Badanie funkcji genu

Transkrypt

1 Badanie funkcji genu

2 Funkcję genu można zbadać różnymi sposobami Przypadkowa analizy funkcji genu MUTACJA FENOTYP GEN Strategia ukierunkowanej analizy funkcji genu GEN 1. wprowadzenie mutacji w genie 2. nadekspresja genu 3. potranskrypcyjne wyciszanie genu (antysensowne RNA oraz RNAi) FENOTYP

3 1. Inaktywacja (mutacja) genu poprzez homologiczną rekombinację jest podstawą analizy jego funkcji Bakteria X. xxxx Gen, którego funkcję chcemy ustalić 4. Homologiczna rekombinacja przerywa gen docelowy inaktywuje go przez wstawienie kasety kan do genomu bakterii X. xxxx 1. Kopia genu, który chcemy wyłączyć czyli odpowiedni fragment DNA sklonowany w wektorze plazmidowym w komórkach E. coli Początek i koniec genu, który chcemy wyłączyć Bakteria E. coli 2. Przebudowanie sklonowanego genu in vitro konstrukt do mutagenezy 3. Przebudowana kopia genu (konstrukt do mutagenezy) jest dostarczana na wektorze do komórek bakterii X. xxxx Gen kodujący oporność na antybiotyk np. kan (kaseta oporności)

4 Jak uzyskać mysz - z nokautem genowym?????? Problemy: Diploidalny genom Myszy nie da się wyhodować na płytce z selekcją na antybiotyk I wiele innych...

5 1. Infekcja wczesnego zarodka zrekombinowanym wektorem pochodzenia wirusowego Wektor retrowirusowy Komórki wczesnego mysiego zarodka

6 2) Mikroiniekcja in vitro DNA do jednego z przedjądrzy zapłodnionej komórki jajowej przed pierwszym jej podziałem

7 3) Zastosowanie zarodkowych komórek macierzystych ES (embrionic stem) totipotencjalnych tzn. takich które nie są przypisane do żadnego szlaku rozwojowego i mogą dać początek każdemu rodzajowi zróżnicowanych komórek. Takie komórki poddaje się modyfikacji in vitro (w kontrolowanych warunkach). Genetycznie zmienione (po homologicznej rekombinacji in vitro) komórki ES wprowadza się do zarodka myszy 1. Etap: pozyskanie komórek ES i hodowla in vitro komórki węzła zarodkowego są zdolne do różnicowania się we wszystkie typy komórek

8 2. Etap: przygotowanie konstruktu do mutagenezy in vitro na bazie kopii docelowego genu sklonowanego w wektorze w E. coli Tylko pewien procent wprowadzonych konstruktów włącza się, w wyniku homologicznej rekombinacji w komórkach zarodkowych, we właściwej pozycji genomowej. Dlatego konstrukt do mutegenezy wyposaża się w dodatkowe elementy genetyczne neo, gen kodujący enzym, który inaktywuje antybiotyk neomycynę oraz jego pochodne, np. G418, który jest toksyczny dla komórek ssaczych; tk, gen kodujący kinazę tymidynową enzym, który fosforyluje analogi nukleozydów np. gancyklowir. Polimeraza DNA może wbudować taki analog nukleotydu do nowosyntetyzowanej nici DNA co prowadzi do zaburzenia procesu replikacji DNA. Dlatego komórki zawierające gen tk, giną po podaniu gancyklowiru (są wrażliwe na gancyklowir).

9 3. Etap: wprowadzenie konstruktu do mutagenezy do komórek zarodkowych hodowanych in vitro i selekcja komórek z insercją konstruktu w docelowym genie in vitro selekcja komórek z insercją konstruktu w docelowym genie in vitro

10 4. Etap: iniekcja wyselekcjonowanych in vitro komórek zarodkowych z nokautem genowym i uzyskanie potomstwa z nokautem genowym we wszystkich komórkach ciała Uzyskujemy celowe uszkodzenie (knock-out) genu i uzyskanie tzw. myszy transgenicznych z nokautem genowym, dzięki któremu możliwe staje się zbadanie funkcji takiego genu

