figura 5 przedstawia tabelę sekwencji protoprzerywników (SEQ ID NO: 16, 15, 14, 53-58, 18, 17 i 59-63, odpowiednio w kolejności występowania) i podsumowuje wyniki dla skuteczności modyfikacji dla docelowych protoprzerywników zaprojektowanych w oparciu o przykładowe systemy CRISPR S. pyogenes i S. thermophilus, z odpowiadającymi PAM przeciw loci w genomach ludzkim i mysim. Komórki transfekowano Cas9 i pre-crrna/tracrrna albo chimerycznym RNA, i analizowano 72

13 PZ/3317/AGR 12 EP B1 godziny po transfekcji. Odsetek indeli obliczany jest w oparciu o wyniki testu Surveyor ze wskazanych linii komórkowych (N=3 dla wszystkich docelowych protoprzerywników, błędy to S.E.M., N.D. wskazuje niewykrywalne z zastosowaniem testu Surveyor, a N.T. wskazuje niebadane w niniejszym badaniu). Figura 6A-C przedstawia porównanie różnych transkryptów tracrrna dla celowania w geny za pośrednictwem Cas9. Figura 6A ujawnia SEQ ID NO: 64-65, odpowiednio w kolejności występowania. Figura 7 przedstawia schemat testu surveyor z nukleazą do wykrywania mikro-insercji i delecji indukowanych dwuniciowymi pęknięciami. Figura 8A-B przedstawia przykładowe bicistronowe wektory ekspresyjne do wyrażania elementów systemu CRISPR w komórkach eukariotycznych. Figura 8A ujawnia SEQ ID NO: 66-68, odpowiednio w kolejności występowania. Figura 8B ujawnia SEQ ID NO: 69-71, odpowiednio w kolejności występowania. Figura 9A-C przedstawia histogramy dla odległości między przyległymi PAM z locus 1 S, pyogenes SF370 (NGG) (Figura 9A) i PAM z locus 2 S. thermophilus LMD9 (NNAGAAW) (Figura 9B) w genomie ludzkim; oraz odległości dla każdego PAM wg chromosomu (Chr) (Figura 9C). Figura 10A-D przedstawia przykładowy system CRISPR, przykładowe dostosowanie do ekspresji w komórkach eukariotycznych oraz wyniki testów oceniających aktywność CRISPR. Figura 10B ujawnia SEQ ID NO: 72-73, odpowiednio w kolejności występowania. Figura 10C ujawnia SEQ ID NO: 74. Figura 11A-C przedstawia przykładowe postępowanie z systemem CRISPR do celowania w genomowe loci w komórkach ssaków. Figura 11A ujawnia SEQ ID NO: 75. Figura 11B ujawnia SEQ ID NO: 76-78, odpowiednio w kolejności występowania. Figura 12A-B przedstawia wyniki analizy Northern blot dla obróbki crrna w komórkach ssaków. Figura 12A ujawnia SEQ ID NO: 79. Figura 13A-B przedstawia przykładowy wybór protoprzerywników w loci ludzkim PVALB i mysim Th. Figura 13A ujawnia SEQ ID NO: 80. Figura 13B ujawnia SEQ ID NO: 81. Figura 14 przedstawia przykładowe docelowe sekwencje protoprzerywników i odpowiadające PAM z systemu CRIPSR S. thermophilus w ludzkim locus EMX1. Figura 14 ujawnia SEQ ID NO: 74. Figura 15 przedstawia tabelę sekwencji (SEQ ID NO: 82-93, odpowiednio w kolejności występowania) dla starterów i sond stosowanych w Surveyor, RFLP, sekwencjonowaniu genomowym i testach Northern blot. Figura 16A-C przedstawia przykładowe postępowanie z systemem CRISPR z chimerycznymi RNA oraz wyniki testów SURVEYOR dla aktywności systemu w komórkach eukariotycznych. Figura 16A ujawnia SEQ ID NO: 94.

14 PZ/3317/AGR 13 EP B1 Figura 17A-B przedstawia graficzną reprezentację wyników testów SURVEYOR dla aktywności systemu CRISPR w komórkach eukariotycznych. Figura 18 przedstawia przykładową wizualizację niektórych miejsc docelowych Cas9 z S. pyogenes w genomie ludzkim, z zastosowaniem UCSC genome browser. Figura 18 ujawnia SEQ ID NO: , odpowiednio w kolejności występowania. Figura 19A-D pokazuje koliste przedstawienie analizy filogenetycznej ujawniającej pięć rodzin Cas9, w tym trzy grupy dużych Cas9 (~1400 aminokwasów) i dwie małych Cas9 (~1100 aminokwasów). Figura 20A-F pokazuje liniowe przedstawienie analizy filogenetycznej ujawniającej pięć rodzin Cas9, w tym trzy grupy dużych Cas9 (~1400 aminokwasów) i dwie małych Cas9 (~1100 aminokwasów). Figura 21A-D przedstawia redagowanie genomu przez rekombinację homologiczną. (a) Schemat nikazy SpCas9, z mutacją D10A w domenie katalitycznej RuvC I. (b) Schematyczne przedstawienie rekombinacji homologicznej (HR) w ludzkim locus EMX1, z zastosowaniem sensownych lub antysensownych jednołańcuchowych oligonukleotydów, jako matryc naprawczych. Czerwona strzałka powyżej wskazuje miejsce cięcia sgrna; startery PCR do genotypowania (Tabele J i K) wskazano jako strzałki w prawym panelu. Figura 21C ujawnia SEQ ID NO: , 174, 177 i 176, odpowiednio w kolejności występowania. (c) Sekwencja regionu zmodyfikowanego HR. d, test SURVEYOR dla typu dzikiego (wt) i indeli za pośrednictwem nikazy (D10A) SpCas9 w docelowym locus 1 z EMX1 (n=3). Strzałki wskazują pozycje dla przewidywanych wielkości fragmentów. Figura 22A-B przedstawia projekty z pojedynczym wektorem dla SpCas9. Figura 22A ujawnia SEQ ID NO: , odpowiednio w kolejności występowania. Figura 22B ujawnia SEQ ID NO: 181. [0024] Niniejsze figury mają jedynie cel ilustracyjny i nie są zawsze narysowane z zachowaniem skali. SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU [0025] Terminy polinukleotyd, nukleotyd, sekwencja nukleotydowa, kwas nukleinowy i oligonukleotyd są używane zamiennie. Odnoszą się do polimerycznej postaci nukleotydów o dowolnej długości, deoksyrybonukleotydów czy rybonukleotydów lub ich analogów. Polinukleotydy mogą mieć dowolną trójwymiarową strukturę i mogą spełniać dowolną funkcję, znaną lub nieznaną. Poniższe są nieograniczającymi przykładami polinukleotydów: kodujące lub niekodujące regiony genu lub fragmentu genu, loci (locus) zdefiniowane z analizy sprzężeń, egzony, introny, informacyjny RNA (mrna), transferowy RNA, rybosomalny RNA, krótki interferujący RNA (sirna), krótki RNA o strukturze spinki do włosów (shrna), mikro-rna (mirna), rybozymy, cdna, rekombinowane polinukleotydy, rozgałęzione polinukleotydy, plazmidy, wektory, izolowany DNA o dowolnej sekwencji, izolowany RNA o dowolnej sekwencji, sondy kwasów nukleinowych i startery. Polinukleotyd może zawierać jeden lub więcej zmodyfikowanych nukleotydów, takich jak metylowane nukleotydy oraz analogi nukleotydów. Jeśli obecne, modyfikacje struktury nukleotydowej mogą być wprowadzane przed lub po złożeniu polimeru. Sekwencja nukleotydów może być przerwana przez komponenty nienukleotydowe. Polinukleotyd może być dalej modyfikowany po polimeryzacji, tak jak przez koniugację z komponentem znakującym.

15 PZ/3317/AGR 14 EP B1 [0026] W aspektach wynalazku terminy chimeryczny RNA, chimeryczny kierujący RNA, kierujący RNA, pojedynczy kierujący RNA oraz syntetyczny prowadzący RNA są używane zamiennie i odnoszą się do sekwencji polinukleotydowej zawierającej sekwencję kierującą, sekwencję tracr oraz sekwencję parującą tracr. Termin sekwencja kierująca odnosi się do sekwencji około 20 pz w obrębie kierującego RNA, która określa miejsce docelowe i może być używane zamiennie z terminami przewodnik lub przerywnik ( spacer, ang. spacer). Termin sekwencja parująca tracr może być używane zamiennie z terminem proste powtórzenie (powtórzenia). Przykładowy system CRISPR-Cas przedstawiono na Figurze 1. [0027] Stosowany tu termin typ dziki jest terminem z dziedziny rozumianym przez specjalistów i oznacza typową postać organizmu, nici, genu lub cechy, tak jak występuje w naturze w odróżnieniu od postaci zmutowanych lub wariantów. [0028] Stosowany tu termin wariant należy rozumieć, jako oznaczający wykazywanie cech, o wzorze, który odbiega od tego co występuje w naturze. [0029] Terminy niewystępujący naturalnie lub skonstuowany są używane zamiennie i wskazują na udział ręki ludzkiej. Terminy te, w odniesieniu do cząsteczek kwasów nukleinowych lub polipeptydów oznaczają, że cząsteczka kwasu nukleinowego lub polipeptydu są przynajmniej zasadniczo wolne od przynajmniej jednego innego komponentu, z którym są one naturalnie powiązane w naturze i jak występują w naturze. [0030] Komplementarność odnosi się do zdolności kwasu nukleinowego do tworzenia wiązania (wiązań) wodorowego (wodorowych) z inną sekwencją kwasu nukleinowego albo standardowo wg Watsona- Cricka, albo wg innych niestandardowych typów. Procentowy stopień komplementarności wskazuje na odsetek reszt w cząsteczce kwasu nukleinowego, które mogą tworzyć wiązania wodorowe (np. przez parowanie zasad Watsona-Cricka) z drugą sekwencją kwasu nukleinowego (np. 5, 6, 7, 8, 9, 10 z 10 stanowi 50%, 60%, 70%, 80%, 90% i 100% komplementarności). Doskonale komplementarne oznacza, że wszystkie kolejne reszty sekwencji kwasu nukleinowego będą tworzyć wiązania wodorowe z tą samą liczbą kolejnych reszt w drugiej sekwencji kwasu nukleinowego. Stosowane tu w dużym stopniu komplementarne odnosi się do stopnia komplementarności, który wynosi co najmniej 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% lub 100% na obszarze 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 lub więcej nukleotydów lub odnosi się do dwóch kwasów nukleinowych, które hybrydyzują w surowych warunkach. [0031] Stosowane tu surowe warunki dla hybrydyzacji odnoszą się do warunków, w których kwas nukleinowy komplementarny z sekwencją docelową w większej części hybrydyzuje z sekwencją docelową i zasadniczo nie hybrydyzuje z sekwencjami niebędącymi docelowymi. Surowe warunki są zasadniczo zależne od sekwencji i różnią się w zależności od szeregu czynników. Ogółem, im dłuższa sekwencja, tym wyższa temperatura, w której sekwencja specyficznie hybrydyzuje z sekwencją docelową. Nieograniczające przykłady surowych warunków są opisane szczegółowo w Tijssen (1993), Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes Część I, Rozdział Drugi Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay, Elsevier, N.Y.

16 PZ/3317/AGR 15 EP B1 [0032] Hybrydyzacja odnosi się do reakcji, w której jeden lub więcej polinukleotydów reaguje tworząc kompleks, który jest stabilizowany przez wiązania wodorowe między zasadami reszt nukleotydowych. Wiązanie wodorowe może pojawić się w parowaniu zasad Watsona Cricka, wiązaniu Hoogsteina lub w dowolnym innym specyficznym dla sekwencji. Kompleks może zawierać dwie nici tworzące strukturę dupleks, trzy lub więcej nici tworzących kompleks wieloniciowy, pojedynczą nić hybrydyzującą sama ze sobą lub dowolną ich kombinację. Reakcja hybrydyzacji może stanowić etap w bardziej rozległym procesie, takim jak inicjacja PCR lub przecinanie polinukleotydów przez enzym. Sekwencja zdolna do hybrydyzacji z daną sekwencją jest określana jako sekwencja komplementarna dla danej sekwencji. [0033] Stosowana tu ekspresja odnosi się do procesu, w którym polinukleotyd jest transkrybowany z matrycy DNA (np. do mrna lub innego transkryptu RNA) i/lub proces, w którym transkrybowany mrna ulega następnie translacji do peptydów, polipeptydów lub białek. Transkrypty i kodowane polipeptydy mogą być zbiorczo określane jako produkt genu. Jeśli polinukleotyd pochodzi z DNA genomowego, ekspresja może obejmować splicing mrna w komórce eukariotycznej. [0034] Terminy polipeptyd, peptyd i białko są używane tutaj zamiennie, w odniesieniu do polimerów aminokwasów o dowolnej długości. Polimer może być liniowy lub rozgałęziony, może zawierać zmodyfikowane aminokwasy i może być przerywany przez nie-aminokwasy. Terminy te obejmują również polimer aminokwasowy, który został zmodyfikowany; na przykład przez tworzenie wiązań dwusiarczkowych, glikozylację, lipidację, acetylację, fosforylację lub dowolne inne zabiegi, takie jak koniugacja z komponentem znacznikowym. Stosowany tu termin aminokwas obejmuje naturalne i/lub nienaturalne lub syntetyczne aminokwasy, w tym glicynę i izomery optyczne zarówno D czy L oraz analogi aminokwasów oraz peptydomimetyki. [0035] Terminy obiekt, osobnik i pacjent są używane tutaj zamiennie, w odniesieniu do kręgowca, korzystnie ssaka, korzystniej człowieka. Ssaki obejmują, ale nie wyłącznie, myszy, małpy, ludzi, zwierzęta gospodarskie, zwierzęta wykorzystywane w sporcie oraz zwierzęta domowe. Objęte są także tkanki, komórki oraz ich pochodne z jednostki biologicznej otrzymane in vivo lub hodowane in vitro. [0036] Terminy środek terapeutyczny, środek o zdolnościach terapeutycznych lub środek leczniczy są używane zamiennie i odnoszą się do cząsteczki lub związku, który wywiera jakiś korzystny wpływ po podaniu osobnikowi. Korzystny wpływ obejmuje umożliwienie oznaczeń diagnostycznych; łagodzenie choroby, objawu, zaburzenia lub stanu patologicznego; redukowanie lub zapobieganie początkowi choroby, objawu, zaburzenia lub stanu; oraz ogólne przeciwdziałanie chorobie, objawowi, zaburzeniu lub stanowi patologicznemu. [0037] Stosowane tu leczenie lub leczniczy lub uśmierzający lub poprawiający są używane zamiennie. Terminy te odnoszą się do sposobu uzyskania korzystnych lub pożądanych wyników obejmujących, ale nie wyłącznie, korzyść terapeutyczną i/lub korzyść profilaktyczną. Przez korzyść terapeutyczną rozumie się dowolną istotną terapeutycznie poprawę lub wpływ na jedną lub więcej chorób, stanów lub objawów podlegających leczeniu. Dla korzyści profilaktycznej, kompozycje mogą być podawane osobnikowi zagrożonemu rozwojem konkretnej choroby, stanu lub objawu lub osobnikowi zgłaszającemu jeden lub więcej fizjologicznych objawów choroby, nawet jeśli choroba, stan lub objaw jeszcze się nie ujawniły.

17 PZ/3317/AGR 16 EP B1 [0038] Terminy skuteczna ilość lub terapeutycznie skuteczna ilość dotyczą ilości środka, która jest dostateczna do skutkowania korzystnymi lub pożądanymi wynikami. Terapeutycznie skuteczna ilość może różnić się w zależności od jednego lub więcej spośród: leczonego osobnika i stanu chorobowego, wagi i wieku osobnika, nasilenia stanu chorobowego, sposobu podania i tym podobnych, co może łatwo określić przeciętny specjalista w dziedzinie. Termin odnosi się również do dawki, która zapewni obraz do detekcji przez dowolną z opisanych tu metod obrazowania. Konkretna dawka może różnić się w zależności od jednego lub więcej spośród: konkretnego wybranego środka, stosowanego sposobu dawkowania, tego czy jest ona podawana w połączeniu z innymi związkami, czasu podawania, tkanki do zobrazowania oraz fizycznego systemu dostarczania, w którym jest przenoszona. [0039] Praktyka przedstawionego wynalazku wykorzystuje, o ile nie wskazano inaczej, konwencjonalne techniki immunologii, biochemii, chemii, biologii molekularnej, mikrobiologii, biologii komórki, genomiki oraz rekombinacji DNA, które mieszczą się w zakresie dziedziny. Zobacz Sambrook, Fritsch i Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, wydanie 2-gie (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al. red., (1987)); seria METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M.J. MacPherson, B.D. Hames i G.R. Taylor red. (1995)), Harlow i Lane, red. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL oraz ANIMAL CELL CULTURE (R.I. Freshney, red. (1987)). [0040] Kilka aspektów ujawnienia odnosi się do systemów wektorowych zawierających jeden lub więcej wektorów, lub do wektorów jako takich. Wektory mogą być zaprojektowane do ekspresji transkryptów CRISPR (np. transkryptów kwasów nukleinowych, białek lub enzymów) w komórkach prokariotycznych lub eukariotycznych. Na przykład, transkrypty CRISPR mogą ulegać ekspresji w komórkach bakteryjnych takich jak Escherichia coli, komórkach owadów (z zastosowaniem bakulowirusowych wektorów ekspresyjnych), komórkach drożdży lub komórkach ssaczych. Odpowiednie komórki gospodarze są omówione dalej w Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Alternatywnie, rekombinowany wektor ekspresyjny może być transkrybowany i ulegać translacji in vitro, na przykład z zastosowaniem sekwencji regulatorowych promotora T7 i polimerazy T7. [0041] Wektory mogą być wprowadzane i namnażane w prokarioncie. W niektórych przykładach wykonania, prokariont jest stosowany do amplifikacji kopii wektora do wprowadzenia do komórki eukariotycznej lub jako wektora pośredniego w wytwarzaniu wektora do wprowadzenia do komórki eukariotycznej (np. amplifikacja plazmidu, jako część systemu pakowania wektora wirusowego). W niektórych przykładach wykonania, prokariont jest używany do amplifikacji kopii wektora i ekspresji jednego lub więcej kwasów nukleinowych, np. do dostarczania źródła jednego lub więcej białek do dostarczenia do komórki gospodarza lub organizmu gospodarza. Ekspresja białek w prokariontach jest najczęściej przeprowadzana w Escherichia coli z wektorami obejmującymi konstytutywne lub indukowalne promotory kierujące ekspresją białek fuzyjnych albo niefuzyjnych. Wektory fuzyjne dodają szereg aminokwasów do kodowanego w nich białka, takich jak koniec aminowy rekombinowanego białka. Takie wektory fuzyjne mogą służyć do jednego lub więcej celów, takich jak: (i) zwiększenie ekspresji rekombinowanego białka; (ii) wzrost rozpuszczalności rekombinowanego białka; i (iii) wspomaganie oczyszczania rekombinowanego białka poprzez działanie jako ligand w oczyszczaniu metodą

18 PZ/3317/AGR 17 EP B1 powinowactwa. Często, w fuzyjnych wektorach ekspresyjnych, wprowadzane jest miejsce cięcia proteolitycznego na połączeniu ugrupowania fuzyjnego i rekombinowanego białka, aby umożliwić oddzielenie rekombinowanego białka od ugrupowania fuzyjnego po oczyszczeniu białka fuzyjnego. Takie enzymy i ich pokrewne rozpoznawane sekwencje, obejmują Czynnik Xa, trombinę oraz enterokinazę. Przykłady fuzyjnych wektorów ekspresyjnych obejmują pgex (Pharmacia Biotech Inc; Smith i Johnson, Gene 67: 31-40), pmal (New England Biolabs, Beverly, Mass.) i prit5 (Pharmacia, Piscataway, N.J.), które łączą odpowiednio S-transferazę glutationową (GST), białko wiążące maltozę E, lub białko A, z docelowym rekombinowanym białkiem. [0042] Przykłady odpowiednich indukowalnych niefuzyjnych wektorów ekspresyjnych E. coli obejmują ptrc (Amrann et al., (1988) Gene 69: ) oraz pet 11d (Studier et al., GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). (1990) 60-89). [0043] W niektórych przykładach wykonania, wektorem jest drożdżowy wektorekspresyjny. Przykłady wektorów do ekspresji w drożdżach Saccharomyces cerivisae obejmują pyepsec1 (Baldari, et al., EMBO J. 6: ), pmfa (Kuijan i Herskowitz, Cell 30: ), pjry88 (Schultz et al., Gene 54: ), pyes2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.) oraz picz (InVitrogen Corp, San Diego, Calif.). [0044] W niektórych przykładach wykonania, wektor kieruje ekspresją białka w komórkach owadów z zastosowaniem bakulowirusowych wektorów ekspresyjnych. Dostępne wektory bakulowirusowe do ekspresji białek w hodowanych komórkach owadów (np. komórki SF9) obejmują serię pac (Smith, et al., Mol. Cell. Biol. 3: ) oraz serię pvl (Lucklow i Summers, Virology 170: 31-39). [0045] W niektórych przykładach wykonania, wektory są zdolne do kierowania ekspresją jednej lub więcej sekwencji w komórkach ssaczych z zastosowaniem ssaczych wektorów ekspresyjnych. Przykłady ssaczych wektorów ekspresyjnych obejmują pcdm8 (Seed, Nature 329: 840) i pmt2pc (Kaufman, et al., EMBO J. 6: ). Przy stosowaniu w komórkach ssaczych, funkcje kontrolne wektorów ekspresyjnych są zwykle zapewniane przez jeden lub więcej elementów regulatorowych. Na przykład, powszechnie używane promotory pochodzą z poliomawirusa, adenowirusa 2, wirusa cytomegalii, małpiego wirusa 40 i innych ujawnionych tutaj i znanych w dziedzinie. Po inne odpowiednie systemy ekspresyjne, zarówno dla komórek prokariotycznych jak i eukariotycznych, zobacz np. Rozdziały 16 i 17 z Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. wyd. 2-gie Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., [0046] W niektórych przykładach wykonania, rekombinowany ssaczy wektor ekspresyjny jest zdolny do kierowania ekspresją kwasu nukleinowego preferencyjnie w konkretnym typie komórki (np. do ekspresji kwasu nukleinowego stosowane są specyficzne dla tkanki elementy regulatorowe). Specyficzne dla tkanki elementy regulatorowe są znane w dziedzinie. Nieograniczające przykłady odpowiednich specyficznych dla tkanek promotorów obejmują promotor albuminy (specyficzny dla wątroby; Pinkert, et al., Genes Dev. 1: ), promotory specyficzne dla tkanek limfoidalnych (Calame i Eaton, Adv. Immunol. 43: ), w szczególności promotory receptorów komórek T (Winoto i Baltimore, EMBO J. 8: ) oraz immunoglobulin (Baneiji, et al., Cell 33: ;

19 PZ/3317/AGR 18 EP B1 Queen i Baltimore, Cell 33: ), promotory specyficzne dla neuronów (np. promotor neurofilamentu; Byrne i Ruddle, Proc. Natl. Acad Sci. USA 86: ), promotory specyficzne dla trzustki (Edlund, et al., Science 230: ) oraz promotory specyficzne dla gruczołów sutkowych (np. promotory serwatki mleka; patent US nr 4,873,316 i publikacja europejskiego zgłoszenia nr 264,166). Objęte są także promotory regulowane w zależności od fazy rozwoju, np. mysie promotory hox (Kessel i Gruss, Science 249: ) i promotor α-fetoproteiny (Campes i Tilghman, Genes Dev. 3: ). [0047] W niektórych przykładach wykonania, element regulatorowy jest funkcjonalnie połączony z jednym lub więcej elementami systemu CRISPR, tak aby kierować ekspresją jednego lub więcej elementów systemu CRISPR. Zasadniczo, CRISPR (Zgrupowane Regularnie Rozmieszczone Krótkie Powtórzenia Palindromowe, ang. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats),), znane również jako SPIDR (ang. SPacer Interspersed Direct Repeats, Proste Powtórzenia Przerywane Przerywnikami), stanowią rodzinę loci DNA, które są zwykle specyficzne dla konkretnych gatunków bakteryjnych. Locus CRISPR zawiera odrębną klasę przerywanych, krótkich powtórzeń sekwencyjnych (SSR), które zostały rozpoznane u E. coli (Ishino et al., J. Bacteriol., 169: [1987]; i Nakata et al., J. Bacteriol., 171: [1989]), oraz powiązane geny. Podobne przerywane SSR zostały zidentyfikowane w Haloferax mediterranei, Streptococcus pyogenes, Anabaena oraz Mycobacterium tuberculosis (Zob., Groenen et al., Mol. Microbiol., 10: [1993]; Hoe et al., Emerg. Infect. Dis., 5: [1999]; Masepohl et al., Biochim. Biophys. Acta 1307:26-30 [1996]; i Mojica et al., Mol. Microbiol., 17:85-93 [1995]). Loci CRISPR zwykle różnią się od innych SSR strukturą powtórzeń, które zostały określone jako krótkie regularnie rozmieszczone powtórzenia (SRSR) (Janssen et al., OMICS J. Integ. Biol., 6:23-33 [2002]; i Mojica et al., Mol. Microbiol., 36: [2000]). Zasadniczo, powtórzenia są krótkimi elementami, które pojawiają się w zgrupowaniach, które są regularnie przerywane unikalnymi sekwencjami przerywnikowymi o zasadniczo stałej długości (Mojica et al., [2000], powyżej). Chociaż sekwencje powtórzeń są wysoce konserwowane między szczepami, ilość przerywających powtórzeń oraz sekwencje regionów przerywnikowych zwykle różnią się w zależności od szczepu (van Embden et al., J. Bacteriol., 182: [2000]). Loci CRISPR zostały zidentyfikowane u ponad 40 prokariontów (Zob. np. Jansen et al., Mol. Microbiol., 43: [2002]; i Mojica et al., [2005]) w tym, ale nie wyłącznie, Aeropyrum, Pyrobaculum, Sulfolobus, Archaeoglobus. Halocarcula, Methanobacterium, Methanococcus, Methanosarcina, Methanopyrus, Pyrococcus, Picrophilus, Thermoplasma, Corynebacterium, Mycobacterium, Streptomyces, Aquifex, Porphyromonas, Chlorobium, Thermus, Bacillus, Listeria, Staphylococcus, Clostridium, Thermoanaerobacter, Mycoplasma, Fusobacterium, Azarcus, Chromobacterium, Neisseria, Nitrosomonas, Desulfovibrio, Geobacter, Myxococcus, Campylobacter, Wolinella. Acinetobacter, Erwinia, Escherichia, Legionella, Methylococcus, Pasteurella, Photobacterium, Salmonella, Xanthomonas, Yersinia, Treponema i Thermotoga. [0048] Zasadniczo, system CRISPR odnosi się łącznie do transkryptów oraz innych elementów zaangażowanych w ekspresję lub kierujących aktywnością genów elementów towarzyszących CRISPR ( Cas ), w tym sekwencji kodujących gen Cas, sekwencji tracr (aktywującej CRISPR in trans; np. tracrrna lub aktywne częściowe tracrrna), sekwencji parującej tracr (obejmującej proste powtórzenie oraz procesowane przez tracrrna częściowe proste powtórzenie w kontekście endogennego systemu CRISPR), sekwencji kierującej (określanej również jako przerywnik w kontekście endogennego systemu CRISPR) lub innych sekwencji oraz transkryptów z locus CRISPR. W niektórych przykładach wykonania,

