Badanie funkcji genu

Transkrypt

1 Badanie funkcji genu

2 Funkcję genu można zbadać różnymi sposobami Przypadkowa analizy funkcji genu MUTACJA FENOTYP GEN Strategia ukierunkowanej analizy funkcji genu GEN 1. wprowadzenie mutacji w genie 2. nadekspresja genu 3. potranskrypcyjne wyciszanie genu (antysensowne RNA oraz RNAi) FENOTYP

3 1. Inaktywacja (mutacja) genu poprzez homologiczną rekombinację jest podstawą analizy jego funkcji Bakteria X. xxxx Gen, którego funkcję chcemy ustalić 4. Homologiczna rekombinacja przerywa gen docelowy inaktywuje go przez wstawienie kasety kan do genomu bakterii X. xxxx 1. Kopia genu, który chcemy wyłączyć czyli odpowiedni fragment DNA sklonowany w wektorze plazmidowym w komórkach E. coli Początek i koniec genu, który chcemy wyłączyć Bakteria E. coli 2. Przebudowanie sklonowanego genu in vitro konstrukt do mutagenezy 3. Przebudowana kopia genu (konstrukt do mutagenezy) jest dostarczana na wektorze do komórek bakterii X. xxxx Gen kodujący oporność na antybiotyk np. kan (kaseta oporności)

4 Jak uzyskać mysz - z knockoutem genowym?????? Problemy: Diploidalny genom Myszy nie da się wyhodować na płytce z selekcją na antybiotyk I wiele innych...

5 1. Infekcja wczesnego zarodka zrekombinowanym wektorem pochodzenia wirusowego Wektor retrowirusowy Komórki wczesnego mysiego zarodka

6 2) Mikroiniekcja in vitro DNA do jednego z przedjądrzy zapłodnionej komórki jajowej przed pierwszym jej podziałem

7 3) Zastosowanie zarodkowych komórek macierzystych ES (embrionic stem) totipotencjalnych tzn. takich które nie są przypisane do żadnego szlaku rozwojowego i mogą dać początek każdemu rodzajowi zróżnicowanych komórek. Takie komórki poddaje się modyfikacji in vitro (w kontrolowanych warunkach). Genetycznie zmienione (po homologicznej rekombinacji in vitro) komórki ES wprowadza się do zarodka myszy 1. Etap: pozyskanie komórek ES i hodowla in vitro komórki węzła zarodkowego są zdolne do różnicowania się we wszystkie typy komórek

8 2. Etap: przygotowanie konstruktu do mutagenezy in vitro na bazie kopii docelowego genu sklonowanego w wektorze w E. coli Tylko pewien procent wprowadzonych konstruktów włącza się, w wyniku homologicznej rekombinacji w komórkach zarodkowych, we właściwej pozycji genomowej. Dlatego konstrukt do mutegenezy wyposaża się w dodatkowe elementy genetyczne neo, gen kodujący enzym, który inaktywuje antybiotyk neomycynę oraz jego pochodne, np. G418, który jest toksyczny dla komórek ssaczych; tk, gen kodujący kinazę tymidynową enzym, który fosforyluje analogi nukleozydów np. gancyklowir. Polimeraza DNA może wbudować taki analog nukleotydu do nowosyntetyzowanej nici DNA co prowadzi do zaburzenia procesu replikacji DNA. Dlatego komórki zawierające gen tk, giną po podaniu gancyklowiru (są wrażliwe na gancyklowir).