11 Nokaut genowy w konkretnej tkance lub nadrządzie zastosowanie systemu Cre-lox Cre miejscowo specyficzna rekombinaza działa na miejsca loxp (potworzone sekwencje długości 34 pz). Dlaczego wycinanie DNA za pomocą Cre/loxP może być użyteczne w komórkach eukariotycznych? System Cre/loxP pochodzi z bakteriofaga P1, a sekwencje docelowe typu loxp rozpoznawane przez rekombinazę Cre nie występują np. w roślinach czy u zwierząt sekwencje loxp mogą być sztucznie wstawiane do genomów zwierząt/roślin w celu precyzyjnego oznaczenia określonych sekwencji DNA przeznaczonych do wycinania, bez obawy że przy okazji może dojść do usunięcia jakiejś istotnej część genomu

12 Jak za pomocą systemu Cre/loxP otrzymać mysz, z nokautem genu w określonej tkance/narządzie? Do uzyskania obydwu linii transgenicznych myszy (z genem cre pod kontrolą tkankowo-specyficznego promotora oraz z miejscami loxp otaczającym docelowy gen) opiera się na homologicznej rekombinacji, która przeprowadza się in vitro w zarodkowych komórkach macierzystych

13 Strategia ukierunkowanej analizy funkcji genu GEN 1. wprowadzenie mutacji w genie 2. nadekspresja genu 3. potranskrypcyjne wyciszanie genu (antysensowne RNA oraz RNAi) FENOTYP

14 Inaktywacja genu z użyciem tzw. programowanych nukleaz Metody specyficznych modyfikacji genomów, określane jako edycja genomu wykorzystują tzw. programowane nukleazy System CRISPR-Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats-crispr associated), w którym główną rolę odgrywa jedna z tzw. programowanych nukleaz - Cas9 System wykorzystuje elementy mechanizmu nabytej odporności ( pamięci immunologicznej ) bakterii i archeonów na infekcję fagami i transformację obcym materiałem genetycznym Istnieje kilka typów opisanych systemów CRISPR-Cas, w inżynierii genetycznej zastosowanie znalazły narzędzia oparte na systemie CRISPR typu II.

15 System CRISPR-Cas zasada działania Mikroorganizmy włączają do swojego genomu (loci CRISPR) fragmenty obcego DNA (protospacer), co umożliwia im w przyszłości szybkie rozpoznanie i zniszczenie obcego DNA (np. fagowego). Długość włączanych sekwencji różni się i wynosi nukleotydów; najczęściej są to fragmenty nukleotydowe Każdej integracji towarzyszy duplikacja końcowej sekwencji powtórzonej tak, aby została zachowana architektura: powtórzenie proste-sekwencja rozdzielająca-powtórzenie proste (długość powtórzeń prostych także jest gatunkowo swoista i wynosi nt, zwykle nt) W integracji tych sekwencji do genomu biorą udział dwie endonukleazy: Cas1 oraz Cas2

16 Przy ponownym kontakcie z obcym DNA moduł kodujący crrna ulega ekspresji powstaje pierwotny transkrypt pre-crrna, obejmujący wszystkie sekwencje rozdzielające i powtórzenia proste Dojrzewanie pre-crrna wymaga obecności transaktywującego RNA (tracrrna). tracrrna hybrydyzuje z sekwencjami odpowiadającymi powtórzeniom prostym w pre-crrna Dupleks taki jest trawiony przez bakteryjną RNazę III w obecności nukleazy Cas9, tworząc dojrzałe cząsteczki crrna Dojrzałe cząsteczki crrna rozpoznają (na zasadzie komplementarności) obce DNA, które ulega trawieniu przez obecną w kompleksie nukleazę Cas9 crrna rozpoznaje obce DNA, które ulega degradacji przez Cas9

17 CRISPR-Cas typu II wykorzystuje małe cząsteczki RNA (crrna i tracrrna) do precyzyjnego nakierowania nukleazy efektorowej Cas9 na konkretne miejsce w DNA (jest to sekwencja komplementarna do crrna) W systemach będących narzędziem do precyzyjnej modyfikacji genomowego DNA komórek eukariotycznych do wprowadzenia zmiany w pożądanym miejscu genomu niezbędne elementy systemu są dostarczone komórce z zewnątrz. Ich ekspresja (zazwyczaj przejściowa), powoduje wprowadzenie stałych zmian w docelowym genomie Systemy CRISPR-Cas używane jako narzędzia są uproszczone przez zastosowanie chimerycznego RNA (połączenie crrna z tracrrna) określanego mianem sgrna (singleguide RNA ) Fragment crrna w obrębie sgrna nakierowuje kompleks na docelowe miejsce w genomie, w którym dochodzi do trawienia DNA