20 PZ/3317/AGR 19 EP B1 jeden lub więcej elementów systemu CRISPR pochodzi z systemu CRISPR typu I, typu II lub typu III. W niektórych przykładach wykonania, jeden lub więcej elementów systemu CRISPR pochodzi z konkretnego organizmu obejmującego endogenny system CRISPR, takiego jak Streptococcus pyogenes. Zasadniczo, system CRISPR charakteryzuje się elementami, które sprzyjają tworzeniu kompleksu CRISPR w miejscu sekwencji docelowej (określanej również jako protoprzerywnik w kontekście endogennego systemu CRISPR). W kontekście formowania kompleksu CRISPR, sekwencja docelowa odnosi się do sekwencji, dla której zaprojektowana jest sekwencja pod względem komplementarności, przy czym hybrydyzacja między sekwencją docelową i sekwencją kierującą sprzyja tworzeniu kompleksu CRISPR. Pełna komplementarność nie jest koniecznie wymagana, pod warunkiem, że występuje dostateczna komplementarność, aby skutkować hybrydyzacją i sprzyjać tworzeniu kompleksu CRISPR. Sekwencja docelowa może zawierać dowolny polinukleotyd, taki jak polinukleotydy DNA lub RNA. W niektórych przykładach wykonania, sekwencja docelowa jest zlokalizowana w jądrze lub cytoplazmie komórki. W niektórych przykładach wykonania, sekwencja docelowa może być w obrębie organelli komórki eukariotycznej, na przykład, mitochondrium lub chloroplaście. Sekwencja lub matryca, która może być wykorzystywana do rekombinacji do docelowego locus, zawierającego sekwencję docelową, jest określana jako matryca redagująca lub polinukleotyd redagujący lub sekwencja redagująca. W aspektach wynalazku, egzogenny polinukleotyd matrycowy może być określany, jako matryca redagująca. W aspekcie wynalazku, rekombinacją jest rekombinacja homologiczna. [0049] Zazwyczaj, w kontekście endogennego systemu CRISPR, tworzenie kompleksu CRISPR (zawierającego sekwencję kierującą hybrydyzującą z sekwencją docelową oraz w kompleksie z jednym lub więcej białkami Cas) skutkuje przecięciem jednej lub dwóch nici w lub w pobliżu (np. w obrębie 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50 lub więcej par zasad od) sekwencji docelowej. Bez ograniczania się teorią, sekwencja tracr, która może zawierać lub składa się z całej lub części sekwencji tracr typu dzikiego (np. około lub więcej niż około 20, 26, 32, 45, 48, 54, 63, 67, 85 lub więcej nukleotydów sekwencji tracr typu dzikiego), może również tworzyć część kompleksu CRISPR, np. przez hybrydyzację wzdłuż przynajmniej części sekwencji tracr do całości lub części sekwencji parującej tracr, która jest funkcjonalnie połączona z sekwencją kierującą. W niektórych przykładach wykonania, sekwencja tracr ma dostateczną komplementarność do sekwencji parującej tracr, aby hybrydyzować i uczestniczyć w formowaniu kompleksu CRISPR. Jak w przypadku sekwencji docelowej, uważa się, że całkowita komplementarność nie jest wymagana, o ile jest wystarczająca dla funkcjonalności. W niektórych przykładach wykonania, sekwencja tracr wykazuje przynajmniej 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% lub 99% komplementarność sekwencyjną wzdłuż długości sekwencji parującej tracr przy optymalnym dopasowaniu. W niektórych przykładach wykonania, jeden lub więcej wektorów kierujących ekspresją jednego lub więcej elementów systemu CRISPR jest wprowadzanych do komórki gospodarza tak, że ekspresja elementów systemu CRISPR kieruje tworzeniem kompleksu CRISPR w jednym lub więcej miejscach docelowych. Na przykład, enzym Cas, sekwencja kierująca połączona z sekwencją parującą tracr oraz sekwencja tracr, każda może być funkcjonalnie połączona z osobnymi elementami regulatorowymi na osobnych wektorach. Alternatywnie, dwa lub więcej elementów ulegających ekspresji z tego samego lub innych elementów regulatorowych, może być połączonych w pojedynczy wektor, z jednym lub więcej dodatkowymi wektorami zapewniającymi dowolne składniki systemu CRISPR niewłączone do pierwszego wektora. Elementy systemu CRISPR, które są połączone w pojedynczy wektor mogą być ułożone w

21 PZ/3317/AGR 20 EP B1 dowolnej odpowiedniej orientacji, np. gdy jeden element zlokalizowany w kierunku 5' ( powyżej ) lub 3 ( poniżej ) względem drugiego elementu. Sekwencja kodująca jednego elementu może być zlokalizowana na tej samej lub przeciwnej nici co sekwencja kodująca drugiego elementu, i zorientowana w tym samym lub przeciwnym kierunku. W niektórych przykładach wykonania, pojedynczy promotor kieruje ekspresją transkryptu kodującego enzym CRISPR oraz jednej lub więcej sekwencji kierujących, sekwencji parującej tracr (opcjonalnie funkcjonalnie połączonej z sekwencją kierującą) oraz sekwencji tracr osadzonej w obrębie jednej lub więcej sekwencji intronowych (np. każda w innym intronie, dwie lub więcej w przynajmniej jednym intronie lub wszystkie w jednym intronie). W niektórych przykładach wykonania, enzym CRISPR, sekwencja kierująca, sekwencja parująca tracr oraz sekwencja tracr są funkcjonalnie połączone i ulegają ekspresji z tego samego promotora. Konstrukty pojedynczych wektorów z SpCas9 przedstawiono na Figurze 22. [0050] W niektórych przykładach wykonania, wektor zawiera jedno lub więcej miejsc insercji, takich jak sekwencja rozpoznawana przez endonukleazę restrykcyjną (określana również jako miejsce klonowania ). W niektórych przykładach wykonania, jedno lub więcej miejsc insercji (np. około lub więcej niż około 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 lub więcej miejsc insercji) jest zlokalizowanych powyżej i/lub poniżej jednego lub więcej elementów sekwencji jednego lub więcej wektorów. W niektórych przykładach wykonania, wektor zawiera miejsce insercji powyżej sekwencji parującej tracr oraz opcjonalnie poniżej elementu regulatorowego funkcjonalnie połączonego z sekwencją parującą tracr, tak, że po insercji sekwencji kierującej do miejsca insercji oraz przy ekspresji sekwencja kierująca kieruje specyficznym dla sekwencji wiązaniem kompleksu CRISPR do sekwencji docelowej w komórce eukariotycznej. W niektórych przykładach wykonania wektor zawiera dwa lub więcej miejsc insercji, przy czym każde miejsce insercji jest zlokalizowane między dwiema sekwencjami parującymi tracr, tak, aby umożliwić insercję sekwencji kierującej w każdym miejscu. W takim ułożeniu, dwie lub więcej sekwencji kierujących może zawierać dwie lub więcej kopii pojedynczej sekwencji kierującej, dwie lub więcej różnych sekwencji kierujących lub ich kombinacje. Kiedy użytych jest wiele różnych sekwencji kierujących, stosowany może być pojedynczy konstrukt ekspresyjny do celowania aktywnością CRISPR do wielu różnych, odpowiednich sekwencji docelowych w obrębie komórki. Na przykład, pojedynczy wektor może zawierać około lub więcej niż około 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 lub więcej sekwencji kierujących. W niektórych przykładach wykonania, zapewnionych i opcjonalnie dostarczonych do komórki, może być około lub więcej niż około 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 lub więcej takich wektorów zawierających sekwencje kierujące. [0051] W niektórych przykładach wykonania, wektor zawiera element regulatorowy funkcjonalnie połączony z sekwencją kodującą enzym, która koduje enzym CRISPR, taki jak białko Cas. Nieograniczające przykłady białek Cas obejmują Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (znane również jako Csn1 i Csx12), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, ich homologii lub zmodyfikowane wersje. Enzymy te są znane; na przykład, sekwencję aminokwasową białka Cas9 z S. pyogenes można znaleźć w bazie danych SwissProt pod numerem dostępu Q99ZW2. W niektórych przykładach wykonania, niezmodyfikowany enzym CRISPR ma aktywność cięcia DNA, tak jak Cas9. W niektórych przykładach wykonania enzymem CRISPR jest Cas9, i może być to Cas9 z S. pyogenes lub

22 PZ/3317/AGR 21 EP B1 S. pneumoniae. W niektórych przykładach wykonania, enzym CRISPR kieruje bezpośrednim cięciem jednej lub obydwu nici w miejscu sekwencji docelowej, tak jak w obrębie sekwencji docelowej i/lub w obrębie sekwencji komplementarnej do sekwencji docelowej. W niektórych przykładach wykonania, enzym CRISPR kieruje cięciem jednej lub obydwu nici w obrębie około 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500 lub więcej par zasad od pierwszego lub ostatniego nukleotydu sekwencji docelowej. W niektórych przykładach wykonania, wektor koduje enzym CRISPR, który jest zmutowany względem odpowiedniego enzymu typu dzikiego, tak, że zmutowany enzym CRISPR nie ma zdolności cięcia jednej lub obydwu nici docelowego polinukleotydu zawierającego sekwencję docelową. Na przykład, substytucja asparaginianiu na alaninę (D10A) w domenie katalitycznej RuvC I Cas9 z S. pyogenes przekształca Cas9 z nukleazy, która tnie obydwie nici, do nikazy (tnie pojedynczą nić). Inne przykłady mutacji, które przekształcają Cas9 w nikazę obejmują, ale nie wyłącznie, H840A, N854A i N863A. W aspektach wynalazku, nikazy można stosować do redagowania genomu poprzez rekombinację homologiczną. Na przykład, Figura 21 przedstawia redagowanie genomu poprzez rekombinację homologiczną. Figura 21 (a) przedstawia schemat nikazy SpCas9, z mutacją D10A w domenie katalitycznej RuvC I. (b) Schematyczne przedstawienie rekombinacji homologicznej (HR) w ludzkim locus EMX1, z zastosowaniem sensownych lub antysensownych jednołańcuchowych oligonukleotydów, jako matryc do naprawy. (c) Sekwencja regionu zmodyfikowanego HR. d, test SURVEYOR dla typu dzikiego (wt) i indeli za pośrednictwem nikazy (D10A) SpCas9 w docelowym locus 1 z EMX1 (n=3). Strzałki wskazują pozycje dla przewidywanych wielkości fragmentów. [0052] W niektórych przykładach wykonania, nikaza Cas9 może być stosowana w połączeniu z sekwencją (/ami) kierującą (/ymi), np. dwiema sekwencjami kierującymi, które celują odpowiednio w nić sensowną i antysensowną docelowego DNA. To połączenie umożliwia nacięcie obu nici i ich wykorzystanie do indukowania NHEJ. Twórcy wykazali (dane nie przedstawione) wydajność dwóch celów dla nikaz (tj. sgrna celujących w to samo miejsce, jednak na różnych niciach DNA) w indukowaniu mutagennego NHEJ. Pojedyncza nikaza (Cas9-D10A z pojedynczym sgrna) nie jest zdolna do indukowania NHEJ i wytworzenia indeli, jednak Twórcy wykazali, że podwójna nikaza (Cas9-D10A i dwa sgrna celujące w różne nici w tym samym miejscu) mogą mieć taki wpływ w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych (hesc). Skuteczność to około 50% nukleazy (tj. zwykłego Cas9 bez mutacji D10) w hesc. [0053] W dalszym przykładzie, dwie lub więcej katalitycznych domen Cas9 (RuvC I, RuvC II i RuvC III) można zmutować, z wytworzeniem zmutowanego Cas9, zasadniczo niemającego pełnej aktywności cięcia DNA. W niektórych przykładach wykonania, mutacja D10A jest połączona z jedną lub więcej mutacjami H840A, N854A lub N863A z wytworzeniem enzymu Cas9 zasadniczo niemającego pełnej aktywności cięcia DNA. W niektórych przykładach wykonania, enzym CRISPR jest uznawany za zasadniczo niemający pełnej aktywności cięcia DNA, kiedy aktywność cięcia DNA zmutowanego enzymu jest poniżej około 25%, 10%, 5%, 1%, 0,1%, 0,01% lub mniej względem jego niezmutowanej postaci. Inne mutacje mogą być użyteczne; gdy Cas9 lub inny enzym CRISPR pochodzi z gatunków innych niż S. pyogenes, można wprowadzić mutacje w odpowiednich aminokwasach w celu osiągnięcia podobnych efektów.

23 PZ/3317/AGR 22 EP B1 [0054] W niektórych przykładach wykonania, sekwencja kodująca enzym, która koduje enzym CRISPR jest zoptymalizowana pod względem kodonów do ekspresji w konkretnych komórkach, takich jak komórki eukariotyczne. Komórkami eukariotycznymi mogą być należące do lub pochodzące od konkretnego organizmu, takiego jak ssak, w tym, ale nie wyłącznie, człowiek, mysz, szczur, królik, pies lub naczelny niebędący człowiekiem. Zasadniczo, optymalizacja pod względem kodonów dotyczy procesu modyfikacji sekwencji kwasu nukleinowego w celu wzmocnienia ekspresji w komórkach gospodarzach poprzez zamianę przynajmniej jednego kodonu (np. około lub więcej niż około 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50 lub więcej kodonów) sekwencji natywnej, kodonami, które są częściej lub najczęściej używane w genach tej komórki gospodarza, z jednoczesnym utrzymaniem natywnej sekwencji aminokwasów. Różne gatunki wykazują szczególną preferencję dla pewnych kodonów konkretnego aminokwasu. Preferencja do kodonów (różnice w wykorzystaniu kodonów między organizmami) często koreluje z wydajnością translacji informacyjnego RNA (mrna), co w efekcie uważane jest za zależne od, między innymi, właściwości kodonów ulegających translacji oraz dostępności konkretnych cząsteczek transferowego RNA (trna). Przewaga wybranych trna w komórce jest zasadniczo odzwierciedleniem kodonów stosowanych najczęściej w syntezie peptydów. W związku z tym, geny mogą być projektowane pod kątem optymalnej ekspresji genów w danym organizmie w oparciu o optymalizację pod względem kodonów. Tabele wykorzystania kodonów są łatwo dostępne, np. w Codon Usage Database, a tabele te mogą być dostosowane na szereg sposobów. Zob. Nakamura, Y., et al. Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000 Nucl. Acids Res. 28:292 (2000). Algorytmy komputerowe do optymalizacji pod względem kodonów konkretnej sekwencji do ekspresji w konkretnej komórce gospodarzu są również dostępne, takie jak Gene Forge (Aptagen; Jacobus, PA), są również dostępne. W niektórych przykładach wykonania, jeden lub więcej kodonów (np. 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50 lub więcej lub wszystkie kodony) w sekwencji kodującej enzym CRISPR odpowiada najczęściej używanemu kodonowi dla konkretnego aminokwasu. [0055] Zasadniczo, sekwencją kierującą jest dowolna sekwencja polinukleotydowa mającą dostateczną komplementarność z docelową sekwencją polinukleotydową, do hybrydyzacji z sekwencją docelową i kierowania specyficznym dla sekwencji wiązaniem kompleksu CRISPR do sekwencji docelowej. W niektórych przykładach wykonania, stopień komplementarności między sekwencją kierującą oraz jej odpowiadającą sekwencją docelową, przy optymalnym dopasowaniu z zastosowaniem odpowiedniego algorytmu dopasowywania, wynosi około lub więcej niż około 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97,5%, 99% lub więcej. Optymalne dopasowanie może być określone z zastosowaniem dowolnego odpowiedniego algorytmu do dopasowywania sekwencji, czego nieograniczające przykłady obejmują algorytm Smitha-Watermana, algorytm Needlemana-Wunscha, algorytmy oparte o Transformatę Burrowsa-Wheelera (np. Burrows Wheeler Aligner), ClustalW, Clustal X, BLAT, Novoalign (Novocraft Technologies, ELAND (Illumina, San Diego, CA), SOAP (dostępny pod soap.genomics.org.cn), i Maq (dostępny pod maq.sourceforge.net). W niektórych przykładach wykonania, sekwencja kierująca ma około lub więcej niż około 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75 lub więcej nukleotydów długości. W niektórych przykładach wykonania, sekwencja kierująca ma mniej niż około 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12 lub mniej nukleotydów długości. Zdolność sekwencji kierującej do kierowania specyficznym dla sekwencji wiązaniem kompleksu CRISPR z sekwencją docelową może być oceniona przez dowolny odpowiedni test. Na przykład, elementy

24 PZ/3317/AGR 23 EP B1 systemu CRISPR wystarczające do uformowania kompleksu CRISPR, z włączeniem sekwencji kierującej, która ma być badana, mogą być dostarczone do komórki gospodarza zawierającej odpowiednią sekwencję docelową, np. przez transfekcję wektorami kodującymi elementy sekwencji CRISPR, z następującą oceną preferencyjnego cięcia w obrębie sekwencji docelowej, np. za pomocą testu Surveyor jak tu opisano. Podobnie, przecięcie docelowej sekwencji polinukleotydowej może być ocenione w probówce przez zapewnienie sekwencji docelowej, elementów kompleksu CRISPR, w tym sekwencji kierującej, która ma być badana i kontrolnej sekwencji kierującej, różnej od testowej sekwencji kierującej oraz porównanie wiązania lub częstości cięcia w sekwencji docelowej między reakcjami dla testowej i kontrolnej sekwencji kierującej. Możliwe są i będą oczywiste dla specjalistów inne testy. [0056] Można wybrać sekwencję kierującą do celowania w dowolną sekwencję docelową. W niektórych przykładach wykonania, sekwencją docelową jest sekwencja w obrębie genomu komórki. Przykładowe sekwencje docelowe obejmują te, które są unikalne w genomie docelowym. Na przykład, dla Cas9 z S. pyogenes, unikalna sekwencja docelowa w genomie może obejmować miejsce docelowe Cas9 w postaci MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXGG gdzie NNNNNNNNNNNNXGG (N to A, G, T lub C; a X może być dowolne) występuje w genomie tylko raz. Unikalna sekwencja docelowa w genomie może obejmować miejsce docelowe Cas9 z S. pyogenes w postaci MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXGG gdzie NNNNNNNNNNNXGG (N to A, G, T lub C; a X może być dowolne) występuje w genomie tylko raz. Dla Cas9 CRISPR1 z S. thermophilus, unikalna sekwencja docelowa w genomie może obejmować miejsce docelowe Cas9 w postaci MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXXAGAAW (SEQ ID NO: 1), gdzie NNNNNNNNNNNNXXAGAAW (SEQ ID NO: 2) (N to A, G, T lub C; X może być dowolne; a W to A lub T) występuje w genomie tylko raz. Unikalna sekwencja docelowa w genomie może obejmować miejsce docelowe Cas9 CRISPR1 z S. thermophilus w postaci MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXXAGAAW (SEQ ID NO: 3), gdzie NNNNNNNNNNNXXAGAAW (SEQ ID NO: 4) (N to A, G, T lub C; X może być dowolne; a W to A lub T) występuje w genomie tylko raz. Dla Cas9 z S. pyogenes, unikalna sekwencja docelowa w genomie może obejmować miejsce docelowe Cas9 w postaci MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXGGXG, gdzie NNNNNNNNNNNNXGGXG (N to A, G, T lub C; a X może być dowolne) występuje w genomie tylko raz. Unikalna sekwencja docelowa w genomie może obejmować miejsce docelowe Cas9 z S. pyogenes w postaci MMMMMMMMNMNNNNNNNNNNXGGXG gdzie NNNNNNNNNNNXGGXG (N to A, G, T lub C; a X może być dowolne) występuje w genomie tylko raz. W każdej z tych sekwencji M może być A, G, T lub C i nie musi być brane pod uwagę w identyfikacji sekwencji jako unikalnej. [0057] W niektórych przykładach wykonania, sekwencja kierująca wybierana jest tak aby zmniejszyć poziom struktur drugorzędowych w obrębie sekwencji kierującej. Struktura drugorzędowa może być określona przez dowolny odpowiedni algorytm fałdowania polinukleotydu. Niektóre programy opierają się na obliczeniach minimalnej energii swobodnej Gibbsa. Przykładem jednego z takich algorytmów jest mfold, jak opisali Zuker i Stiegler (Nucleic Acids Res. 9 (1981), ). Innym przykładem algorytmu fałdowania jest internetowy serwer sieciowy RNAfold, opracowany w Institute for Theoretical Chemistry na Uniwersytecie Wiedeńskim, wykorzystujący algorytm przewidywania ciężkości struktury (zob. np. A.R. Gruber et al., 2008, Cell 106(1): 23-24; i PA Carr i GM Church, 2009, Nature Biotechnology 27(12): ).

25 PZ/3317/AGR 24 EP B1 [0058] Zasadniczo, sekwencja parująca tracr obejmuje dowolną sekwencję, która ma dostateczną komplementarność z sekwencją tracr do sprzyjania jednemu lub więcej spośród: (1) wycięcia sekwencji kierującej otoczonej przez sekwencje parujące tracr w komórce zawierającej odpowiadającą sekwencję tracr; oraz (2) tworzenia kompleksu CRISPR przy sekwencji docelowej, przy czym kompleks CRISPR obejmuje sekwencję parującą tracr hybrydyzującą z sekwencją tracr. Zasadniczo, stopień komplementarności odnosi się do optymalnego dopasowania sekwencji parującej tracr i sekwencji tracr, wzdłuż długości krótszej spośród dwóch sekwencji. Optymalne dopasowanie może być określone przez dowolny odpowiedni algorytm dopasowania i może ponadto odpowiadać za struktury drugorzędowe, np. auto-komplementarności w obrębie sekwencji tracr lub sekwencji parującej tracr. W niektórych przykładach wykonania, stopień komplementarności między sekwencją tracr a sekwencją parującą tracr wzdłuż długości krótszej spośród nich przy optymalnym dopasowaniu wynosi około lub więcej niż około 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97,5%, 99% lub więcej. Przykładowe ilustracje optymalnego dopasowania między sekwencją tracr i sekwencją parującą tracr przedstawiono na Figurach 10B i 11B. W niektórych przykładach wykonania, sekwencja tracr ma około lub więcej niż około 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50 lub więcej nukleotydów długości. W niektórych przykładach wykonania, sekwencja tracr i sekwencja parująca tracr zawierają się w obrębie pojedynczego transkryptu, tak że hybrydyzacja między nimi wytwarza transkrypt mający strukturę drugorzędową, taką jak spinka do włosów. Korzystne sekwencje tworzące pętle do wykorzystania w strukturach spinek do włosów mają cztery nukleotydy długości, a najkorzystniej mają sekwencję GAAA. Jednakże, stosować można dłuższe lub krótsze sekwencje pętli, jak i sekwencje alternatywne. Sekwencje korzystnie obejmują tryplet nukleotydów (na przykład AAA) oraz dodatkowy nukleotyd (na przykład C lub G). Przykłady sekwencji tworzących pętle obejmują CAAA i AAAG. W przykładzie wykonania ujawnienia, transkrypt lub transkrybowana sekwencja polinukleotydowa zawiera co najmniej dwie lub więcej spinek do włosów. W korzystnych przykładach wykonania, transkrypt zawiera dwie, trzy, cztery lub pięć spinek do włosów. W dalszym przykładzie wykonania, transkrypt zawiera co najwyżej pięć spinek do włosów. W niektórych przykładach wykonania, pojedynczy transkrypt ponadto obejmuje sekwencję terminacji transkrypcji; korzystnie jest to sekwencja polit, na przykład sześć nukleotydów T. Przykładowa ilustracja takiej struktury spinki do włosów jest przedstawiona w dolnej części Figury 11B, gdzie część sekwencji w kierunku 5' od końcowego N oraz powyżej pętli odpowiada sekwencji parującej tracr, a część sekwencji w kierunku 3' od pętli odpowiada sekwencji tracr. Dalsze nieograniczające przykłady pojedynczych polinukleotydów zawierających sekwencję kierującą, sekwencję parującą tracr i sekwencję tracr są następujące (przedstawione 5' do 3'), przy czym N oznacza zasadę sekwencji kierującej, pierwszy blok małych liter przedstawia sekwencję parującą tracr, a drugi blok małych liter przedstawia sekwencję tracr, a ostatnia sekwencja polit przedstawia terminator transkrypcji: (1) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaagatttaGAAAtaaatcttgcagaagctacaaagataaggctt catgccgaaatcaacaccctgtcattttatggcagggtgttttcgttatttaatttttt (SEQ ID NO: 5); (2) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaGAAAtgcagaagctacaaagataaggcttcatgccgaaatca acaccctgtcattttatggcagggtgttttcgttatttaatttttt (SEQ ID NO: 6); (3) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaGAAAtgcagaagctacaaagataaggcttcatgccgaaatca acaccctgtcattttatggcagggtgttttttt (SEQ ID NO: 7); (4) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctaGAAAtagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaa agtggcaccgagtcggtgctttttt (SEQ ID NO: 8); (5)

26 PZ/3317/AGR 25 EP B1 NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctaGAAATAGcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaa aaagtgttttttt (SEQ ID NO: 9); i (6) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctagAAATAGcaagttaaaataaggctagtccgttatcaTTTTT TTT (SEQ ID NO: 10). W niektórych przykładach wykonania, sekwencje (1) do (3) stosowane są w połączeniu z Cas9 z CRISPR1 z S. thermophilus. W niektórych przykładach wykonania, sekwencje (4) do (6) stosowane są w połączeniu z Cas9 z S. pyogenes. W niektórych przykładach wykonania, sekwencja tracr jest osobnym transkryptem od transkryptu zawierającego sekwencję parującą tracr (tak jak zilustrowano w górnej części Figury 11B). [0059] W niektórych przykładach wykonania, enzym CRISPR jest częścią białka fuzyjnego obejmującego jedną lub więcej heterologicznych domen białkowych (np. około lub więcej niż około 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 lub więcej domen poza enzymem CRISPR). Białko fuzyjne enzymu CRISPR może obejmować dowolną dodatkową sekwencję aminokwasów i opcjonalnie sekwencję łączącą między dowolnymi dwiema domenami. Przykłady domen białkowych, które mogą być łączone z enzymem CRISPR obejmują, bez ograniczenia, znaczniki epitopowe, sekwencje genów reporterowych oraz domeny białkowe mające jedną lub więcej z następujących aktywności: aktywność metylazy, aktywność demetylazy, aktywność aktywacji transkrypcji, aktywność represji transkrypcji, aktywność czynnika uwalniającego transkrypt, aktywność modyfikacji histonu, aktywność cięcia RNA oraz aktywność wiązania kwasu nukleinowego. Nieograniczające przykłady znaczników epitopowych obejmują znaczniki histydynowe (His), znaczniki V5, znaczniki FLAG, znaczniki hemaglutyniny (HA) grypy, znaczniki Myc, znaczniki VSV-G oraz znaczniki tioredoksyny (Trx). Przykłady genów reporterowych obejmują, ale nie wyłącznie, S-transferazę glutationową (GST), peroksydazę chrzanową (HRP), acetylotransferazę chloramfenikolu (CAT), beta-galaktozydazę, beta-glukuronidazę, lucyferazę, białko zielonej fluorescencji (GFP), HcRed, DsRed, białko jasnoniebieskiej fluorescencji (CFP), białko żółtej fluorescencji (YFP) i białka autofluoroscencyjne, w tym białko niebieskiej fluorescencji (BFP). Enzym CRISPR można łączyć z sekwencją genu kodującą białko lub fragment białka, które wiążą cząsteczki DNA lub wiążą inne cząsteczki komórkowe, w tym, ale nie wyłącznie, białko wiążącego maltozę (MBP), S-tag, fuzje z domeną wiążącą DNA (DBD) Lex A, fuzje z domeną wiążącą DNA GAL4 i fuzje z białkiem wirusa opryszczki pospolitej (HSV) BP16. Dodatkowe domeny, które mogą tworzyć część białka fuzyjnego obejmującego enzym CRISPR opisano w US W niektórych przykładach wykonania, do identyfikacji miejsca sekwencji docelowej stosowany jest tagowany enzym CRISPR. [0060] W jednym z aspektów ujawnienia, gen reporterowy, co obejmuje, ale nie wyłącznie, S-transferazę glutationową (GST), peroksydazę chrzanową (HRP), acetylotransferazę chloramfenikolu (CAT), beta-galaktozydazę, beta-glukuronidazę, lucyferazę, białko zielonej fluorescencji (GFP), HcRed, DsRed, białko jasnoniebieskiej fluorescencji (CFP), białko żółtej fluorescencji (YFP) i białka autofluoroscencyjne, w tym białko niebieskiej fluorescencji (BFP), można wprowadzać do komórki w celu kodowania produktu genu, który służy jako znacznik, z pomocą którego mierzy się zmianę lub modyfikację ekspresji produktu genu. W dalszym przykładzie wykonania ujawnienia, cząsteczkę DNA kodującą produkt genu można wprowadzić do komórki z pomocą wektora. W korzystnym przykładzie wykonania ujawnienia, produktem genu jest lucyferaza. W dalszym przykładzie wykonania ujawnienia, ekspresja produktu genu jest zmniejszona.