9 3. Etap: wprowadzenie konstruktu do mutagenezy do komórek zarodkowych hodowanych in vitro i selekcja komórek z insercją konstruktu w docelowym genie in vitro selekcja komórek z insercją konstruktu w docelowym genie in vitro

10 4. Etap: iniekcja wyselekcjonowanych in vitro komórek zarodkowych z nokautem genowym i uzyskanie potomstwa z nokautem genowym we wszystkich komórkach ciała Uzyskujemy celowe uszkodzenie (knock-out) genu i uzyskanie tzw. myszy transgenicznych z nokautem genowym, dzięki któremu możliwe staje się zbadanie funkcji takiego genu

11 Nokaut genowy w konkretnej tkance lub nadrządzie zastosowanie systemu Cre-lox Cre miejscowo specyficzna rekombinaza działa na miejsca loxp (potworzone sekwencje długości 34 pz). Dlaczego wycinanie DNA za pomocą Cre/loxP może być użyteczne w komórkach eukariotycznych? System Cre/loxP pochodzi z bakteriofaga P1, a sekwencje docelowe typu loxp rozpoznawane przez rekombinazę Cre nie występują np. w roślinach czy u zwierząt sekwencje loxp mogą być sztucznie wstawiane do genomów zwierząt/roślin w celu precyzyjnego oznaczenia określonych sekwencji DNA przeznaczonych do wycinania, bez obawy że przy okazji może dojść do usunięcia jakiejś istotnej część genomu

12 Jak za pomocą systemu Cre/loxP otrzymać mysz, z nokautem genu w określonej tkance/narządzie?

13 Strategia ukierunkowanej analizy funkcji genu GEN 1. wprowadzenie mutacji w genie 2. nadekspresja genu 3. potranskrypcyjne wyciszanie genu (antysensowne RNA oraz RNAi) FENOTYP

14 2. Nadekpresja genu - celem jest ustalenie czy znacząco zwiększona ekspresja badanego genu wpłynie na fenotyp organizmu np. myszy transgenicznej. Transgeniczna mysz do której komórek wprowadza się cdna badanego genu sklonowany w wektorze pod kontrolą silnego promotora, który spowoduje ekspresję cdna np. w określonych tkankach

15 3. Potranksrypcyjne wyciszanie genu antysensowne RNA (arna) interferencja RNA (RNAi)

16 Antysensowne RNA (arna) mrna może tworzyć struktury dsrna jeśli w komórce pojawi się druga nić RNA komplementarna do nici sensownej Taka nić nazywa się antysensownym RNA arna Wprowadzenie do komórki konstruktu genetycznego, w którym określony gen będzie transkrybowany w taki sposób aby powstawał arna prowadzi do utworzenie dsrna i zahamowania ekspresji docelowego genu Pomidor Flavr Savr to przykład transgenicznej rośliny z zablokowaną za pomocą arna ekspresją genu kodującego enzym poligalakturonazę, która rozkłada pektyny powodując mięknięcie pomidorów

17 Interferencja RNA (RNAi) 1990 Napoli i wsp. przeprowadzili doświadczenie którego celem było uzyskanie odmiany petunii z kwiatami o bardziej intensywnej purpurowej barwie W tym celu do komórek roślinnych wprowadzono dodatkowe kopie genu (cdna) syntazy chalonowej odpowiedzialne za syntezę fioletowego barwnika kwiatów W efekcie zamiast ciemniejszych kwiatów uzyskano odmiany pstrokate lub zupełnie białe. Wprowadzenie dodatkowego genu nie prowadziło do wydajniejszej syntezy barwnika, ale spowodowało zahamowanie wytwarzania barwnika kwiatu Pomiar w komórce roślinnej petunii poziomu mrna genu, którego dodatkową kopię dodano wykazał, że jego poziom znacząco spadł, a obserwowane zjawisko miało tendencję do rozprzestrzeniania się na inne komórki rośliny Zjawisko to nazwano kosupresją - zahamowanie ekspresji dotyczyło zarówno normalny gen kodujący purpurową barwę, jak również jego wprowadzonych dodatkowych kopii

18 W 1998 r. Fire i wsp. scharakteryzowali na poziomie molekularnym potranskrypcyjny mechanizm regulujący poziom mrna w komórkach nicienia C. elegans Opisano zjawisko zostało nazwane interferencją RNA (RNA interference RNAi) polegało ono na wyciszaniu ekspresji docelowego genu przez krótkie dwuniciowe RNA którego jedna nić była komplementarna do mrna konkretnego genu Potranskrypcyjne wyciszanie zachodziło na zasadzie degradacji mrna określonego genu

