(62) Numer zgłoszenia, z którego nastąpiło wydzielenie: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/EP03/009145

Transkrypt

1 PL B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (62) Numer zgłoszenia, z którego nastąpiło wydzielenie: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/EP03/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO04/ (13) B1 (51) Int.Cl. C12N 9/20 ( ) C12N 15/52 ( ) C07H 21/04 ( ) A23L 1/00 ( ) Opis patentowy przedrukowano ze względu na zauwaźone błędy (54) Wyizolowane polinukleotydy, wektor, wyizolowane enzymy lipolityczne, sposób wytwarzania enzymów lipolitycznych, rekombinowane komórki gospodarza, sposób wytwarzania ciasta, sposób wytwarzania wyrobu piekarniczego oraz zastosowanie enzymu lipolitycznego (30) Pierwszeństwo: (43) Zgłoszenie ogłoszono: , EP, , EP, , EP, , EP, , EP, , EP, , EP, , EP, , EP, , EP, , EP, , EP, BUP 20/00 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 09/13 (73) Uprawniony z patentu: DSM IP Assets B. V., Heerlen, NL (72) Twórca(y) wynalazku: RICHARD ALBANG, Martinsried, DE ULRIKE FOLKERS, München, DE ANDREAS FRITZ, Martinsried, DE BEATRIX GERHARD, Unterhaching, DE OLIVER HEINRICH, Martinsried, DE HILMAR ILGENFRITZ, Martinsried, DE LEX DE BOER, Wateringen, NL DIETER MAIER, Martinsried, DE CHRISTIAN WAGNER, Martinsried, DE FABIO SPREAFICO, Martinsried, DE ROELF BERNHARD MEIMA, Kamerik, NL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Marta Kawczyńska

2 2 PL B1 Opis wynalazku Niniejszy wynalazek dotyczy wyizolowanych polinukleotydów, wektora, wyizolowanych enzymów lipolitycznych oraz sposobu wytwarzania takich enzymów lipolitycznych, rekombinowanych komórek gospodarza, sposobu wytwarzania ciasta, sposobu wytwarzania wyrobu piekarniczego oraz zastosowania enzymu lipolitycznego do wytwarzania ciasta i/lub wyrobu piekarniczego. Dziedzina wynalazku Wynalazek dotyczy nowo zidentyfikowanych sekwencji polinukleotydowych zawierających gen, który koduje nowy enzym lipolityczny z Aspergillus niger. Wynalazek opisuje pełnej długości sekwencję nukleotydową nowego genu, sekwencję cdna zawierającą pełnej długości sekwencję kodującą nowy enzym lipolityczny, jak również pełnej długości sekwencję aminokwasową funkcjonalnego białka i jego funkcjonalnych odpowiedników. Zgodnie z wynalazkiem opisano także sposoby zastosowania tych enzymów w procesach przemysłowych i sposoby diagnozowania zakażeń grzybami. Zgodnie z wynalazkiem opisano również komórki transformowane polinukleotydem według wynalazku i komórki, w których enzym lipolityczny według wynalazku jest genetycznie zmodyfikowany w celu zwiększenia jego aktywności i/lub poziomu ekspresji. Tło wynalazku Wyroby piekarnicze, takie jak pieczywo, są przygotowywane z ciasta, które jest zazwyczaj sporządzone z podstawowych składników mąki (pszennej), wody i opcjonalnie soli. W zależności od rodzaju wyrobów piekarniczych innymi dodanymi składnikami mogą być cukry, aromaty i tym podobne. W wyrobach na zaczynie używane są w pierwszym rzędzie drożdże piekarnicze przed chemicznymi systemami spulchniającymi, takimi jak kombinacja kwasu (składnika uwalniającego) i wodorowęglanu. W celu udoskonalenia cech użytkowych i/lub ostatecznych właściwości wyrobów piekarniczych ciągle dąży się do opracowania substancji pomagających w przetwarzaniu o udoskonalonych właściwościach. Substancje pomagające w przetwarzaniu są tutaj zdefiniowane jako składniki, które poprawiają właściwości użytkowe ciasta i/lub ostateczne właściwości wyrobów piekarniczych. Właściwości ciasta, które mogą być ulepszone obejmują podatność na przetwarzanie automatyczne, poje m- ność zatrzymującą gaz, zmniejszoną lepkość, elastyczność, rozciągliwość, podatność na zarabianie i tym podobne. Właściwości wyrobów piekarniczych, które mogą być ulepszone obejmują o b- jętość bochenka, chrupkość skórki, strukturę i delikatność miąższu, względną czerstwość, sm a- kowitość i okres przechowywania. Te substancje ulepszające przetwarzanie ciasta i/lub wyrobów piekarniczych mogą być podzielone na dwie grupy: chemiczne dodatki i enzymy (także określane jako enzymy piekarnicze). Drożdże, enzymy i dodatki chemiczne są zazwyczaj dodawane do ciasta osobno. Drożdże mogą być dodane jako płynna zawiesina, w formie zagęszczonej lub jako drożdże suche aktywne (ADY, ang. active dry yeast) lub błyskawiczne (IDY, ang. instant dry yeast). Różnica pomiędzy tymi preparatami drożdży polega na zawartości wody i suchej masy drożdży. Płynne drożdże posiadają zawartość suchej masy mniej niż 25% (wag./obj.). Krem drożdżowy jest szczególną formą płynnych drożdży i posiada zawartość suchej masy pomiędzy 17 a 23% (wag./obj.). Drożdże zagęszczone posiadają zawartość suchej masy drożdży pomiędzy 25-35% (wag./obj.), podczas gdy preparaty suchych drożdży posiadają zawartość suchej masy drożdży pomiędzy 92-98% (wag./obj.). Enzymy mogą być dodane w postaci suchej np. zgranulowanej lub w postaci płynnej. Dodatki chemiczne są w większości przypadków dodawane w postaci sproszkowanej. Kompozycje substancji pomagających w przetwarzaniu, które są przystosowane do specyficznych zastosowań piekarniczych mogą się składać z zalecanej mieszaniny dodatków chemicznych i enzymu. Wytwarzanie ciasta ze składników i substancji pomagających w przetwarzaniu opisanych powyżej jest dobrze znane w tej dziedzinie i obejmuje mieszanie tych składników i substancji pomagających w przetwarzaniu oraz jeden lub więcej etapów zarabiania i fermentacji. Wytwarzanie wyrobów piekarniczych z takich ciast jest także dobrze znane w tej dziedzinie i może obejmować zarabianie i formowanie oraz późniejszą fermentację ciasta, po której następuje pieczenie w żądanych temperaturach i czasach pieczenia. Dodatki chemiczne o polepszających właściwościach obejmują środki utleniające, takie jak kwas askorbinowy, bromian i azodiwęglan, środki redukujące, takie jak L-cysteina i glutation, emulgatory działające jako środki polepszające właściwości ciasta, takie jak diacetylowe estry kwasu winowego mono/diglicerydów (DATEM, ang. diacetyl tartaric esters of mono/diglicerides), stearoilomleczan

3 PL B1 3 sodu (SSL, ang. sodium stearoyl lactylate) lub stearoilomleczan wapnia (CSL, ang. calcium stearyl lactylate), lub działające jako zmiękczacze miąższu, takie jak monostearynian glicerolu (GMS, ang. glycerol monostearate) i tym podobne, tłuszcze, takie jak triglicerydy (tłuszcz) lub lecytyna i inne. W wyniku oczekiwań klientów co do zastąpienia dodatków chemicznych przez bardziej naturalne produkty, opracowano szereg enzymów piekarniczych o właściwościach poprawiających ciasto i/lub wyrób piekarniczy, które są używane we wszystkich możliwych kombinacjach w zależności od specyficznych warunków zastosowania piekarniczego. Odpowiednie enzymy obejmują enzymy rozkładające skrobię, enzymy rozkładające arabinoksylan i inne hemicelulozy, enzymy rozkładające celulozę, enzymy utleniające, enzymy rozkładające materiał tłuszczowy, enzymy modyfikujące lub tworzące wiązania krzyżowe. Enzymy degradujące skrobię są na przykład enzymami działającymi wewnątrz cząsteczki, takimi jak alfa-amylaza, amylaza tworząca maltozę, pullulanaza lub inne enzymy usuwające rozgałęzienia i enzymami działającymi na koniec cząsteczki, które odcinają glukozę (amyloglukozydaza), maltozę (beta-amylaza), maltotriozę, maltotetriozę i dłuższe oligosacharydy. Enzymy rozkładające arabinoksylan i inne hemicelulozy są na przykład ksylanazami, pentazami, hemicelulazą, arabinofuranozydazą, glukanazą i innymi. Enzymy rozkładające celulozę są na przykład celulazą, celobiohydrolazą i beta-glukozydazą. Enzymy utleniające są na przykład oksydazą glukozy, oksydazą heksozy, oksydazą piranozy, oksydazą grupy tiolowej, lipooksygenazą, oksydazą p-difenylową, oksydazą polifenolu i innymi. Enzymy rozkładające materiał tłuszczowy są na przykład enzymami lipolitycznymi, takimi jak lipazy triacyloglicerolu, fosfolipazy (takie jak A 1, A 2, B, C i D) i galaktolipazy. Enzymy rozkładające białka, modyfikujące lub tworzące wiązania krzyżowe są na przykład proteazami działającymi wewnątrz cząsteczki (proteazy serynowe, metaloproteazy, proteazy asparaginianowe, proteazy tiolowe), peptydazami działającymi na końce cząsteczki, które odcinają jeden aminokwas lub dipeptyd, tripeptyd i typ podobne z N-terminalnych (aminopeptydazy) lub C-terminalnych (karboksypeptydazy) końców łańcucha polipeptydowego, enzymami usuwającymi grupę aminową z asparaginy lub glutaminy, takimi jak deaminaza i peptydoglutaminaza lub enzymami tworzącymi wiązania krzyżowe, takimi jak transglutaminaza. Enzymy piekarnicze mogą w dogodny sposób być produkowane w mikroorganizmach. Enzymy piekarnicze pochodzenia mikrobiologicznego są dostępne z różnych źródeł; Bacillus spec. są powszechnym źródłem enzymów bakteryjnych, podczas gdy enzymy grzybowe są powszechnie wytwarzane w Aspergillus spec. Enzymy piekarnicze mogą być użyte w wielorakich produktach piekarniczych. Określenie produkty piekarnicze jest tutaj zdefiniowane jako produkty obejmujące pieczywo, takie jak chleb paczkowany, bochenki chleba, chleb francuski, jak również produkty, takie jak bułeczki, ciastka, placki, mufinki, ciasto drożdżowe oraz pączki i tym podobne. W powyższych procesach, zalecane jest zastosowanie enzymów piekarniczych, które są uzyskane technikami rekombinacji DNA. Takie rekombinowane enzymy posiadają szereg dogodnych cech w porównaniu ze składnikami oczyszczanymi w sposób tradycyjny. Enzymy rekombinowane mogą być wytwarzane po niskich kosztach, z dużą wydajnością, mogą być wolne od zanieczyszczających czynników, takich jak bakterie lub wirusy, ale również wolne od toksyn bakteryjnych lub zanieczyszczających innych aktywności enzymatycznych. Cele wynalazku Celem wynalazku jest dostarczenie nowych polinukleotydów kodujących nowe enzymy lipolityczne o udoskonalonych właściwościach. Dalszym celem jest dostarczenie enzymów lipolitycznych wytwarzanych w sposób naturalny lub rekombinowany, jak również rekombinowanych szczepów je wytwarzających. Celem wynalazku są także polipeptydy fuzyjne, jak również sposoby wytwarzania i zastosowania polinukleotydów i polipeptydów według wynalazku. Celem wynalazku jest także dostarczenie nowych enzymów lipolitycznych, które rozwiązują przynajmniej jeden powyżej wspomnianych problemów lub dostarczenie nowych enzymów lipolitycznych, które, jeśli są zastosowane w cieście i/lub wyrobach piekarniczych, mają jedną lub więcej ulepszonych właściwości wybranych z grupy składającej się ze zwiększonej wytrzymałości ciasta, zwiększonej elastyczności ciasta, zwiększonej stabilności ciasta, zmniejszonej lepkości ciasta, ulepszonej rozciągliwości ciasta, ulepszonej podatności na przetwarzanie automatyczne, zwiększonej objętości wyrobu piekarniczego, ulepszonej struktury miąższu wyrobu piekarniczego, ulepszonego aromatu wyrobu piekarniczego, ulepszonych właściwości opóźniających czerstwienie wyrobu piekarniczego,