27 PZ/3317/AGR 26 EP B1 [0061] W jednym z aspektów, ujawnienie zapewnia sposoby obejmujące dostarczanie jednego lub więcej polinukleotydów, np. jednego lub więcej wektorów jak tu opisane, jednego lub więcej ich transkryptów i/lub jednego lub białek z nich wyrażanych, do komórki gospodarza. Ujawnienie służy jako podstawowy system do umożliwiania ukierunkowanej modyfikacji genomów opartych na DNA. Można go łączyć z wieloma systemami dostarczania, w tym, ale nie wyłącznie wirusowym, liposomowym, elektroporacją, mikroiniekcją i koniugacją. W niektórych aspektach, ujawnienie ponadto zapewnia komórki wytworzone takimi sposobami i organizmy (takie jak zwierzęta, rośliny lub grzyby) zawierające lub tworzone przez takie komórki. W niektórych przykładach wykonania, enzym CRISPR w połączeniu z (i opcjonalnie w kompleksie z) sekwencją kierującą jest dostarczany do komórki. Można stosować standardowe, wirusowe i nie-wirusowe sposoby transferu genów do wprowadzania kwasów nukleinowych do komórek ssaczych lub tkanek docelowych. Takie sposoby stosować można do podania kwasów nukleinowych kodujących elementy systemu CRISPR do komórek w hodowli lub do organizmu gospodarza. Nie-wirusowe wektorowe systemy dostarczania obejmują plazmidy DNA, RNA (np. transkrypt opisanego tutaj wektora), nagi kwas nukleinowy oraz kwas nukleinowy w kompleksie z nośnikiem, takim jak liposom. Wirusowe wektorowe systemy dostarczania obejmują wirusy DNA oraz RNA, które po dostarczeniu do komórki mają genomy episomalne, albo zintegrowane. Dla przeglądu procedur terapii genowej, zobacz Anderson, Science 256: (1992); Nabel & Felgner, TIBTECH 11: (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11: (1993); Dillon, TIBTECH 11: (1993); Miller, Nature 357: (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10): (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995); Haddada et al., w Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler i Böhm (red.) (1995); oraz Yu et al., Gene Therapy 1:13-26 (1994). [0062] Sposoby nie-wirusowego dostarczania kwasów nukleinowych obejmują lipofekcję, nukleofekcję, mikroiniekcję, biolistykę, wirosomy, liposomy, immunoliposomy, koniugaty polikation lub lipid:kwas nukleinowy, nagi DNA, sztuczne wiriony oraz wzmocniony chemicznie wychwyt DNA. Lipofekcja jest opisana np. w patencie US nr 5,049,386, 4,946,787; i 4,897,355), a odczynniki do lipofekcji są sprzedawane komercyjnie (np. Transfectam i Lipofectin ). Kationowe i obojętne lipidy, które są odpowiednie do wydajnej, opartej na rozpoznaniu przez receptory lipofekcji polinukleotydów, obejmują te z Felgner, WO 91/17424; WO 91/ Dostarczanie może następować do komórek (np. podanie in vitro lub ex vivo) lub tkanek docelowych (np. podanie in vivo). [0063] Wytwarzanie kompleksów lipid:kwas nukleinowy, w tym ukierunkowanych liposomów, takich jak kompleksy immunolipidowe, jest dobrze znane specjalistom w dziedzinie (zobacz np. Crystal, Science 270: (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2: (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5: (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5: (1994); Gao et al., Gene Therapy 2: (1995); Ahmad et al., Cancer Res. 52: (1992); patenty US nr 4,186,183, 4,217,344, 4,235,871, 4,261,975, 4,485,054, 4,501,728, 4,774,085, 4,837,028, i 4,946,787). [0064] Stosowanie opartych o wirusy systemów RNA lub DNA do dostarczenia kwasów nukleinowych wykorzystuje wysoko rozwinięte procesy kierowania wirusa do specyficznych komórek w organizmie i przenoszenia zawartości wirusa do jądra. Wektory wirusowe mogą być podawane bezpośrednio pacjentom (in vivo) lub mogą być stosowane do traktowania komórek in vitro, a zmodyfikowane komórki

28 PZ/3317/AGR 27 EP B1 mogą być opcjonalnie podawane pacjentom (ex vivo). Standardowe systemy oparte o wirusy mogą obejmować wektory retrowirusowe, lentiwirusowe, adenowirusowe, towarzyszące adenowirusom oraz wirusa opryszczki pospolitej do transferu genów. Przy sposobach transferu genów z pomocą retrowirusów, lentiwirusów i wirusów towarzyszących adenowirusom, możliwa jest integracja z genomem gospodarza, co często skutkuje długoterminową ekspresją wprowadzonego transgenu. Dodatkowo, obserwowano wysokie wydajności transdukcji w wielu różnych typach komórek i tkankach docelowych. [0065] Tropizm retrowirusa można zmieniać przez włączenie obcych białek otoczki, co poszerza potencjalną populację docelową komórek docelowych. Wektory lentiwirusowe są wektorami retrowirusowymi, które są zdolne do transdukcji lub infekcji niedzielących się komórek i zwykle dają wysokie miana wirusa. Wybór retrowirusowego systemu transferu genów byłby więc zależny od tkanki docelowej. Wektory retrowirusowe obejmują długie powtórzenia końcowe działające in cis, ze zdolnością upakowania dla maksymalnie 6-10 kpz obcej sekwencji. Minimalne LTR działające in cis są wystarczające dla replikacji oraz pakowania wektorów, które są następnie wykorzystywane do integrowania terapeutycznego genu do komórki docelowej w celu zapewnienia trwałej ekspresji transgenu. Szeroko stosowane wektory retrowirusowe obejmują oparte o mysi wirus białaczki (MuLV), wirus białaczki małp gibonowatych (GaLV), małpi wirus niedoboru odporności (SIV), ludzki wirus niedoboru odporności (HIV) oraz ich kombinacje (zob., np. Buchscher et al., J. Virol. 66: (1992); Johann et al., J. Virol. 66: ); Sommnerfelt et al., Virol. 176:58-59 (1990); Wilson et al., J. Virol. 63: (1989); Miller et al., J. Virol. 65: (1991); PCT/US94/05700). W zastosowaniach gdzie preferowana jest przejściowa ekspresja, stosowane mogą być systemy oparte o adenowirusy. Wektory oparte o adenowirusy są zdolne do bardzo wysokiej wydajności transdukcji w wielu typach komórek oraz nie wymagają podziału komórki. Z takimi wektorami uzyskiwano wysokie miano i poziomy ekspresji. Wektor ten może być wytwarzany w dużych ilościach w stosunkowo prostym systemie. Wektory towarzyszące adenowirusom ( AAV ) mogą być wykorzystywane do transdukcji komórek docelowymi kwasami nukleinowymi, np. przy wytwarzaniu kwasów nukleinowych i peptydów in vitro oraz dla procedur terapii genowej in vivo i ex vivo (zob., np. West et al., Virology 160:38-47 (1987); patent US nr 4,797,368; WO 93/24641; Kotin, Human Gene Therapy 5: (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351 (1994). Konstrukcja rekombinowanych wektorów AAV jest opisana w szeregu publikacji, w tym patent US nr 5,173,414; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5: (1985); Tratschin, et al., Mol. Cell. Biol. 4: (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81: (1984) oraz Samulski et al., J. Virol. 63: (1989). [0066] Do formowania cząstek wirusowych, które są zdolne do infekowania komórki gospodarza, stosowane są zwykle komórki pakujące. Komórki takie obejmują komórki 293, które pakują adenowirusy oraz komórki ψ2 lub komórki PA317, które pakują retrowirusy. Wektory wirusowe używane w terapii genowej są zwykle tworzone przez wytworzenie linii komórek, która pakuje wektor kwasu nukleinowego do cząstki wirusowej. Wektory te zwykle zawierają minimalną sekwencję wirusową wymaganą do pakowania i następującej po nim integracji do gospodarza, przy czym inne sekwencje wirusowe są podmieniane na kasetę ekspresyjną dla polinukleotydu (polinukleotydów) do ekspresji. Brakujące funkcje wirusowe są zwykle dostarczane in trans przez linię komórek pakujących. Na przykład, wektory AAV stosowane w terapii genowej zwykle mają jedynie sekwencje ITR z genomu AAV, które są wymagane do pakowania i integracji z genomem gospodarza. Wirusowe DNA jest pakowane w linii komórkowej, która

29 PZ/3317/AGR 28 EP B1 zawiera plazmid pomocniczy kodujący inne geny AAV, mianowicie rep oraz cap, jednak bez sekwencji ITR. Linia komórkowa może być również zakażana adenowirusem pomocniczym. Wirus pomocniczy promuje replikację wektora AAV oraz ekspresję genów AAV z plazmidu pomocniczego. Plazmid pomocniczy nie jest pakowany w znaczących ilościach ze względu na brak sekwencji ITR. Zanieczyszczenie adenowirusem może być zmniejszone przez np. obróbkę cieplną, na którą adenowirus jest bardziej wrażliwy niż AAV. Dodatkowe metody dostarczenia kwasów nukleinowych do komórek są znane specjalistom w dziedzinie. Zobacz, na przykład, US [0067] W niektórych przykładach wykonania, komórka gospodarz jest przejściowo lub nieprzejściowo transfekowana jednym lub więcej opisanymi tu wektorami. W niektórych przykładach wykonania, komórka jest transfekowana, tak jak następuje to naturalnie u osobnika. W niektórych przykładach wykonania, komórka, która jest transfekowana jest pobrana od osobnika. W niektórych przykładach wykonania, komórka pochodzi od komórek pobranych od osobnika, tak jak przy linii komórkowej. Szeroki wybór linii komórkowych dla hodowli tkankowych jest znany w dziedzinie. Przykłady linii komórkowych obejmują, ale nie wyłącznie, C8161, CCRF-CEM, MOLT, mimcd-3, NHDF, HeLa-S3, Huh1, Huh4, Huh7, HUVEC, HASMC, HEKn, HEKa, MiaPaCell, Panc1, PC-3, TF1, CTLL-2, C1R, Rat6, CV1, RPTE, A10, T24, J82, A375, ARH-77, Calu1, SW480, SW620, SKOV3, SK-UT, CaCo2, P388D1, SEM-K2, WEHI-231, HB56, TIB55, Jurkat, J45.01, LRMB, Bcl-1, BC-3, IC21, DLD2, Raw264.7, NRK, NRK-52E, MRC5, MEF, Hep G2, HeLa B, HeLa T4, COS, COS-1, COS-6, COS-M6A, BS-C-1 małpi nabłonek nerek, BALB/ 3T3 mysie fibroblasty zarodkowe, 3T3 Swiss, 3T3-L1, 132-d5 ludzkie fibroblasty płodowe; 10.1 mysie fibroblasty, 293-T, 3T3, 721, 9L, A2780, A2780ADR, A2780cis, A172, A20, A253, A431, A-549, ALC, B16, B35, komórki BCP-1, BEAS-2B, bend.3, BHK-21, BR 293, BxPC3, C3H-10T1/2, C6/36, Cal-27, CHO, CHO-7, CHO-IR, CHO-K1, CHO-K2, CHO-T, CHO Dhfr -/-, COR-L23, COR-L23/CPR, COR-L23/5010, COR- L23/R23, COS-7, COV-434, CML T1, CMT, CT26, D17, DH82, DU145, DuCaP, EL4, EM2, EM3, EMT6/AR1, EMT6/AR10.0, FM3, H1299, H69, HB54, HB55, HCA2, HEK-293, HeLa, Hepa1c1c7, HL-60, HMEC, HT-29, Jurkat, komórki JY, komórki K562, Ku812, KCL22, KG1, KYO1, LNCap, Ma-Mel 1-48, MC-38, MCF-7, MCF-10A, MDA-MB-231, MDA-MB-468, MDA-MB-435, MDCK II, MDCK II, MOR/0.2R, MONO-MAC 6, MTD-1A, MyEnd, NCI-H69/CPR, NCI-H69/LX10, NCI-H69/LX20, NCI-H69/LX4, NIH-3T3, NALM-1, NW-145, linie komórkowe OPCN / OPCT, Peer, PNT-1A / PNT 2, RenCa, RIN-5F, RMA/RMAS, komórki Saos-2, Sf-9, SkBr3, T2, T-47D, T84, linia komórkowa THP1, U373, U87, U937, VCaP, komórki Vero, WM39, WT-49, X63, YAC-1, YAR i ich warianty transgeniczne. Linie komórkowe są dostępne z szeregu źródeł znanych specjalistom w dziedzinie (zob., np. the American Type Culture Collection (ATCC) (Manassus, Va.)). W niektórych przykładach wykonania, komórka transfekowana jednym lub więcej opisanymi tu wektorami jest wykorzystywana do ustanowienia nowej linii komórkowej zawierającej jedną lub więcej sekwencji pochodzących z wektora. W niektórych przykładach wykonania, komórka przejściowo transfekowana elementami systemu CRISPR zgodnie z niniejszym opisem (tak jak przez przejściową transfekcję jednego lub więcej wektorów lub transfekcję z RNA) i modyfikowana przez aktywność kompleksu CRISPR, wykorzystywana jest do ustanowienia nowej linii komórkowej obejmującej komórki niosące modyfikację, jednak niemające żadnej innej sekwencji egzogennej. W niektórych przykładach wykonania, komórki przejściowo lub nieprzejściowo transfekowane jednym lub więcej opisanymi tu wektorami lub linie komórkowe pozyskane z takich komórek stosowane są do oceny jednego lub więcej związków testowych.

30 PZ/3317/AGR 29 EP B1 [0068] Aspekty ujawnienia dotyczą tworzenia izogenicznych linii komórek ssaczych do badania zmienności genetycznej choroby. Dalszy aspekt ujawnienia dotyczy tworzenia modyfikowanych genetycznie modeli zwierzęcych, transgenicznych lub poprzez dostarczanie za pośrednictwem wirusów. Ujawnienie obejmuje też modyfikacje genomu mikroorganizmów, komórek, roślin, zwierząt lub organizmów syntetycznych do tworzenia produktów użytecznych w biomedycynie, rolnictwie i przemyśle. W jeszcze innym aspekcie, ujawnienie obejmuje terapię genową. Ujawnienie można wykorzystywać jako narzędzie w badaniach biologicznych, dla zrozumienia genomu, np. w badaniach z knockoutami genów. Ujawnienie dotyczy wielu innych sposobów i kompozycji, które zależą od podstawowej zdolności redagowania i przepisywania zawartości DNA genomów, jak również celowanej inaktywacji organizmów opartych na DNA. Ujawnienie można stosować też jako lek do celowania w konkretne szczepy przy zakażeniach bakteryjnych, zakażeniach wirusowych itp. [0069] W niektórych przykładach wykonania, jeden lub więcej opisanych tutaj wektorów jest używanych do wytwarzania zwierzęcia transgenicznego niebędącego człowiekiem lub rośliny transgenicznej. W niektórych przykładach wykonania, transgenicznym zwierzęciem jest ssak, taki jak mysz, szczur lub królik. W pewnych przykładach wykonania, organizmem lub osobnikiem jest roślina. W pewnych przykładach wykonania, organizmem lub osobnikiem lub rośliną jest glon. Sposoby wytwarzania transgenicznych roślin i zwierząt są znane w dziedzinie i zasadniczo wychodzą od sposobu transfekcji komórek, tak jak tu opisano. Zapewnione są też zwierzęta transgeniczne, jak i rośliny transgeniczne, zwłaszcza rośliny uprawne i glony. Transgeniczne zwierzę lub roślina może być użyteczne w zastosowaniach wykraczających poza zapewnienie modelu choroby. Może to obejmować wytwarzanie żywności lub pasz poprzez ekspresję, na przykład, wyższych poziomów białek, węglowodanów, składników odżywczych lub witamin niż normalnie obserwowane u typu dzikiego. W tym względzie, korzystne są rośliny transgeniczne, zwłaszcza strączkowe i bulwiaste, oraz zwierzęta, zwłaszcza ssaki takie jak zwierzęta gospodarskie (krowy, owce, kozy i świnie), ale również drób i jadalne owady. [0070] Transgeniczne glony lub inne rośliny, takie jak rzepak mogą być szczególnie użyteczne w wytwarzaniui olejów roślinnych lub biopaliw takich jak na przykład alkohole (zwłaszcza metanol oraz etanol). Mogą być one konstruowane do ekspresji lub nadekspresji wysokich poziomów oleju lub alkoholu do zastosowania w przemyśle olejowym lub biopaliwowym. [0071] W jednym z aspektów, ujawnienie zapewnia sposoby modyfikacji docelowego polinukleotydu w komórce eukariotycznej, które mogą być in vivo, ex vivo lub in vitro. W niektórych przykładach wykonania, sposób obejmuje pobieranie próbek komórki lub populacji komórek od człowieka lub zwierzęcia niebędącego człowiekiem lub rośliny (w tym mikroglonu) i modyfikację komórki lub komórek. Hodowla może następować ex vivo na dowolnym etapie. Komórkę lub komórki można nawet ponownie wprowadzać do zwierzęcia niebędącego człowiekiem lub rośliny (w tym mikroglonu). [0072] W jednym z aspektów, ujawnienie zapewnia sposoby modyfikacji docelowego polinukleotydu w komórce eukariotycznej. W niektórych przykładach wykonania, sposób obejmuje umożliwianie kompleksowi CRISPR wiązania się z docelowym polinukleotydem, do przeprowadzenia cięcia wymienionego docelowego polinukleotydu, z modyfikowaniem w ten sposób docelowego polinukleotydu, przy czym kompleks CRISPR obejmuje enzym CRISPR w kompleksie z sekwencją kierującą hybrydyzującą z sekwencją docelową w obrębie wymienionego polinukleotydu docelowego, przy czym

31 PZ/3317/AGR 30 EP B1 wymieniona sekwencja kierująca jest połączona z sekwencją parującą tracr, która z kolei hybrydyzuje z sekwencją tracr. [0073] W jednym z aspektów, ujawnienie zapewnia sposób modyfikowania ekspresji polinukleotydu w komórce eukariotycznej. W niektórych przykładach wykonania, sposób obejmuje umożliwianie kompleksowi CRISPR wiązania się z polinukleotydem, tak że wymienione wiązanie skutkuje wzrostem lub obniżeniem ekspresji wymienionego polinukleotydu; przy czym kompleks CRISPR obejmuje enzym CRISPR w kompleksie z sekwencją kierującą hybrydyzującą z sekwencją docelową w obrębie wymienionego polinukleotydu, przy czym wymieniona sekwencja kierująca jest połączona z sekwencją parującą tracr, która z kolei hybrydyzuje z sekwencją tracr. [0074] Dzięki ostatnim postępom w genomice roślin uprawnych, możliwość stosowania systemów CRISPR-Cas do przeprowadzania wydajnego i opłacalnego ekonomicznie redagowania i manipulowania genami, umożliwi szybką selekcję i porównywanie pojedynczych i multipleksowych manipulacji genowych celu transformacji takich genomów dla zwiększania produkcji oraz ulepszonych cech. W tym względzie odsyła się do amerykańskich patentów i publikacji: patent US nr 6,603,061 - Agrobacterium-Mediated Plant Transformation Method (Sposób transformacji roślin z pomocą Agrobacterium); patent US nr 7,868,149 - Plant Genome Sequences and Uses Thereof (Sekwencje genomu roślin i ich zastosowania) oraz US 2009/ Transgenic Plants with Enhanced Agronomic Traits (Rośliny transgeniczne o ulepszonych cechach agronomicznych). W praktycznym stosowaniu ujawnienia, odsyła się też do zawartości i ujawnienia w Morrell et al Crop genomics:advances and applications Nat Rev Genet Dec 29;13(2): [0075] W roślinach, patogeny są często specyficzne wobec gospodarza. Na przykład, Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici powoduje więdnięcie pomidorów, ale atakuje jedynie pomidory, a F. oxysporum f. dianthii Puccinia graminis f. sp. tritici atakuje jedynie pszenicę. U roślin występują konstytutywne i indukowane systemy obronne w celu stawiania oporu większości patogenów. Mutacje i zdarzenia rekombinacyjne przez pokolenia roślin prowadzą do zmienności genetycznej, która daje początek wrażliwości, szczególnie z uwagi na to, że patogeny mnożą się z większą częstotliwością niż rośliny. W roślinach występować może odporność wynikająca z niegościnności (ang. non-host resistance) np. gospodarz i patogen są niekompatybilni. Może występować też Odporność Horyzontalna, np. częściowa odporność wobec wszystkich odmian patogenu, zwykle pod kontrolą wielu genów oraz Odporność Wertykalna, np. całkowita odporność na niektóre odmiany patogenu, ale nie na inne odmiany, zwykle pod kontrolą kilku genów. Na poziomie gen-do-genu, rośliny i patogenu ewoluują razem, a zmiany genetyczne w jednym równoważą zmianę w drugim. W związku z tym, wykorzystując naturalną zmienność, hodowcy łączą najbardziej użyteczne geny dla Wydajności, Jakości, Jednorodności, Wytrzymałości, Odporności. Źródła genów odporności obejmują odmiany natywne i obce, odmiany potomne, spokrewnione rośliny dzikie oraz indukowane mutacje, np. traktowanie materiału roślinnego czynnikami mutagennymi. Stosując niniejsze ujawnienie, hodowcy roślin otrzymują nowe narzędzie do wprowadzania mutacji. W związku z tym, specjalista w dziedzinie może analizować genom źródeł genów odporności i u odmian mających pożądane właściwości lub cechy wykorzystywać niniejsze ujawnienie w celu indukowania powstania genów odporności, z precyzją większą niż przy wcześniejszych czynnikach mutagennych, i tym samym przyspieszać i ulepszać programy hodowli roślin.

32 PZ/3317/AGR 31 EP B1 [0076] W jednym z aspektów, ujawnienie zapewnia zestawy obejmujące dowolny jeden lub więcej z elementów ujawnionych w powyższych sposobach i kompozycjach. W niektórych przykładach wykonania, zestaw obejmuje system wektorowy i instrukcje do używania zestawu. W niektórych przykładach wykonania, system wektorowy obejmuje a) pierwszy element regulatorowy połączony funkcjonalnie z sekwencją parującą tracr oraz jedno lub więcej miejsc insercji do wprowadzania sekwencji kierującej powyżej sekwencji parującej tracr, przy czym przy ekspresji sekwencja kierująca kieruje specyficznym wobec sekwencji wiązaniem się kompleksu CRISPR do sekwencji docelowej w komórce eukariotycznej, przy czym kompleks CRISPR obejmuje enzym CRISPR w kompleksie z (1) sekwencją kierującą, która hybrydyzuje z sekwencją docelową i (2) sekwencją parującą tracr, która hybrydyzuje z sekwencją tracr; i/lub (b) drugi element regulatorowy połączony funkcjonalnie z sekwencją kodującą enzym, która koduje wymieniony enzym CRISPR obejmujący sekwencję lokalizacji jądrowej. Elementy można zapewnić osobno lub w połączeniach i mogą być zapewnione w dowolnym odpowiednim pojemniku, takim jak fiolka, butelka lub probówka. W niektórych przykładach wykonania, zestaw zawiera instrukcje w jednym lub więcej językach, na przykład w więcej niż jednym języku. [0077] W niektórych przykładach wykonania, zestaw zawiera jeden lub więcej reagentów do zastosowania w procesie wykorzystania jednego lub więcej opisanych tu elementów. Reagenty mogą być zapewnione w dowolnym odpowiednim pojemniku. Na przykład, zestaw może zapewniać jeden lub więcej buforów reakcyjnych lub do przechowywania. Reagenty mogą być dostarczone w formie, która jest użyteczna w konkretnym teście lub w postaci, która wymaga dodania jednego lub więcej innych komponentów przed użyciem (np. w postaci stężonej lub liofilizowanej). Buforem może być dowolny bufor, w tym, ale nie wyłącznie, buforu węglanu sodu, buforu wodorowęglanu sodu, buforu boranowego, buforu Tris, buforu MOPS, buforu HEPES oraz ich kombinacji. W niektórych przykładach wykonania, bufor jest zasadowy. W niektórych przykładach wykonania, bufor ma ph od około 7 do około 10. W niektórych przykładach wykonania, zestaw zawiera jeden lub więcej oligonukleotydów odpowiadających sekwencji kierującej do wprowadzenia do wektora tak, aby funkcjonalnie połączyć sekwencję kierującą oraz element regulatorowy. W niektórych przykładach wykonania, zestaw zawiera polinukleotyd matrycowy do rekombinacji homologicznej. [0078] W jednym z aspektów, ujawnienie zapewnia sposoby stosowania jednego lub więcej elementów systemu CRISPR. Kompleks CRISPR według ujawnienia zapewnia skuteczny środek do modyfikacji docelowego polinukleotydu. Kompleks CRISPR według ujawnienia ma szeroki wachlarz zastosowań, w tym modyfikację (np. delecję, insercję, translokację, inaktywację, aktywację) docelowego polinukleotydu w wielu typach komórek. Jako taki, kompleks CRISPR według ujawnienia ma szerokie spektrum zastosowań, np. w terapii genowej, badaniach przesiewowych leków, diagnostyce i prognozowaniu chorób. Przykładowy kompleks CRISPR zawiera enzym CRISPR w kompleksie z sekwencją kierującą hybrydyzującą z sekwencją docelową w obrębie docelowego polinukleotydu. Sekwencja kierująca jest połączona z sekwencją parującą tracr, która z kolei hybrydyzuje z sekwencją tracr. [0079] Docelowym polinukleotydem kompleksu CRISPR może być dowolny polinukleotyd endogenny lub egzogenny dla komórki eukariotycznej. Na przykład, docelowym polinukleotydem może być polinukleotyd znajdujący się w jądrze komórki eukariotycznej. Docelowym polinukleotydem może być sekwencja kodująca produkt genu (np. białko) lub sekwencja niekodująca (np. polinukleotyd regulatorowy lub