19 Wyciszanie ekspresji genu poprzez degradację mrna w przypadku degradacji mrna w komórce obserwuje się obecność specyficznych pośredników interferencji - są to małe (długości pz) dwuniciowe RNA (dsrna) tzw. interferujące RNA (sirna, small interfering RNA) Jedna z nici sirna jest komplementarna do transkryptu wyciszanego genu Skąd się biorą w komórce cząsteczki sirna? Powstają w wyniku trawienia większych cząsteczek dsrna, które zazwyczaj są dla komórki sygnałem nienormalności, dsrna może pojawić się w komórce np. w wyniku infekcji wirusem RNA czy nadmierną ilością kopii genu Uważa się, że mechanizm sirna powstał w komórkach najprawdopodobniej jako system obrony przed dwuniciowymi wirusami RNA (dsrna)

20 Jak działa RNAi na poziomie molekularnym? dsrna jest dla komórki czymś niezwykłym i sygnałem nienormalności. Obecna w komórkach rybonukleaza Dicer, rozpoznaje dsrna i tnie go małe fragmenty pz sirna. Następnie powstaje tzw. kompleks wyciszającego zwany RISC (RNAinduced silencing complex), który ulega aktywacji wtedy kiedy sirna rozdzieli się na pojedyncze nici, Aktywny kompleks RISC wiąże się do mrna za pomocą antysensownego RNA. Obecna w kompleksie RISC rybonukleaza Slicer, trawi związane mrna powodując wyciszenie ekspresji genu.

21 Zjawisko RNAi jest powszechne u komórkach Eukariota (oprócz drożdży), występuje u pierwotniaków, jamochłonów, muszki owocowej, ryb, płazów, grzybów, myszy, człowieka, u różnych gatunków roślin niższych i wyższych Zjawisko RNAi jest niezwykle specyficzne: dostarczenie do cytoplazmy komórki dwuniciowych cząsteczek dsrna odpowiadających np. eksonom konkretnego genu powinno wywołać skuteczne obniżenie poziomu mrna tego genu (poprzez degradację jego transkryptu) Zjawisko RNAi można zastosować: 1. W badaniach podstawowych: do precyzyjnego i ukierunkowanego blokowania ekspresji genów 2. W praktyce: np. w terapii genowej (m.in. nowotworów wstrzykiwanie sirna komplementarnego do znanych protoonkogenów)

22 Otrzymywanie sirna do ukierunkowanego wyciszania genów 1. Iv vivo W wektorze umieszcza się odpowiednio spreparowane DNA, w którym do nici sensownego RNA danego genu wprowadza się krótkie odcinki antysensowne, W wyniku ekspresji w komórkach docelowych nić sensowna i antysensowna będą mogły utworzyć odcinki dwuniciowego RNA, dsrna po przekształceniu w sirna prowadzi do zahamowanie ekspresji konkretnego genu.

23 2. Otrzymywania sirna do ukierunkowanego wyciszania genów in vitro przez transkrypcję in vitro małych RNA (sirna) transkrypcja in vitro długich RNA, które będą wprowadzane do komórki i przekształcane w sirna przez rybonukleazę typu Dicer Na drodze syntezy chemicznej sirna

24 Potranskrypcyjne wyciszanie jest powszechnym mechanizmem regulacji ekspresji genów w komórkach eukariotycznych a) degradacji mrna b) blokowania translacji mrna W przypadku mechanizmu interferencji z translacją mrna, mediatorami są cząsteczki tzw. mikro-rna (mirna), zakodowane w genomie jak normalne geny Geny kodujące są transkrybowane przez polimerazę RNA II powstają długie cząsteczki mirna, które tworzą struktury typu szpilki do włosów, podlegające obróbce podobnej do sirna mirna wchodzą w skład kompleksów rybonukleoproteinowych specyficznie blokujących translację mrna W odróżnieniu od sirna, sekwencja mirna nie musi być w 100% identyczne do sekwencji docelowego mrna Ocenia się, że mirna biorą udział w regulacji 30% ludzkich genów