18 System wykorzystujący nukleazę Cas9 może być użyty do: wprowadzania trwałych zmian w genomie (np. typu nokaut) system CRISPR-Cas9 pozwala na samo przecięcie nici DNA, jednak po połączeniu go z mechanizmami naprawy DNA możliwe jest nie tylko wycięcie określonego segmentu DNA ale i wstawienie w przecięte miejsce dostarczonego z zewnątrz elementu genetycznego aktywacji bądź wyciszenia ekspresji wybranych genów (narzędzia oparte na systemie CRISPR-Cas znalazły zastosowanie przy tworzeniu zwierzęcych i komórkowych modeli wielu chorób, np. konkretnych typów nowotworów) Edycja genomu wykorzystująca programowane nukleazy może znaleźć szerokie zastosowanie m.in. w medycynie np. do walki z chorobami genetycznymi mutacje typu indel duża delecja insercja obcego DNA Jednoczesne powstanie dwóch pęknięć w obu niciach DNA na jednym chromosomie (DSB double strand brake) może prowadzić do pojawienia się mutacji typu indel (efekt naprawy przecięcia DNA) w obu docelowych loci albo do delecji bądź insercji obcego fragmentu DNA (nokaut genu)

19 Strategia ukierunkowanej analizy funkcji genu GEN 1. wprowadzenie mutacji w genie 2. nadekspresja genu 3. potranskrypcyjne wyciszanie genu (antysensowne RNA oraz RNAi) FENOTYP

20 2. Nadekspresja genu - celem jest ustalenie czy znacząco zwiększona ekspresja badanego genu wpłynie na fenotyp organizmu np. myszy transgenicznej. Transgeniczna mysz do której komórek wprowadza się cdna badanego genu sklonowany w wektorze pod kontrolą silnego promotora, który spowoduje ekspresję cdna np. w określonych tkankach

21 Strategia ukierunkowanej analizy funkcji genu GEN 1. wprowadzenie mutacji w genie 2. nadekspresja genu 3. potranskrypcyjne wyciszanie genu (antysensowne RNA oraz RNAi) FENOTYP 3. Potranksrypcyjne wyciszanie genu antysensowne RNA (arna) interferencja RNA (RNAi)

22 Antysensowne RNA (arna) mrna może tworzyć struktury dsrna jeśli w komórce pojawi się druga nić RNA komplementarna do nici sensownej Taka nić nazywa się antysensownym RNA arna Wprowadzenie do komórki konstruktu genetycznego, w którym określony gen będzie transkrybowany w taki sposób aby powstawał arna prowadzi do utworzenie dsrna i zahamowania ekspresji docelowego genu Pomidor Flavr Savr to przykład transgenicznej rośliny z zablokowaną za pomocą arna ekspresją genu kodującego enzym poligalakturonazę, która rozkłada pektyny powodując mięknięcie pomidorów

23 Interferencja RNA (RNAi) 1990 Napoli i wsp. przeprowadzili doświadczenie którego celem było uzyskanie odmiany petunii z kwiatami o bardziej intensywnej purpurowej barwie W tym celu do komórek roślinnych wprowadzono dodatkowe kopie genu (cdna) syntazy chalonowej odpowiedzialne za syntezę fioletowego barwnika kwiatów W efekcie zamiast ciemniejszych kwiatów uzyskano odmiany pstrokate lub zupełnie białe. Wprowadzenie dodatkowego genu nie prowadziło do wydajniejszej syntezy barwnika, ale spowodowało zahamowanie wytwarzania barwnika kwiatu Pomiar w komórce roślinnej petunii poziomu mrna genu, którego dodatkową kopię dodano wykazał, że jego poziom znacząco spadł, a obserwowane zjawisko miało tendencję do rozprzestrzeniania się na inne komórki rośliny Zjawisko to nazwano kosupresją - zahamowanie ekspresji dotyczyło zarówno normalny gen kodujący purpurową barwę, jak również jego wprowadzonych dodatkowych kopii