33 PZ/3317/AGR 32 EP B1 śmieciowy DNA). Bez wiązania się teorią, uważa się, że sekwencja docelowa powinna być powiązana z PAM (motywem przylegającym do protoprzerywnika, ang. protospacer adjacent motif); czyli krótką sekwencją rozpoznawaną przez kompleks CRISPR. Precyzyjne wymagania dot. sekwencji i długości dla PAM różnią się w zależności od stosowanego enzymu CRISPR, jednak PAM są zwykle sekwencjami po 2-5 par zasad, przylegającymi do protoprzerywnika (czyli sekwencji docelowej). Przykłady sekwencji PAM są podane w sekcji przykładów poniżej, a specjalista będzie w stanie zidentyfikować dalsze sekwencje PAM do zastosowania z danym enzymem CRISPR. [0080] Docelowy polinukleotyd kompleksu CRISPR może obejmować szereg genów i polinukleotydów powiązanych z chorobami, a także genów i polinukleotydów powiązanych ze ścieżkami sygnalizacji biochemicznej. [0081] Przykłady docelowych polinukleotydów obejmują sekwencję powiązaną z biochemicznym szlakiem sygnałowym, np. gen lub polinukleotyd powiązany z biochemicznym szlakiem sygnałowym. Przykłady docelowych polinukleotydów obejmują gen lub polinukleotyd powiązany z chorobą. Gen lub polinukleotyd powiązany z chorobą odnosi się do dowolnego genu lub polinukleotydu, który dostarcza produktów transkrypcji lub translacji na nieprawidłowym poziomie lub w nieprawidłowej postaci w komórkach pochodzących z tkanek dotkniętych chorobą w porównaniu z tkankami lub komórkami z próby kontrolnej bez choroby. Może być to gen, który ulega ekspresji na nieprawidłowo wysokim poziomie; może być to gen, który ulega ekspresji na nieprawidłowo niskim poziomie, przy czym zmieniona ekspresja koreluje z występowaniem i/lub postępem choroby. Powiązany z chorobą gen odnosi się też do genu mającego mutację (mutacje) lub zmienność genetyczną, która jest bezpośrednio odpowiedzialna za etiologię choroby lub jest w nierównowadze z genem (genami), który jest odpowiedzialny za etiologię choroby. Transkrybowane lub ulegające translacji produkty mogą być znane lub nieznane, i mogą być na prawidłowym lub nieprawidłowym poziomie. [0082] Przykłady powiązanych z chorobą genów i polinukleotydów są dostępne z McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine, Johns Hopkins University (Baltimore, Md.) oraz National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine (Bethesda, Md.), dostępnych w internecie. [0083] Przykłady powiązanych z chorobą genów i polinukleotydów są wymienione w Tabelach A i B. Specyficzne dla choroby informacje są dostępne z McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine, Johns Hopkins University (Baltimore, Md.) oraz National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine (Bethesda, Md.), dostępnych w internecie. Przykłady genów i polinukleotydów powiązanych ze szlakami sygnalizacji biochemicznej są wymienione w Tabeli C. [0084] Mutacje w tych genach i szlakach mogą skutkować wytwarzaniem nieprawidłowych białek lub białek w nieprawidłowych ilościach, co wpływa na funkcję. Takie geny, białka oraz szlaki mogą być docelowym polinukleotydem kompleksu CRISPR. Tabela A CHOROBA/CHOROBY Neoplazja GEN(Y) PTEN; ATM; ATR; EGFR; ERBB2; ERBB3; ERBB4; Notch1; Notch2; Notch3; Notch4; AKT; AKT2; AKT3; HIF;

34 PZ/3317/AGR 33 EP B1 CHOROBA/CHOROBY Związane z wiekiem plamki żółtej zwyrodnienie Schizofrenia Zaburzenia Zaburzenia z powtórzeniami trinukleotydowymi Zespół łamliwego chromosomu X Zaburzenia związane z sekretazą Inne Zaburzenia związane z prionami Prp ALS Uzależnienie od używek Autyzm Choroba Alzheimera Stan zapalny GEN(Y) HIF1a; HIF3a; Met; HRG; Bc12; PPAR alfa; PPAR gamma; WT 1 (guz Wilmsa); członkowie rodziny receptora FGF (5 członków: 1, 2, 3, 4, 5); CDKN2a; APC; RB (retinoblastoma); MEN1; VHL; BRCA1; BRCA2; AR (receptor androgenowy); TSG101; IGF; receptor IGF; Igfl (4 warianty); Igf2 (3 warianty); receptor Igf 1; receptor Igf 2; Bax; Bc12; rodzina kaspaz (9 członków: 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 12); Kras; Apc Abcr; Cc12; Cc2; cp (ceruloplazmina); Timp3; katepsyna D; Vldlr; Ccr2 Neuregulina 1 (Nrg1); Erb4 (receptor dla Neureguliny); Kompleksyna 1 (Cplx1); Tph1 hydroksylaza tryptofanowa; Tph2 Hydroksylaza tryptofanowa 2; Neureksyna 1; GSK3; GSK3a; GSK3b 5-HTT (Slc6a4); COMT; DRD (Drd1a); SLC6A3; DAOA; DTNBP1; Dao (Dao1) HTT (choroba Huntingtona); SBMA/SMAX1/AR (choroba Kennedy ego); FXN/X25 (ataksja Friedricha); ATX3 (choroba Machado-Josepha); ATXN1 i ATXN2 (ataksje rdzeniowo-móżdżkowe); DMPK (dystrofia miotoniczna); Atrofina-1 i Atn1 (choroba DRPLA); CBP (Creb-BP uogólniona niestabilność); VLDLR (choroba Alzheimera); Atxn7; Atxn10 FMR2; FXR1; FXR2; mglur5 APH-1 (alfa i beta); Presenilina (Psen1); nikastryna (Ncstn); PEN-2 Nos1; Parpl; Nat1; Nat2 SOD1; ALS2; STEX; FUS; TARDBP; VEGF (VEGF-a; VEGF-b; VEGF-c) Prkce (alkohol); Drd2; Drd4; ABAT (alkohol); GRIA2; Grm5; Grin1; Htrlb; Grin2a; Drd3; Pdyn; Grial (alkohol) Mecp2; BZRAP1; MDGA2; Sema5A; Neurexin 1; Łamliwy X (FMR2 (AFF2); FXR1; FXR2; Mglur5) El; CHIP; UCH; UBB; Tau; LRP; PICALM; Klusteryna; PS1; SORL1; CR1; Vldlr; Uba1; Uba3; CHIP28 (Aqp1, Akwaporyna 1); Uchll; Uchl3; APP IL-10; IL-1 (IL-la; IL-1b); IL-13; IL-17 (IL-17a (CTLA8); IL- 17b; IL-17c; IL-17d; IL-17f); II-23; Cx3cr1; ptpn22; TNFa;

35 PZ/3317/AGR 34 EP B1 CHOROBA/CHOROBY Choroba Parkinsona GEN(Y) NOD2/CARD15 for IBD; IL-6; IL-12 (IL-12a; IL-12b); CTLA4; Cx3c11 x-synukleina; DJ-1; LRRK2; Parkina; PINK1 Tabela B: Choroby i zaburzenia krwi i krzepliwości anemia (CDAN1, CDA1, RPS19, DBA, PKLR, PK1, NT5C3, UMPH1, PSN1, RHAG, RH50A, NRAMP2, SPTB, ALAS2, ANH1, ASB, ABCB7, ABC7, ASAT); Zespół nagich limfocytów (TAPBP, TPSN, TAP2, ABCB3, PSF2, RING11, MHC2TA, C2TA, RFX5, RFXAP, RFX5), Zaburzenia krzepliwości (TBXA2R, P2RX1, P2X1); Czynnik H i czynnik podobny do czynnika H 1 (HF1, CFH, HUS); Czynnik V i czynnik VIII (MCFD2); niedobór Czynnika VII (F7); niedobór Czynnika X (F10); niedobór Czynnika XI (F11); niedobór Czynnika XII (F12, HAF); niedobór Czynnika XIIIA (F13A1, F13A); niedobór Czynnika XIIIB (F13B); anemia Fanconi ego (FANCA, FACA, FA1, FA, FAA, FAAP95, FAAP90, FLJ34064, FANCB, FANCC, FACC, BRCA2, FANCD1, FANCD2, FANCD, FACD, FAD, FANCE, FACE, FANCF, XRCC9, FANCG, BRIP1, BACH1, FANCJ, PHF9, FANCL, FANCM, KIAA1596); Zaburzenia z limfohistiocytozą hemofagocytową (PRF1, HPLH2, UNC13D, MUNC13-4, HPLH3, HLH3, FHL3); Hemofilia A (F8, F8C, HEMA); Hemofilia B (F9, HEMB), Zaburzenia krwotoczne (PI, ATT, F5); Niedobory i zaburzenia związane z leukocytami (ITGB2, CD18, LCAMB, LAD, EIF2B1, EIF2BA, EIF2B2, EIF2B3, EIF2B5, LVWM, CACH, CLE, EIF2B4); anemia sierpowata (HBB); talasemia (HBA2, HBB, HBD, LCRB, HBA1). Zaburzenia regulacji komórkowej oraz choroby i zaburzenia nowotworowe B-komórkowy chłoniak nieziarniczy (BCL7A, BCL7); Białaczka (TAL1, TCL5, SCL, TAL2, FLT3, NBS1, NBS, ZNFN1A1, IK1, LYF1, HOXD4, HOX4B, BCR, CML, PHL, ALL, ARNT, KRAS2, RASK2, GMPS, AF10, ARHGEF12, LARG, KIAA0382, CALM, CLTH, CEBPA, CEBP, CHIC2, BTL, FLT3, KIT, PBT, LPP, NPM1, NUP214, D9S46E, CAN, CAIN, RUNX1, CBFA2, AML1, WHSC1L1, NSD3, FLT3, AF1Q, NPM 1, NUMA 1, ZNF145, PLZF, PML, MYL, STAT5B, AF10, CALM, CLTH, ARL11, ARLTS1, P2RX7, P2X7, BCR, CML, PHL, ALL, GRAF, NF1, VRNF, WSS, NFNS, PTPN11, PTP2C, SHP2, NS1, BCL2, CCND1, PRAD1, BCL1, TCRA, GATA1, GF1, ERYF1, NFE1, ABL1, NQO1, DIA4, NMOR1, NUP214, D9S46E, CAN, CAIN). Choroby i zaburzenia powiązane ze stanem zapalnym i układem odpornościowym AIDS (KIR3DL1, NKAT3, NKB1, AMB11, KIR3DS1, IFNG, CXCL12, SDF1); Autoimmunizacyjny zespół limfoproliferacyjny (TNFRSF6, APT1, FAS, CD95, ALPS1A); złożony niedobór odporności, (IL2RG, SCIDX1, SCIDX, IMD4); HIV-1 (CCL5, SCYA5, D17S136E, TCP228), podatność na lub zakażenie HIV (IL10, CSIF, CMKBR2, CCR2, CMKBR5, CCCKR5 (CCR5)); Niedobory odporności (CD3E, CD3G, AICDA, AID, HIGM2, TNFRSF5, CD40, UNG, DGU, HIGM4, TNFSF5, CD40LG, HIGM1, IGM, FOXP3, IPEX, AIID, XPID, PIDX, TNFRSF14B, TACI); Stan zapalny (IL-10, IL-1 (IL-la, IL-1b), IL-13, IL-17 (IL-17a (CTLA8), IL-17b, IL-17c, IL-17d, IL-17f), 11-23, Cx3crl, ptpn22, TNFa, NOD2/CARD15 for IBD, IL-6, IL-12 (IL-12a, IL- 12b), CTLA4, Cx3cll); Ciężkie złożone niedobory odporności (SCID)(JAK3, JAKL, DCLRE1C, ARTEMIS, SCIDA, RAG1, RAG2, ADA, PTPRC, CD45, LCA, IL7R, CD3D, T3D, IL2RG, SCIDX1, SCIDX, IMD4). Choroby i zaburzenia metaboliczne, wątroby, nerek i związane z białkami neuropatia amyloidowa (TTR, PALB); Amyloidoza (APOA1, APP, AAA, CVAP, AD1, GSN, FGA, LYZ, TTR, PALB); Marskość wątroby (KRT18, KRT8, CIRH1A, NAIC, TEX292, KIAA1988); Mukowiscydoza (CFTR, ABCC7, CF, MRP7); Choroby spichrzeniowe glikogenu (SLC2A2, GLUT2, G6PC, G6PT, G6PT1, GAA, LAMP2, LAMPB, AGL, GDE, GBE1, GYS2, PYGL, PFKM); Gruczolak wątrobowokomórkowy, (TCF1, HNF1A, MODY3), Niewydolność choroby o wczesnym wystąpieniu oraz zaburzenie neurologiczne (SCOD1, SCO1), Niedobór lipazy wątrobowej (LIPC), Wątrobiak, nowotwór i rak (CTNNB1, PDGFRL, PDGRL, PRLTS, AXIN1, AXIN, CTNNB1, TP53, P53, LFS1, IGF2R, MPRI, MET, CASP8, MCH5; Torbielowatość rdzenia nerki (UMOD, HNFJ, FJHN, MCKD2, ADMCKD2); Fenyloketonuria (PAH,

36 PZ/3317/AGR 35 EP B1 PKU1, QDPR, DHPR, PTS); Wielotorbielowatość nerki i wątroby (FCYT, PKHD1, ARPKD, PKD1, PKD2, PKD4, PKDTS, PRKCSH, G19P1, PCLD, SEC63). Choroby i zaburzenia mięśniowe / szkieletowe dystrofia mięśniowa Beckera (DMD, BMD, MYF6), dystrofia mięśniowa Duchenne a (DMD, BMD); dystrofia mięśniowa Emery ego-dreifussa (LMNA, LMN 1, EMD2, FPLD, CMD1A, HGPS, LGMD1B, LMNA, LMN 1, EMD2, FPLD, CMD1A); dystrofia mięśniowa twarzowo-łopatkowo-ramieniowa (FSHMD1A, FSHD1A); dystrofia mięśniowa (FKRP, MDC1C, LGMD2I, LAMA2, LAMM, LARGE, KIAA0609, MDC1D, FCMD, TTID, MYOT, CAPN3, CANP3, DYSF, LGMD2B, SGCG, LGMD2C, DMDA1, SCG3, SGCA, ADL, DAG2, LGMD2D, DMDA2, SGCB, LGMD2E, SGCD, SGD, LGMD2F, CMD1L, TCAP, LGMD2G, CMD1N, TRIM32, HT2A, LGMD2H, FKRP, MDC1C, LGMD2I, TTN, CMD1G, TMD, LGMD2J, POMT 1, CAV3, LGMD1C, SEPN 1, SELN, RSMD1, PLEC1, PLTN, EBS1); Osteopetroza (LRP5, BMND1, LRP7, LR3, OPPG, VBCH2, CLCN7, CLC7, OPTA2, OSTM1, GL, TCIRG1, TIRC7, OC116, OPTB1); atrofia mięśniowa (VAPB, VAPC, ALS8, SMN 1, SMA 1, SMA2, SMA3, SMA4, BSCL2, SPG 17, GARS, SMAD1, CMT2D, HEXB, IGHMBP2, SMUBP2, CATF1, SMARD1). Choroby i zaburzenia neurologiczne i neuronalne ALS (SOD1, ALS2, STEX, FUS, TARDBP, VEGF (VEGF-a, VEGF-b, VEGF-c); choroba Alzheimera (APP, AAA, CVAP, AD1, APOE, AD2, PSEN2, AD4, STM2, APBB2, FE65L1, NOS3, PLAU, URK, ACE, DCP 1, ACE 1, MPO, PACIP1, PAXIP1L, PTIP, A2M, BLMH, BMH, PSEN1, AD3); Autyzm (Mecp2, BZRAP1, MDGA2, Sema5A, Neureksyna 1, GLO1, MECP2, RTT, PPMX, MRX16, MRX79, NLGN3, NLGN4, KIAA1260, AUTSX2); Zespół łamliwego chromosomu X (FMR2, FXR1, FXR2, mglur5); choroba Huntingtona i podobne zaburzenia (HD, IT15, PRNP, PRIP, JPH3, JP3, HDL2, TBP, SCA17); choroba Parkinsona (NR4A2, NURR1, NOT, TINUR, SNCAIP, TBP, SCA17, SNCA, NACP, PARK1, PARK4, DJ1, PARK7, LRRK2, PARK8, PINK1, PARK6, UCHL1, PARK5, SNCA, NACP, PARK1, PARK4, PRKN, PARK2, PDJ, DBH, NDUFV2); zespół Retta (MECP2, RTT, PPMX, MRX16, MRX79, CDKL5, STK9, MECP2, RTT, PPMX, MRX16, MRX79, x-synukleina, DJ-1); Schizofrenia (Neuregulina1 (Nrg1), Erb4 (receptor Neureguliny), Compleksyna1 (Cplxl), hydroksylaza tryptofanowa, Tph2, hydroksylaza tryptofanowa 2, Neureksyna 1, GSK3, GSK3a, GSK3b, 5-HTT (Slc6a4), COMT, DRD (Drdla), SLC6A3, DAOA, DTNBP1, Dao (Dao1)); zaburzenia powiązane z sekretazą (APH-1 (alfa i beta), Presenilina (Psen1), nikastryna, (Ncstn), PEN-2, Nos1, Parpl, Nat1, Nat2); Zaburzenia z powtórzeniami trinukleotydowymi (HTT (Choroba Huntingtona), SBMA/SMAX1/AR (choroba Kennedy ego), FXN/X25 (ataksja Friedricha), ATX3 (chroba Machado- Josepha), ATXN1 i ATXN2 (ataksje rdzeniowo-móżdzkowe), DMPK (dystrofia miotoniczna), Atrofina-1 i Atn1 (choroba DRPLA), CBP (Creb-BP uogólniona niestabilność), VLDLR (choroba Alzheimera), Atxn7, Atxn10). Choroby i zaburzenia oczu Związane z wiekiem zwyrodnienie plamki żółtej (Abcr, Ccl2, Cc2, cp (ceruloplazmina), Timp3, katepsyna D, Vldlr, Ccr2); Zaćma (CRYAA, CRYA1, CRYBB2, CRYB2, PITX3, BFSP2, CP49, CP47, CRYAA, CRYA1, PAX6, AN2, MGDA, CRYBA1, CRYB1, CRYGC, CRYG3, CCL, LIM2, MP19, CRYGD, CRYG4, BFSP2, CP49, CP47, HSF4, CTM, HSF4, CTM, MIP, AQP0, CRYAB, CRYA2, CTPP2, CRYBB1, CRYGD, CRYG4, CRYBB2, CRYB2, CRYGC, CRYG3, CCL, CRYAA, CRYA1, GJA8, CX50, CAE1, GJA3, CX46, CZP3, CAE3, CCM1, CAM, KRIT1); Zmętnienie i dystrofia rogówki (APOA1, TGFBI, CSD2, CDGG1, CSD, BIGH3, CDG2, TACSTD2, TROP2, M1S1, VSX1, RINX, PPCD, PPD, KTCN, COL8A2, FECD, PPCD2, PIP5K3, CFD); wrodzona rogówka płaska (KERA, CNA2); jaskra (MYOC, TIGR, GLC1A, JOAG, GPOA, OPTN, GLC1E, FIP2, HYPL, NRP, CYP1B1, GLC3A, OPA1, NTG, NPG, CYP1B1, GLC3A); wrodzona ślepota Lebera (CRB1, RP12, CRX, CORD2, CRD, RPGRIP1, LCA6, CORD9, RPE65, RP20, AIPL1, LCA4, GUCY2D, GUC2D, LCA1, CORD6, RDH12, LCA3); dystrofia plamki żółtej (ELOVL4, ADMD, STGD2, STGD3, RDS, RP7, PRPH2, PRPH, AVMD, AOFMD, VMD2). padaczka, EPM2A, MELF, EPM2

37 PZ/3317/AGR 36 EP B1 miokloniczna, typu Lafora, padaczka, miokloniczna, typu Lafora, NHLRC1, EPM2A, EPM2B dystrofia mięśniowa Duchenne a, (3) DMD, BMD AIDS, o opóźnionym/szybkim przebiegu do (3) AIDS, o szybkim przebiegu do, (3) AIDS, odporność na (3) KIR3DL1, NKAT3, NKB1, AMB11, KIR3DS1 IFNG CXCL12, SDF1 niedobór alfa 1- antytrypsyny SERPINA1 [inhibitor peptydaz serynowych (serpin), klad A (antyproteinaza alfa-1, antytrypsyna), członek 1]; SERPINA2 [inhibitor peptydaz serynowych (serpin), klad A (antyproteinaza alfa-1, antytrypsyna), członek 2]; SERPINA3 [inhibitor peptydaz serynowych (serpin), klad A (antyproteinaza alfa-1, antytrypsyna), członek 3]; SERPINA5 [inhibitor peptydaz serynowych (serpin), klad A (antyproteinaza alfa-1, antytrypsyna), członek 5]; SERPINA6 [inhibitor peptydaz serynowych (serpin), klad A (antyproteinaza alfa-1, antytrypsyna), członek 6]; SERPINA7 [inhibitor peptydaz serynowych (serpin), klad A (antyproteinaza alfa-1, antytrypsyna), członek 7];" I "SERPINA6 ( inhibitor peptydaz serynowych (serpin), klad A (antyproteinaza alfa-1, antytrypsyna), członek 6) Tabela C FUNKCJA KOMÓRKOWA sygnalizacja PI3K/AKT GENY PRKCE; ITGAM; ITGA5; IRAK1; PRKAA2; EIF2AK2; PTEN; EIF4E; PRKCZ; GRK6; MAPK1; TSC1; PLK1; AKT2; IKBKB; PIK3CA; CDK8; CDKN1B; NFKB2; BCL2; PIK3CB; PPP2R1A; MAPK8; BCL2L1; MAPK3; TSC2; ITGA1; KRAS; EIF4EBP1; RELA; PRKCD; NOS3; PRKAA1; MAPK9; CDK2; PPP2CA; PIM1; ITGB7; YWHAZ; ILK; TP53; RAF1; IKBKG; RELB; DYRK1A; CDKN1A; ITGB1; MAP2K2; JAK1; AKT1; JAK2; PIK3R1; CHUK; PDPK1; PPP2R5C; CTNNB1; MAP2K1; NFKB1; PAK3; ITGB3; CCND1; GSK3A; FRAP1; SFN; ITGA2; TTK; CSNK1A1; BRAF; GSK3B; AKT3; FOXO1; SGK;

38 PZ/3317/AGR 37 EP B1 FUNKCJA KOMÓRKOWA sygnalizacja ERK/MAPK sygnalizacja receptora glukokortykoidowego sygnalizacja dot. kierowania rozwojem aksonów sygnalizacja receptora efrynowego GENY HSP90AA1; RPS6KB1 PRKCE; ITGAM; ITGA5; HSPB1; IRAK1; PRKAA2; EIF2AK2; RAC 1; RAP1A; TLN 1; EIF4E; ELK1; GRK6; MAPK1; RAC2; PLK1; AKT2; PIK3CA; CDK8; CREB1; PRKCI; PTK2; FOS; RPS6KA4; PIK3CB; PPP2R1A; PIK3C3; MAPK8; MAPK3; ITGA1; ETS 1; KRAS; MYCN; EIF4EBP1; PPARG; PRKCD; PRKAA1; MAPK9; SRC; CDK2; PPP2CA; PIM1; PIK3C2A; ITGB7; YWHAZ; PPP1CC; KSR1; PXN; RAF1; FYN; DYRK1A; ITGB1; MAP2K2; PAK4; PIK3R1; STAT3; PPP2R5C; MAP2K1; PAK3; ITGB3; ESR1; ITGA2; MYC; TTK; CSNK1A1; CRKL; BRAF; ATF4; PRKCA; SRF; STAT1; SGK RAC1; TAF4B; EP300; SMAD2; TRAF6; PCAF; ELK1; MAPK1; SMAD3; AKT2; IKBKB; NCOR2; UBE2I; PIK3CA; CREB1; FOS; HSPA5; NFKB2; BCL2; MAP3K14; STAT5B; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; BCL2L1; MAPK3; TSC22D3; MAPK10; NRIP1; KRAS; MAPK13; RELA; STAT5A; MAPK9; NOS2A; PBX1; NR3C1; PIK3C2A; CDKN1C; TRAF2; SERPINE1; NCOA3; MAPK14; TNF; RAF1; IKBKG; MAP3K7; CREBBP; CDKN1A; MAP2K2; JAK1; IL8; NCOA2; AKT1; JAK2; PIK3R1; CHUK; STAT3; MAP2K1; NFKB1; TGFBR1; ESR1; SMAD4; CEBPB; JUN; AR; AKT3; CCL2; MMP1; STAT1; IL6; HSP90AA1 PRKCE; ITGAM; ROCK1; ITGA5; CXCR4; ADAM12; IGF1; RAC 1; RAP1A; EIF4E; PRKCZ; NRP 1; NTRK2; ARHGEF7; SMO; ROCK2; MAPK1; PGF; RAC2; PTPN11; GNAS; AKT2; PIK3CA; ERBB2; PRKCI; PTK2; CFL1; GNAQ; PIK3CB; CXCL12; PIK3C3; WNT11; PRKD1; GNB2L1; ABL1; MAPK3; ITGA1; KRAS; RHOA; PRKCD; PIK3C2A; ITGB7; GLI2; PXN; VASP; RAF1; FYN; ITGB1; MAP2K2; PAK4; ADAM 17; AKT 1; PIK3R 1; GLI1; WNT5A; ADAM10; MAP2K1; PAK3; ITGB3; CDC42; VEGFA; ITGA2; EPHA8; CRKL; RND1; GSK3B; AKT3; PRKCA PRKCE; ITGAM; ROCK1; ITGA5; CXCR4; IRAK1; PRKAA2; EIF2AK2; RAC1; RAP1A; GRK6; ROCK2; MAPK1; PGF; RAC2; PTPN11; GNAS; PLK1; AKT2; DOK1; CDK8; CREB1; PTK2; CFL1; GNAQ; MAP3K14;

39 PZ/3317/AGR 38 EP B1 FUNKCJA KOMÓRKOWA sygnalizacja cytoszkieletu aktynowego sygnalizacja w chorobie Huntingtona sygnalizacja w apoptozie sygnalizacja receptorów komórek B GENY CXCL12; MAPK8; GNB2L1; ABL1; MAPK3; ITGA1; KRAS; RHOA; PRKCD; PRKAA1; MAPK9; SRC; CDK2; PIM1; ITGB7; PXN; RAF1; FYN; DYRK1A; ITGB1; MAP2K2; PAK4; AKT1; JAK2; STAT3; ADAM10; MAP2K1; PAK3; ITGB3; CDC42; VEGFA; ITGA2; EPHA8; TTK; CSNK1A1; CRKL; BRAF; PTPN13; ATF4; AKT3; SGK ACTN4; PRKCE; ITGAM; ROCK1; ITGA5; IRAK1; PRKAA2; EIF2AK2; RAC1; INS; ARHGEF7; GRK6; ROCK2; MAPK1; RAC2; PLK1; AKT2; PIK3CA; CDK8; PTK2; CFL1; PIK3CB; MYH9; DIAPH1; PIK3C3; MAPK8; F2R; MAPK3; SLC9A1; ITGA1; KRAS; RHOA; PRKCD; PRKAA1; MAPK9; CDK2; PIM1; PIK3C2A; ITGB7; PPP1CC; PXN; VIL2; RAF1; GSN; DYRK1A; ITGB1; MAP2K2; PAK4; PIP5K1A; PIK3R1; MAP2K1; PAK3; ITGB3; CDC42; APC; ITGA2; TTK; CSNK1A1; CRKL; BRAF; VAV3; SGK PRKCE; IGF1; EP300; RCOR1; PRKCZ; HDAC4; TGM2; MAPK1; CAPNS1; AKT2; EGFR; NCOR2; SP1; CAPN2; PIK3CA; HDAC5; CREB1; PRKCI; HSPA5; REST; GNAQ; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; IGF1R; PRKD1; GNB2L1; BCL2L1; CAPN1; MAPK3; CASP8; HDAC2; HDAC7A; PRKCD; HDAC11; MAPK9; HDAC9; PIK3C2A; HDAC3; TP53; CASP9; CREBBP; AKT1; PIK3R1; PDPK1; CASP1; APAF1; FRAP1; CASP2; JUN; BAX; ATF4; AKT3; PRKCA; CLTC; SGK; HDAC6; CASP3 PRKCE; ROCK1; BID; IRAK1; PRKAA2; EIF2AK2; BAK1; BIRC4; GRK6; MAPK1; CAPNS1; PLK1; AKT2; IKBKB; CAPN2; CDK8; FAS; NFKB2; BCL2; MAP3K14; MAPK8; BCL2L1; CAPN1; MAPK3; CASP8; KRAS; RELA; PRKCD; PRKAA1; MAPK9; CDK2; PIM1; TP53; TNF; RAF1; IKBKG; RELB; CASP9; DYRK1A; MAP2K2; CHUK; APAF1; MAP2K1; NFKB1; PAK3; LMNA; CASP2; BIRC2; TTK; CSNK1A1; BRAF; BAX; PRKCA; SGK; CASP3; BIRC3; PARP1 RAC1; PTEN; LYN; ELK1; MAPK1; RAC2; PTPN11; AKT2; IKBKB; PIK3CA; CREB1; SYK; NFKB2; CAMK2A; MAP3K14; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; BCL2L1; ABL1; MAPK3; ETS1; KRAS; MAPK13; RELA; PTPN6; MAPK9;