4 4 PL B1 ulepszonego koloru wyrobu piekarniczego, ulepszonej skórki wyrobu piekarniczego lub które mają szeroką specyficzność substratową. Streszczenie wynalazku Przedmiotem wynalazku jest wyizolowany polinukleotyd kodujący polipeptyd, który zawiera sekwencję aminokwasową o Nr Id. Sekw.: 12 i który ma aktywność lipolityczną, charakteryzujący się tym, że polinukleotyd ten zdolny jest do hybrydyzacji w bardzo ostrych warunkach do polinukleotydu o sekwencji wybranej z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 10 i 11. Korzystnie polinukleotyd według wynalazku można uzyskać z grzybów nitkowatych. Korzystniej można go uzyskać z Aspergillus niger. Przedmiotem wynalazku jest także wyizolowany polinukleotyd, charakteryzujący się tym, że zawiera sekwencję nukleotydową o sekwencji wybranej z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 10 i 11. Przedmiotem wynalazku jest też wyizolowany polinukleotyd, charakteryzujący się tym, że składa się z sekwencji wybranej z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 10 i 11. Przedmiotem wynalazku jest ponadto wektor, charakteryzujący się tym, że zawiera jedną z sekwencji polinukleotydowych określonych powyżej. Korzystnie w wektorze według wynalazku taka sekwencja polinukleotydowa określona powyżej jest funkcjonalnie połączona z sekwencjami regulatorowymi odpowiednimi do ekspresji tej sekwencji polinukleotydowej w odpowiedniej komórce gospodarza. Korzystniej odpowiednią komórkę gospodarza stanowi grzyb nitkowaty. Przedmiotem wynalazku jest również wyizolowany enzym lipolityczny, charakteryzujący się tym, że składa się z sekwencji aminokwasowej pokazanej w NR ID. SEKW.: 12. Korzystnie wyizolowany enzym lipolityczny według wynalazku można uzyskać z Aspergillus niger. Przedmiotem wynalazku jest także wyizolowany enzym lipolityczny, charakteryzujący się tym, że można go uzyskać przez ekspresję jednego z polinukleotydów określonych powyżej albo wektora określonego powyżej w odpowiedniej komórce gospodarza, korzystnie Aspergillus niger. Przedmiotem wynalazku jest też sposób wytwarzania enzymu lipolitycznego, który można uzyskać przez ekspresję jednego z polinukleotydów określonych powyżej albo wektora określonego powyżej w odpowiedniej komórce gospodarza, korzystnie Aspergillus Niger, który to sposób polega na tym, że obejmuje etapy, w których transformuje się odpowiednią komórkę gospodarza wyizolowanym polinukleotydem określonym powyżej albo wektorem określonym powyżej, hoduje się tę komórkę w warunkach pozwalających na ekspresję tego polinukleotydu i opcjonalnie oczyszcza się kodowany polipeptyd z tej komórki lub pożywki hodowlanej. Przedmiotem wynalazku jest ponadto rekombinowana komórka gospodarza, charakteryzująca się tym, że zawiera polinukleotyd określony powyżej albo wektor określony powyżej. Przedmiotem wynalazku jest też rekombinowana komórka gospodarza, charakteryzująca się tym, że wykazuje ekspresję enzymu lipolitycznego, który można uzyskać przez ekspresję jednego z polinukleotydów określonych powyżej albo wektora określonego powyżej w odpowiedniej komórce gospodarza, korzystnie Aspergillus Niger. Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób wytwarzania ciasta, polegający na tym, że obejmuje on etap, w którym dodaje się enzym lipolityczny, który można uzyskać przez ekspresję jednego z polinukleotydów określonych powyżej albo wektora określonego powyżej w odpowiedniej komórce gospodarza, korzystnie Aspergillus Niger. Przedmiotem wynalazku jest też sposób wytwarzania wyrobu piekarniczego, polegający na tym, że stosuje się w nim ciasto wytworzone sposobem wytwarzania ciasta określonym powyżej. Przedmiotem wynalazku jest też zastosowanie enzymu lipolitycznego, który można uzyskać przez ekspresję jednego z polinukleotydów określonych powyżej albo wektora określonego powyżej w odpowiedniej komórce gospodarza, korzystnie Aspergillus Niger, do wytwarzania z niego ciasta i/lub wyrobu piekarniczego. Wynalazek dostarcza nowych polinukleotydów kodujących nowe enzymy lipolityczne. Bardziej szczegółowo, wynalazek dostarcza polinukleotydów posiadających sekwencję nukleotydową, która hybrydyzuje, korzystnie w bardzo ostrych warunkach, do sekwencji wybranej z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 10 i 11. Opisano także sekwencje polipeptydów które mogą hybrydyzować, zwłaszcza w bardzo ostrych warunkach, z sekwencją wybraną z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 i 38. W związku z tym zgodnie z wynalazkiem opisano też kwasy nukleinowe, które są w ponad 40%, tak jak około w 60%, zwłaszcza w 65%, w szczególności w 70%, a nawet jeszcze dogodniej w 75%, 80%, 85%, 90%, 95%,

5 PL B1 5 96%, 97%, 98% lub 99% homologiczne do sekwencji wybranych z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 10 i 11. Opisano też kwasy nukleinowe, które są bardziej niż w 40%, tak jak około w 60%, zwałszacza w 65%, w sczególności w 70%, zwłaszcza w 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% lub 99% homologiczne do sekwencji wybranych z grupy składającej się z NR ID. SEKW. : 1, 2, 4, 5, 7, 8, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 i 38. W bardziej korzystnym wykonaniu wynalazek dostarcza takiego wyizolowanego polinukleotydu możliwego do uzyskania z grzybów nitkowatych, w szczególności korzystny jest Aspergillus niger. W jednym z wykonań, wynalazek dostarcza wyizolowanego polinukleotydu zawierającego sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej NR ID. SEKW.: 12. Opisano też wyizolowany polinukleotyd zawierający sekwencję kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wybranej z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 3, 6, 9, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 i 39 lub ich funkcjonalnych odpowiedników. Opisano tu także wyizolowany polinukleotyd kodujący przynajmniej jedną funkcjonalną domenę polipeptydu o sekwencj NR ID. SEKW.: 12 lub jej funkcjonalnych odpowiedników. Opisano również polinukleotyd kodujący przynajmniej jedną funkcjonalną domenę polipeptydu wybranego z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 3, 6, 9, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 i 39 lub ich funkcjonalnych odpowiedników. W zalecanym wykonaniu wynalazek dostarcza genu enzymu lipolitycznego o sekwencji NR ID. SEKW.: 10. Opisano też geny enzymu lipolitycznego o sekwencji wybranej spośród NR ID. SEKW.: 1, 4, 7, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34 i 37. W innym aspekcie wynalazek dostarcza polinukleotydu, w szczególności cdna, kodującego enzym lipolityczny z Aspergillus Niger o sekwencji aminokwasowej NR ID. SEKW.: 12 lub jej funkcjonalnych odpowiedników. Opisano też polinukleotyd, w szczególności cdna, kodujący enzym lipolityczny o sekwencji aminokwasowej wybranej z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 3, 6, 9, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 i 39 lub wariantów lub fragmentów tego peptydu. W zalecanym wykonaniu cdna posiada sekwencję NR ID. SEKW.: 11 lub jej funkcjonalnych odpowiedników. Opisano też cdna posiadające sekwencje wybrane z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 2, 5, 8, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35 i 38 lub ich funkcjonalnych odpowiedników. W nawet bardziej zalecanym wykonaniu polinukleotydy zawierający sekwencję kodującą polinukleotydów według wynalazku zawiera w szczególności sekwencję polinukleotydową NR ID. SEKW.: 11. Opisano też polinukleotydy zawierające sekwencję kodującą polinukleotydów w szczególności sekwencję polinukleotydową wybraną z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 2, 5, 8, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35 i 38. Wynalazek dotyczy także wektorów zawierających sekwencję polinukleotydową według wynalazku oraz starterów, sond i fragmentów, które mogą być użyte do namnożenia lub wykrycia DNA według wynalazku. W dalszym korzystnym wykonaniu dostarczony jest wektor, w którym sekwencja polinukleotydowa według wynalazku jest funkcjonalnie połączona z sekwencjami regulatorowymi odpowiednimi do ekspresji kodowanej sekwencji aminokwasowej w odpowiedniej komórce gospodarza, takiej jak Aspergillus niger lub Aspergillus oryzae. Opisano tu również sposoby wytwarzania polinukleotydów i wektorów według wynalazku. Wynalazek także dotyczy komórek gospodarza uzyskanych technikami rekombinacji DNA, które zawierają heterologiczne lub homologiczne polinukleotydy według wynalazku. W innym wykonaniu wynalazek dostarcza rekombinowanych komórek gospodarza, w których ekspresja enzymu lipolitycznego według wynalazku jest znacząco zwiększona lub w których aktywność enzymu lipolitycznego jest zwiększona. W innym wykonaniu wynalazek dostarcza komórek gospodarza uzyskanych technikami rekombinacji, które zawierają heterologiczny lub homologiczny polinukleotyd według wynalazku, które są w stanie wytwarzać funkcjonalny enzym lipolityczny według wynalazku, zwłaszcza komórek z nadekspresją enzymu lipolitycznego według wynalazku, na przykład szczepu Aspergillus zawierającego zwiększoną liczbę kopii genu lub cdna według wynalazku. W jeszcze innym aspekcie wynalazku dostarczony jest oczyszczony polipeptyd. Polipeptydy według wynalazku obejmują polipeptydy kodowane przez polinukleotydy według wynalazku. Szczególnie korzystny jest polipeptyd o sekwencji NR ID. SEKW.: 12. Opisano też polipeptyd o sekwencji wybranej z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 3, 6, 9, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 i 39 lub ich funkcjonalnych odpowiedników.

6 6 PL B1 Odpowiednio w jednym z aspektów niniejszego wynalazku opisano kompozycję enzymu lipolitycznego zawierającą jako składnik aktywny enzym o sekwencji NR ID. SEKW.: 12. Opisano też enzymy o sekwencjach wybranych z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 3, 6, 9, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 i 39 lub ich funkcjonalnych odpowiedników. W innym aspekcie wynalazek dostarcza sposobu wytwarzania wyrobów piekarniczych, w których do ciasta stosowanego do wyrobu wyrobów piekarniczych włączony jest (dodawany jest) jeden enzym według wynalazku lub ewentualnie większa liczba enzymów wybranych z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 i 39 lub ich funkcjonalnych odpowiedników. Opisano tu także białka fuzyjne zawierające polipeptyd według wynalazku oraz sposoby otrzymywania polipeptydów według wynalazku. Opisano tu także zastosowania enzymu lipolitycznego według wynalazku w dowolnym procesie przemysłowym jaki tutaj opisano. Szczegółowy opis wynalazku Enzym lipolityczny jest tutaj zdefiniowany jako enzym wykazujący przynajmniej jedną, a zwłaszcza dwie lub trzy lub cztery lub więcej z następujących aktywności: lipaza triacyloglicerolu, fosfolipaza A 1 fosfolipaza A 2, fosfolipaza B, fosfolipaza C, fosfolipaza D, lizofosfolipaza i galaktolipaza. Polinukleotydy Niniejszy wynalazek dostarcza polinukleotydów kodujących enzymy lipolityczne posiadające sekwencję aminokwasową o NR ID. SEKW.: 12. Sekwencja genu kodującego ten enzym lipolityczny NBE031 została ustalona przez sekwencjonowanie klonów genomowych otrzymanych z Aspergillus niger. Opisano też polinukleotydy kodujące enzymy lipolityczne posiadające sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 3, 6, 9, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 i 39 lub ich funkcjonalnych odpowiedników. Sekwencje tych genów kodujących poszczególne enzymy lipolityczne odpowiednio NBE028, NBE029, NBE030, NBE032, NBE033, NBE034, NBE036, NBE038, NBE039, NBE043, NBE045 i NBE042 zostały ustalone przez sekwencjonowanie klonów genomowych otrzymanych z Aspergillus niger. Zgodnie z wynalazkiem opisano też sekwencje polinukleotydowe zawierające geny kodujące enzymy lipolityczne NBE028, NBE029, NBE030, NBE031, NBE032, NBE033, NBE034, NBE036, NBE038, NBE039, NBE043, NBE045 i NBE042, jak również ich kompletne sekwencje cdna i ich sekwencje kodujące (Tabela 1). Ponadto, zgodnie z wynalazkiem opisano wyizolowane polinukleotydy zawierające sekwencje nukleotydowe wybrane z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 i 38 lub ich funkcjonalnych odpowiedników. T a b e l a 1 Enzym lipolityczny Sekwencja (NR ID. SEKW.) NBExxx genomowa cdna aminokwasowa NBE NBE NBE NBE NBE NBE NBE NBE NBE NBE NBE NBE NBE