24 W 1998 r. Fire i wsp. scharakteryzowali na poziomie molekularnym potranskrypcyjny mechanizm regulujący poziom mrna w komórkach nicienia C. elegans Opisano zjawisko zostało nazwane interferencją RNA (RNA interference RNAi) polegało ono na wyciszaniu ekspresji docelowego genu przez krótkie dwuniciowe RNA którego jedna nić była komplementarna do mrna konkretnego genu Potranskrypcyjne wyciszanie zachodziło na zasadzie degradacji mrna określonego genu

25 Wyciszanie ekspresji genu poprzez degradację mrna w przypadku degradacji mrna w komórce obserwuje się obecność specyficznych pośredników interferencji - są to małe (długości pz) dwuniciowe RNA (dsrna) tzw. interferujące RNA (sirna, small interfering RNA) Jedna z nici sirna jest komplementarna do transkryptu wyciszanego genu Skąd się biorą w komórce cząsteczki sirna? Powstają w wyniku trawienia większych cząsteczek dsrna, które zazwyczaj są dla komórki sygnałem nienormalności, dsrna może pojawić się w komórce np. w wyniku infekcji wirusem RNA czy nadmierną ilością kopii genu Uważa się, że mechanizm sirna powstał w komórkach najprawdopodobniej jako system obrony przed dwuniciowymi wirusami RNA (dsrna)

26 Jak działa RNAi na poziomie molekularnym? dsrna jest dla komórki czymś niezwykłym i sygnałem nienormalności. Obecna w komórkach rybonukleaza Dicer, rozpoznaje dsrna i tnie go małe fragmenty pz sirna. Następnie powstaje tzw. kompleks wyciszającego zwany RISC (RNAinduced silencing complex), który ulega aktywacji wtedy kiedy sirna rozdzieli się na pojedyncze nici, Aktywny kompleks RISC wiąże się do mrna za pomocą antysensownego RNA. Obecna w kompleksie RISC rybonukleaza Slicer, trawi związane mrna powodując wyciszenie ekspresji genu.

27 Zjawisko RNAi jest powszechne u komórkach Eukariota (oprócz drożdży), występuje u pierwotniaków, jamochłonów, muszki owocowej, ryb, płazów, grzybów, myszy, człowieka, u różnych gatunków roślin niższych i wyższych Zjawisko RNAi jest niezwykle specyficzne: dostarczenie do cytoplazmy komórki dwuniciowych cząsteczek dsrna odpowiadających mrna konkretnego genu powoduje skuteczne obniżenie poziomu ekspresji tego genu (poprzez degradację jego transkryptu) RNAi można zastosować: 1. W badaniach podstawowych: do precyzyjnego i ukierunkowanego blokowania ekspresji genów 2. W praktyce: np. w terapii genowej (m.in. nowotworów wstrzykiwanie sirna komplementarnego do znanych protoonkogenów)

28 Dostarczanie sirna do ukierunkowanego wyciszania genów 1. sirna może być produkowane in vivo W wektorze umieszcza się odpowiednio spreparowane DNA, w którym do nici sensownego RNA danego genu wprowadza się krótkie odcinki antysensowne, W wyniku ekspresji w komórkach docelowych nić sensowna i antysensowna będą mogły utworzyć odcinki dwuniciowego RNA, dsrna po przekształceniu w sirna prowadzi do zahamowanie ekspresji konkretnego genu

29 2. sirna może być produkowane in vitro i dostarczane do komórki przez transkrypcję in vitro małych RNA (sirna) transkrypcja in vitro długich RNA, które będą wprowadzane do komórki i przekształcane w sirna przez rybonukleazę typu Dicer Na drodze syntezy chemicznej sirna

30 Potranskrypcyjne wyciszanie jest powszechnym mechanizmem regulacji ekspresji genów w komórkach eukariotycznych a) degradacji mrna b) blokowania translacji mrna W przypadku mechanizmu interferencji z translacją mrna, mediatorami są cząsteczki tzw. mikro-rna (mirna), zakodowane w genomie jak normalne geny Geny kodujące są transkrybowane przez polimerazę RNA II powstają długie cząsteczki mirna, które tworzą struktury typu szpilki do włosów, podlegające obróbce podobnej do sirna mirna wchodzą w skład kompleksów rybonukleoproteinowych specyficznie blokujących translację mrna W odróżnieniu od sirna, sekwencja mirna nie musi być w 100% identyczne do sekwencji docelowego mrna Ocenia się, że mirna biorą udział w regulacji 30% ludzkich genów