40 PZ/3317/AGR 39 EP B1 FUNKCJA KOMÓRKOWA sygnalizacja przy diapedezie sygnalizacja integrynowa sygnalizacja odpowiedzi ostrej fazy sygnalizacja PTEN sygnalizacja p53 GENY EGR1; PIK3C2A; BTK; MAPK14; RAF1; IKBKG; RELB; MAP3K7; MAP2K2; AKT1; PIK3R1; CHUK; MAP2K1; NFKB1; CDC42; GSK3A; FRAP1; BCL6; BCL10; JUN; GSK3B; ATF4; AKT3; VAV3; RPS6KB1 ACTN4; CD44; PRKCE; ITGAM; ROCK1; CXCR4; CYBA; RAC1; RAP1A; PRKCZ; ROCK2; RAC2; PTPN11; MMP14; PIK3CA; PRKCI; PTK2; PIK3CB; CXCL12; PIK3C3; MAPK8; PRKD1; ABL1; MAPK10; CYBB; MAPK13; RHOA; PRKCD; MAPK9; SRC; PIK3C2A; BTK; MAPK14; NOX1; PXN; VIL2; VASP; ITGB1; MAP2K2; CTNND1; PIK3R1; CTNNB1; CLDN1; CDC42; F11R; ITK; CRKL; VAV3; CTTN; PRKCA; MMP1; MMP9 ACTN4; ITGAM; ROCK1; ITGA5; RAC1; PTEN; RAP1A; TLN1; ARHGEF7; MAPK1; RAC2; CAPNS1; AKT2; CAPN2; PIK3CA; PTK2; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; CAV1; CAPN1; ABL1; MAPK3; ITGA1; KRAS; RHOA; SRC; PIK3C2A; ITGB7; PPP1CC; ILK; PXN; VASP; RAF1; FYN; ITGB1; MAP2K2; PAK4; AKT1; PIK3R1; TNK2; MAP2K1; PAK3; ITGB3; CDC42; RND3; ITGA2; CRKL; BRAF; GSK3B; AKT3 IRAK1; SOD2; MYD88; TRAF6; ELK1; MAPK1; PTPN11; AKT2; IKBKB; PIK3CA; FOS; NFKB2; MAP3K14; PIK3CB; MAPK8; RIPK1; MAPK3; IL6ST; KRAS; MAPK13; IL6R; RELA; SOCS1; MAPK9; FTL; NR3C1; TRAF2; SERPINE1; MAPK14; TNF; RAF1; PDK1; IKBKG; RELB; MAP3K7; MAP2K2; AKT1; JAK2; PIK3R1; CHUK; STAT3; MAP2K1; NFKB1; FRAP1; CEBPB; JUN; AKT3; IL1R1; IL6 ITGAM; ITGA5; RAC1; PTEN; PRKCZ; BCL2L11; MAPK1; RAC2; AKT2; EGFR; IKBKB; CBL; PIK3CA; CDKN1B; PTK2; NFKB2; BCL2; PIK3CB; BCL2L1; MAPK3; ITGA1; KRAS; ITGB7; ILK; PDGFRB; INSR; RAF1; IKBKG; CASP9; CDKN1A; ITGB1; MAP2K2; AKT1; PIK3R1; CHUK; PDGFRA; PDPK1; MAP2K1; NFKB1; ITGB3; CDC42; CCND 1; GSK3A; ITGA2; GSK3B; AKT3; FOXO1; CASP3; RPS6KB1 PTEN; EP300; BBC3; PCAF; FASN; BRCA1; GADD45A; BIRC5; AKT2; PIK3CA; CHEK1; TP53INP1; BCL2; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; THBS1; ATR; BCL2L1; E2F1; PMAIP1; CHEK2; TNFRSF10B; TP73; RB1; HDAC9;

41 PZ/3317/AGR 40 EP B1 FUNKCJA KOMÓRKOWA sygnalizacja receptorów węglowodorów arylowych sygnalizacja dot. metabolizmu ksenobiotyków sygnalizacja SAPK/JNK sygnalizacja PPAr/RXR sygnalizacja NF-KB GENY CDK2; PIK3C2A; MAPK14; TP53; LRDD; CDKN1A; HIPK2; AKT1; PIK3R1; RRM2B; APAF1; CTNNB1; SIRT1; CCNDI; PRKDC; ATM; SFN; CDKN2A; JUN; SNAI2; GSK3B; BAX; AKT3 HSPB1; EP300; FASN; TGM2; RXRA; MAPK1; NQO1; NCOR2; SP1; ARNT; CDKN1B; FOS; CHEK1; SMARCA4; NFKB2; MAPK8; ALDH1A1; ATR; E2F1; MAPK3; NRIP1; CHEK2; RELA; TP73; GSTP1; RB1; SRC; CDK2; AHR; NFE2L2; NCOA3; TP53; TNF; CDKN1A; NCOA2; APAF1; NFKB1; CCND1; ATM; ESR1; CDKN2A; MYC; JUN; ESR2; BAX; IL6; CYP1B1; HSP90AA1 PRKCE; EP300; PRKCZ; RXRA; MAPK1; NQO1; NCOR2; PIK3CA; ARNT; PRKCI; NFKB2; CAMK2A; PIK3CB; PPP2R1A; PIK3C3; MAPK8; PRKD1; ALDH1A1; MAPK3; NRIP1; KRAS; MAPK13; PRKCD; GSTP1; MAPK9; NOS2A; ABCB1; AHR; PPP2CA; FTL; NFE2L2; PIK3C2A; PPARGC1A; MAPK14; TNF; RAF1; CREBBP; MAP2K2; PIK3R1; PPP2R5C; MAP2K1; NFKB1; KEAP1; PRKCA; EIF2AK3; IL6; CYP1B1; HSP90AA1 PRKCE; IRAK1; PRKAA2; EIF2AK2; RAC1; ELK1; GRK6; MAPK1; GADD45A; RAC2; PLK1; AKT2; PIK3CA; FADD; CDK8; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; RIPK1; GNB2L1; IRS1; MAPK3; MAPK10; DAXX; KRAS; PRKCD; PRKAA1; MAPK9; CDK2; PIM1; PIK3C2A; TRAF2; TP53; LCK; MAP3K7; DYRK1A; MAP2K2; PIK3R1; MAP2K1; PAK3; CDC42; JUN; TTK; CSNK1A1; CRKL; BRAF; SGK PRKAA2; EP300; INS; SMAD2; TRAF6; PPARA; FASN; RXRA; MAPK1; SMAD3; GNAS; IKBKB; NCOR2; ABCA1; GNAQ; NFKB2; MAP3K14; STAT5B; MAPK8; IRS1; MAPK3; KRAS; RELA; PRKAA1; PPARGC1A; NCOA3; MAPK14; INSR; RAF1; IKBKG; RELB; MAP3K7; CREBBP; MAP2K2; JAK2; CHUK; MAP2K1; NFKB1; TGFBR1; SMAD4; JUN; IL1R1; PRKCA; IL6; HSP90AA1; ADIPOQ IRAK1; EIF2AK2; EP300; INS; MYD88; PRKCZ; TRAF6; TBK1; AKT2; EGFR; IKBKB; PIK3CA; BTRC; NFKB2;

42 PZ/3317/AGR 41 EP B1 FUNKCJA KOMÓRKOWA sygnalizacja neureguliny sygnalizacja Wnt i Beta kateniny sygnalizacja receptora insulinowego sygnalizacja IL-6 cholestaza wątrobowa sygnalizacja IGF-1 GENY MAP3K14; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; RIPK1; HDAC2; KRAS; RELA; PIK3C2A; TRAF2; TLR4; PDGFRB; TNF; INSR; LCK; IKBKG; RELB; MAP3K7; CREBBP; AKT1; PIK3R1; CHUK; PDGFRA; NFKB1; TLR2; BCL10; GSK3B; AKT3; TNFAIP3; IL1R1 ERBB4; PRKCE; ITGAM; ITGA5; PTEN; PRKCZ; ELK1; MAPK1; PTPN11; AKT2; EGFR; ERBB2; PRKCI; CDKN1B; STAT5B; PRKD1; MAPK3; ITGA 1; KRAS; PRKCD; STAT5A; SRC; ITGB7; RAF1; ITGB1; MAP2K2; ADAM17; AKT1; PIK3R1; PDPK1; MAP2K1; ITGB3; EREG; FRAP1; PSEN1; ITGA2; MYC; NRG1; CRKL; AKT3; PRKCA; HSP90AA1; RPS6KB1 CD44; EP300; LRP6; DVL3; CSNK1E; GJA1; SMO; AKT2; PIN1; CDH1; BTRC; GNAQ; MARK2; PPP2R1A; WNT11; SRC; DKK1; PPP2CA; SOX6; SFRP2; ILK; LEF1; SOX9; TP53; MAP3K7; CREBBP; TCF7L2; AKT1; PPP2R5C; WNT5A; LRP5; CTNNB1; TGFBR1; CCNDI; GSK3A; DVL1; APC; CDKN2A; MYC; CSNK1A1; GSK3B; AKT3; SOX2 PTEN; INS; EIF4E; PTPN1; PRKCZ; MAPK1; TSC1; PTPN11; AKT2; CBL; PIK3CA; PRKCI; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; IRS1; MAPK3; TSC2; KRAS; EIF4EBP1; SLC2A4; PIK3C2A; PPP1CC; INSR; RAF1; FYN; MAP2K2; JAK1; AKT1; JAK2; PIK3R1; PDPK1; MAP2K1; GSK3A; FRAP1; CRKL; GSK3B; AKT3; FOXO1; SGK; RPS6KB1 HSPB1; TRAF6; MAPKAPK2; ELK1; MAPK1; PTPN11; IKBKB; FOS; NFKB2; MAP3K14; MAPK8; MAPK3; MAPK10; IL6ST; KRAS; MAPK13; IL6R; RELA; SOCS1; MAPK9; ABCB1; TRAF2; MAPK14; TNF; RAF1; IKBKG; RELB; MAP3K7; MAP2K2; IL8; JAK2; CHUK; STAT3; MAP2K1; NFKB1; CEBPB; JUN; IL1R1; SRF; IL6 PRKCE; IRAK1; INS; MYD88; PRKCZ; TRAF6; PPARA; RXRA; IKBKB; PRKCI; NFKB2; MAP3K14; MAPK8; PRKD1; MAPK10; RELA; PRKCD; MAPK9; ABCB1; TRAF2; TLR4; TNF; INSR; IKBKG; RELB; MAP3K7; IL8; CHUK; NR1H2; TJP2; NFKB1; ESR1; SREBF1; FGFR4; JUN; IL1R1; PRKCA; IL6 IGF1; PRKCZ; ELK1; MAPK1; PTPN11; NEDD4; AKT2;

43 PZ/3317/AGR 42 EP B1 FUNKCJA KOMÓRKOWA odpowiedź na stres oksydacyjny za pośrednictwem NRF2 zwłóknienie wątroby/aktywacja komórek gwiaździstych wątroby sygnalizacja PPAR sygnalizacja Fc Epsilon RI sygnalizacja receptorów sprzężonych z białkiem G metabolizm fosforanu inozytolu GENY PIK3CA; PRKCI; PTK2; FOS; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; IGF1R; IRS 1; MAPK3; IGFBP7; KRAS; PIK3C2A; YWHAZ; PXN; RAF1; CASP9; MAP2K2; AKT1; PIK3R1; PDPK1; MAP2K1; IGFBP2; SFN; JUN; CYR61; AKT3; FOXO1; SRF; CTGF; RPS6KB1 PRKCE; EP300; SOD2; PRKCZ; MAPK1; SQSTM1; NQO1; PIK3CA; PRKCI; FOS; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; PRKD1; MAPK3; KRAS; PRKCD; GSTP1; MAPK9; FTL; NFE2L2; PIK3C2A; MAPK14; RAF1; MAP3K7; CREBBP; MAP2K2; AKT1; PIK3R1; MAP2K1; PPIB; JUN; KEAP1; GSK3B; ATF4; PRKCA; EIF2AK3; HSP90AA1 EDN 1; IGF1; KDR; FLT 1; SMAD2; FGFR 1; MET; PGF; SMAD3; EGFR; FAS; CSF1; NFKB2; BCL2; MYH9; IGF1R; IL6R; RELA; TLR4; PDGFRB; TNF; RELB; IL8; PDGFRA; NFKB1; TGFBR1; SMAD4; VEGFA; BAX; IL1R1; CCL2; HGF; MMP1; STAT1; IL6; CTGF; MMP9 EP300; INS; TRAF6; PPARA; RXRA; MAPK1; IKBKB; NCOR2; FOS; NFKB2; MAP3K14; STAT5B; MAPK3; NRIP1; KRAS; PPARG; RELA; STAT5A; TRAF2; PPARGC1A; PDGFRB; TNF; INSR; RAF1; IKBKG; RELB; MAP3K7; CREBBP; MAP2K2; CHUK; PDGFRA; MAP2K1; NFKB1; JUN; IL1R1; HSP90AA1 PRKCE; RAC 1; PRKCZ; LYN; MAPK1; RAC2; PTPN11; AKT2; PIK3CA; SYK; PRKCI; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; PRKD1; MAPK3; MAPK10; KRAS; MAPK13; PRKCD; MAPK9; PIK3C2A; BTK; MAPK14; TNF; RAF1; FYN; MAP2K2; AKT1; PIK3R1; PDPK1; MAP2K1; AKT3; VAV3; PRKCA PRKCE; RAP1A; RGS16; MAPK1; GNAS; AKT2; IKBKB; PIK3CA; CREB1; GNAQ; NFKB2; CAMK2A; PIK3CB; PIK3C3; MAPK3; KRAS; RELA; SRC; PIK3C2A; RAF1; IKBKG; RELB; FYN; MAP2K2; AKT1; PIK3R1; CHUK; PDPK1; STAT3; MAP2K1; NFKB1; BRAF; ATF4; AKT3; PRKCA PRKCE; IRAK1; PRKAA2; EIF2AK2; PTEN; GRK6; MAPK1; PLK1; AKT2; PIK3CA; CDK8; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; MAPK3; PRKCD; PRKAA1; MAPK9; CDK2; PIM1; PIK3C2A; DYRK1A; MAP2K2; PIP5K1A; PIK3R1; MAP2K1; PAK3; ATM; TTK; CSNK1A1; BRAF; SGK

44 PZ/3317/AGR 43 EP B1 FUNKCJA KOMÓRKOWA GENY sygnalizacja PDGF EIF2AK2; ELK1; ABL2; MAPK1; PIK3CA; FOS; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; CAV1; ABL1; MAPK3; KRAS; SRC; PIK3C2A; PDGFRB; RAF1; MAP2K2; JAK1; JAK2; PIK3R1; PDGFRA; STAT3; SPHK1; MAP2K1; MYC; JUN; CRKL; PRKCA; SRF; STAT1; SPHK2 sygnalizacja VEGF ACTN4; ROCK1; KDR; FLT1; ROCK2; MAPK1; PGF; AKT2; PIK3CA; ARNT; PTK2; BCL2; PIK3CB; PIK3C3; BCL2L1; MAPK3; KRAS; HIF1A; NOS3; PIK3C2A; PXN; RAF1; MAP2K2; ELAVL1; AKT1; PIK3R1; MAP2K1; SFN; VEGFA; AKT3; FOXO1; PRKCA sygnalizacja komórek NK PRKCE; RAC 1; PRKCZ; MAPK 1; RAC2; PTPN11; KIR2DL3; AKT2; PIK3CA; SYK; PRKCI; PIK3CB; PIK3C3; PRKD1; MAPK3; KRAS; PRKCD; PTPN6; PIK3C2A; LCK; RAF1; FYN; MAP2K2; PAK4; AKT1; PIK3R1; MAP2K1; PAK3; AKT3; VAV3; PRKCA cykl komórkowy: punkt kontrolny HDAC4; SMAD3; SITV39H1; HDAC5; CDKN1B; BTRC; przejścia G1/S ATR; ABL1; E2F1; HDAC2; HDAC7A; RB1; HDAC11; HDAC9; CDK2; E2F2; HDAC3; TP53; CDKN1A; CCND1; E2F4; ATM; RBL2; SMAD4; CDKN2A; MYC; NRG1; GSK3B; RBL1; HDAC6 sygnalizacja receptora komórek T RAC1; ELK1; MAPK1; IKBKB; CBL; PIK3CA; FOS; NFKB2; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; MAPK3; KRAS; RELA; PIK3C2A; BTK; LCK; RAF1; IKBKG; RELB; FYN; MAP2K2; PIK3R1; CHUK; MAP2K1; NFKB1; ITK; BCL10; JUN; VAV3 sygnalizacja receptora śmierci CRADD; HSPB1; BID; BIRC4; TBK1; IKBKB; FADD; FAS; NFKB2; BCL2; MAP3K14; MAPK8; RIPK1; CASP8; DAXX; TNFRSF10B; RELA; TRAF2; TNF; IKBKG; RELB; CASP9; CHUK; APAF1; NFKB1; CASP2; BIRC2; CASP3; BIRC3 sygnalizacja FGF RAC1; FGFR1; MET; MAPKAPK2; MAPK1; PTPN11; AKT2; PIK3CA; CREB1; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; MAPK3; MAPK13; PTPN6; PIK3C2A; MAPK14; RAF1; AKT1; PIK3R1; STAT3; MAP2K1; FGFR4; CRKL; ATF4; AKT3; PRKCA; HGF sygnalizacja GM-CSF LYN; ELK1; MAPK1; PTPN11; AKT2; PIK3CA; CAMK2A; STAT5B; PIK3CB; PIK3C3; GNB2L1; BCL2L1; MAPK3; ETS 1; KRAS; RUNX1; PIM 1; PIK3C2A; RAF 1; MAP2K2; AKT1; JAK2; PIK3R1; STAT3; MAP2K1; CCND1; AKT3; STAT1

45 PZ/3317/AGR 44 EP B1 FUNKCJA KOMÓRKOWA sygnalizacja w stwardnieniu zanikowym bocznym sygnalizacja JAK/Stat metabolizm nikotynianu i nikotynamidu sygnalizacja chemokinowa sygnalizacja IL-2 długotrwałe osłabienie synaptyczne sygnalizacja receptora estrogenowego szlak ubikwitynacji białek sygnalizacja IL-10 aktywacja VDR/RXR GENY BID; IGF1; RAC1; BIRC4; PGF; CAPNS1; CAPN2; PIK3CA; BCL2; PIK3CB; PIK3C3; BCL2L1; CAPN1; PIK3C2A; TP53; CASP9; PIK3R1; RAB5A; CASP1; APAF1; VEGFA; BIRC2; BAX; AKT3; CASP3; BIRC3 PTPN1; MAPK1; PTPN11; AKT2; PIK3CA; STAT5B; PIK3CB; PIK3C3; MAPK3; KRAS; SOCS1; STAT5A; PTPN6; PIK3C2A; RAF1; CDKN1A; MAP2K2; JAK1; AKT1; JAK2; PIK3R1; STAT3; MAP2K1; FRAP1; AKT3; STAT1 PRKCE; IRAKI; PRKAA2; EIF2AK2; GRK6; MAPK1; PLK1; AKT2; CDK8; MAPK8; MAPK3; PRKCD; PRKAA1; PBEF1; MAPK9; CDK2; PIM1; DYRK1A; MAP2K2; MAP2K1; PAK3; NT5E; TTK; CSNK1A1; BRAF; SGK CXCR4; ROCK2; MAPK1; PTK2; FOS; CFL1; GNAQ; CAMK2A; CXCL12; MAPK8; MAPK3; KRAS; MAPK13; RHOA; CCR3; SRC; PPP1CC; MAPK14; NOX1; RAF1; MAP2K2; MAP2K1; JUN; CCL2; PRKCA ELK1; MAPK1; PTPN11; AKT2; PIK3CA; SYK; FOS; STAT5B; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; MAPK3; KRAS; SOCS1; STAT5A; PIK3C2A; LCK; RAF1; MAP2K2; JAK1; AKT1; PIK3R1; MAP2K1; JUN; AKT3 PRKCE; IGF1; PRKCZ; PRDX6; LYN; MAPK1; GNAS; PRKCI; GNAQ; PPP2R1A; IGF1R; PRKD 1; MAPK3; KRAS; GRN; PRKCD; NOS3; NOS2A; PPP2CA; YWHAZ; RAF1; MAP2K2; PPP2R5C; MAP2K1; PRKCA TAF4B; EP300; CARM1; PCAF; MAPK1; NCOR2; SMARCA4; MAPK3; NRIP1; KRAS; SRC; NR3C1; HDAC3; PPARGC1A; RBM9; NCOA3; RAF1; CREBBP; MAP2K2; NCOA2; MAP2K1; PRKDC; ESR1; ESR2 TRAF6; SMURF1; BIRC4; BRCA1; UCHL1; NEDD4; CBL; UBE2I; BTRC; HSPA5; USP7; USP10; FBXW7; USP9X; STUB1; USP22; B2M; BIRC2; PARK2; USP8; USP1; VHL; HSP90AA1; BIRC3 TRAF6; CCR1; ELK1; IKBKB; SP1; FOS; NFKB2; MAP3K14; MAPK8; MAPK13; RELA; MAPK14; TNF; IKBKG; RELB; MAP3K7; JAK1; CHUK; STAT3; NFKB1; JUN; IL1R1; IL6 PRKCE; EP300; PRKCZ; RXRA; GADD45A; HES1; NCOR2; SP 1; PRKCI; CDKN1B; PRKD 1; PRKCD; RUNX2; KLF4; YY1; NCOA3; CDKN1A; NCOA2; SPP1;

46 PZ/3317/AGR 45 EP B1 FUNKCJA KOMÓRKOWA sygnalizacja TGF-beta sygnalizacja receptora Toll-like (TLR) sygnalizacja p38 MAPK sygnalizacja Neurotrofina/TRK aktywacja FXR/RXR długotrwałe wzmocnienie synaptyczne sygnalizacja wapniowa sygnalizacja EGF sygnalizacja związana z hipoksją układzie sercowo-naczyniowym Hamowanie funkcji RXR za pośrednictwem LPS/IL-1 aktywacja LXR/RXR GENY LRP5; CEBPB; FOXO1; PRKCA EP300; SMAD2; SMURF1; MAPK1; SMAD3; SMAD1; FOS; MAPK8; MAPK3; KRAS; MAPK9; RUNX2; SERPINE1; RAF1; MAP3K7; CREBBP; MAP2K2; MAP2K1; TGFBR1; SMAD4; JUN; SMAD5 IRAK1; EIF2AK2; MYD88; TRAF6; PPARA; ELK1; IKBKB; FOS; NFKB2; MAP3K14; MAPK8; MAPK13; RELA; TLR4; MAPK14; IKBKG; RELB; MAP3K7; CHUK; NFKB 1; TLR2; JUN HSPB1; IRAK1; TRAF6; MAPKAPK2; ELK1; FADD; FAS; CREB1; DDIT3; RPS6KA4; DAXX; MAPK13; TRAF2; MAPK14; TNF; MAP3K7; TGFBR1; MYC; ATF4; IL1R1; SRF; STAT1 NTRK2; MAPK1; PTPN11; PIK3CA; CREB1; FOS; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; MAPK3; KRAS; PIK3C2A; RAF1; MAP2K2; AKT1; PIK3R1; PDPK1; MAP2K1; CDC42; JUN; ATF4 INS; PPARA; FASN; RXRA; AKT2; SDC1; MAPK8; APOB; MAPK10; PPARG; MTTP; MAPK9; PPARGC1A; TNF; CREBBP; AKT1; SREBF1; FGFR4; AKT3; FOXO1 PRKCE; RAP1A; EP300; PRKCZ; MAPK1; CREB1; PRKCI; GNAQ; CAMK2A; PRKD1; MAPK3; KRAS; PRKCD; PPP1CC; RAF1; CREBBP; MAP2K2; MAP2K1; ATF4; PRKCA RAP1A; EP300; HDAC4; MAPK1; HDAC5; CREB1; CAMK2A; MYH9; MAPK3; HDAC2; HDAC7A; HDAC11; HDAC9; HDAC3; CREBBP; CALR; CAMKK2; ATF4; HDAC6 ELK1; MAPK1; EGFR; PIK3CA; FOS; PIK3CB; PIK3C3; MAPK8; MAPK3; PIK3C2A; RAF1; JAK1; PIK3R1; STAT3; MAP2K1; JUN; PRKCA; SRF; STAT1 EDN1; PTEN; EP300; NQO1; UBE2I; CREB1; ARNT; HIF1A; SLC2A4; NOS3; TP53; LDHA; AKT1; ATM; VEGFA; JUN; ATF4; VHL; HSP90AA1 IRAK1; MYD88; TRAF6; PPARA; RXRA; ABCA1; MAPK8; ALDH1A1; GSTP1; MAPK9; ABCB1; TRAF2; TLR4; TNF; MAP3K7; NR1H2; SREBF1; JUN; IL1R1 FASN; RXRA; NCOR2; ABCA1; NFKB2; IRF3; RELA; NOS2A; TLR4; TNF; RELB; LDLR; NR1H2; NFKB1;

47 PZ/3317/AGR 46 EP B1 FUNKCJA KOMÓRKOWA procesowanie amyloidu sygnalizacja IL-4 cykl komórkowy: regulacja punkt kontrolny dla uszkodzeń DNA dla przejścia G2/M sygnalizacja tlenku azotu GENY SREBF1; IL1R1; CCL2; IL6; MMP9 PRKCE; CSNK1E; MAPK1; CAPNS1; AKT2; CAPN2; CAPN1; MAPK3; MAPK13; MAPT; MAPK14; AKT1; PSEN1; CSNK1A1; GSK3B; AKT3; APP AKT2; PIK3CA; PIK3CB; PIK3C3; IRS1; KRAS; SOCS1; PTPN6; NR3C1; PIK3C2A; JAK1; AKT1; JAK2; PIK3R1; FRAP1; AKT3; RPS6KB1 EP300; PCAF; BRCA1; GADD45A; PLK1; BTRC; CHEK1; ATR; CHEK2; YWHAZ; TP53; CDKN1A; PRKDC; ATM; SFN; CDKN2A KDR; FLT1; PGF; AKT2; PIK3CA; PIK3CB; PIK3C3; w układzie sercowo-naczyniowym CAV1; PRKCD; NOS3; PIK3C2A; AKT1; PIK3R1; metabolizm puryn sygnalizacja za pośrednictwem camp zaburzenia funkcji mitochondriów sygnalizacja Notch Szlak stresu retikulum endoplazmatycznego metabolizm pirymidyn sygnalizacja w chorobie Parkinsona sygnalizacja w sercu i betaadrenergiczna Glikoliza/Glikoneogeneza sygnalizacja interferonu sygnalizacja Sonic Hedgehog metabolizm glicerofosfolipidów degradacja fosfolipidów metabolizm tryptofanu VEGFA; AKT3; HSP90AA1 NME2; SMARCA4; MYH9; RRM2; ADAR; EIF2AK4; PKM2; ENTPD 1; RAD51; RRM2B; TJP2; RAD51C; NT5E; POLD1; NME1 RAP1A; MAPK1; GNAS; CREB 1; CAMK2A; MAPK3; SRC; RAF1; MAP2K2; STAT3; MAP2K1; BRAF; ATF4 SOD2; MAPK8; CASP8; MAPK10; MAPK9; CASP9; PARK7; PSEN1; PARK2; APP; CASP3 HES1; JAG1; NUMB; NOTCH4; ADAM17; NOTCH2; PSEN1; NOTCH3; NOTCH1; DLL4 HSPA5; MAPK8; XBP1; TRAF2; ATF6; CASP9; ATF4; EIF2AK3; CASP3 NME2; AICDA; RRM2; EIF2AK4; ENTPD1; RRM2B; NT5E; POLD1; NME1 UCHL1; MAPK8; MAPK13; MAPK14; CASP9; PARK7; PARK2; CASP3 GNAS; GNAQ; PPP2R1A; GNB2L1; PPP2CA; PPP1CC; PPP2R5C HK2; GCK; GPI; ALDH1A1; PKM2; LDHA; HK1 IRF1; SOCS1; JAK1; JAK2; IFITM1; STAT1; IFIT3 ARRB2; SMO; GLI2; DYRK1A; GLI1; GSK3B; DYRK1B PLD1; GRN; GPAM; YWHAZ; SPHK1; SPHK2 PRDX6; PLD1; GRN; YWHAZ; SPHK1; SPHK2 SIAH2; PRMT5; NEDD4; ALDH1A1; CYP1B1; SIAH1