7 PL B1 7 Bardziej szczegółowo, wynalazek dotyczy wyizolowanych polinukleotydów, mogących hybrydyzować w bardzo ostrych warunkach do polinukleotydu wybranego z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 10 i 11. Opisano też wyizolowane polinukleotydy, mogące hybrydyzować w ostrych warunkach, zwłaszcza w bardzo ostrych warunkach, do polinukleotydu wybranego z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 i 38. Takie polinukleotydy mogą być otrzymane z grzybów nitkowatych, w szczególności z Aspergillus niger. Bardziej szczegółowo wynalazek dotyczy wyizolowanych polinukleotydów posiadających sekwencję nukleotydową wybraną z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 10 i 11. Opisano też wyizolowane polinukleotydy posiadające sekwencję nukleotydową wybraną z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 1 2, 4, 5, 7, 8, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 i 38. Opisano tu także wyizolowany polinukleotyd kodujący przynajmniej jedną funkcjonalną domenę polipeptydu mającego sekwencję aminokwasową NR ID. SEKW.: 12 lub jej funkcjonalnych odpowiedników. Opisano też wyizolowany polinukleotyd kodujący przynajmniej jedną funkcjonalną domenę polipeptydu mającego sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 3, 6, 9, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 i 39 lub ich funkcjonalnych odpowiedników. Stosowane tutaj określenia gen i gen rekombinowany odnoszą się do cząsteczek kwasu nukleinowego, które mogą być wyizolowane z chromosomowego DNA, który zawiera otwartą ramkę odczytu kodującą białko, np. enzym lipolityczny z Aspergillus niger. Gen może zawierać sekwencje kodujące, sekwencje niekodujące, introny i sekwencje regulatorowe. Ponadto, gen odnosi się do wyizolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego, jak to zdefiniowano tutaj. Cząsteczka kwasu nukleinowego według niniejszego wynalazku, taka jak cząsteczka kwasu nukleinowego posiadająca sekwencję nukleotydową wybraną z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 10 i 11, a ewentualnie 1, 2, 4, 5, 7, 8, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 i 38, lub ich funkcjonalnych odpowiedników, może być wyizolowana przy użyciu standardowych technik biologii molekularnej i informacji o sekwencji dostarczonej tutaj. Na przykład, przy użyciu całej lub fragmentu sekwencji kwasu nukleinowego wybranej z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 10 i 11, a ewentualnie 1, 2, 4, 5, 7, 8, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 i 38 jako sondy do hybrydyzacji, cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku, lub ewentualnie innych opisanych tu kwasów nukleinowych, mogą być wyizolowane przy użyciu standardowych technik hybrydyzacji i klonowania (np. jak opisano w Sambrook, J., Fritsh, E. F., i Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. drugie wyd., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Ponadto cząsteczka kwasu nukleinowego obejmująca całą lub fragment sekwencji kwasu nukleinowego wybranej z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 10 i 11, a ewentualnie 1, 2, 4, 5, 7, 8, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 i 38 może być wyizolowana w łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) przy użyciu syntetycznych starterów oligonukleotydowych zaprojektowanych w oparciu o informację o sekwencji zawartą w sekwencji kwasu nukleinowego wybranej z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 10 i 11, a ewentualnie 1, 2, 4, 5, 7, 8, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 i 38. Kwas nukleinowy według wynalazku może być namnożony przy użyciu cdna, mrna lub alternatywnie, DNA genomowego, jako matrycy oraz odpowiednich starterów oligonukleotydowych według standardowych technik namnażania z użyciem PCR. Tak namnożony kwas nukleinowy może być klonowany do odpowiedniego wektora i scharakteryzowany przez analizę sekwencji DNA. Ponadto, oligonukleotydy odpowiadające lub hybrydyzujące do sekwencji nukleotydowej według wynalazku mogą być otrzymane przez standardowe techniki syntezy, np. przy użyciu automatycznego urządzenia do syntezy DNA. Opisano tu wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową pokazaną w NR ID. SEKW.:2. Sekwencja NR ID. SEKW.:2 odpowiada regionowi kodującemu genu z Aspergillus niger dostarczonemu w NR ID. SEKW.:1. Ten cdna obejmuje sekwencję kodującą polipeptyd NBE028 z Aspergillus niger, jak pokazano w NR ID. SEKW.:3. Opisano tu wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową pokazaną w NR ID. SEKW.:5. Sekwencja NR ID. SEKW.: 5 odpowiada regionowi kodującemu genu z Aspergillus niger dostarczonemu w NR ID. SEKW.:4. Ten cdna obejmuje sekwencję kodującą polipeptydu NBE029 z Aspergillus niger, jak pokazano w NR ID. SEKW.:6. Opisano tu wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową pokazaną w NR ID. SEKW.:8. Sekwencja NR ID. SEKW.:8 odpowiada regionowi kodującemu genu

8 8 PL B1 z Aspergillus niger dostarczonemu w NR ID. SEKW.:7. Ten cdna obejmuje sekwencję kodującą polipeptydu NBE030 z Aspergillus niger, jak pokazano w NR ID. SEKW.:9. W korzystnym wykonaniu wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku zawiera sekwencję nukleotydową pokazaną w NR ID. SEKW.:11. Sekwencja NR ID. SEKW.:11 odpowiada regionowi kodującemu genu z Aspergillus niger dostarczonemu w NR ID. SEKW.:10. Ten cdna obejmuje sekwencję kodującą polipeptydu NBE031 z Aspergillus niger, jak pokazano w NR ID. SEKW.:12. Opisano tu wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową pokazaną w NR ID. SEKW.:14. Sekwencja NR ID. SEKW.:14 odpowiada regionowi kodującemu genu z Aspergillus niger dostarczonemu w NR ID. SEKW.:13. Ten cdna obejmuje sekwencję kodującą polipeptydu NBE032 z Aspergillus niger, jak pokazano w NR ID. SEKW.:15. Opisano tu wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową pokazaną w NR ID. SEKW.:17. Sekwencja NR ID. SEKW.:17 odpowiada regionowi kodującemu genu z Aspergillus niger dostarczonemu w NR ID. SEKW.:16. Ten cdna obejmuje sekwencję kodującą polipeptydu NBE033 z Aspergillus niger, jak pokazano w NR ID. SEKW.:18. Opisano tu wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową pokazaną w NR ID. SEKW.:20. Sekwencja NR ID. SEKW.:20 odpowiada regionowi kodującemu genu z Aspergillus niger dostarczonemu w NR ID. SEKW.:19. Ten cdna obejmuje sekwencję kodującą polipeptydu NBE034 z Aspergillus niger, jak pokazano w NR ID. SEKW.:21. Opisano tu wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową pokazaną w NR ID. SEKW.:23. Sekwencja NR ID. SEKW.:23 odpowiada regionowi kodującemu genu z Aspergillus niger dostarczonemu w NR ID. SEKW.:22. Ten cdna obejmuje sekwencję kodującą polipeptydu NBE034 z Aspergillus niger, jak pokazano w NR ID. SEKW.:24. Opisano tu wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową pokazaną w NR ID. SEKW.:26. Sekwencja NR ID. SEKW.:26 odpowiada regionowi kodującemu genu z Aspergillus niger dostarczonemu w NR ID. SEKW.:25. Ten cdna obejmuje sekwencję kodującą polipeptydu NBE034 z Aspergillus niger, jak pokazano w NR ID. SEKW.:27. Opisano tu wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową pokazaną w NR ID. SEKW.:29. Sekwencja NR ID. SEKW.:29 odpowiada regionowi kodującemu genu z Aspergillus niger dostarczonemu w NR ID. SEKW.:28. Ten cdna obejmuje sekwencję kodującą polipeptydu NBE034 z Aspergillus niger, jak pokazano w NR ID. SEKW.:30. Opisano tu wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową pokazaną w NR ID. SEKW.:32. Sekwencja NR ID. SEKW.:32 odpowiada regionowi kodującemu genu z Aspergillus niger dostarczonemu w NR ID. SEKW.:31. Ten cdna obejmuje sekwencję kodującą polipeptydu NBE034 z Aspergillus niger, jak pokazano w NR ID. SEKW.:33. Opisano tu wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową pokazaną w NR ID. SEKW.:35. Sekwencja NR ID. SEKW.:35 odpowiada regionowi kodującemu genu z Aspergillus niger dostarczonemu w NR ID. SEKW.:34. Ten cdna obejmuje sekwencję kodującą polipeptydu NBE034 z Aspergillus niger, jak pokazano w NR ID. SEKW.:36. Opisano tu wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową pokazaną w NR ID. SEKW.:38. Sekwencja NR ID. SEKW.:38 odpowiada regionowi kodującemu genu z Aspergillus niger dostarczonemu w NR ID. SEKW.:37. Ten cdna obejmuje sekwencję kodującą polipeptydu NBE034 z Aspergillus niger, jak pokazano w NR ID. SEKW.:39. W innym wykonaniu, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera cząsteczkę kwasu nukleinowego, która jest sekwencją komplementarną sekwencji nukleotydowej wybranej z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 10 i 11 lub funkcjonalnych odpowiedników tych sekwencji nukleotydowych. Opisano też wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą cząsteczkę kwasu nukleinowego, która jest sekwencją komplementarną sekwencji nukleotydowej wybranej z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 i 38 lub funkcjonalnych odpowiedników tych sekwencji nukleotydowych. Cząsteczka kwasu nukleinowego, która jest komplementarna do innej sekwencji nukleotydowej, jest tą, która jest wystarczająco komplementarna do innej sekwencji nukleotydowej tak, że może ona hybrydyzować do innej sekwencji nukleotydowej formując w ten sposób stabilny dupleks. Jeden z aspektów wynalazku dotyczy wyizolowanych cząsteczek kwasu nukleinowego, które kodują polipeptyd według wynalazku lub jego funkcjonalny odpowiednik, taki jak biologicznie aktywny fragment lub domena, jak również cząsteczek kwasu nukleinowego wystarczających do zastosowania

9 PL B1 9 jako sondy hybrydyzacyjne do identyfikacji cząsteczek kwasu nukleinowego kodujących polipeptyd według wynalazku oraz fragmentów takich cząsteczek kwasu nukleinowego odpowiednich do zastosowania jako startery PCR do namnażania lub mutowania cząsteczek kwasu nukleinowego. Wyizolowanym polinukleotydem lub wyizolowanym kwasem nukleinowym jest DNA lub RNA, który nie przylega bezpośrednio do obu sekwencji kodujących, do których przylega bezpośrednio (jedna na końcu 5' i jedna na końcu 3') w naturalnie występującym genomie organizmu, z którego on pochodzi. Tak więc, w jednym z wykonań, wyizolowany kwas nukleinowy obejmuje część lub całe sekwencje niekodujące 5' (np. promotor), które bezpośrednio przylegają do sekwencji kodującej. Określenie zatem obejmuje, na przykład, rekombinowany DNA, który jest włączony do wektora, do ulegającego autonomicznej replikacji plazmidu lub wirusa lub do genomowego DNA prokariota lub eukariota, lub który istnieje jako oddzielna cząsteczka niezależnie od innych cząsteczek (np. cdna lub fragment genomowego DNA wytworzonego przez PCR lub traktowanie endonukleazą restrykcyjną). Obejmuje ono również rekombinowany DNA, który jest zasadniczo wolny od materiału komórkowego, materiału wirusowego lub pożywki hodowlanej (jeżeli jest wytworzony technikami rekombinowanego DNA) lub chemicznych prekursorów lub innych związków chemicznych (jeżeli jest syntetyzowany chemicznie). Ponadto wyizolowany fragment kwasu nukleinowego jest fragmentem kwasu nukleinowego, który nie występuje w sposób naturalny jako fragment i nie byłby znaleziony w warunkach naturalnych. Oczekuje się, że stosowane tutaj określenia polinukleotydy lub cząsteczka kwasu nukleinowego będą obejmować cząsteczki DNA (np. cdna lub genomowy DNA) i cząsteczki RNA (np. mr- NA) oraz analogi DNA lub RNA otrzymane przy użyciu analogów nukleotydów. Cząsteczka kwasu nukleinowego może być jednoniciowa lub dwuniciowa, ale dogodnie jest dwuniciowym DNA. Kwas nukleinowy może być zsyntetyzowany przy użyciu analogów oligonukleotydowych lub pochodnych (np. inozyny lub nukleotydów fosforosiarkowych). Takie oligonukleotydy mogą być zastosowane, na przykład, do przygotowania kwasów nukleinowych, które posiadają zmienione zdolności parowania zasad lub zwiększoną odporność na nukleazy. W innym wykonaniu opisano wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego, która jest antysensowna do cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku. Opisano także nici komplementarne cząsteczek kwasu nukleinowego opisanego tutaj. Błędy sekwencjonowania Dostarczona tutaj informacja o sekwencji nie powinna być interpretowana tak wąsko, żeby wymagane było włączenie błędnie zidentyfikowanych zasad. Specyficzne sekwencje ujawnione tutaj mogą być z łatwością użyte do wyizolowania kompletnego genu z grzyba nitkowatego, w szczególności z Aspergillus niger, który może być z kolei w łatwy sposób poddany dalszym analizom sekwencji identyfikującym w ten sposób błędy sekwencjonowania. Jeżeli nie wskazano inaczej wszystkie sekwencje ustalone tutaj przez sekwencjonowanie cząsteczki DNA były ustalone przy użyciu automatycznego urządzenia do sekwencjonowania DNA i wszystkie sekwencje aminokwasowe polipeptydów kodowanych przez cząsteczki DNA ustalone tutaj były przewidziane przez translację sekwencji DNA oznaczonych jak powyżej. Zatem, jak to jest znane w tej dziedzinie dla dowolnej sekwencji DNA oznaczonej przy podejściu zautomatyzowanym, dowolna sekwencja nukleotydową ustalona tutaj może zawierać pewne błędy. Sekwencje nukleotydowe ustalone w sposób automatyczny są typowo w przynajmniej 90% identyczne, bardziej typowo w przynajmniej 95% do 99,9% identyczne z faktyczną sekwencją nukleotydową cząsteczki DNA poddanej sekwencjonowaniu. Faktyczna sekwencja może być ustalona w sposób bardziej precyzyjny przez inne podejścia włączając w to sposoby ręcznego sekwencjonowania DNA znane w tej dziedzinie. Jak to jest również znane w tej dziedzinie, pojedyncza insercja lub delecja w oznaczonej sekwencji nukleotydowej w porównaniu z faktyczną sekwencją spowoduje zmianę ramki odczytu w translacji sekwencji nukleotydowej, tak że przewidziana sekwencja aminokwasowa kodowana przez oznaczoną sekwencję nukleotydową będzie całkowicie różna od sekwencji aminokwasowej faktycznie kodowanej przez sekwencjonowaną cząsteczkę DNA, poczynając od położenia takiej insercji lub delecji. Specjalista w tej dziedzinie jest zdolny do zidentyfikowania takich błędnie zidentyfikowanych zasad i wie, jak skorygować takie błędy. Fragmenty, sondy i startery kwasu nukleinowego Cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku może obejmować tylko część lub fragment sekwencji kwasu nukleinowego wybranej z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 10 i 11, na przykład