48 PZ/3317/AGR 47 EP B1 FUNKCJA KOMÓRKOWA degradacja lizyny szlak naprawy przez wycięcie nukleotydu GENY SUV39H1; EHMT2; NSD1; SETD7; PPP2R5C ERCC5; ERCC4; XPA; XPC; ERCC1 metabolizm skrobi UCHL1; HK2; GCK; GPI; HK1 i sacharozy metabolizm aminocukrów NQO1; HK2; GCK; HK1 metabolizm PRDX6; GRN; YWHAZ; CYP1B1 kwasu arachidonowego sygnalizacja rytmu dobowego CSNK1E; CREB1; ATF4; NR1D1 układ krzepnięcia BDKRB1; F2R; SERPINE1; F3 sygnalizacja receptora PPP2R1A; PPP2CA; PPP1CC; PPP2R5C dopaminowego metabolizm glutationu IDH2; GSTP1; ANPEP; IDH1 metabolizm glicerolipidów ALDH1A1; GPAM; SPHK1; SPHK2 metabolizm kwasu linolowego PRDX6; GRN; YWHAZ; CYP1B1 metabolizm metioniny DNMT1; DNMT3B; AHCY; DNMT3A metabolizm pirogronianu GLO1; ALDH1A1; PKM2; LDHA metabolizm ALDH1A1; NOS3; NOS2A argininy i proliny sygnalizacja eikozanoidowa PRDX6; GRN; YWHAZ metabolizm HK2; GCK; HK1 fruktozy i mannozy metabolizm galaktozy HK2; GCK; HK1 biosynteza stylbenu, kumaryny PRDX6; PRDX1; TYR i ligniny szlak prezentacji CALR; B2M antygenu biosynteza steroidów NQO1; DHCR7 metabolizm butanianu ALDH1A1; NLGN1 cykl kwasu cytrynowego IDH2; IDH1 metabolizm kwasów tłuszczowych ALDH1A1; CYP1B1 metabolizm PRDX6; CHKA glicerofosfolipidów metabolizm histydyny PRMT5; ALDH1A1 metabolizm inozytolu ERO1L; APEX1 metabolizm ksenobiotyków GSTP1; CYP1B1 poprzez cytochrom p450 metabolizm metanu PRDX6; PRDX1 metabolizm fenyloalaniny PRDX6; PRDX1

49 PZ/3317/AGR 48 EP B1 FUNKCJA KOMÓRKOWA metabolizm propanianu metabolizm selenoaminokwasów metabolizm sfingolipidów metabolizm aminofosforanów metabolizm androgenów i estrogenów metabolizm askorbinianów i pochodnych kwasu aldarowego biosynteza kwasu żółciowego metabolizm cysteiny biosynteza kwasów tłuszczowych sygnalizacja receptora glutaminianowego reakcja na stres oksydacyjny za pośrednictwem NRF2 szlak pentozofosforanowy przekształcenia pentoz i glukuronianu metabolizm retinolu metabolizm ryboflawiny metabolizm tyrozyny biosynteza ubichinonu degradacja waliny leucyny i izoleucyny metabolizm glicyny, seryny i treoniny degradacja lizyny ból/zmysł smaku ból funkcje mitochondriów rozwój układu nerwowego GENY ALDH1A1; LDHA PRMT5; AHCY SPHK1; SPHK2 PRMT5 PRMT5 ALDH1A1 ALDH1A1 LDHA FASN GNB2L1 PRDX1 GPI UCHL1 ALDH1A1 TYR PRMT5, TYR PRMT5 ALDH1A1 CHKA ALDH1A1 TRPM5; TRPA1 TRPM7; TRPC5; TRPC6; TRPC1; Cnr1; cnr2; Grk2; Trpa1; Pomc; Cgrp; Crf; Pka; Era; Nr2b; TRPM5; Prkaca; Prkacb; Prkar1a; Prkar2a AIF; CytC; SMAC (Diablo); Aifm-1; Aifm-2 BMP-4; Chordyna (Chrd); Noggina (Nog); WNT (Wnt2; Wnt2b; Wnt3a; Wnt4; Wnt5a; Wnt6; Wnt7b; Wnt8b; Wnt9a; Wnt9b; Wnt10a; Wnt10b; Wnt16); beta-katenina; Dkk-1; białka powiązane z Frizzled; Otx-2; Gbx2; FGF-8;

50 PZ/3317/AGR 49 EP B1 FUNKCJA KOMÓRKOWA GENY Reelina; Dab1; unc-86 (Pou4fl lub Brn3a); Numb; Reln [0085] Przykłady wykonania ujawnienia dotyczą także sposobów i kompozycji powiązanych z knockoutem genów, amplifikacją genów i naprawą konkretnych mutacji związanych z niestabilnością powtórzeń DNA i zaburzeniami neurologicznymi (Robert D. Wells, Tetsuo Ashizawa, Genetic Instabilities and Neurological Diseases, wydanie drugie, Academic Press, Paź 13, 2011-Medical). Stwierdzono, że specyficzne aspekty sekwencji powtórzeń tandemowych odpowiadają za ponad dwadzieścia chorób ludzkich (New insights into repeat instability: role of RNA DNA hybrids. McIvor EI, Polak U, Napierala M. RNA Biol Sept-Oct.;7(5):551-8). System CRISPR-Cas może być wykorzystywany do naprawiania tych zaburzeń niestabilności genetycznej. [0086] Dalszy aspekt ujawnienia odnosi się do wykorzystania systemu CRISPR-Cas do naprawy uszkodzeń w genach EMP2A i EMP2B, które zostały zidentyfikowane jako powiązane z chorobą Lafory. Choroba Lafory jest schorzeniem autosomalnym recesywnym, które charakteryzuje się progresywną padaczką miokloniczną, która może rozpocząć się jako ataki padaczki w młodości. Kilka przypadków choroby mogło być wywołanych przez mutacje genach, których jeszcze nie zidentyfikowano. Choroba wywołuje ataki, skurcze mięśni, trudności z chodzeniem, otępienie i ostatecznie śmierć. Brak obecnie terapii, która okazałaby się efektywna przeciwko postępom choroby. Celem systemu CRISPR-Cas mogą być też inne nieprawidłowości genetyczne powiązane z padaczką, a leżąca u podstaw genetyka jest dalej opisana w Genetics of Epilepsy and Genetic Epilepsies, pod redakcją Giuliano Avanzini, Jeffrey L. Noebels, Mariani Foundation Paediatric Neurology:20; 2009). [0087] W jeszcze innym aspekcie ujawnienia, system CRISPR-Cas może być stosowany do korekcji wad wzroku, które mogą być wynikiem kilku mutacji genetycznych opisanych dalej w Genetic Diseases of the Eye, wydanie drugie, pod redakcją Elias I. Traboulsi, Oxford University Press, [0088] Kilka dalszych aspektów odnosi się do korekcji wad powiązanych z szerokim zakresem chorób genetycznych, które opisano dalej na stronie internetowej National Institutes of Health w podsekcji tematycznej Genetic Disorders (strona health.nih.gov/topic/geneticdisorders). Genetyczne choroby mózgu mogą obejmować, ale nie wyłącznie, adrenoleukodystrofię, agenezję ciała modzelowatego, zespół Aicardiego, chorobę Alpersa, chorobę Alzheimera, zespół Bartha, chorobę Battena, CADASIL, degenerację móżdżkową, chorobę Fabry'ego, chorobę Gerstmanna-Strausslera-Scheinkera, chorobę Huntingtona i inne Zaburzenia Powtórzeń Trinukletydowych, chorobę Leigha, zespół Lesch-Nyhana, chorobę Menkesa, miopatie mitochondrialne oraz kolpocefalię NINDS. Choroby te są dalej opisane na stronie internetowej National Institutes of Health w podsekcji Genetic Brain Disorders. [0089] W niektórych przykładach wykonania, schorzeniem może być neoplazja. W niektórych przykładach wykonania, gdy schorzeniem jest neoplazja, genami do celowania są dowolne spośród wymienionych w Tabeli A (w tym przypadku PTEN i tak dalej). W niektórych przykładach wykonania, schorzeniem może być związane z wiekiem zwyrodnienie plamki żółtej. W niektórych przykładach wykonania, schorzeniem może być zaburzenie schizofreniczne. W niektórych przykładach wykonania, schorzeniem może być zaburzenie z powtórzeniami trinukleotydowymi W niektórych przykładach

51 PZ/3317/AGR 50 EP B1 wykonania, schorzeniem może być zespół łamliwego chromosomu X. W niektórych przykładach wykonania, schorzeniem może być zaburzenie powiązane z sekretazą. W niektórych przykładach wykonania, schorzeniem może być zaburzenie powiązane z prionami. W niektórych przykładach wykonania, schorzeniem może być ALS. W niektórych przykładach wykonania, schorzeniem może być uzależnienie od używek. W niektórych przykładach wykonania, schorzeniem może być autyzm. W niektórych przykładach wykonania, schorzeniem może być choroba Alzheimera. W niektórych przykładach wykonania, schorzeniem może być stan zapalny. W niektórych przykładach wykonania, schorzeniem może być choroba Parkinsona. [0090] Przykłady białek powiązanych z chorobą Parkinsona obejmują, ale nie wyłącznie, α-synukleinę, DJ-1, LRRK2, PINK1, Parkinę, UCHL1, Synfilinę-1 i NURR1. Przykłady białek związanych z nałogiem mogę obejmować na przykład ABAT. [0091] Przykłady białek związanych ze stanem zapalnym mogą obejmować na przykład białko chemotaktyczne dla monocytów-1 (MCP1) kodowane przez gen Ccr2, receptor chemokinowy C-C typu 5 (CCR5) kodowany przez gen Ccr5, receptor IgG IIB (FCGR2b, określany również jako CD32) kodowany przez gen Fcgr2b lub białko Fc epsilon R1g (FCER1g) kodowane przez gen Fcer1g. [0092] Przykłady białek powiązanych z chorobami sercowo-naczyniowymi mogą obejmować na przykład IL1B (interleukinę 1, beta), XDH (dehydrogenazę ksantynową), TP53 (białko nowotworowe p53), PTGIS (syntazę prostaglandyny 12 (prostacykliny)), MB (mioglobinę), IL4 (interleukinę 4), ANGPT1 (angiopoetynę 1), ABCG8 (kasetę wiążąca ATP z podrodziny G (WHITE), członek 8) lub CTSK (katepsynę K). [0093] Przykłady białek powiązanych z chorobą Alzheimera mogą obejmować na przykład białko receptora lipoproteiny bardzo małej gęstości (VLDLR) kodowane przez gen VLDLR, enzym aktywujący modyfikator podobny do ubikwityny 1 (UBA1) kodowany przez gen UBA1 lub białko podjednostki katalitycznej enzymu E1 aktywującego NEDD8 (UBE1C) kodowane przez gen UBA3. [0094] Przykłady białek powiązanych z zaburzeniem ze spektrum autyzmu mogą obejmować na przykład białko 1 powiązane z receptorem benzodiazepinowym (obwodowym) (BZRAP1) kodowane przez gen BZRAP1, białko członka 2 rodziny AF4/FMR2 (AFF2) kodowane przez gen AFF2 (również określany jako MFR2), białko homolog autosomalny 1 upośledzenia umysłowego w zespole łamliwego chromosomu X (FXR1) kodowane przez gen FXR1 lub białko homolog autosomalny 2 upośledzenia umysłowego w zespole łamliwego chromosomu X (FXR2) kodowane przez gen FXR2. [0095] Przykłady białek powiązanych ze zwyrodnieniem plamki żółtej mogą obejmować na przykład białko członka 4 podrodziny A (ABC 1) z kasetą wiążącą ATP (ABCA4), kodowane przez gen ABCR, białko apolipoproteiny E (APOE) kodowane przez gen APOE lub białko liganda 2 chemokinowego (z motywem C-C) (CCL2), kodowane przez gen CCL2. [0096] Przykłady białek powiązanych ze schizofrenią mogą obejmować NRG1, ErbB4, CPLX1, TPH1, TPH2, NRXN1, GSK3A, BDNF, DISC1, GSK3B i ich kombinacje.

52 PZ/3317/AGR 51 EP B1 [0097] Przykłady białek zaangażowanych w supresję nowotworów mogą obejmować na przykład ATM (ataksja teleangiektazja, zmutowany), ATR (ataksja teleangiektazja i powiązany z Rad3), EGFR (receptor naskórkowego czynnika wzrostu), ERBB2 (wirusowy onkogenny homolog 2 białaczki erytroblastycznej v-erb-b2), ERBB3 (wirusowy onkogenny homolog 3 białaczki erytroblastycznej v-erb-b2), ERBB4 (wirusowy onkogenny homolog 4 białaczki erytroblastycznej v-erb-b2), Notch 1, Notch2, Notch 3, lub Notch 4. [0098] Przykłady białek związanych z zaburzeniem powiązanym z sekretazą mogą obejmować na przykład PSENEN (homolog 2 wzmacniający presenilinę (C. elegans)), CTSB (katepsynę B), PSEN1 (presenilinę 1), APP (białko prekursorowe beta-amyloidu (A4)), APH1B (defektywny homolog B z przedniej części gardła 1 (C. elegans)), PSEN2 (presenilinę 2 (choroba Alzheimera 4)) lub BACE1 (enzym 1 przecinający miejsce beta-app). [0099] Przykłady białek powiązanych ze stwardnieniem zanikowym bocznym mogą obejmować SOD1 (dysmutaza ponadtlenkowa 1), ALS2 (stwardnienie zanikowe boczne 2), FUS (ang. fused in sarcoma, jądrowe białko wiążące RNA/DNA), TARDBP (białko wiążące TAR DNA), VAGFA (czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego A), VAGFB (czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego B) i VAGFC (czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego C) oraz ich dowolne kombinacje. [0100] Przykłady białek powiązanych z chorobami prionowymi mogą obejmować SOD1 (dysmutaza ponadtlenkowa 1), ALS2 (stwardnienie zanikowe boczne 2), FUS (ang. fused in sarcoma, jądrowe białko wiążące RNA/DNA), TARDBP (białko wiążące TAR DNA), VAGFA (czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego A), VAGFB (czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego B) i VAGFC (czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego C) oraz ich dowolne kombinacje. [0101] Przykłady białek związanych ze schorzeniami neurodegeneracyjnymi przy zaburzeniach prionowych mogą obejmować na przykład A2M (alfa-2-makroglobulinę), AATF (przeciwapoptotyczny czynnik transkrypcyjny), ACPP (fosfatazę kwaśną sterczowa), ACTA2 (aktynę alfa 2 mięśniówki gładkiej aorty), ADAM22 (domenę metalopeptydazy ADAM), ADORA3 (receptor adenozyny A3) lub ADRA1D (receptor alfa-1d adrenergiczny dla adrenoreceptora alfa-1d). [0102] Przykłady białek powiązanych z niedoborem odporności mogą obejmować na przykład A2M [alfa-2-makroglobulinę]; AANAT [N-acetylotransferazę aryloalkiloaminową]; ABCA1 [kasetę wiążącą ATP z podrodziny A (ABC1), członek 1]; ABCA2 [kasetę wiążącą ATP z podrodziny A (ABC1), członek 2]; lub ABCA3 [kasetę wiążącą ATP z podrodziny A (ABC1), członek 3]. [0103] Przykłady białek powiązanych z zaburzeniami powtórzeń trinukleotydowych obejmują na przykład AR (receptor androgenowy), FMR1 (białko 1 upośledzenia umysłowego w zespole łamliwego chromosomu X), HTT (huntingtynę) lub DMPK (kinazę białkową dystrofii miotonicznej), FXN (frataksynę), ATXN2 (ataksynę 2). [0104] Przykłady białek powiązanych z zaburzeniami neurotransmisji obejmują na przykład SST (somatostatynę), NOS1 (syntazę tlenku azotu 1 (neuronalną)), ADRA2A (receptor alfa-2aadrenergiczny), ADRA2C (receptor alfa-2c-adrenergiczny), TACR1 (receptor dla tachykinin 1) lub HTR2c (receptor C 5-hydroksytryptaminy (serotoniny)).

53 PZ/3317/AGR 52 EP B1 [0105] Przykłady powiązanych sekwencji powiązanych z rozwojem układu nerwowego obejmują na przykład A2BP1 [białko 1 wiążące ataksynę-2], AADAT [transaminazę aminoadypinianową], AANAT [N-acetylotransferazę aryloalkiloaminową], ABAT [transaminazę 4-aminomaślanową], ABCA1 [kasetę wiążącą ATP z podrodziny A (ABC1), członek 1] lub ABCA13 [kasetę wiążącą ATP z podrodziny A (ABC1), członek 13]. [0106] Dalsze przykłady korzystnych schorzeń, które można leczyć niniejszym systemem obejmują, mogą być wybrane spośród następujących: zespół Aicardiego-Goutièresa; choroba Alexandra; zespół Allana-Herndona-Dudleya; zaburzenia związane z POLG; alfa-mannozydoza (Typ II i III); zespół Alströma; zespół Angelmana; ataksja-teleangiektazja; ceroidolipofuscynozy neuronalne; beta-talasemia; obustronny zanik nerwu wzrokowego i (niemowlęcy) zanik nerwu wzrokowego typu 1; retinoblastoma (obustronna); choroba Canavan; zespół mózgowo-oczno-twarzowo-szkieletowy 1 [COFS1]; ksantomatoza mózgowo-ścięgnista; zespół Cornelii de Lange; zaburzenia związane z MAPT; genetyczne choroby prionowe; zespół Dravet; dziedziczna choroba Alzheimera o wczesnym początku; ataksja Friedreicha [FRDA]; zespół Frynsa; fukozydoza; wrodzona dystrofia mięśniowa Fukuyamy; galaktosialidoza; choroba Gauchera; kwasice organiczne; limfohistiocytoza hemofagocytarna; zespół progerii Hutchinsona-Gilforda; mukolipidoza II; niemowlęca choroba spichrzeniowa wolnych kwasów sialowych; neurodegeneracja związana z PLA2G6; zespół Jervell i Lange-Nielsena; postać łącząca pęcherzowego oddzielania się naskórka; choroba Huntingtona; choroba Krabbego (niemowlęca); mitochondrialny zależny od DNA zespół Leigh a i NARP; zespół Lesch-Nyhana; związane z LIS1 gładkomózgowie; zespół Lowe a; choroba syropu klonowego; zespół duplikacji MECP2; związane z ATP7A zaburzenia transportu miedzi; związana z LAMA2 dystrofia mięśniowa; niedobór arylosulfatazy A; mukopolisacharydozy typu I, II lub III; zaburzenia biogenezy peroksysomów, spektrum zespołu Zellwegera; neurodegeneracja z zaburzeniami z mózgową akumulacją żelaza; niedobór kwaśnej sfinogmielinazy; choroba Niemanna-Picka typu C; encefalopatia glicynowa; zaburzenia związane z ARX; zaburzenia cyklu mocznikowego; związana z COL1A1/2 wrodzona łamliwość kości; zespoły mitochondrialnych delecji DNA; zaburzenia związane z PLP1; zespół Perry ego; zespół Phelan-McDermid; choroba spichrzeniowa glikogenu typu II (choroba Pompego) (niemowlęca); zaburzenia związane z MAPT; zaburzenia związane z MECP2; rizomeliczna chondrodystrofia punktowa typu 1; zespół Robertsa; choroba Sandhoffa; choroba Schindlera - typu 1; niedobór deaminazy adenozynowej; zespół Smitha-Lemliego-Opitza; rdzeniowy zanik mięśni; ataksja rdzeniowo-móżdżkowa o początku niemowlęcym; niedobór heksozaminidazy A; dysplazja tanatoforyczna typu 1; zaburzenia związane z kolagenem typu VI; zespół Ushera typu I; wrodzona dystrofia mięśniowa; zespół Wolfa-Hirschhorna; niedobór kwaśnej lipazy lizosomalnej; oraz skóra pergaminowa. [0107]Jest oczywistym, że przewidywane jest stosowanie niniejszego systemu do celowania w dowolną daną sekwencję polinukleotydową. Niektóre przykłady schorzeń lub chorób, które mogą być użytecznie leczone z zastosowaniem niniejszego systemu są zawarte w Tabelach powyżej, i przedstawiono tam również przykłady genów obecnie wiązanych z tymi schorzeniami. Przykłady genów nie są jednak wyczerpujące. PRZYKŁADY

54 PZ/3317/AGR 53 EP B1 [0108] Poniższe przykłady podano dla celów ilustracji różnych przykładów wykonania wynalazku i nie mają w zamierzeniu w żaden sposób ograniczać niniejszego wynalazku. Niniejsze przykłady, wraz z opisanymi tu sposobami są niniejszym reprezentatywne dla korzystnych przykładów wykonania, są przykładowe i nie mają w zamierzeniu ograniczać zakresu wynalazku. Przykład 1: Aktywność kompleksu CRISPR w jądrze komórki eukariotycznej [0109] Przykładem systemu CRISPR typu II jest locus CRISPR typu II ze Streptococcus pyogenes SF370, które zawiera klaster czterech genów Cas9, Cas1, Cas2 i Csn1, a także dwa niekodujące elementy RNA, tracrna oraz charakterystyczny układ powtarzalnych sekwencji (proste powtórzenia) przerywanych krótkimi odcinkami niepowtarzających się sekwencji (przerywniki, około 30 pz każdy). W systemie tym, tworzone jest celowane dwuniciowe pęknięcie DNA (DSB) w czterech kolejnych etapach (Figura 2A). Po pierwsze, dwa niekodujące RNA, zestaw pre-crrna i tracrrna ulegają transkrypcji z locus CRISPR. Po drugie, tracrrna hybrydyzuje z prostymi powtórzeniami pre-crrna, który jest następnie procesowany do dojrzałego crrna zawierającego indywidualne sekwencje przerywnikowe. Po trzecie, dojrzały kompleks crrna:tracrrna kieruje Cas9 do docelowego DNA składającego się z protoprzerywnika oraz odpowiadającego PAM przez uformowanie heterodupleksu między regionem przerywnika crrna oraz protoprzerywnikem DNA. Wreszcie, Cas9 pośredniczy w cięciu docelowego DNA powyżej PAM z utworzeniem DSB w obrębie protoprzerywnika (Figura 2A). Przykład ten opisuje przykładowy proces dostosowywania tego programowalnego przez RNA systemu nukleazy do kierowania aktywnością kompleksu CRISPR w jądrach komórek eukariotycznych. Hodowla komórek i transfekcja [0110] Linię HEK 293FT komórek nerek zarodków ludzkich (HEK) (Life Technologies) hodowano w pożywce Eagle a zmodyfikowanej przez Dulbecco (DMEM) uzupełnianej 10% płodowej surowicy bydlęcej (HyClone), 2mM GlutaMAX (Life Technologies), 100 U/ml penicyliny i 100 µg/ml streptomycyny z inkubacją w 37 C z 5% CO 2. Mysią linię komórkową neuro2a (N2A) (ATCC) hodowano w DMEM uzupełnianym 5% płodową surowicą bydlęcą (HyClone), 2mM GlutaMAX (Life Technologies), 100 U/ml penicyliny i 100 µg/ml streptomycyny w 37 C z 5% CO 2. [0111] Komórki HEK 293FT lub N2A wysiewano na płytki 24-dołkowe (Corning) na dzień przed transfekcją, w gęstości komórek na studzienkę. Komórki transfekowano stosując Lipofektaminę 2000 (Life Technologies) według zalecanego protokołu producenta. Dla każdej studzienki z płytki 24-dołkowej stosowano w sumie 800 ng plazmidów. Test Surveyor i analiza z sekwencjonowaniem pod kątem modyfikacji genomu [0112] Komórki HEK 293FT lub N2A transfekowano DNA plazmidowym jak opisano powyżej. Po transfekcji, komórki inkubowano w 37 C przez 72 godziny, przed ekstrakcją genomowego DNA. DNA genomowy ekstrahowano stosując zestaw do ekstrakcji DNA QuickExtract (Epicentre) według protokołu producenta. W skrócie, komórki ponownie zawieszano w roztworze QuickExtract i inkubowano w 65 C przez 15 minut oraz w 98 C przez 10 minut. Ekstrahowany DNA genomowy procesowano natychmiast lub przechowywano w -20 C.

55 PZ/3317/AGR 54 EP B1 [0113] Region genomu otaczający miejsce docelowe CRISPR dla każdego genu amplifikowano z pomocą PCR, a produkty oczyszczano stosując kolumnę QiaQuick Spin Column (Qiagen) według protokołu producenta. W sumie 400 ng oczyszczonych produktów PCR mieszano z 2 µl 10x buforem PCR do polimerazy Taq (Enzymatics) i ultraczystą wodą do ostatecznej objętości 20 µl i poddawano procesowi ponownej hybrydyzacji aby umożliwić tworzenie heterodupleksu: 95 C przez 10 min, 95 C do 85 C ze zmianą o -2 C/s, 85 C do 25 C przy -0,25 C/s i stałe 25 C przez 1 minutę. Po ponownej hybrydyzacji produkty traktowano nukleazą Surveyor i wzmacniaczem Surveyor enhancer S (Transgenomics) według zalecanego protokołu producenta, i analizowano na 4-20% żelach poliakrylamidowych Novex TBE (Life Technologies). Żele wybarwiano barwnikiem do DNA SYBR Gold (Life Technologies) przez 30 minut i obrazowano w systemie obrazowania żeli Gel Doc (Bio-rad). Oznaczanie ilościowe opierano na względnych intensywności prążków, jako miarach frakcji przeciętego DNA. Figura 7 zapewnia schematyczną ilustrację tego testu Surveyor. [0114] Test polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych do wykrywania rekombinacji homologicznej. [0115] Komórki HEK 293FT i N2A transfekowano plazmidowym DNA i inkubowano w 37 C przez 72 godziny przed ekstrakcją genomowego DNA, jak opisano powyżej. Docelowy region genomu amplifikowano z pomocą PCR stosując startery poza ramionami homologii matrycy do rekombinacji homologicznej (HR). Produkty PCR rozdzielano na 1% żelu agarozowym i ekstrahowano zestawem MinElute GelExtraction Kit (Qiagen). Oczyszczone produkty trawiono HindIII (Fermentas) i analizowano na 6% żelu poliakrylamidowym Novex TBE (Life Technologies). Przewidywanie i analiza struktury drugorzędowej RNA [0116] Przewidywanie struktury drugorzędowej RNA wykonywano stosując serwer sieciowy RNAfold opracowany przez Institute for Theoretical Chemistry na Uniwersytecie Wiedeńskim, wykorzystujący algorytm przewidywania ciężkości struktury (zob. np. A.R. Gruber et al., 2008, Cell 106(1): 23-24; i PA Carr i GM Church, 2009, Nature Biotechnology 27(12): ). Oczyszczanie RNA [0117] Komórki HEK 293FT hodowano i transfekowano jak wskazano powyżej. Komórki zbierano przez trypsynizację z następującym płukaniem w buforowanej fosforanem soli fizjologicznej (PBS). Całkowity RNA komórkowy ekstrahowano odczynnikiem TRI (Sigma) według protokołu producenta. Ekstrahowany całkowity RNA oznaczano ilościowo stosując Nanodrop (Thermo Scientific) i normalizowano do takiego samego stężenia. Analiza Northern blot ekspresji crrna i tracrrna w komórkach ssaków [0118] RNA mieszano z równymi objętościami 2x buforu do nakładania (Ambion), podgrzewano do 95 C przez 5 min, schładzano na lodzie przez 1 min, a następnie nakładano na 8% żele poliakrylamidowe w warunkach denaturujących (SequaGel, National Diagnostics) po wstępnym puszczeniu żelu przez co najmniej 30 minut. Próbki poddawano elektroforezie przez 1,5 godz. z ograniczeniem do 40W. Następnie przenoszono RNA na membranę Hybond N+ (GE Healthcare) przy 300 ma w urządzeniu do transferu

56 PZ/3317/AGR 55 EP B1 półsuchego (Bio-rad) w temperaturze pokojowej przez 1,5 godz. RNA wiązano z membraną stosując przycisk autocrosslink (autosieciowanie) w crosslinkerze Stratagene UV Crosslinker (Stratagene). Membranę poddawano wstępnej hybrydyzacji w buforze ULTRAhyb-Oligo Hybridization Buffer (Ambion) przez 30 min z rotacją w 42 C, a następnie dodawano sondy i hybrydyzowano przez noc. Sondy zamawiano z IDT i znakowano [gamma- 32 P] ATP (Perkin Elmer) z kinazą polinukleotydową T4 (New England Biolabs). Membranę płukano raz wcześniej podgrzanym (42 C) 2x SSC, 0,5% SDS przez 1 min z kolejnymi dwoma 30 minutowymi płukaniami w 42 C. Membranę eksponowano z ekranem fosforowym przez jedną godzinę lub przez noc w temperaturze pokojowej, a następnie skanowano urządzeniem Phosphorimager (Typhoom). Konstrukcja i ocena bakteryjnego systemu CRISPR [0119] Elementy locus CRISPR, w tym tracrrna, Cas9 i sekwencję liderową amplifikowano z pomocą PCR z DNA genomowego Streptococcus pyogenes SF370 z flankującymi ramionami homologii do składania wg sposobu Gibson Assembly. Wprowadzono dwa miejsca IS typu BsaI między dwoma prostymi powtórzeniami, w celu udogodnienia łatwego wstawiania przerywników (Figura 8). Produkty PCR klonowano do pacyc184 trawionego EcoRV, poniżej promotora tet, stosując Gibson Assembly Master Mix (NEB). Pomijano inne endogenne systemy CRISPR, za wyjątkiem ostatnich 50 pz z Csn2. Oligonukleotydy (Integrated DNA Technology) kodujące przerywniki z komplementarnymi wystającymi końcami klonowano do wektora pdc000 (NEB) trawionego BsaI, a następnie ligowano ligazą T7 (Enzymatics) w celu wytworzenia plazmidów pcrispr. Plazmidy obciążeniowe zawierające przerywniki z PAM [0120] do ekspresji w komórkach ssaczych (konstrukty ekspresyjne zilustrowane na Figurze 6A, z funkcjonalnością jak określona przez wyniki testu Surveyor przedstawionego na Figurze 6B). Miejsca początku transkrypcji są oznaczone +1, a wskazano również terminator transkrypcji i sekwencję sondowaną przez Northern blot. Ekspresja przetworzonego tracrrna została również potwierdzona przez Northern blot. Figura 6C przedstawia wyniki analizy Northern blot całkowitego RNA ekstrahowanego z komórek 293FT transfekowanych konstruktami ekspresyjnymi U6 niosącymi długie lub krótkie tracrrna, a także SpCas9 oraz DR-EMX1(1)-DR. Lewy i prawy panel dotyczą komórek 293FT transfekowanych odpowiednio bez lub z SpRNazą III. U6 wskazuje kontrolę nakładania wizualizowaną sondą celującą w ludzki snrna U6. Transfekcja konstruktem ekspresyjnym krótkiego tracrrna doprowadziła do wysokiego poziomu przetworzonej postaci tracrrna (~75pz). W Northern blot wykrywano bardzo małe ilości długiego tracrrna. [0121] Aby sprzyjać precyzyjnej inicjacji transkrypcji, wybrano promotor U6 dla polimerazy RNA III do kierowania ekspresją tracrrna (Figura 2C). Podobnie, opracowano konstrukt oparty o promotor U6 do ekspresji układu prec-crrna składającego się z pojedynczego przerywnika flankowanego dwoma prostymi powtórzeniami (DR, również objęte terminem sekwencje parujące tracr ; Figura 2C). Początkowy przerywnik został zaprojektowany do celowania w miejsce docelowe mające 33 pary zasad (pz) (protoprzerywnik 30-pz plus 3-pz sekwencja motywu CRISPR (PAM) odpowiadająca rozpoznawanemu motywowi NGG dla Cas9) w ludzkim locus EMX1 (Figura 2C), kluczowym genie w rozwoju kory mózgowej.

57 PZ/3317/AGR 56 EP B1 [0122] Aby sprawdzić, czy heterologiczna ekspresja systemu CRISPR (SpCas9, SpRNaza III, tracrrna i pre-crrna) w komórkach ssaczych może osiągnąć celowane cięcie chromosomów ssaczych, komórki HEK 293FT transfekowano kombinacjami elementów CRISPR. Ponieważ DSB w jądrach ssaczych są częściowo naprawione przez szlak łączenia niehomologicznych końców (NHEJ), co prowadzi do powstawania indeli (ang. indels; insercji i delecji), zastosowano test Surveyor do detekcji potencjalnej aktywności cięcia w docelowym locus EMX1 (zob., np. Guschin et al., 2010, Methods Mol Biol 649: 247). Ko-transfekcja wszystkich czterech elementów CRISPR mogła zaindukować do 5,0% cięcia protoprzerywnika (zob. Figura 2D). Kotransfekcja wszystkich elementów CRISPR minus SpRNaza III również indukowała do 4,7% indeli w protoprzerywniku, co wskazuje, że mogą istnieć endogenne ssacze RNazy, które są zdolne do wspomagania dojrzewania crrna, tak jak na przykład powiązane enzymy Dicer i Drosha. Usunięcie dowolnych spośród pozostałych trzech elementów znosiło aktywność cięcia genomu systemu CRISPR (Figura 2D). Sekwencjonowanie metodą Sangera amplikonów zawierających docelowe locus zweryfikowało aktywność cięcia: w 43 sekwencjonowanych klonach znaleziono 5 zmutowanych alleli (11,6%). Podobne doświadczenia z użyciem szeregu różnych sekwencji kierujących skutkowały odsetkiem indeli nawet do 29% (zobacz Figury 3-6, 10 i 11). Wyniki te definiują trójelementowy system do wydajnej modyfikacji genomu w komórkach ssaczych za pośrednictwem CRISPR. Aby zoptymalizować wydajność cięcia, Zgłaszający zbadali też czy różne izoformy tracrrna wpływały na wydajność cięcia i stwierdzili, że w tym przykładowym systemie, jedynie krótka (89-bp) postać transkryptu była w stanie pośredniczyć w cięciu ludzkiego locus genomowego EMX1 (Figura 6B). [0123] Figura 12 przedstawia dodatkową analizę Northern blot procesowania crrna w komórkach ssaczych. Figura 12A ilustruje schemat przedstawiający wektor ekspresyjny dla pojedynczego przerywnika oflankowanego dwoma prostymi powtórzeniami (DR-EMX1(1)-DR). 30 pz przerywnik celujący w ludzki protoprzerywnik 1 locus EMX1 (zob. Figura 6) oraz sekwencje prostych powtórzeń przedstawiono na sekwencji poniżej Figury 12A. Linia wskazuje region, dla którego wykorzystano sekwencję odwrotnie komplementarną do wytworzenia sond Northern blot do detekcji EMX1(1) crrna. Figura 12B przedstawia analizę Northern blot całkowitego RNA ekstrahowanego z komórek 293FT transfekowanych konstruktami ekspresyjnymi U6 przenoszącymi DR-EMX1(1)-DR. Lewy i prawy panel dotyczą komórek 293FT transfekowanych odpowiednio bez lub z SpRNazą III. DR-EMX1(1)-DR był przetwarzany do dojrzałych crrna jedynie w obecności SpCas9 i krótkiego tracrrna i nie był zależny od obecności SpRNazy III. Dojrzały crrna wykryty z całkowitego RNA transfekowanych 293FT ma ~33 pz i jest krótszy niż pz dojrzały crrna z S. pyogenes. Wyniki te wykazują, że system CRISPR może być przeniesiony do komórek eukariotycznych i przeprogramowany do ułatwienia cięcia endogennych ssaczych docelowych polinukleotydów. [0124] Figura 2 przedstawia bakteryjny system CRISPR opisany w tym przykładzie. Figura 2A ilustruje schemat przedstawiający locus 1 CRISPR ze Streptococcus pyogenes SF370 oraz proponowany mechanizm cięcia DNA za pośrednictwem CRISPR w tym systemie. Dojrzały crrna przetworzony z układu proste powtórzenie-przerywnik kieruje Cas9 do genomowych celów składających się z komplementarnych protoprzerywników oraz motywu przylegającego do protoprzerywnika (ang. protospacer-adjacent motif, PAM). Przy parowaniu zasad cel-przerywnik, Cas9 indukuje dwuniciowe pęknięcie w docelowym DNA. Figura 2B ilustruje konstrukcję Cas9 z S. pyogenes (SpCas9) i RNazy III (SpRNaza III) z jądrowymi sygnałami lokalizacji (NLS), w celu umożliwienia importowania do jądra

58 PZ/3317/AGR 57 EP B1 ssaków. Figura 2C ilustruje ssaczą ekspresję SpCas9 i SpRNazy III kierowaną przez konstytutywny promotor EF1a oraz układ tracrrna i pre-crrna (DR-Przerywnik-DR) kierowaną przez promotor U6 RNA Pol3 do wspierania precyzyjnej inicjacji i terminacji transkrypcji. Protoprzerywnik z ludzkiego locus EMX1 z odpowiednią sekwencją PAM stosowany jest jako przerywnik w układzie pre-crrna. Figura 2D ilustruje test z nueklazy surveyor dla niewielkich insercji i delecji indukowanych przez SpCas9. SpCas9 wyrażano z i bez SpRNazy III, tracrrna i układu pre-crrna niosącego docelowy przerywnik EMX1. Figura 2E ilustruje schematyczne przedstawienie parowania zasad między locus i crrna celującym w EMX1, a także przykładowy chromatogram przedstawiający mikrodelecję przyległą do miejsca cięcia SpCas9. Figura 2F ilustruje zmutowane allele zidentyfikowane z analizy sekwencyjnej 43 klonalnych amplikonów przedstawiając szereg mikro insercji oraz delecji. Kreski wskazują usunięte zasady, a niedopasowane lub niesparowane zasady wskazują insercje lub mutacje. Pasek podziałki = 10µm. [0125] Aby dalej uprościć trój-elementowy system, dostosowano hybrydowy wzór chimerycznego crrna-tracrrna, w którym dojrzały crrna (zawierający sekwencję kierującą) może być połączony z częściowym tracrrna przez łodyżkę-pętlę w celu naśladowania naturalnego dupleksu crrna:tracrrna. W celu zwiększenia wydajności wspólnego dostarczania, wytworzono bicistronowy wektor ekspresyjny do kierowania ko-ekspresją (współekspresją) chimerycznego RNA i SpCas9 w transfekowanych komórkach. Równolegle, wykorzystywano wektory bicistronowe do wyrażania pre-crrna (DR-sekwencja kierująca- DR) z SpCas9, w celu indukowania procesowania do crrna z osobno wyrażanym tracrrna (por. Figura 11B, część górna i dolna). Figura 8 przedstawia schematyczne ilustracje bicistronowych wektorów ekspresyjnych do układu pre-crrna (Figura 8A) lub chimerycznego crrna (przedstawionego krótką linią poniżej miejsca insercji sekwencji kierującej i powyżej promotora EF1α na Figurze 8B) z hspcas9, pokazując lokalizacje różnych elementów i miejsce insercji sekwencji kierującej. Rozszerzona sekwencja wokół miejsca insercji sekwencji kierującej na Figurze 8B przedstawia też częściową sekwencję DR (GTTTTAGAGCTA) (SEQ ID NO: 11) i częściową sekwencję tracrrna (TAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTTTT) (SEQ ID NO: 12). Sekwencje kierujące można wstawiać między miejscami BsbI wykorzystując hybrydyzujące oligonukleotydy. Projektowanie sekwencji oligonukleotydów przedstawiono poniżej schematycznych ilustracji na Figurze 8, ze wskazaniem odpowiednich adapterów do ligacji. WPRE oznacza post-transkrypcyjny element regulatorowy wirusa zapalenia wątroby świstaka. Wydajność cięcia za pośrednictwem chimerycznego RNA testowano przez celowanie w to samo locus EMX1 opisane powyżej. Stosując zarówno test Surveyor jak i sekwencjonowanie amplikonów metodą Sangera, Zgłaszający potwierdzili, że konstrukt chimerycznego RNA ułatwia cięcie ludzkiego locus EMXX1 z około 4,7% stopniem modyfikacji (Figura 3). [0126] Uogólnienie cięcia za pośrednictwem CRISPR w komórkach eukariotycznych badano celując w dodatkowe loci genomowe, w komórkach ludzkich jak i mysich, projektując chimeryczne RNA celujące w wiele miejsc w ludzkich loci EMX1 i PVALB, jak również w mysim Th. Figura 13 ilustruje wybór kilku dodatkowych docelowych protoprzerywników w loci ludzkim PVALB (Figura 13A) i mysim Th (Figura 13B). Przedstawiono schematy loci genowych i lokalizacji trzech protoprzerywników w obrębie ostatniego egzonu. Podkreślone sekwencje obejmują 30 pz sekwencji protoprzerywnika i 3 pz na końcu 3 odpowiadające sekwencjom PAM. Protoprzerywniki w niciach sensownej i antysensownej są wskazane odpowiednio powyżej i poniżej sekwencji DNA. Uzyskano stopień modyfikacji 6,3% i 0,75% odpowiednio z loci ludzkiego PVALB i mysiego Th, wykazując szerokie zastosowanie systemu CRISPR w modyfikacji

59 PZ/3317/AGR 58 EP B1 różnych loci w wielu organizmach (Figura 5). Chociaż cięcie wykrywano jedynie w jednym na trzy przerywniki dla każdego locus przy zastosowaniu konstruktów chimerycznych, wszystkie sekwencje docelowe były cięte z wydajnością tworzenia indeli osiągającą 27% przy użyciu ulegającego ko-ekspresji układu pre-crrna (Figury 6 i 13). [0127] Figura 11 przedstawia dalszą ilustrację tego, że SpCas9 może być przeprogramowane do celowania w wiele genomowych loci w komórkach ssaczych. Figura 11A przedstawia schemat ludzkiego locus EMX1 pokazując umiejscowienie pięciu protoprzerywników wskazanych przez podkreślone sekwencje. Figura 11B przedstawia schemat kompleksu pre-crrna/tracrrna pokazując hybrydyzację między regionem prostego powtórzenia pre-crrna i tracrrna (góra), oraz schemat projektu chimerycznego RNA zawierającego 20 pz sekwencję kierującą i sekwencje parującą tracr i tracr składające się z częściowych sekwencji prostych powtórzeń oraz sekwencji tracrrna hybrydyzujących w strukturze spinki do włosów (dół). Wyniki testu Surveyor porównującego efektywność cięcia za pośrednictwem Cas9 przy pięciu protoprzerywnikach w ludzkim locus EMX1 przedstawiono na Figurze 11C. Celowanie w każdy protoprzerywnik odbywa się przy użyciu przetworzonego kompleksu precrrna/tracrrna (crrna) albo chimerycznego RNA (chirna). [0128] Ponieważ struktura drugorzędowa RNA może być istotna dla interakcji międzycząsteczkowych, wykorzystano algorytm przewidywania struktury oparty o minimalną energię swobodną i zespoły strukturalne ważone wg modelu Boltzmanna do porównania przewidywanej struktury drugorzędowej wszystkich sekwencji kierujących stosowanych w doświadczeniu celowania w genomie (zob. np. Gruber et al., 2008, Nucleic Acids Research, 36: W70). Analiza wykazała, że w większości przypadków, efektywne sekwencje kierujące w kontekście chimerycznego crrna były zasadniczo wolne od drugorzędowych motywów strukturalnych, podczas gdy nieefektywne sekwencje kierujące były bardziej skłonne do tworzenia wewnętrznych struktur drugorzędowych, które mogły zapobiegać parowaniu zasad z docelowym protoprzerywnikem DNA. Jest w związku z tym możliwe, że zmienność w drugorzędowej strukturze przerywnika może wpływać na wydajność interferencji za pośrednictwem CRISPR przy zastosowaniu chimerycznego crrna. [0129] Dalsze konstrukcje wektorów dla SpCas9 przedstawiono na Figurze 22, która ilustruje pojedyncze wektory ekspresyjne z włączeniem promotora U6 połączonego z miejscem insercji dla kierującego oligo oraz promotor Cbh połączony z sekwencją kodującą SpCas9. Wektor przedstawiony na Figurze 22b obejmuje sekwencję kodującą tracrrna połączoną z promotorem H1. [0130] W teście na bakteriach, wszystkie przerywniki umożliwiły wydają interferencję CRISPR (Figura 3C). Wyniki te sugerują, że mogą istnieć dodatkowe czynniki wpływające na wydajność aktywności CRISPR w komórkach ssaczych. [0131] Aby zbadać specyficzność cięcia za pośrednictwem CRISPR, analizowano wpływ mutacji pojedynczych nukleotydów w sekwencji kierującej na cięcie protoprzerywnika w genomie ssaczym przy użyciu serii chimerycznych crrna celujących w EMX1 z pojedynczymi mutacjami punktowymi (Figura 3A). Figura 3B ilustruje wyniki testu z nukleazą Surveyor porównującego wydajność cięcia Cas9 przy parowaniu z różnymi zmutowanymi chimerycznymi RNA. Brak sparowania dla pojedynczej zasady do 12 pz 5' od PAM zasadniczo znosił cięcie genomu przez SpCas9, podczas gdy przerywniki z mutacjami w

60 PZ/3317/AGR 59 EP B1 dalszych pozycjach powyżej zachowywały aktywność wobec wyjściowego docelowego protoprzerywnika (Figura 3B). Poza PAM, SpCas9 wykazuje specyficzność wobec pojedynczej zasady w obrębie ostatnich 12 pz przerywnika. Co więcej, CRISPR może pośredniczyć w cięciu genomu tak wydajnie jak para nukleaz TALE (TALEN) celujących w ten sam protoprzerywnik EMX1. Figura 3C zapewnia schemat pokazujący konstrukcję TALEN-ów celujących w EMX1, a Figura 3D przedstawia żel dla Surveyor porównujący wydajność TALEN oraz Cas9 (n=3). [0132] Po ustaleniu zestawu elementów do uzyskania redagowania genów w komórkach ssaczych za pośrednictwem CRISPR przez podatny na błędy mechanizm NHEJ, badano zdolność CRIPSR do stymulowania rekombinacji homologicznej (HR), wysoce dokładnego szlaku naprawy genów do tworzenia precyzyjnych modyfikacji w genomie. SpCas9 typu dzikiego może indukować specyficzne dla miejsca DSB, które mogą być naprawione zarówno przez NHEJ jak i HR. Dodatkowo, wprowadzono substytucję asparaginianu na alaninę (D10A) w domenie katalitycznej RuvC I SpCas9 w celu przekształcenia nukleazy w nikazę (SpCas9n; zilustrowane na Figurze 4A) (zob. np. Sapranausaks et al., 2011, Nucleic Acis Research, 39: 9275; Gasiunas et al., 2012, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 109:E2579), tak że nacinany genomowy DNA przechodzi wysoce dokładną naprawę homologiczną (HDR). Test Surveyor potwierdził, że SpCas9n nie wytwarza indeli przy docelowym protoprzerywniku EMX1. Jak przedstawiono na Figurze 4B, ko-ekspresja celującego w EMX1 chimerycznego crrna z SpCas9 daje indele w miejscu docelowym, natomiast ko-ekspresja z SpCas9n nie (n=3). Ponadto, sekwencjonowanie 327 amplikonów nie wykryło jakichkolwiek indeli indukowanych przez SpCas9n. Ten sam locus wybrano do testowania HR indukowanej przez CRISPR, poprzez ko-transfekcję komórek HEK 293 FT chimerycznym RNA celującym w EMX1, hspcas9 lub hspcas9n, a także matrycą HR w celu wprowadzania pary miejsc restrykcyjnych (HindIII i NheI) w pobliżu protoprzerywnika. Figura 4C przedstawia schematyczną ilustrację strategii HR, ze względnymi miejscami punktów rekombinacji i sekwencjami hybrydyzacji starterów (strzałki). SpCas9 i SpCas9n rzeczywiście katalizowały integrację matrycy HR do locus EMX1. Amplifikacja PCR regionu docelowego, z dalszym trawieniem restrykcyjnym HindIII wykazały produkty cięcia odpowiadające oczekiwanym wielkościom fragmentów (strzałki w analizie polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych na żelu przedstawionej na Figurze 4D), z SpCas9 i SpCas9n indukującymi podobne poziomy wydajności HR. Zgłaszający dalej zweryfikowali HR stosując sekwencjonowanie amplikonów genomowych metodą Sangera (Figura 4E). Wyniki te wykazują użyteczność CRISPR do umożliwiania ukierunkowanej insercji genowej w genomie ssaczym. Z uwagi na specyficzność SpCas9 typu dzikiego dla docelowych 14 pz (12-pz ze przerywnika i 2-pz z PAM), dostępność nikazy może znacząco zmniejszyć prawdopodobieństwo modyfikacji poza celem, ponieważ pojedyncze pęknięcia nici nie są substratami dla podatnego na błędy szlaku NHEJ. [0133] Skonstruowano konstrukty ekspresyjne naśladujące naturalną architekturę loci CRISPR z układem przerywników (Figura 2A), aby przetestować możliwość multipleksowego celowania sekwencyjnego. Z wykorzystaniem pojedynczego układu CRISPR kodującego parę przerywników celujących w EMX1 - i PVALB, wykrywano wydajne cięcie w obydwu loci (Figura 4F, przedstawiająca zarówno schematyczny projekt układu crrna jak i blot Surveyor przedstawiający wydajną indukcję cięcia). Przetestowano też ukierunkowaną delecję większych regionów genomowych przez towarzyszące DSB z zastosowaniem przerywników przeciw dwóm celom w obrębie EMX1 oddzielonym przez 119 pz i stwierdzono 1,6%

61 PZ/3317/AGR 60 EP B1 wydajności delecji (3 spośród 182 amplikonów; Figura 4G). To wykazuje, że system CRISPR może pośredniczyć w multipleksowym redagowaniu w obrębie pojedynczego genomu. Przykład 2: Modyfikacje i alternatywy systemu CRISPR [0134] Możliwość do wykorzystywania RNA do programowania specyficznego dla sekwencji cięcia DNA definiuje nową klasę narzędzi inżynierii genomu dla szeregu zastosowań badawczych i przemysłowych. Kilka aspektów systemu CRISPR można dalej ulepszać w celu zwiększenia wydajności i uniwersalności celowania CRISPR. Optymalna aktywność Cas9 może zależeć od dostępności wolnego Mg 2+ na poziomach wyższych niż te występujące w jądrze ssaczym (zob. np. Jinek et al., 2012, Science, 337:816) a preferencja dla motywu NGG bezpośrednio poniżej protoprzerywnika ogranicza zdolność do celowania do średnio co 12 pz w ludzkim genomie (Figura 9, oceniająca nici zarówno plus jak i minus ludzkich sekwencji chromosomalnych). Niektóre z tych ograniczeń można przezwyciężyć badając możliwości różnorodnych loci CRISPR w całym metagenomie mikroorganizmów (zobacz np. Makarova et al., 2011, Nat Rev Microbiol, 9:467). Inne loci CRISPR mogą być przenoszone do środowiska komórki ssaczej w procesie podobnym do opisanego w Przykładzie 1. Na przykład, Figura 10 przedstawia dostosowanie systemy CRISPR typu II z CRISPR 1 ze Streptococcus thermophilus LMD-9 do ekspresji heterologicznej w komórkach ssaków w celu uzyskania redagowania genomu za pośrednictwem CRISPR. Figura 10A przedstawia schematyczną ilustrację CRISPR 1 z S. thermophilus LMD-9. Figura 10B przedstawia konstrukcję układu ekspresyjnego dla systemu CRISPR z S. thermophilus. hstcas9 zoptymalizowany pod względem kodonów pod kątem człowieka, wyrażany jest z zastosowaniem konstytutywnego promotora EF1α. Dojrzałe wersje tracrrna i crrna wyrażane są z zastosowaniem promotora U6, aby sprzyjać precyzyjnej inicjacji transkrypcji. Przedstawiono sekwencje dojrzałych crrna i tracrrna. Pojedynczą zasadę oznaczoną małym a w sekwencji crrna wykorzystuje się do usunięcia sekwencji poli-u, która służy jako terminator transkrypcji dla RNA PolIII. Figura 10C przedstawia schemat pokazujący sekwencje kierujące celujące w ludzki locus EMX1. Figura 10D przedstawia wyniki dla cięcia indukowanego przez hstcas9 w docelowym locus z zastosowaniem testu Surveyor. Przerywniki kierujące RNA 1 i 2 indukowały odpowiednio 14% i 6,4%. Analizę statystyczną aktywności cięcia w obrębie replik biologicznych tych dwóch miejsc protoprzerywnikowych również przedstawiono na Figurze 5. Figura 14 przedstawia schemat dodatkowego protoprzerywnika i odpowiadające docelowe sekwencje PAM z systemu CRISPR S. thermophilus w ludzkim locus EMX1. Wyróżniono dwie sekwencje protoprzerywników, a ich odpowiadające sekwencje PAM odpowiadające motywowi NNAGAAW wskazano przez podkreślenie w kierunku 3 w odniesieniu do opowiadającej wyróżnionej sekwencji. Celem obu protoprzerywników jest nić antysensowna. Przykład 3: Algorytm wyboru sekwencji docelowej w próbie [0135] Opracowano oprogramowanie do identyfikacji kandydackich sekwencji docelowych CRISPR na obydwu niciach wejściowej sekwencji DNA w oparciu o pożądaną długość sekwencji kierującej oraz sekwencji motywu CRISPR (PAM) dla określonego enzymu CRISPR. Na przykład, miejsca docelowe dla Cas9 z S. pyogenes, z sekwencjami PAM NGG można identyfikować przez przeszukanie dla 5'-Nx-NGG-3' zarówno sekwencji wejściowej jak i sekwencji odwrotnie komplementarnej do sekwencji wejściowej. Podobnie, miejsca docelowe dla Cas9 z CRISPR1 z S. thermophilus, z sekwencją PAM NNAGAAW, można identyfikować przez przeszukanie dla 5'-Nx-NNAGAAW-3' zarówno sekwencji

62 PZ/3317/AGR 61 EP B1 wejściowej, jak i sekwencji odwrotnie komplementarnej do sekwencji wejściowej. Podobnie, miejsca docelowe dla Cas9 z CRISPR3 S. thermophilus, z sekwencją PAM NGGNG można identyfikować przez przeszukanie dla 5'-Nx-NGGNG-3' zarówno sekwencji wejściowej jak i sekwencji odwrotnie komplementarnej do sekwencji wejściowej. Wartość x w Nx może byś ustalona przez program lub określona przez użytkownika, np. 20. [0136] Ponieważ wiele wystąpień docelowego miejsca DNA w genomie może prowadzić do niespecyficznego redagowania genomu, po identyfikacji wszystkich potencjalnych miejsc program odfiltrowuje sekwencje w oparciu o liczbę ich wystąpień w odpowiednim genomie referencyjnym. Dla tych enzymów CRISPR dla których specyficzność sekwencji jest określona przez sekwencję,,jądra'', taką jak pz w kierunku 5' od sekwencji PAM, łącznie z samą sekwencją PAM, etap filtrowania może być oparty o sekwencję jądra. A zatem, aby uniknąć redagowania dodatkowych loci genomowych, wyniki filtrowane są w oparciu o liczbę wystąpień jądro:sekwencja PAM w odpowiednim genomie. Użytkownik może mieć możliwość wyboru długości sekwencji jądra. Użytkownik może mieć również możliwość ustalenia liczby wystąpień jądro:sekwencja PAM w genomie do przechodzenia przez filtr. Ustawieniem domyślnym jest odsiewanie pod kątem sekwencji unikalnych. Poziom filtracji zmieniany jest przez zmianę zarówno długości sekwencji jądra, jak i liczby wystąpień sekwencji w genomie. Program może dodatkowo lub alternatywnie zapewniać sekwencję kierującą komplementarną do zgłoszonej/-ych sekwencji docelowej/-ych zapewniając sekwencję odwrotnie komplementarną do zidentyfikowanej/-ych sekwencji docelowej/-ych. Przykładową wizualizację niektórych miejsc docelowych w genomie ludzkim przedstawiono na Figurze 18. Przykład 4: Ocena wielu chimerycznych hybryd crrna-tracrrna [0137] Przykład ten opisuje wyniki uzyskane dla chimerycznych RNA (chirna; zawierających sekwencję kierującą, sekwencję parującą tracr oraz sekwencję tracr w pojedynczym transkrypcie) mających sekwencje tracr, które obejmują różne długości sekwencji tracrrna typu dzikiego. Figura 16a przedstawia schematy bicistronowego wektora ekspresyjnego dla chimerycznego RNA i Cas9. Cas9 jest kierowane przez promotor CBh, a chimeryczny RNA kierowany jest przez promotor U6. Chimeryczny kierujący RNA składa się z 20 pz sekwencji kierującej (Ns) połączonej z sekwencją tracr (biegnącej od pierwszego U dolnej nici do końca transkryptu), która jest skrócona w różnych wskazanych miejscach. Sekwencje kierujące oraz tracr są rozdzielone przez sekwencję parującą tracr GUUUUAGAGCUA (SEQ ID NO: 13), z dalszą sekwencją pętli GAAA. Wyniki testów SURVEYOR dla indukowanych przez Cas9 indeli w ludzkich loci EMX1 i PVALB przedstawiono odpowiednio na Figurze 16b i 16c. Strzałki wskazują oczekiwane fragmenty SURVEYOR. ChiRNA wskazano przez ich oznaczenie,,+n, a crrna odnosi się do hybrydowego RNA, w którym sekwencje kierujące i tracr ulegają ekspresji jako osobne transkrypty. Oznaczenie ilościowe dla tych wyników, wykonane w trzech powtórzeniach, przedstawiono na histogramie na Figurach 17a i 17b, odpowiadającym odpowiednio Figurom 16b i 16c (,,N.D. wskazuje na brak wykrytych indeli). Identyfikację protoprzerywników i ich odpowiadający cel genomowy, sekwencję protoprzerywnika, sekwencję PAM i lokalizację na nici przedstawiono w Tabeli D. Sekwencje kierujące zaprojektowano tak aby były komplementarne do całej sekwencji protoprzerywnika w przypadku osobnych transkryptów w systemie hybrydowym, lub wyłącznie do podkreślonej części w przypadku chimerycznych RNA.