10 10 PL B1 fragment, który może być użyty jako sonda lub starter lub fragment kodujący część białka według wynalazku. Opisano też cząsteczkę kwasu nukleinowego obejmującą tylko część lub fragment sekwencji kwasu nukleinowego wybranej z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 i 38, na przykład fragment, który może być użyty jako sonda lub starter lub fragment kodujący część opisanego tu białka. Sekwencja nukleotydowa oznaczona z klonowania genu enzymu lipolitycznego oraz cdna pozwala na przygotowanie sond i starterów zaprojektowanych do zastosowania w identyfikacji i/lub klonowaniu innych członków rodziny enzymów lipolitycznych, jak również homologów enzymów lipolitycznych z innych gatunków. Sonda/starter typowo obejmuje zasadniczo oczyszczony oligonukleotyd, który typowo obejmuje region sekwencji nukleotydowej, który hybrydyzuje, zwłaszcza w ostrych warunkach, do przynajmniej około 12 lub 15, zwłaszcza około 18 lub 20, zwłaszcza około 22 lub 25, bardziej korzystnie około 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, lub 75 lub więcej nukleotydów z rzędu sekwencji nukleotydowej wybranej z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 10 i 11 lub ich funkcjonalnych odpowiedników, ewentualnie sekwencji nukleotydowej wybranej z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 i 38 lub ich funkcjonalnych odpowiedników. Sondy oparte na sekwencjach nukleotydowych dostarczonych tutaj mogą być zastosowane do wykrywania transkryptów lub sekwencji genomowych kodujących te same lub homologiczne białka, na przykład w innych organizmach. W zalecanych wykonaniach sonda ponadto zawiera dołączoną do niej grupę znacznika, np. grupa znacznika może być radioizotopem, związkiem fluorescencyjnym, enzymem lub kofaktorem enzymu. Takie sondy mogą być także zastosowane jako część zestawu do testu diagnostycznego do identyfikacji komórek, w których ulega ekspresji białko enzymu lipolitycznego. Identyczność i homologia Określenia homologia" lub procent identyczności są tutaj stosowane zamiennie. Na potrzeby tego wynalazku zdefiniowano tutaj, że w celu oznaczenia procentu identyczności dwie sekwencje aminokwasowe lub dwie sekwencje kwasu nukleinowego są przyrównywane w celu optymalnego dopasowania (np. do sekwencji aminokwasowej lub kwasu nukleinowego mogą być wprowadzone przerwy w celu optymalnego przyrównania z drugą sekwencją aminokwasową lub kwasu nukleinowego). Reszty aminokwasowe lub nukleotydy w odpowiadających sobie pozycjach aminowasowych lub pozycjach nukleotydowych są następnie porównywane. Jeżeli w danej pozycji w pierwszej sekwencji znajduje się ta sama reszta aminokwasowa lub nukleotyd jak w odpowiadającej jej pozycji w drugiej sekwencji, to cząsteczki są identyczne w tej pozycji. Procent identyczności pomiędzy dwoma sekwencjami jest funkcją liczby identycznych pozycji dzielonych przez długość sekwencji (tj. % identyczności = liczba identycznych pozycji/całkowita liczba pozycji (tj. nakładających się pozycji) x 100). Dogodnie, dwie sekwencje są tej samej długości. Specjalista w tej dziedzinie wie, że dostępnych jest kilka różnych programów komputerowych do ustalania homologii pomiędzy dwiema sekwencjami. Na przykład, porównanie sekwencji i ustalenie procentu identyczności pomiędzy dwiema sekwencjami może być dokonane przy użyciu algorytmu matematycznego. W zalecanym wykonaniu procent identyczności pomiędzy dwiema sekwencjami aminokwasowymi jest ustalany przy użyciu algorytmu Needlemana i Wunscha (J. Mol. Biol. (48): (1970)), który został włączony do programu GAP w pakiecie programów GCG (dostępny na przy użyciu macierzy Blossom 62 lub macierzy PAM250, i wagi przerwy 16, 14, 12, 10, 8, 6 lub 4 oraz wagi za wydłużenie przerwy 1, 2, 3, 4, 5 lub 6. Specjalista w tej dziedzinie dostrzeże, że te wszystkie parametry zaowocują nieco różnymi wynikami, ale sumaryczny procent identyczności nie jest znacząco zmieniony po zastosowaniu różnych algorytmów. W jeszcze innym wykonaniu procent identyczności pomiędzy dwiema sekwencjami nukleotydowymi jest ustalany przy użyciu programu GAP w pakiecie programów GCG (dostępnym na przy użyciu macierzy NWSgapdna.CMP i wagi przerwy 40, 50, 60, 70 lub 80 oraz wagi wydłużenia przerwy 1, 2, 3, 4, 5 lub 6. W innym wykonaniu procent identyczności dwóch sekwencji aminokwasowych lub nukleotydowych jest ustalony przy użyciu algorytmu E. Meyersa i W. Millera (CABIOS, 4: (1989), który został włączony do programu ALIGN (wersja 2.0) (dostępnym na przy użyciu tablicy wag reszt PAM120 kary za wydłużenie przerwy 12 i kary za przerwę 4. Sekwencje nukleotydowe i białkowe według niniejszego wynalazku mogą być także zastosowane jako sekwencja zapytania do wykonania przeszukiwania publicznych baz danych w celu, na przykład, identyfikacji innych członków rodziny lub sekwencji spokrewnionych. Takie przeszukiwania mogą

11 PL B1 11 być wykonane przy użyciu programów BLASTN i BLASTX (wersja 2.0) opracowanych przez Altschul, i wsp. (1990) J. Mol. Biol. 215: Nukleotydowe wyszukiwania BLAST mogą być wykonane przy użyciu programu BLASTN, wynik = 100, długość słowa = 12 w celu uzyskania sekwencji nukleotydowych homologicznych do cząsteczek kwasu nukleinowego PLP03 tu opisanych. Przeszukiwania białkowe BLAST mogą być wykonane przy użyciu programu BLASTX, wynik = 50, długość słowa = 3 w celu uzyskania sekwencji aminokwasowych homologicznych do cząsteczek białkowych PLP03 tu opisanych. W celu uzyskania przyrównań z przerwami do celów porównawczych może być wykorzystany BLAST wprowadzający przerwy, jak opisano w Altschul i wsp., (1997) Nucleic Acids Res. (17): Przy korzystaniu z BLAST i BLAST wprowadzającego przerwy mogą być zastosowane domyślne parametry odpowiednich programów (np. BLASTX i BLASTN). Zobacz Hybrydyzacja W stosowanym tu znaczeniu określenie hybrydyzowanie ma opisywać warunki hybrydyzacji i płukania w warunkach, w których nukleotydowe sekwencje homologiczne do siebie w przynajmniej około 50%, przynajmniej około 60%, przynajmniej około 70%, dogodnie w przynajmniej około 80%, zwłaszcza w przynajmniej około 85% do 90%, w szczególności w przynajmniej 95% typowo pozostaną do siebie zhybrydyzowane. Zalecanymi, nieograniczającymi przykładami takich warunków hybrydyzacji jest hybrydyzacja w 6x chlorku sodu/cytrynianie sodu (SSC) w około 45 C, po której następuje jedno lub więcej płukań w 1x SSC, 0,1% SDS w 50 C, dogodnie w 55 C, dogodnie w 60 C, a nawet dogodniej w 65 C. Bardzo ostre warunki obejmują, na przykład, hybrydyzowanie w 68 C w 5x SSC/5x roztworze Denhardta/1,0% SDS i płukanie w 0,2x SSC/0,1% SDS w temperaturze pokojowej. Alternatywnie płukanie może być wykonane w 42 C. Specjalista w tej dziedzinie będzie wiedzieć, jakie warunki zastosować do ostrych i bardzo ostrych warunków hybrydyzacji. Dodatkowe informacje o takich warunkach są łatwo dostępne w tej dziedzinie, na przykład w Sambrook i wsp., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N. Y.; oraz Ausubel i wsp. (red.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (JohnWiley & Sons, N. Y.). Oczywiście polinukleotyd, który hybrydyzuje tylko do sekwencji polia, takiej jak 3'-końcowy trakt poli(a) cząsteczek mrna lub do nici komplementarnej złożonej z reszt T (lub U) nie byłby włączony jako polinukleotyd według wynalazku stosowany do specyficznej hybrydyzacji do fragmentu kwasu nukleinowego według wynalazku, gdyż taki polinukleotyd hybrydyzowałby do dowolnej cząsteczki kwasu nukleinowego zawierającej ciąg poli(a) lub jego dopełnienie (np. do praktycznie dowolnego klonu dwuniciowego cdna). Uzyskiwanie pełnej długości DNA z innych organizmów. W typowym podejściu mogą być przeszukiwane biblioteki cdna skonstruowane z innych organizmów, np. grzybów nitkowatych, w szczególności z gatunków Aspergillus. Na przykład, szczepy Aspergillus mogą być przeszukiwane na homologiczne polinukleotydy przy użyciu analizy Northern blot. Po wykryciu transkryptów homologicznych do polinukleotydów według wynalazku, mogą być skonstruowane bibioteki cdna z RNA wyizolowanego z odpowiedniego szczepu, przy wykorzystaniu standardowych technik dobrze znanych specjalistom w tej dziedzinie. Alternatywnie, biblioteka totalnego genomowego DNA może być przeszukana przy użyciu sondy zdolnej do hybrydyzacji do polinukleotydu według niniejszego wynalazku. Sekwencje genu homologicznego mogą być wyizolowane, na przykład, przy wykonaniu PCR z użyciem dwóch zdegenerowanych puli starterów oligonukleotydowych zaprojektowanych na podstawie sekwencji nukleotydowych, jak było tutaj przedstawione. Matrycą do reakcji może być cdna uzyskany przez odwrotną transkrypcję mrna przygotowanego ze szczepów, o których wiadomo lub podejrzewa się, że wykazują ekspresję polinukleotydu według wynalazku. Produkt PCR może być subklonowany i sekwencjonowany, aby upewnić się, że namnożone sekwencje reprezentują sekwencje nowej sekwencji kwasu nukleinowego PLP03, lub jego funkcjonalnego odpowiednika. Fragment PCR może być następnie użyty do izolowania pełnej długości klonu cdna różnymi znanymi sposobami. Na przykład, namnożony fragment może być wyznakowany i użyty do przeszukania biblioteki cdna na bakteriofagach lub kosmidach. Alternatywnie, wyznakowany fragment może być użyty do przeszukania biblioteki genomowej. Technika PCR może być także użyta do wyizolowania pełnej długości sekwencji cdna z innych organizmów. Na przykład, RNA może być wyizolowany, przy użyciu standardowych procedur, z odpowiedniego źródła komórkowego lub tkankowego. Na RNA może być wykonana odwrotna transkryp-

12 12 PL B1 cja przy użyciu startera oligonukleotydowego specyficznego do samego końca 5' namnażanego fragmentu w celu zapoczątkowania syntezy pierwszej nici. Do otrzymanej hybrydy RNA/DNA może być następnie dodany ogon (np. z guanin) przy użyciu standardowej reakcji terminalnej transferazy, hybryda może być strawiona przy użyciu RNazy H i wtedy może być zapoczątkowana synteza drugiej nici (np. ze starterem poli-c). Tak więc, sekwencje cdna po lewej stronie namnożonego fragmentu mogą być łatwo namnożone. Dla przejrzenia dogodnych strategii klonowania zobacz, np. Sambrook i wsp., powyżej; i Ausubel i wsp., powyżej. Wektory Inny aspekt wynalazku odnosi się do wektorów, zwłaszcza wektorów ekspresyjnych, zawi e- rających kwas nukleinowy kodujący białko według wynalazku lub jego funkcjonalny odpowiednik. Stosowane tutaj określenie wektor" odnosi się cząsteczki kwasu nukleinowego zdolnej do tran s- portowania innego kwasu nukleinowego, do którego została przyłączona. Jednym z typów wekt o- ra jest plazmid, który odnosi się do kolistej dwuniciowej pętli DNA, do której mogą być dołączone dodatkowe segmenty DNA. Innym typem wektora jest wektor wirusowy, w którym dodatkowe segmenty DNA mogą być włączone w genom wirusowy. Pewne wektory są zdolne do auton o- micznej replikacji w komórce gospodarza, do której są one wprowadzone (np. wektory bakteryjne posiadające bakteryjny początek replikacji oraz ssacze wektory episomalne). Inne wektory (np. nieepisomalne wektory ssacze) są wintegrowane w genom komórki gospodarza po wprowadzeniu do komórki gospodarza, i przez to ulegają replikacji wraz z genomem gospodarza. Ponadto pe w- ne wektory są zdolne do kierowania ekspresją genów, do których są one funkcjonalnie przyłącz o- ne. Takie wektory są określane tutaj, jako wektory ekspresyjne. Ogólnie, wektory ekspresyjne stosowane w technikach rekombinacji DNA mają często postać plazmidów. Określenia plazmid i wektor" mogą być tutaj używane zamiennie, jako że plazmid jest najczęściej używaną postacią wektora. Jednakże zgodnie z wynalazkiem możliwe jest wykorzystanie takich form innych wektorów ekspresyjnych, jak wektory wirusowe (np. retrowirusy z defektywną replikacją, adenowirusy i wirusy adeno-satelitarne), które dostarczają takich samych funkcji. Rekombinowane wektory ekspresyjne tu opisane zawierają kwas nukleinowy według wynalazku w postaci odpowiedniej do ekspresji kwasu nukleinowego w komórce gospodarza, co oznacza, że rekombinowany wektor ekspresyjny zawiera jeden lub większą liczbę sekwencji regulatorowych wybranych na podstawie komórek gospodarza użytych do ekspresji, które są połączone w sposób funkcjonalny do sekwencji kwasu nukleinowego w celu jego ekspresji. Oczekuje się, że w rekombinowanym wektorze ekspresyjnym połączony w sposób funkcjonalny oznacza, że sekwencja nukleotydowa będąca przedmiotem zainteresowania jest przyłączona do sekwencji regulatorowej (regulatorowych) w sposób, który pozwala na ekspresję sekwencji nukleotydowej (np. w systemie transkrypcji/translacji in vitro lub w komórce gospodarza, jeżeli wektor jest wprowadzony do komórki gospodarza). Oczekuje się, że określenie sekwencja regulatorowa obejmuje promotory, wzmacniacze transkrypcji i inne elementy kontrolujące ekspresję (np. sygnał poliadenylacji). Takie sekwencje regulatorowe są opisane, na przykład w Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Sekwencje regulatorowe obejmują te, które kierują ekspresją konstytutywną lub indukowaną sekwencji nukleotydowej tylko w pewnej komórce gospodarza (np. sekwencje regulatorowe tkankowo-specyficzne). Zostanie doceniony przez specjalistę w tej dziedzinie fakt, że zaprojektowanie wektora ekspresyjnego może zależeć od takich czynników, jak wybór komórki gospodarza, która będzie transformowana, poziom ekspresji pożądanego białka, itp. Wektory ekspresyjne według wynalazku mogą być wprowadzone do komórek gospodarza, aby produkować białka lub peptydy kodowane przez kwasy nukleinowe, jak to tutaj opisano (np. enzymy lipolityczne, zmutowane enzymy lipolityczne, ich fragmenty, warianty lub ich funkcjonalne odpowiedniki, białka fuzyjne itp.). Rekombinowane wektory ekspresyjne tu opisane mogą być zaprojektowane do ekspresji enzymów lipolitycznych w komórkach prokariotycznych lub eukariotycznych. Na przykład, białko według wynalazku może ulegać ekspresji w komórkach bakteryjnych, takich jak E. coli i gatunki Bacillus, komórkach owadzich (przy użyciu bakulowirusowych wektorów ekspresyjnych), komórkach drożdży lub komórkach ssaczych. Odpowiednie komórki gospodarza są dalej dyskutowane w Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Alternatywnie, rekombinowany wektor ekspresyjny może ulegać transkrypcji i translacji in vitro, na przykład przy użyciu sekwencji regulatorowych promotora T7 i polimerazy T7. Wektory ekspresyjne użyteczne w niniejszym wynalazku obejmują wektory pochodzenia chromosomowego, episomalnego i wirusowego, np. wektory pochodzące od plazmidów bakteryjnych,

13 PL B1 13 bakteriofagów, drożdżowych episomów, elementów chromosomowych drożdży, wirusów, takich jak, bakulowirusy, papowawirusy, wirusy krowianki, adenowirusy, wirusy ospy drobiu, wirusy rzekomej wścieklizny świń i retrowirusy, oraz wirusy pochodzące z ich kombinacji, takie jak te pochodzące z elementów genetycznych plazmidów i baktriofagów, takie jak kosmidy i fagmidy. Wstawka DNA powinna być połączona w sposób funkcjonalny z odpowiednim promotorem, takim jak promotor faga lambda PL, promotory E. coli lac, trp i tac, wczesne i późne promotory SV40 oraz promotory retrowirusowe LTR, żeby wymieć kilka z nich. Specjalista w tej dziedzinie będzie znał inne odpowiednie promotory. W specyficznym wykonaniu zalecane są promotory, które są zdolne do kierowania wysokim poziomem ekspresji enzymów lipolitycznych w grzybach nitkowatych. Takie promotory są znane w tej dziedzinie. Konstrukty ekspresyjne mogą zawierać miejsca dla inicjacji, terminacji transkrypcji i, w obszarze ulegającym transkrypcji, miejsce wiązania rybosomu dla translacji. Część kodująca dojrzałych transkryptów ulegających ekspresji z konstruktów będzie zawierać kodon inicjacji translacji AUG na początku i kodon terminacji odpowiednio usytuowany na końcu polipeptydu ulegającego translacji. DNA wektora może być wprowadzony do komórek prokariotycznych lub eukariotycznych przy użyciu konwencjonalnych technik transformacji i transfekcji. Oczekuje się, że stosowane tutaj określenia transformacja i transfekcja będą się odnosiły do różnych technik stosowanych w tej dziedzinie do wprowadzenia obcego kwasu nukleinowego (np. DNA) do komórki gospodarza, włączając koprecypitację fosforanem wapnia lub chlorkiem wapnia, transfekcję za pośrednictwem dekstranu DEAE, transdukcję, infekcję, lipofekcję, transfekcję za pośrednictwem lipidów kationowych lub elektroporację. Odpowiednie sposoby transformacji lub transfekcji komórek gospodarza mogą być znalezione w Sambrook, i wsp. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wyd. drugie, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), Davis i wsp., Basic Methods in Molecular Biology (1986) i innych podręcznikach laboratoryjnych. W przypadku stabilnej transfekcji komórek ssaczych wiadomo, że w zależności od wektora ekspresyjnego i zastosowanej techniki transfekcji, tylko niewielka część komórek może wintegrować obcy DNA do ich genomu. W celu identyfikacji i selekcji tych integrantów do komórki gospodarza wraz z genem będącym przedmiotem zainteresowania w ogólności wprowadzany jest gen, który koduje marker selekcyjny (np. oporność na antybiotyki). Zalecane markery selekcyjne obejmują te, które nadają oporność na antybiotyki, takie jak G418, higromycyna i metotreksat. Kwas nukleinowy kodujący marker selekcyjny jest dogodnie wprowadzany do komórki gospodarza na tym samym wektorze, jak ten kodujący białko według wynalazku lub może być wprowadzany na odrębnym wektorze. Komórki stabilnie transfekowane wprowadzonym kwasem nukleinowym mogą być zidentyfikowane przez selekcję na antybiotyk (np. komórki, które włączyły gen markera selekcyjnego przetrwają, podczas gdy inne komórki zginą). Ekspresja białek w prokariotach jest często przeprowadzana w E. coli przy użyciu wektorów zawierających konstytutywne lub indukowalne promotory kierujące ekspresją zarówno białek fuzyjnych jak i niefuzyjnych. Wektory fuzyjne dodają pewną liczbę aminokwasów do białka kodowanego przez nie, np. do końca aminowego rekombinowanego białka. Takie wektory fuzyjne typowo służą do trzech celów: 1) do zwiększenia ekspresji białka rekombinowanego; 2) do zwiększenia rozpuszczalności białka rekombinowanego; i 3) do ułatwienia oczyszczenia rekombinowanego białka przez działanie jako ligand w oczyszczaniu przez powinowactwo. Często w fuzyjnych wektorach ekspresyjnych wprowadzone jest miejsce cięcia proteolitycznego na połączeniu składnika fuzyjnego i białka rekombinowanego w celu umożliwienia odłączenia białka rekombinowanego od składnika fuzyjnego po oczyszczeniu białka fuzyjnego. Takie enzymy i pokrewne im rozpoznawane sekwencje obejmują czynnik Xa, trombinę i enterokinazę. Jak wskazano, wektory ekspresyjne będą dogodnie zawierały markery selekcyjne. Takie markery obejmują reduktazę dihydrofolianu lub oporność na neomycynę dla komórek eukariotycznych oraz oporność na tetracyklinę lub ampicylinę dla hodowli w E. coli lub innych bakteriach. Wybrane przykłady odpowiedniego gospodarza obejmują komórki bakteryjne, takie jak E. coli, Streptomyces i Salmonella typhimurium; komórki grzybów, takie jak drożdże; komórki owadzie takie jak Drosophila S2 i Spodoptera Sf9; komórki zwierzęce, takie jak CHO, COS i czerniak Bowsa; oraz komórki roślinne. Odpowiednie pożywki i warunki hodowli dla powyżej opisanych komórek gospodarza są znane w tej dziedzinie. Wśród wektorów zalecanych do zastosowania w bakteriach są pqe70, pqe60 i PQE-9, dostępne z Qiagen; wektory pbs, wektory Phagescript, wektory Bluescript, pνη8a, pνη18α, pnh18a,

14 14 PL B1 pnh46a, dostępne ze Stratagene; i ptrc99a, pkk223-3, pkk233-3, pdr540, prit5 dostępne z Pharmacia. Wśród zalecanych wektorów eukariotycznych są PWLNEO, psv2cat, pog44, pzt1 i psg dostępne ze Stratagene; oraz psvk3, pbpv, pmsg i psvl dostępne z Pharmacia. Inne odpowiednie wektory będą z łatwością oczywiste dla specjalisty w tej dziedzinie. Znane promotory bakteryjne do zastosowania w niniejszym wynalazku obejmują promotory E. coli IacI i IacZ, promotory T3 i T7, promotor gpt, promotory lambda PR, PL i promotor trp, promotor kinazy tymidynowej HSV, wczesne i późne promotory SV40, promotory retrowirusowe LTR, jak te z wirusa mięsaka Rousa ( RSV") i promotory metaloproteinowe, takie jak promotor mysiej metalotioneiny-1. Wstawienie sekwencji wzmacniającej transkrypcję do wektora może w wyższych eukariotach zwiększyć transkrypcję DNA kodującego polipeptydy według niniejszego wynalazku. Wzmacniacze transkrypcji są elementami DNA działającymi w pozycji cis, zazwyczaj około od 10 do 300 pz, które działają tak, że zwiększają transkrypcyjną aktywność promotora w danym typie komórki gospodarza. Przykłady takich wzmacniaczy transkrypcji obejmują wzmacniacz transkrypcji SV40, który jest położony na miejscu późnym startu replikacji w pozycji 100 do 270 pz, wzmacniacz transkrypcji wczesnego promotora wirusa cytomegalii, wzmacniacz transkrypcji poliomawirusa na stronie późnej miejsca startu replikacji oraz adenowirusowe wzmacniacze transkrypcji. Do sekrecji białka ulegającego translacji do światła siateczki śródplazmatycznej, do przestrzeni międzybłonowej lub do środowiska zewnątrzkomórkowego może być użyty odpowiedni sygnał sekrecji włączony do polipeptydu ulegającego ekspresji. Sygnały mogą być endogenne dla polipeptydu lub mogą one być sygnałami heterologicznymi. Polipeptyd może ulegać ekspresji w postaci zmodyfikowanej, takiej jak białko fuzyjne i może zawierać nie tylko sygnały sekrecji, ale także dodatkowe heterologiczne sygnały funkcjonalne. Tak więc, na przykład, region dodatkowych aminokwasów, szczególnie aminokwasów obdarzonych ładunkiem, może być dodany do N-końca polipeptydu w celu poprawienia stabilności i trwałości w komórce gospodarza podczas oczyszczania lub podczas dostawy i przechowywania. Także składniki peptydowe mogą być dodane do polipeptydu w celu usprawnienia oczyszczania. Polipeptydy według wynalazku Wynalazek dostarcza wyizolowanego peptydu posiadającego sekwencję aminokwasową NR ID. SEKW.: 12, sekwencję aminokwasową możliwą do uzyskania przez ekspresję polinukleotydu wybranego z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 10 i 11 w odpowiednim gospodarzu. Powyższe polipeptydy są wspólnie objęte określeniem polipeptydy według wynalazku. Opisano też wyizolowane peptydy posiadające sekwencje aminokwasowe wybrane z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 3, 6, 9, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 i 39, sekwencje aminokwasowe możliwe do uzyskania przez ekspresję polinukleotydu wybranego z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 i 38 w odpowiednim gospodarzu. Opisano także peptyd lub polipeptyd zawierający funkcjonalny odpowiednik powyższych polipeptydów. Określenia peptyd" i oligopeptyd" są uważane za synonimiczne (jak się powszechnie uważa) i każde określenie może być użyte zamiennie, jeżeli kontekst wymaga wskazania łańcucha przynajmniej dwóch aminokwasów sparowanych przez wiązanie peptydowe. Słowo polipeptyd" jest stosowane tutaj dla łańcuchów zawierających więcej niż siedem reszt aminokwasowych. Wszystkie wzory oligopeptydów i polipeptydów lub sekwencje są tutaj napisane od lewej strony do prawej i w kierunku od końca aminowego do końca karboksylowego. Stosowany tutaj kod jednoliterowy aminokwasów jest powszechnie znany w tej dziedzinie i może być znaleziony w Sambrook, i wsp. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, drugie wyd., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Przez wyizolowany" polipeptyd lub białko uważa się polipeptyd lub białko wyodrębnione z jego natywnego środowiska. Na przykład, polipeptydy i białka ulegające ekspresji w komórkach gospodarza są polipeptydami natywnymi lub rekombinowanymi, które zostały zasadniczo oczyszczone przez dowolną odpowiednią technikę, taką jak, na przykład, sposób jednoetapowego oczyszczania ujawnionego w Smith i Johnson, Gene 67:31-40 (1988). Enzym lipolityczny według wynalazku może być odzyskany i oczyszczony z hodowli komórek rekombinowanych dobrze znanymi sposobami, w tym z użyciem precypitacji siarczanem amonu lub etanolem, ekstrakcji kwasem, anionową lub kationową chromatografią jonowymienną, chromatografią na fosfocelulozie, chromatografią oddziaływań hydrofobowych, chromatografią powinowactwa, chro-