63 PZ/3317/AGR 62 EP B1 Tabela D: Nr identyfikacyjny cel w sekwencja protoprzerywnika (5' do 3') PAM SEQ nić protoprzerywnika genomie ID NO: 1 EMX1 GGACATCGATGTCACCTCCAATGACTAGGG TGG EMX1 CATTGGAGGTGACATCGATGTCCTCCCCAT TGG 15-3 EMX1 GGAAGGGCCTGAGTCCGAGCAGAAGAAGAA GGG PVALB GGTGGCGAGAGGGGCCGAGATTGGGTGTTC AGG PVALB ATGCAGGAGGGTGGCGAGAGGGGCCGAGAT TGG 18 + [0138] Początkowo celowano w trzy miejsca w locus EMX1 w ludzkich komórkach HEK 293FT. Wydajność modyfikacji genomu dla każdego chirna oceniano stosując test z nukleazą SURVEYOR, który wykrywa mutacje będące wynikiem dwuniciowych pęknięć DNA (DSB) oraz ich dalszej naprawy przez szlak naprawy uszkodzeń DNA z łączeniem niehomologicznych końców (NHEJ). Konstrukty oznaczone chirna(+n) wskazują, że do konstruktu chimerycznego RNA włączony jest nukleotyd +n tracrrna typu dzikiego, ze stosowanymi dla n wartościami 48, 54, 67 i 85. Chimeryczne RNA zawierające dłuższe fragmenty tracrrna typu dzikiego (chirna(+67) i chirna(+85)) indukowały cięcie DNA przy wszystkich trzech miejscach docelowych EMX1, z chirna (+85) w szczególności wykazującym znacznie wyższe poziomy cięcia DNA niż odpowiadające hybrydy crrna/tracrrna, które wyrażały sekwencje kierującą i tracr w osobnych transkryptach (Figury 16b i 17a). W dwa miejsca w locus PVALB, które nie dawały wykrywalnego cięcia przy zastosowaniu systemu hybrydowego (sekwencja kierująca i sekwencja tracr ulegające ekspresji jako osobne transkrypty) celowano także stosując chirna. chirna (+67) i chirna(+85) były zdolne do indukowania znaczącego cięcia przy dwóch protoprzerywnikach PVALB (Figury 16c i 17b). Dla wszystkich pięciu celów w loci EMX1 i PVALB, obserwowano stały wzrost w wydajności modyfikacji genomu ze wzrostem długości sekwencji tracr. Bez wiązania się teorią, struktura drugorzędowa tworzona przez koniec 3' tracrrna może odgrywać rolę we wzmocnieniu częstotliwości tworzenia kompleksu CRISPR. Przykład 5: Zróżnicowanie Cas9 [0139] System CRISPR-Cas jest adaptacyjnym mechanizmem odpornościowym przeciwko inwazyjnemu, egzogennemu DNA, wykorzystywanym przez szereg gatunków wśród bakterii i archeonów. System CRISPR-Cas9 typu II składa się z zestawu genów kodujących białka odpowiedzialne za pobieranie obcego DNA do locus CRISPR, jak również z zestawu genów kodujących wykonanie mechanizmu cięcia DNA; obejmują one nukleazę DNA (Cas9), niekodujący crrna aktywujący in trans (tracrrna) oraz układ przerywników pochodzących od obcego DNA oflankowanych prostymi powtórzeniami (crrna). Po dojrzewaniu za sprawą Cas9, dupleks tracrrna i crrna kieruje nukleazę Cas9 do docelowej sekwencji DNA określonej przez sekwencje kierujące przerywników i pośredniczy w powstaniu dwuniciowych

64 PZ/3317/AGR 63 EP B1 pęknięć w DNA w pobliżu krótkiego motywu sekwencji w DNA docelowym, który jest wymagany do cięcia i specyficzny dla każdego systemu CRISPR-Cas. Systemy CRISPR-Cas typu II występują w całym królestwie bakterii i są wysoce zróżnicowane pod względem sekwencji i wielkości białka Cas9, sekwencji prostych powtórzeń tracrrna i crrna, organizacji tych elementów w genomie oraz wymogów co do motywu do docelowego cięcia. Jeden gatunek może mieć wiele odrębnych systemów CRISPR-Cas. [0140] Zgłaszający ocenili 207 domniemanych Cas9 z gatunków bakterii zidentyfikowanych w oparciu o homologię sekwencji dla znanych Cas9 i ortologi strukturalne dla znanych subdomen, w tym domeny endonukleazy HNH i domen endonukleazy RuvC [informacje od Eugene Koonin i Kira Makarova]. Analiza filogenetyczna oparta o konserwowanie sekwencji białka w tym zestawie wykazała pięć rodzin Cas9, w tym trzy grupy dużych Cas9 (~1400 aminokwasów) i dwie małych Cas9 (~1100 aminokwasów) (zob. Figury 19 i 20A-F). Przykład 6: Ortologi Cas9 [0141] Zgłaszający przeanalizowali ortologi Cas9 w celu identyfikacji odpowiednich sekwencji PAM i odpowiadających chimerycznych kierujących RNA. Rozszerzony zestaw PAM zapewnia szersze celowanie w obrębie genomu, jak również znacząco zwiększa liczbę unikalnych miejsc docelowych i zapewnia potencjał do identyfikacji nowych Cas9 ze zwiększonym poziomem specyficzności w genomie. [0142] Specyficzność ortologów Cas9 można oceniać testując zdolność każdego Cas9 do tolerowania niesparowania między kierującym RNA a jego docelowym DNA. Na przykład, specyficzność SpCas9 scharakteryzowano testując wpływ mutacji w kierującym RNA na wydajność cięcia. Przygotowano biblioteki kierujących RNA z pojedynczymi lub wielokrotnymi niesparowaniami pomiędzy sekwencją kierującą a DNA docelowym. Na podstawie tych ustaleń, można wybierać miejsca docelowe dla SpCas9, opierając się na poniższych wskazówkach: [0143] Do maksymalizacji specyficzności SpCas9 dla redagowania konkretnego genu, należy wybrać miejsce docelowe w obrębie danego locus, w taki sposób, żeby potencjalne sekwencje genomowe poza celem odpowiadały następującym czterem ograniczeniom: po pierwsze i najważniejsze, nie powinny poprzedzać PAM ani sekwencji 5 -NGG czy NAG. Po drugie, ich ogólne podobieństwo sekwencji do sekwencji docelowej powinno być minimalizowane. Po trzecie, maksymalnie wiele niesparowań powinno występować w obrębie regionu w pobliżu PAM miejsca poza celem. Wreszcie, maksymalnie wiele niesparowań powinno występować kolejno lub rozdzielonych od siebie mniej niż czterema zasadami. [0144] Podobne sposoby można wykorzystywać do oceny specyficzności innych ortologów Cas9 oraz do określenia kryteriów do wyboru konkretnych miejsc docelowych w obrębie genomów gatunków docelowych. Jak wspomniano wcześniej, analiza filogenetyczna oparta o konserwowanie sekwencji białka w tym zestawie wykazała pięć rodzin Cas9, w tym trzy grupy dużych Cas9 (~1400 aminokwasów) i dwie małych Cas9 (~1100 aminokwasów) (zob. Figury 19 i 20A-F). Przykład 7: Konstruowanie roślin (mikroglonów) z zastosowaniem Cas9 do celowania i manipulowania genami roślinnymi Sposoby dostarczania Cas9

65 PZ/3317/AGR 64 EP B1 [0145] Sposób 1: Zgłaszający dostarczają Cas9 i kierujący RNA stosując wektor, który wyraża Cas9 pod kontrolą konstytutywnego promotora, takiego jak Hsp70A-Rbc S2 lub tubuliny beta2. Sposób 2: Zgłaszający dostarczają Cas9 i polimerazę T7 stosując wektory, które wyrażają Cas9 i polimerazę T7 pod kontrolą konstytutywnego promotora, takiego jak Hsp70A-Rbc S2 lub tubuliny beta2. Kierujący RNA dostarczany będzie z zastosowaniem wektora zawierającego promotor T7 kontrolujący kierujący RNA. Sposób 3: Zgłaszający dostarczają mrna Cas9 i transkrybowany in vitro kierujący RNA do komórek glonu. RNA może ulegać transkrypcji in vitro. mrna Cas9 będzie składać się z regionu kodującego Cas9, jak również z 3 UTR z Cop1 w celu zapewnienia stabilizacji mrna Cas9. [0146] Do rekombinacji homologicznej, Zgłaszający zapewniają dodatkową macierz do naprawy homologicznej. [0147] Sekwencja kasety kierującej ekspresją Cas9 pod kontrolą promotora tubuliny beta-2, z następującym 3 UTR z Cop1.

66 PZ/3317/AGR 65 EP B1

67 PZ/3317/AGR 66 EP B1

68 PZ/3317/AGR 67 EP B1 [0148] Sekwencja kasety kierującej ekspresją polimerazy T7 pod kontrolą promotora tubuliny beta-2, z następującym 3 UTR z Cop 1:

69 PZ/3317/AGR 68 EP B1 [0149] Sekwencja kierującego RNA pod kontrolą promotora T7 (promotor T7, litery N oznaczają sekwencję kierującą): Dostarczanie genu:

70 PZ/3317/AGR 69 EP B1 [0150] Do elektroporacji wykorzystany zostanie szczep CC-124 i CC-125 Chlamydomonas reinhardti z Chlamydomonas Resource Center. Protokół elektroporacji przebiega według zalecanego protokołu z zestawu GeneArt Chlamydomonas Engineering. [0151] Ponadto, Zgłaszający tworzą linię Chlamydomonas reinhardtii, która konstytutywnie wyraża Cas9. Można to zrobić stosując pchlamy1 (linearyzowany z zastosowaniem PvuI) i selekcję kolonii opornych na higromycynę. Sekwencja pchlamy1 zawierającego Cas9 znajduje się poniżej. W ten sposób, w celu uzyskania knockoutu genu, należy jedynie dostarczyć RNA dla kierującego RNA. Do rekombinacji homologicznej Zgłaszający dostarczają kierujący RNA, jak również linearyzowaną matrycę do rekombinacji homologicznej. pchlamy1-cas9: [0152]

71 PZ/3317/AGR 70 EP B1

72 PZ/3317/AGR 71 EP B1

73 PZ/3317/AGR 72 EP B1

74 PZ/3317/AGR 73 EP B1

75 PZ/3317/AGR 74 EP B1 [0153] Dla wszystkich modyfikowanych komórek Chlamydomonas reinhardtii Zgłaszający stosują PCR, test z nukleazą SURVEYOR i sekwencjonowanie DNA w celu weryfikacji skutecznej modyfikacji. [0154] Chociaż przedstawiono i opisano tu korzystne przykłady wykonania niniejszego wynalazku, dla specjalistów w dziedzinie oczywistym będzie, że takie przykłady wykonania zapewnione są jedynie tytułem przykładu. Dla specjalistów w dziedzinie oczywiste teraz staną się liczne wariacje, zmiany i podmiany, które nie wykraczają poza zakres wynalazku. Należy rozumieć, że w realizacji wynalazku w praktyce wykorzystywane mogą być różne alternatywy wobec opisanych tu przykładów wykonania wynalazku. W zamierzeniu, poniższe zastrzeżenia określają zakres wynalazku i objęte są niniejszym sposoby i struktury z zakresu tychże zastrzeżeń oraz ich ekwiwalenty. Literatura: [0155] 1. Urnov, F.D., Rebar, E.J., Holmes, M.C., Zhang, H.S. & Gregory, P.D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat. Rev. Genet. 11, (2010). 2. Bogdanove, A.J. & Voytas, D.F. TAL effectors: customizable proteins for DNA targeting. Science 333, (2011). 3. Stoddard, B.L. Homing endonuclease structure and function. Q. Rev. Biophys. 38, (2005). 4. Bae, T. & Schneewind, O. Allelic replacement in Staphylococcus aureus with inducible counterselection. Plasmid 55, (2006). 5. Sung, C.K., Li, H., Claverys, J.P. & Morrison, D.A. An rpsl cassette, janus, for gene replacement through negative selection in Streptococcus pneumoniae. Appl. Environ. Microbiol. 67, (2001). 6. Sharan, S.K., Thomason, L.C., Kuznetsov, S.G. & Court, D.L. Recombineering: a homologous recombination-based method of genetic engineering. Nat. Protoc. 4, (2009).

76 PZ/3317/AGR 75 EP B1 7. Jinek, M. et al. A programmable dual-rna-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 337, (2012). 8. Deveau, H., Garneau, J.E. & Moineau, S. CRISPR/Cas system and its role in phage-bacteria interactions. Annu. Rev. Microbiol. 64, (2010). 9. Horvath, P. & Barrangou, R. CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea. Science 327, (2010). 10. Terns, M.P. & Terns, R.M. CRISPR-based adaptive immune systems. Curr. Opin. Microbiol. 14, (2011). 11. van der Oost, J., Jore, M.M., Westra, E.R., Lundgren, M. & Brouns, S.J. CRISPR-based adaptive and heritable immunity in prokaryotes. Trends. Biochem. Sci. 34, (2009). 12. Brouns, S.J. et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science 321, (2008). 13. Carte, J., Wang, R., Li, H., Terns, R.M. & Terns, M.P. Cas6 is an endoribonuclease that generates guide RNAs for invader defense in prokaryotes. Genes Dev. 22, (2008). 14. Deltcheva, E. et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature 471, (2011). 15. Hatoum-Aslan, A., Maniv, I. & Marraffini, L.A. Mature clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats RNA (crrna) length is measured by a ruler mechanism anchored at the precursor processing site. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, (2011). 16. Haurwitz, R.E., Jinek, M., Wiedenheft, B., Zhou, K. & Doudna, J.A. Sequence- and structure-specific RNA processing by a CRISPR endonuclease. Science 329, (2010). 17. Deveau, H. et al. Phage response to CRISPR-encoded resistance in Streptococcus thermophilus. J. Bacteriol. 190, (2008). 18. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P. & Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2012). 19. Makarova, K.S., Aravind, L., Wolf, Y.I. & Koonin, E.V. Unification of Cas protein families and a simple scenario for the origin and evolution of CRISPR-Cas systems. Biol. Direct. 6, 38 (2011). 20. Barrangou, R. RNA-mediated programmable DNA cleavage. Nat. Biotechnol. 30, (2012). 21. Brouns, S.J. Molecular biology. A Swiss army knife of immunity. Science 337, (2012). 22. Carroll, D. A CRISPR Approach to Gene Targeting. Mol. Ther. 20, (2012).

77 PZ/3317/AGR 76 EP B1 23. Bikard, D., Hatoum-Aslan, A., Mucida, D. & Marraffini, L.A. CRISPR interference can prevent natural transformation and virulence acquisition during in vivo bacterial infection. Cell Host Microbe 12, (2012). 24. Sapranauskas, R. et al. The Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas system provides immunity in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. (2011). 25. Semenova, E. et al. Interference by clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) RNA is governed by a seed sequence. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2011). 26. Wiedenheft, B. et al. RNA-guided complex from a bacterial immune system enhances target recognition through seed sequence interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2011). 27. Zahner, D. & Hakenbeck, R. The Streptococcus pneumoniae beta-galactosidase is a surface protein. J. Bacteriol. 182, (2000). 28. Marraffini, L.A., Dedent, A.C. & Schneewind, O. Sortases and the art of anchoring proteins to the envelopes of gram-positive bacteria. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 70, (2006). 29. Motamedi, M.R., Szigety, S.K. & Rosenberg, S.M. Double-strand-break repair recombination in Escherichia coli: physical evidence for a DNA replication mechanism in vivo. Genes Dev. 13, (1999). 30. Hosaka, T. et al. The novel mutation K87E in ribosomal protein S12 enhances protein synthesis activity during the late growth phase in Escherichia coli. Mol. Genet. Genomics 271, (2004). 31. Costantino, N. & Court, D.L. Enhanced levels of lambda Red-mediated recombinants in mismatch repair mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, (2003). 32. Edgar, R. & Qimron, U. The Escherichia coli CRISPR system protects from lambda lysogenization, lysogens, and prophage induction. J. Bacteriol. 192, (2010). 33. Marraffini, L.A. & Sontheimer, E.J. Self versus non-self discrimination during CRISPR RNA-directed immunity. Nature 463, (2010). 34. Fischer, S. et al. An archaeal immune system can detect multiple Protospacer Adjacent Motifs (PAMs) to target invader DNA. J. Biol. Chem. 287, (2012). 35. Gudbergsdottir, S. et al. Dynamic properties of the Sulfolobus CRISPR/Cas and CRISPR/Cmr systems when challenged with vector-borne viral and plasmid genes and protospacers. Mol. Microbiol. 79, (2011). 36. Wang, H.H. et al. Genome-scale promoter engineering by coselection MAGE. Nat Methods 9, (2012).

78 PZ/3317/AGR 77 EP B1 37. Cong, L. et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science In press (2013). 38. Mali, P. et al. RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9. Science In press (2013). 39. Hoskins, J. et al. Genome of the bacterium Streptococcus pneumoniae strain R6. J. Bacteriol. 183, (2001). 40. Havarstein, L.S., Coomaraswamy, G. & Morrison, D.A. An unmodified heptadecapeptide pheromone induces competence for genetic transformation in Streptococcus pneumoniae. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, (1995). 41. Horinouchi, S. & Weisblum, B. Nucleotide sequence and functional map of pc194, a plasmid that specifies inducible chloramphenicol resistance. J. Bacteriol. 150, (1982). 42. Horton, R.M. In Vitro Recombination and Mutagenesis of DNA : SOEing Together Tailor-Made Genes. Methods Mol. Biol. 15, (1993). 43. Podbielski, A., Spellerberg, B., Woischnik, M., Pohl, B. & Lutticken, R. Novel series of plasmid vectors for gene inactivation and expression analysis in group A streptococci (GAS). Gene 177, (1996). 44. Husmann, L.K., Scott, J.R., Lindahl, G. & Stenberg, L. Expression of the Arp protein, a member of the M protein family, is not sufficient to inhibit phagocytosis of Streptococcus pyogenes. Infection and immunity 63, (1995). 45. Gibson, D.G. et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods 6, (2009). 46. Garneau J. E. et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature 468,67-71 (04 November 2010) 47. Barrangou R. et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science Mar 23;315(5819): Ishino Y. et al. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. J Bacteriol Dec;169(12): Mojica F. J. M et al. Biological significance of a family of regularly spaced repeats in the genomes of Archaea, Bacteria and mitochondria. Molecular Microbiology (2000) 36(1), Jansen R. et al. Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes. Molecular Microbiology (2002) 43(6),

79 PZ/3317/AGR 78 EP B1 Zastrzeżenia patentowe 1. Skonstruowany, niewystępujący naturalnie system wektorowy Zgrupowanych Regularnie Rozmieszczonych Krótkich Powtórzeń Palindromowych (CRISPR) - elementów towarzyszących CRISPR (Cas) (CRISPR-Cas) obejmujący jeden lub więcej wektorów zawierających: a) pierwszy element regulatorowy połączony funkcjonalnie z jedną lub więcej sekwencjami nukleotydowymi kodującymi jeden lub więcej kierujących RNA systemu CRISPR-Cas, które hybrydyzują z sekwencjami docelowymi w loci polinukleotydowych w komórce eukariotycznej, przy czym kierujący RNA obejmuje sekwencję kierującą, sekwencję tracr i sekwencją parującą tracr, b) drugi element regulatorowy połączony funkcjonalnie z sekwencją nukleotydową kodującą białko Cas9 Typu II, przy czym wymienione białko obejmuje sygnał lokalizacji jądrowej (NLS); przy czym komponenty (a) i (b) są zlokalizowane na tych samych lub innych wektorach systemu, przy czym sekwencja tracr ma 30 lub więcej nukleotydów długości; i przy czym jedno lub więcej kierujących RNA celuje w loci polinukleotydowe w komórce eukariotycznej, a białko Cas9 przecina loci polinukleotydowe, przy czym sekwencja loci polinukleotydowych jest modyfikowana; i przy czym białko Cas9 i jeden lub więcej kierujących RNA nie występują naturalnie razem. 2. Skonstruowany, niewystępujący naturalnie system wektorowy CRISPR-Cas Typu II według zastrz. 1, w którym białko Cas9 obejmuje jedną lub więcej mutacji w domenie katalitycznej, takich że zmutowane białko Cas9 nie ma zdolności do cięcia jednej z nici loci polinukleotydowych i jest nikazą. 3. System według zastrz. 1 lub 2, w którym wektorami są wektory wirusowe. 4. System według zastrz. 3, w którym wektorami wirusowymi są wektory retrowirusowe, lentiwirusowe, adenowirusowe, wirusów towarzyszących adenowirusom lub wirusów opryszczki pospolitej. 5. System według dowolnego z zastrz. 2 do 4, w którym białko Cas9 zawiera jedną lub więcej mutacji w domenach katalitycznych RuvC I, RuvC II lub RuvC III. 6. System według dowolnego spośród zastrz. 2 do 4, w którym białko Cas9 zawiera mutację wybraną z grupy składającej się z D10A, H840A, N854A i N863A w odniesieniu do numeracji pozycji białka Cas9 ze Streptococcus pyogenes (SpCas9). 7. System według dowolnego z poprzedzających zastrzeżeń, w którym kierującym RNA jest chimeryczny RNA obejmujący sekwencję kierującą, sekwencję tracr i sekwencję parującą tracr.

80 PZ/3317/AGR 79 EP B1 8. System według zastrz. 7, w którym hybrydyzacja między sekwencją tracr a sekwencją parującą tracr daje transkrypt mający strukturę drugorzędową. 9. System według zastrz. 8, w którym strukturą drugorzędową jest spinka do włosów. 10. System według dowolnego z poprzedzających zastrzeżeń, w którym komórką eukariotyczną jest komórka ssacza lub komórka ludzka. 11. System według dowolnego z poprzedzających zastrzeżeń, w którym białko Cas9 jest zoptymalizowane pod względem kodonów do ekspresji w komórce eukariotycznej. 12. System według dowolnego z poprzedzających zastrzeżeń, w którym do przecinanych loci polinukleotydowych wstawiana jest matryca naprawcza. 13. Zastosowanie systemu określonego w dowolnym spośród zastrz. 1 do 12: a) do knockoutu genu w sposób specyficzny dla miejsca; b) do redagowania genomu w sposób specyficzny dla miejsca; c) do interferencji specyficznej dla sekwencji DNA; lub d) do multipleksowej modyfikacji genomu; o ile zastosowanie to nie obejmuje procesu do modyfikacji tożsamości genetycznej linii zarodkowej istot ludzkich i przy czym zastosowanie i) jest in vitro lub ex vivo; lub ii) nie jest sposobem leczenia ciała ludzkiego lub zwierzęcego przez terapię. 14. Zastosowanie według zastrz. 13, przy czym zastosowanie to ponadto obejmuje naprawę wymienionego ciętego docelowego polinukleotydu przez rekombinację homologiczną z egzogennym polinukleotydem matrycowym, przy czym wymieniona naprawa skutkuje mutacją obejmującą insercję, delecję lub substytucję jednego lub więcej nukleotydów wymienionego docelowego polinukleotydu. 15. Zastosowanie systemu określonego w dowolnym z zastrz. 1 do 12 w wytwarzaniu zwierzęcia transgenicznego niebędącego człowiekiem lub rośliny transgenicznej, o ile zastosowanie nie jest sposobem leczenia ciała zwierzęcego przez terapię.

81 PZ/3317/AGR 80 EP B1

82 PZ/3317/AGR 81 EP B1

83 PZ/3317/AGR 82 EP B1

84 PZ/3317/AGR 83 EP B1

85 PZ/3317/AGR 84 EP B1

86 PZ/3317/AGR 85 EP B1

87 PZ/3317/AGR 86 EP B1

88 PZ/3317/AGR 87 EP B1

89 PZ/3317/AGR 88 EP B1

90 PZ/3317/AGR 89 EP B1

91 PZ/3317/AGR 90 EP B1

92 PZ/3317/AGR 91 EP B1

93 PZ/3317/AGR 92 EP B1

94 PZ/3317/AGR 93 EP B1

95 PZ/3317/AGR 94 EP B1

96 PZ/3317/AGR 95 EP B1

97 PZ/3317/AGR 96 EP B1

98 PZ/3317/AGR 97 EP B1

99 PZ/3317/AGR 98 EP B1

100 PZ/3317/AGR 99 EP B1

101 PZ/3317/AGR 100 EP B1

102 PZ/3317/AGR 101 EP B1

103 PZ/3317/AGR 102 EP B1

104 PZ/3317/AGR 103 EP B1

105 PZ/3317/AGR 104 EP B1

106 PZ/3317/AGR 105 EP B1

107 PZ/3317/AGR 106 EP B1

108 PZ/3317/AGR 107 EP B1

109 PZ/3317/AGR 108 EP B1

110 PZ/3317/AGR 109 EP B1

111 PZ/3317/AGR 110 EP B1

112 PZ/3317/AGR 111 EP B1

113 PZ/3317/AGR 112 EP B1

114 PZ/3317/AGR 113 EP B1

115 PZ/3317/AGR 114 EP B1