15 PL B1 15 matografią na hydroksyapatycie i chromatografią na lektynie. Najdogodniej do oczyszczenia jest stosowana wysokosprawna chromatografia cieczowa ( HPLC ). Polipeptydy według niniejszego wynalazku obejmują naturalnie oczyszczone produkty, produkty z procedur syntezy chemicznej i produkty otrzymane technikami rekombinacji DNA z prokariotycznego lub eukariotycznego gospodarza, włączając w to, na przykład, komórki bakteryjne, drożdżowe, wyższych roślin, owadzie i ssacze. W zależności od gospodarza użytego w procedurze wytwarzania opartej na technice rekombinacji DNA, polipeptydy według niniejszego wynalazku mogą być glikozylowane lub mogą być nieglikozylowane. Dodatkowo polipeptydy według wynalazku mogą także w pewnych przypadkach zawierać zmodyfikowaną resztę początkowej metioniny jako rezultat procesów związanych z gospodarzem. Enzym lipolityczny według wynalazku może być dogodnie stosowany w procesach piekarniczych. Ilość enzymu dodawanego do ciasta jest oznaczana empirycznie. Może to zależeć od ilości użytej mąki, stopnia ulepszenia, jaki jest pożądany, rodzaju pieczywa lub wyrobów piekarniczych, sposobu wytwarzania ciasta, proporcji innych składników i tym podobnych. Fragmenty białek Zgodnie z wynalazkiem opisano także biologicznie aktywne fragmenty polipeptydów według wynalazku. Biologicznie aktywne fragmenty polipeptydów według wynalazku obejmują polipeptydy zawierające sekwencje aminokwasowe wystarczająco identyczne z sekwencją aminokwasową enzymu lipolitycznego lub otrzymane z sekwencji aminokwasowej enzymu lipolitycznego o sekwencji NR ID. SEKW.: 12, które zawierają mniej aminokwasów niż białko pełnej długości i wykazują przynajmniej jedną aktywność biologiczną odpowiedniego białka pełnej długości. Opisano też biologicznie aktywne fragmenty opisanych tu polipeptydów obejmujące polipeptydy zawierające sekwencje aminokwasowe wystarczająco identyczne z sekwencją lub otrzymane z sekwencji aminokwasowej enzymu lipolitycznego (np. sekwencja aminokwasowa wybrana z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 3, 6, 9, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33,36 i 39), które zawierają mniej aminokwasów niż białko pełnej długości i wykazują przynajmniej jedną aktywność biologiczną odpowiedniego białka pełnej długości. Typowo fragmenty aktywne biologicznie zawierają domenę lub motyw z przynajmniej jedną aktywnością odpowiadającego białka pełnej długości. Biologicznie aktywny fragment białka według wynalazku może być polipeptydem, którego długość wynosi, na przykład, 10, 25, 50, 100 lub więcej aminokwasów. Ponadto inne biologicznie aktywne części, w których inne regiony białka są usunięte mogą być przygotowane przez techniki rekombinacji DNA i sprawdzone pod względem jednej lub większej liczby aktywności biologicznych natywnej formy polipeptydu według wynalazku. Zgodnie z wynalazkiem opisano także fragmenty kwasu nukleinowego, które kodują powyższe biologicznie aktywne fragmenty białka enzymu lipolitycznego. Białka fuzyjne Białka według niniejszego wynalazku lub ich funkcjonalne odpowiedniki, np. ich biologicznie aktywne części, mogą być funkcjonalnie przyłączone do polipeptydu enzymu nie-lipolitycznego (np. heterologicznych sekwencji aminokwasowych) w celu utworzenia białek fuzyjnych. Stosowane tutaj określenie białko chimerowe" lub białko fuzyjne" enzymu lipolitycznego obejmuje polipeptyd enzymu lipolitycznego funkcjonalnie przyłączony do polipeptydu enzymu nie-lipolitycznego. Polipeptyd enzymu lipolitycznego odnosi się do polipeptydu posiadającego sekwencję aminokwasową NR ID. SEKW.: 12, lub może się odnosić do polipeptydu o sekwencji wybranej z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 3, 6, 9, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 i 39, podczas, gdy polipeptyd enzymu nielipolitycznego odnosi się do polipeptydu posiadającego sekwencję aminokwasową odpowiadającą białku, które nie jest istotnie homologiczne do enzymu lipolitycznego, np. białku, które jest różne od enzymu lipolitycznego i które pochodzi z tego samego lub innego organizmu. Wewnątrz białka fuzyjnego enzymu lipolitycznego polipeptyd enzymu lipolitycznego może odpowiadać całemu lub części białka enzymu lipolitycznego. W zalecanym wykonaniu, białko fuzyjne enzymu lipolitycznego zawiera przynajmniej dwie biologicznie aktywne części białka enzymu lipolitycznego. Oczekuje się, że wewnątrz białka fuzyjnego określenie funkcjonalnie połączony oznacza, że polipeptyd enzymu lipolitycznego i polipeptyd enzymu nie-lipolitycznego są połączone ze sobą w ramce odczytu. Polipeptyd enzymu nie-lipolitycznego może być przyłączony do N-końca lub C-końca polipeptydu enzymu lipolitycznego.

16 16 PL B1 Na przykład, w jednym z wykonań, białko fuzyjne jest białkiem fuzyjnym GST-enzym lipolityczny, w którym sekwencja enzymu lipolitycznego jest połączona z C-końcem sekwencji GST. Takie białka fuzyjne mogą ułatwić oczyszczanie rekombinowanego enzymu lipolitycznego (rekombinowanych enzymów lipolitycznych). W innym wykonaniu białko fuzyjne jest białkiem enzymu lipolitycznego zawierającym heterologiczną sekwencję sygnałową na jego N-końcu. W pewnych komórkach gospodarza (np. komórkach gospodarza ssaczego lub drożdżowego), ekspresja i/lub oczyszczanie enzymu lipolitycznego może być zwiększone przez zastosowanie heterologiczej sekwencji sygnałowej. W innym przykładzie jako heterologiczna sekwencja może być użyta sekwencja sekrecyjna gp67 białka otoczki bakulowirusa (Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel i wsp., red., John Wiley & Sons, 1992). Inne przykłady eukariotycznych heterologicznych sekwencji sygnałowych obejmują sekwencje sekrecyjne melityny i ludzkiej fosfatazy alkalicznej z łożyska (Stratagene; La Jolla, Kalifornia). W jeszcze innym przykładzie, użyteczne prokariotyczne heterologiczne sekwencje sygnałowe obejmują sygnał sekrecyjny phoa (Sambrook i wsp., powyżej) i sygnał sekrecyjny białka A (Pharmacia Biotech; Piscataway, New Jersey). Sekwencja sygnałowa może być użyta do ułatwienia sekrecji i izolacji białka lub peptydu według wynalazku. Sekwencje sygnałowe są typowo scharakteryzowane przez rdzeń aminokw a- sów hydrofobowych, które w ogólności są odcinane od dojrzałego białka podczas sekrecji w je d- nym lub kilku etapach cięcia. Takie peptydy sygnałowe zawierają miejsca obróbki, które pozwal a- ją na odcięcie sekwencji sygnałowej od dojrzałych białek po ich przejściu przez szlak sekrecyjny. Sekwencja sygnałowa kieruje sekrecję białka, na przykład z gospodarza eukario tycznego, do którego transformowano wektor ekspresyjny, a sekwencja sygnałowa jest po lub w trakcie sekrecji odcinana. Białko może być następnie z łatwością oczyszczone z środowiska pozakomórkowego sposobami znanymi w tej dziedzinie. Alternatywnie, sekwencja sygnałowa może być przyłączona do białka będącego przedmiotem zainteresowania przy użyciu sekwencji, która poprawia oczys z- czanie, jak na przykład domena GST. Tak więc, na przykład, sekwencja kodująca polipeptyd m o- że być przyłączona do sekwencji znacznikowej, takiej jak sekwencja kodująca peptyd, który ułatwia oczyszczanie takiego przyłączonego polipeptydu. W pewnych zalecanych wykonaniach tego aspektu wynalazku sekwencja znacznikowa jest peptydem heksa-histydynowym, takim jak znacznik dostarczony w wektorze pqe(qiagen, Inc.), spośród innych, wiele z nich jest komercyjnie d o- stępnych. Jak opisano w Gentz i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: (1989), na przykład heksa-histydyny dostarczają wygodnego sposobu oczyszczania białka fuzyjnego. Znacznik HA jest innym peptydem użytecznym w oczyszczaniu, który odpowiada epitopowi pochodzącemu z białka hemaglutyniny z wirusa grypy, który na przykład był opisany przez Wilson i wsp., Cell 37 :767 (1984). Dogodnie, białko chimerowe lub fuzyjne tu opisane jest wytwarzane standardowymi technikami rekombinacji DNA. Na przykład, fragmenty DNA kodujące sekwencje różnych polipeptydów są łączone ze sobą w ramce odczytu tradycyjnymi technikami, na przykład przy zastosowaniu tępo zakończonych lub lepko zakończonych końców do ligacji, trawienia enzymem restrykcyjnym w celu dostarczenia odpowiedniego końca, wypełniania spoistych końców jeśli konieczne, trakt o- wania alkaliczną fosfatazą w celu uniknięcia niepożądanego łączenia i enzymatycznej ligacji. W innym wykonaniu gen fuzyjny może być zsyntetyzowany tradycyjnymi technikami, w tym zautomatyzowanych urządzeń do syntezy DNA. Alternatywnie, może być zastosowane namnaż a- nie fragmentów genu w reakcji PCR przy użyciu starterów kotwiczących, które dają początek komplementarnym częściom wystającym pomiędzy dwoma nieprzerwanymi fragmentami genów, które mogą być następnie przyłączone i ponownie namnożone w celu wytworzenia sekwencji genu chimerowego (zobacz, na przykład, Current Protocols in Molecular Biology, red. Ausubel i wsp., JohnWiley & Sons: 1992). Ponadto, komercyjnie dostępnych jest wiele wektorów ekspresyjnych, które już kodują składnik fuzyjny (np. polipeptyd GST). Kwas nukleinowy kodujący enzym lipol i- tyczny może być wklonowany do takiego wektora ekspresyjnego tak, że składnik fuzyjny jest przyłączony w ramce odczytu do białka enzymu lipolitycznego. Funkcjonalne odpowiedniki Określenia funkcjonalne odpowiedniki i funkcjonalne warianty są używane tutaj zamiennie. Funkcjonalne odpowiedniki DNA kodującego enzym lipolityczny są wyizolowanymi fragmentami DNA, które kodują polipeptyd, który wykazuje określoną funkcję enzymu lipolitycznego z Aspergillus niger, jak tutaj opisano. Funkcjonalne odpowiedniki zatem także obejmują fragmenty biologicznie aktywne. Funkcjonalne odpowiedniki białka lub polipeptydu mogą zawierać tylko konserwatywne substytucje jednego lub więcej aminokwasów w sekwencji aminokwasowej NR ID. SEKW.: 12, lub ewentual-

17 PL B1 17 nie w sekwencjach aminokwasowych wybranych z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 3, 6, 9, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 i 39 lub substytucje, insercje lub delecje nieistotnych aminokwasów. Odpowiednio, nieistotnym aminokwasem jest reszta, która może być zmieniona w sekwencjach aminokwasowych wybranych z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 i 39 bez znaczącej zmiany funkcji biologicznej. Na przykład, przewiduje się, że reszty aminokwasowe konserwowane wśród białek enzymów lipolitycznych są specyficznie niepodatne na zmiany. Ponadto, aminokwasy konserwowane pośród białek enzymów lipolitycznych według niniejszego wynalazku i innych enzymów lipolitycznych najprawdopodobniej nie są podatne na zmiany. Oczekuje się, że określenie konserwatywna substytucja będzie oznaczać substytucję, w której reszta aminokwasu jest zastąpiona resztą aminokwasu mającego podobny łańcuch boczny. Te rodziny są znane w tej dziedzinie i obejmują aminokwasy z zasadowymi łańcuchami bocznymi (np. lizyna, arginina i histydyna), kwaśnymi łańcuchami bocznymi (np. kwas asparaginowy i kwas glutaminowy), nienaładowanymi polarnymi łańcuchami bocznymi (np. glicyna, asparagina, glutamina, seryna, treonina, tyrozyna, cysteina), niepolarnymi łańcuchami bocznymi (np. alanina, walina, leucyna, izoleucyna, prolina, fenyloalanina, metionina, tryptofan), beta-rozgałęzionymi łańcuchami bocznymi (np. treonina, walina, izoleucyna) oraz aromatycznymi łańcuchami bocznymi (np. tyrozyna, fenyloalanina, tryptofan, histydyna). Funkcjonalne odpowiedniki kwasu nukleinowego mogą typowo zawierać mutacje ciche lub mutacje, które nie zmieniają biologicznej funkcji kodowanego polipeptydu. Stosownie do tego, wynalazek dostarcza cząsteczek kwasu nukleinowego kodujących białka enzymów lipolitycznych, które zawierają zmiany w resztach aminokwasowych, które nie są istotne do określonej aktywności biologicznej. Takie białka enzymów lipolitycznych różnią się w sekwencji aminokwasowej w y- branej z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 i 39 nadal zachowując przynajmniej jedną aktywność biologiczną. W jednym z wykonań wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera sekwencję nukleotydową kodującą białko, które posiada istotnie homologiczną sekwencję aminokwasową przynajmniej w około 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% lub bardziej homologiczną do sekwencji aminokwasowej NR ID. SEKW.: 12. Opisano też wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową kodującą białko, które posiada istotnie homologiczną sekwencję ami nokwasową przynajmniej w około 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% lub bardziej homologiczną do sekwencji aminokwasowej wybranej z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 3, 6, 9, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 i 39. Na przykład, informacje dotyczące, jak uzyskać fenotypowo ciche substytucje aminokwasowe są dostarczone przez Bowie, J.U. i wsp., Science 247: (1990), w którym autorzy wskazują, że istnieją dwa główne podejścia do badania tolerancji sekwencji aminokwasowej na zmianę. Pierwszy sposób polega na procesie ewolucji, w którym mutacje są zarówno akceptowane lub odrzucane przez dobór naturalny. Drugie podejście stosuje inżynierię genetyczną do wprowadzenia zmian aminokwasów w specyficznych pozycjach sklonowanego genu i wybiera lub przeszukuje w celu zidentyfikowania sekwencji, które zachowują funkcjonalność. Jak twierdzą autorzy, te badania ujawniły, że białka są zaskakująco tolerancyjne na substytucje aminokwasowe. Autorzy dalej wskazują, które zmiany będą prawdopodobnie dozwolone w pewnych pozycjach białka. Na przykład, najbardziej wewnętrzne reszty aminokwasowe wymagają niepolarnych łańcuchów bocznych, podczas gdy ogólnie niewiele cech powierzchniowych łańcuchów bocznych jest konserwowanych. Inne takie fenotypowo ciche substytucje są opisane w Bowie i wsp., powyżej, i referencjach tutaj cytowanych. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego kodującego białko homologiczne do białka wybranego z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 i 39 może być utworzona przez wprowadzenie jednej lub kilku substytucji nukleotydowych, addycji lub delecji do odpowiednich kodujących sekwencji nukleotydowych (Tabela 1) tak, że do kodowanego białka jest wprowadzona jedna lub więcej substytucji, delecji lub insercji. Takie mutacje mogą być wprowadzone przez standardowe techniki, takie jak mutageneza ukierunkowana i mutageneza za pośrednictwem PCR. Określenie funkcjonalne odpowiedniki" także obejmuje ortologi dostarczonych tutaj enzymów lipolitycznych z Aspergillus niger. Ortologi enzymów lipolitycznych z Aspergillus niger są białkami, które mogą być wyizolowane z innych szczepów lub gatunków i posiadają podobną lub identyczną aktywność biologiczną. Takie ortologi mogą natychmiast być zidentyfikowane jako zawierające sekwencję aminokwasową, która jest istotnie homologiczna do sekwencji aminokwasowych wybranych z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 i 39.

18 18 PL B1 Jak zdefiniowano tutaj, określenie istotnie homologiczne odnosi się do pierwszej sekwencji aminokwasowej lub nukleotydowej, która zawiera wystarczającą lub minimalną liczbę identycznych lub równocennych (np. z podobnym łańcuchem bocznym) aminokwasów lub nukleotydów w porównaniu z drugą sekwencją aminokwasową lub nukleotydową tak, że pierwsze i drugie sekwencje aminokwasowe lub nukleotydowe posiadają wspólną domenę. Na przykład, aminokwasowe lub nukleotydowe sekwencje, które zawierają wspólną domenę posiadającą około 60%, dogodnie 65%, zwłaszcza 70%, w szczególności 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% lub 99% identyczności lub więcej są tutaj zdefiniowane jako wystarczająco identyczne. Zgodnie z wynalazkiem opisano także kwasy nukleinowe kodujące innych członków rodziny enzymów lipolitycznych, które przez to mają sekwencję nukleotydową, która różni się od sekwencji nukleotydowej wybranej z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 i 38. Ponadto, opisano również kwasy nukleinowe kodujące białka enzymów lipolitycznych z różnych gatunków, które przez to mają sekwencję nukleotydową, która różni się od sekwencji nukleotydowej wybranej z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 i 38. Cząsteczki kwasu nukleinowego odpowiadające wariantom (np. naturalnym wariantom allelicznym) i homologom polinukleotydów według wynalazku mogą być wyizolowane na podstawie ich homologii do kwasów nukleinowych ujawnionych tutaj przy użyciu cząsteczek cdna ujawnionych tutaj lub ich odpowiednich fragmentów jako sond hybrydyzacyjnych według standardowych technik hybrydyzacji w szczególności w bardzo ostrych warunkach hybrydyzacji. Dodatkowo, do naturalnie występujących wariantów allelicznych sekwencji Aspergillus niger dostarczonych tutaj, specjalista rozpozna, że te zmiany mogą być wprowadzone przez mutację sekwencji nukleotydowych wybranych z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 i 38 prowadząc przez to do zmian w sekwencji aminokwasowej białka enzymu lipolitycznego bez istotnej zmiany w funkcji białka. W innym aspekcie wynalazku dostarczone są ulepszone enzymy lipolityczne. Ulepszone enzymy lipolityczne są białkami, w których ulepszona jest przynajmniej jedna aktywność biologiczna. Takie białka mogą być uzyskane przez losowe wprowadzanie mutacji w całej lub części sekwencji kodującej enzym lipolityczny, tak jak przez mutagenezę wysycania a powstałe mutanty mogą ulegać ekspresji przy użyciu technik rekombinacji DNA i być przeszukiwane pod kątem aktywności biologicznej. Na przykład stn techniki dostarcza standardowych technik pomiaru aktywności enzymatycznej enzymów lipolitycznych i w ten sposób białka mogą być łatwo selekcjonowane. Enzym lipolityczny według wynalazku posiada sekwencję aminokwasową NR ID. SEKW.: 12. Enzym lipolityczny może mieć także sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 3, 6, 9, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 i 39. W innym wykonaniu enzym lipolityczny jest istotnie homologiczny do sekwencji aminokwasowej NR ID. SEKW.: 12 oraz zachowuje przynajmniej jedną aktywność biologiczną polipeptydu NR ID. SEKW.: 12, jednakże różni się w sekwencji aminokwasowej dzięki naturalnej zmienności lub mutagenezie, jak opisano powyżej. Może być ewentualnie homologiczny do sekwencji aminokwasowej wybranej z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 3, 6, 9, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 i 39 oraz zachowywać przynajmniej jedną aktywność biologiczną polipeptydu wybranego z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 3, 6, 9, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 i 39, jednakże różnić się w sekwencji aminokwasowej dzięki naturalnej zmienności lub mutagenezie, jak opisano powyżej. W innym wykonaniu, enzym lipolityczny posiada sekwencję aminokwasową kodowaną przez wyizolowany fragment kwasu nukleinowego zdolny do hybrydyzacji do kwasu nukleinowego wybranego z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 10 i 11. W innym wykonaniu, enzym lipolityczny może posiadać sekwencję aminokwasową kodowaną przez wyizolowany fragment kwasu nukleinowego zdolny do hybrydyzacji do kwasu nukleinowego wybranego z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 i 38 zwłaszcza w bardzo ostrych warunkach hybrydyzacji. Stosownie do tego, enzym lipolityczny jest białkiem, które zawiera sekwencję aminokwasową przynajmniej w około 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% lub bardziej homologiczną do sekwencji aminokwasowej wybranej z grupy składającej się z SEK ID NO: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 i 39 oraz zachowuje przynajmniej jedną funkcjonalną aktywność polipeptydu wybranego z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 i 39.

19 PL B1 19 W szczególności enzym lipolityczny jest białkiem, które zawiera sekwencję aminokwasową przynajmniej w około 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% lub bardziej homologiczną do sekwencji aminokwasowej pokazanej w NR ID. SEKW.:3 lub enzym lipolityczny jest białkiem, które zawiera sekwencję aminokwasową przynajmniej w około 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% lub bardziej homologiczną do sekwencji aminokwasowej pokazanej w NR ID. SEKW.: 6, lub enzym lipolityczny jest białkiem, które zawiera sekwencję aminokwasową przynajmniej w około 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% lub bardziej homologiczną do sekwencji pokazanej w NR ID. SE- KW.:9, lub enzym lipolityczny jest białkiem, które zawiera sekwencję aminokwasową przynajmniej w około 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% lub bardziej homologiczną do sekwencji pokazanej w NR ID. SEKW.:12 lub enzym lipolityczny jest białkiem, które zawiera sekwencję aminokwasową przynajmniej w około 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% lub bardziej homologiczną do sekwencji pokazanej w NR ID. SEKW.:15, lub enzym lipolityczny jest białkiem, które zawiera sekwencję aminokwasową przynajmniej w około 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% lub bardziej homologiczną do sekwencji pokazanej w NR ID. SEKW.:18 lub enzym lipolityczny jest białkiem, które zawiera sekwencję aminokwasową przynajmniej w około 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% lub bardziej homologiczną do sekwencji pokazanej w NR ID. SE- KW.:21, lub enzym lipolityczny jest białkiem, które zawiera sekwencję aminokwasową przynajmniej w około 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%,90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% lub bardziej homologiczną do sekwencji pokazanej w NR ID. SEKW.:24 lub enzym lipolityczny jest białkiem, które zawiera sekwencję aminokwasową przynajmniej w około 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% lub bardziej homologiczną do sekwencji pokazanej w NR ID. SEKW.:27, lub enzym lipolityczny jest białkiem, które zawiera sekwencję aminokwasową przynajmniej w około 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% lub bardziej homologiczną do sekwencji pokazanej w NR ID. SEKW.:30 lub enzym lipolityczny jest białkiem, które zawiera sekwencję aminokwasową przynajmniej w około 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% lub bardziej homologiczną do sekwencji pokazanej w NR ID. SE- KW.:33, lub enzym lipolityczny jest białkiem, które zawiera sekwencję aminokwasową przynaj m- niej w około 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% lub bardziej homologiczną do sekwencji pokazanej w NR ID. SEKW.:36 lub enzym lipolityczny jest białkiem, które zawiera sekwencję aminokwasową przynajmniej w około 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% lub bardziej homologiczną do sekwencji pokazanej w NR ID. SEKW.:39. Funkcjonalne odpowiedniki białka według wynalazku mogą być także zidentyfikowane np. przez przeszukiwanie kombinatorycznych bibliotek mutantów, np. mutantów skróconych, białka według wynalazku pod kątem aktywności enzymu lipolitycznego. W jednym z wykonań zróżnicowana biblioteka wariantów jest wytwarzana przez kombinatoryczną mutagenezę na poziomie kwasu nukleinowego. Zróżnicowana biblioteka wariantów może być stworzona przez, na przykład, enzymatyczne łączenie mieszaniny syntetycznych oligonukleotydów w sekwencje genu tak, że zdegenerowany zestaw potencjalnych sekwencji białkowych ulega ekspresji jako pojedyncze białka (np. w przypadku biblioteki prezentacji białka na powierzchni faga). Istnieją różne sposoby, które można zastosować do wytwarzania bibliotek potencjalnych wariantów polipeptydów według wynalazku ze zdegenerowanej sekwencji oligonukleotydowej. Sposoby syntetyzowania zdegenerowanych oligonukleotydów są znane w tej dziedzinie (zobacz, np. Narang (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura i wsp. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura i wsp. (1984) Science 198:1056; Ike i wsp. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477) Dodatkowo, biblioteki fragmentów sekwencji kodującej polipeptyd według wynalazku mogą być użyte do wytwarzania zróżnicowanej populacji polipeptydów do przeszukiwania i następnie selekcji wariantów. Na przykład, biblioteka fragmentów sekwencji kodującej może być wytworzona przez traktowanie dwuniciowego fragmentu PCR sekwencji kodującej będącej przedmiotem zainteresowania nukleazą w warunkach, których pojawia się pęknięcie około jeden raz na cząsteczkę, denaturowania dwuniciowego DNA, renaturowania DNA w celu powstania dwuniciowego DNA, które może zawierać sensowne/antysensowne pary z różnych pękniętych produktów, usuwania jednoniciowych fragmentów z ponownie powstałych dupleksów przez traktowanie nukleazą S1 ligacja

20 20 PL B1 powstałej biblioteki z wektorem ekspresyjnym. Dzięki temu sposobowi może być otrzymana biblioteka ekspresyjna, która koduje N-końcowe i wewnętrzne fragmenty o różnej wielkości białka będącego przedmiotem zainteresowania. W tej dziedzinie znanych jest kilka technik do przeszukiwania produktów genowych bibliotek kombinatorycznych wytworzonych przez punktowe mutacje powstałe po przycięciu DNA i do przeszukiwania bibliotek cdna dla produktów genowych posiadających wybraną właściwość. Najbardziej rozpowszechnione techniki do przeszukiwania dużych bibliotek genowych, które są użyteczne do analizy w dużej skali, typowo obejmują klonowanie biblioteki genowej do wektorów ekspresyjnych ulegających replikacji, transformowanie odpowiednich komórek powstałą biblioteką wektorów, i ekspresję kombinatorycznych genów w warunkach, w których wykrycie pożądanej aktywności ułatwia izolację wektora kodującego gen, którego produkt został wykryty. W połączeniu ze sposobami przeszukiwania w celu identyfikacji wariantów białka według wynalazku może być zastosowana rekursywna mutageneza grupy mutantów (REM, ang. recursive ensemble mutagenesis), technika, która zwiększa częstość funkcjonalnych mutantów w bibliotekach, (Arkin i Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 9: ; Delgrave i wsp. (1993) Protein Engineering 6(3): ). Dla specjalisty w tej dziedzinie będzie oczywiste, że w danej populacji mogą istnieć polimorfizmy sekwencji DNA, które mogą wprowadzać zmiany do sekwencji aminokwasowej enzymu lipolitycznego. Takie genetyczne polimorfizmy mogą istnieć w komórkach z różnych populacji lub wewnątrz populacji dzięki naturalnej zmienności alleli. Warianty alleliczne mogą także obejmować funkcjonalne odpowiedniki. Fragmenty polinukleotydu według wynalazku mogą także zawierać polinukleotydy, które nie kodują funkcjonalnych polipeptydów. Takie polinukleotydy mogą funkcjonować jako sondy lub startery do reakcji PCR. Kwasy nukleinowe według wynalazku, niezależnie czy kodują funkcjonalne lub niefunkcjonalne polipeptydy, mogą być stosowane jako sondy hybrydyzacyjne lub startery w łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR). Zastosowania cząsteczek kwasu nukleinowego według niniejszego wynalazku, które nie kodują polipeptydu posiadającego aktywności enzymu lipolitycznego obejmują, między innymi, (1) izolowanie genu kodującego białko enzymu lipolitycznego, lub jego allelicznych wariantów z biblioteki cdna np. z innego organizmu niż Aspergillus niger; (2) hybrydyzację in situ (np. FISH) ramion chromosomów metafazowych w celu dostarczenia dokładnej lokalizacji na chromosomie genu enzymu lipolitycznego, jak opisano w Verma i wsp., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988); (3) analizę Northern blot do wykrywania ekspresji mrna enzymu lipolitycznego w specyficznych tkankach i/lub komórkach i 4) sondy i startery, które mogą być zastosowane jako narzędzie diagnostyczne do analizy obecności kwasu nukleinowego zdolnego do hybrydyzacji do sondy enzymu lipolitycznego w danej próbce biologicznej (np. tkance). Zgodnie z wynalazkiem opisano także sposób otrzymywania genu lub cdna kodującego funkcjonalny odpowiednik enzymu lipolitycznego. Taki sposób wymaga otrzymywania wyznakowanej sondy, która zawiera wyizolowany kwas nukleinowy, który koduje całą lub fragment sekwencji wybranej z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 i 39 lub ich wariantów; przeszukiwania biblioteki fragmentów kwasu nukleinowego wyznakowaną sondą w warunkach, które pozwalają na hybrydyzację sondy do fragmentów kwasu nukleinowego w bibliotece, tworząc przez to dupleksy kwasu nukleinowego i sporządzenia sekwencji genu o pełnej długości z fragmentów kwasu nukleinowego z każdego wyznakowanego dupleksu w celu uzyskania genu spokrewnionego z genem enzymu lipolitycznego. W jednym z wykonań kwas nukleinowy według wynalazku jest przynajmniej w 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, lub bardziej homologiczny do sekwencji kwasu nukleinowego wybranego z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 10 i 11. W jednym z wykonań kwas nukleinowy tu opisany może być przynajmniej w 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 25 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, lub bardziej homologiczny do sekwencji kwasu nukleinowego wybranego z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37 i 38 lub ich dopełnienia. W innym zalecanym wykonaniu polipeptyd według wynalazku jest przynajmniej w 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, lub bardziej homologiczny do sekwencji aminokwasowej NR ID. SEKW.: 12. Polipeptyd tu opisany może być przynajmniej w 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%,

21 PL B %, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, lub bardziej homologiczny do sekwencji aminokwasowej wybranej z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 3, 6, 9, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 i 39. Komórki gospodarza W innym wykonaniu wynalazek opisuje komórki, np. transformowane komórki gospodarza lub rekombinowane komórki gospodarza, które zawierają kwas nukleinowy objęty wynalazkiem. Komórką transformowaną lub komórką rekombinowaną jest komórka, do której (lub do której przodka) wprowadzono, w znaczeniu technik rekombinowanego DNA, kwas nukleinowy według wynalazku. Obejmuje to zarówno komórki prokariotyczne jak i eukariotyczne, np. bakterie, grzyby, drożdże i tym podobne, szczególnie korzystne są komórki z grzybów nitkowatych, w szczególności Aspergillus niger. Można wybrać komórkę gospodarza, która moduluje ekspresję wprowadzonych sekwencji, lub modyfikuje i obrabia produkt genowy w specyficzny, pożądany sposób. Takie modyfikacje (np. glikozylacja) i obróbka (np. cięcie) produktów białkowych może polepszyć optymalne funkcjonowanie białka. Różne komórki posiadają charakterystyczne i specyficzne mechanizmy posttranslacyjnej obróbki i modyfikacji białek oraz produktów genowych. W celu zapewnienia pożądanych w poprawnych modyfikacji i obróbki obcego białka ulegającego ekspresji mogą być wybrane odpowiednie linie komórkowe lub systemy gospodarza znane specjalistom w dziedzinie biologii molekularnej i/lub mikrobiologii. W tym celu zastosowane mogą być eukariotyczne komórki gospodarza, które posiadają maszynerię komórkową do właściwej obróbki pierwotnego transkryptu, glikozylacji i fosforylacji produktu genowego. Takie komórki gospodarza są dobrze znane w tej dziedzinie. Komórki gospodarza obejmują, ale bez ograniczenia, ssacze linie komórkowe, takie jak CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38 i linie komórkowe splotu naczyniówkowego. Jeśli to pożądane polipeptydy według wynalazku mogą być wytwarzane przez stabilnie transfekowane linie komórkowe. Publicznie dostępnych jest szereg wektorów odpowiednich do stabilnej transfekcji komórek ssaczych, sposoby otrzymywania takich linii komórkowych są także publicznie znane, np. w Ausubel i wsp. (powyżej). Przeciwciała Zgodnie z wynalazkiem opisano także przeciwciała, takie jak przeciwciała monoklonalne lub poliklonalne, które specyficznie wiążą białka enzymu lipolitycznego według wynalazku. Przez stosowane tutaj określenie przeciwciało (Ab) lub przeciwciało monoklonalne (Mab) rozumie się, że obejmuje ono nienaruszone cząsteczki, jak również fragmenty przeciwciał (takie jak, na przykład, fragmenty Fab i F(ab ) 2, które są zdolne do specyficznego wiązania się do białka enzymu lipolitycznego. Fragmenty Fab i F(ab) 2 nie posiadają fragmentu Fc nienaruszonego przeciwciała, są szybciej usuwane z krwioobiegu, mogą posiadać mniej niespecyficzne wiązanie do tkanek od nienaruszonego przeciwciała (Wahl i wsp., J. Nucl. Med. 24: (1983)). Tak więc, te fragmenty są zalecane. Przeciwciała tu opisane mogą być wytwarzane dowolnym z różnych sposobów. Na przykład komórki z ekspresją białka enzymu lipolitycznego lub jego fragmentu antygenowego mogą być podane zwierzęciu w celu zapoczątkowania produkcji surowicy zawierającej przeciwciała poliklonalne. W zalecanym sposobie preparat białka enzymu lipolitycznego jest przygotowywany i oczyszczany w celu uczynienia go zasadniczo czystym od naturalnych zanieczyszczeń. Taki preparat jest następnie wprowadzany do zwierzęcia w celu produkcji poliklonalnej surowicy odpornościowej o większej aktywności specyficznej. W najbardziej zalecanym sposobie przeciwciała tu opisane są przeciwciałami monoklonalnymi (lub ich fragmentami wiążącymi białko enzymu lipolitycznego). Takie przeciwciała monoklonalne mogą być przygotowywane przy użyciu techniki hybrydomy (Kohler i wsp., Nature 256:495 (1975); Kohler i wsp., Eur. J. Immunol. 6:511 (1976); Hammering i wsp., W: Monoclonal Antibodies andt-cell Hybridomas, Elsevier, N. Y., str (1981)). Ogólnie, takie procedury obejmują immunizację zwierzęcia (zwłaszcza myszy) antygenem białka enzymu lipolitycznego lub komórkami z ekspresją białka enzymu lipolitycznego. Limfocyty śledziony takiej myszy są izolowane i poddawane fuzji z odpowiednią linią komórkową szpiczaka. Zgodnie z wynalazkiem może być użyta dowolna linia komórkowa szpiczaka; jednakże zalecane jest wykorzystanie macierzystej linii komórkowej szpiczaka (SP20), dostępniej w American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. Po fuzji powstałe komórki hybrydomy są utrzymywane w pożywce selekcyjnej HAT a następnie klonowane przez seryjne rozcieńczenia, jak opisano w Wands i wsp. (Gastro-enterology 80: (1981)). Komórki hybrydomy uzyskane przez taką selekcję są następnie poddawane oznaczeniom w celu zidentyfikowania klonów

22 22 PL B1 z sekrecją przeciwciał zdolnych do wiązania antygenu białka enzymu lipolitycznego. Ogólnie, polipeptydy mogą być łączone z białkiem nośnikowym, takim jak KLH, jak opisano w Ausubel i wsp., powyżej, mieszane z adiuwantem i wstrzykiwane do gospodarza ssaczego. Różni gospodarze zwierzęcy mogą być immunizowani przez wstrzyknięcie peptydu będącego przedmiotem zainteresowania. Przykłady odpowiednich gospodarzy zwierzęcych obejmują króliki, myszy, świnki morskie i szczury. W zależności od gatunków gospodarza, w celu zwiększenia odpowiedzi immunologicznej mogą być zastosowane różne adiuwanty, w tym, ale bez ograniczenia, adiuwant Freunda (kompletny i niekompletny), żele mineralne, takie jak wodorotlenek glinu, substancje powierzchniowo czynne, takie jak lizolecytyna, poliole pluroniczne (polimery 2-metylooksiranu), polianiony, peptydy, emulsje olejowe, hemocyjanina ze skałoczepa Megathura crenulata, dinitrofenol, BCG (bacille Calmette-Guerin) i Corynebacterium parvum. Przeciwciała poliklonalne są heterogennymi populacjami cząsteczek przeciwciał otrzymanych z surowicy immunizowanych zwierząt. Takie przeciwciała mogą być dowolną klasą immunoglobulin, w tym IgG, IgM, IgE, IgA, IgD i dowolna ich podklasa. Hybrydomy wytwarzające mab tu opisane mogą być hodowane in vitro lub in vivo. Po otrzymaniu przeciwciała poliklonalne lub monoklonalne są testowane pod kątem specyficznego rozpoznawania białka według wynalazku lub jego funkcjonalnych odpowiedników w immunooznaczeniu, takim jak analiza Western blot lub immunoprecypitacja przy zastosowaniu standardowych technik, np. jak opisano w Ausubel i wsp., powyżej. Przeciwciała, które specyficznie wiążą się do białka według wynalazku lub jego funkcjonalnych odpowiedników są użyteczne w wynalazku. Na przykład, takie przeciwciała mogą być użyte w immunooznaczeniu do wykrywania białka według wynalazku w patogennych lub niepatogennych szczepach Aspergillus (np. w ekstraktach z Aspergillus). Zalecane jest otrzymywanie przeciwciał przy użyciu fragmentów białka według wynalazku, które przypuszczalnie mogą być antygenowe, stosując kryteria, takie jak duża częstość występowania reszt naładowanych. Na przykład, takie fragmenty mogą być wytwarzane przez standardowe techniki oparte o PCR i następnie klonowane do wektora ekspresyjnego pgex (Ausubel i wsp., powyżej). Białka fuzyjne mogą następnie ulegać ekspresji w E. coli i być oczyszczane przy użyciu macierzy powinowactwa do agarozy glutationowej, jak opisano w Ausubel, i wsp., powyżej. Jeśli jest to pożądane, dla każdego białka można wytworzyć kilka (np. dwie lub trzy) fuzji i każda fuzja może być wstrzyknięta do przynajmniej dwóch zwierząt. Surowice odpornościowe mogą być przygotowane przez wstrzyknięcia w seriach, typowo obejmując przynajmniej trzy wstrzyknięcia przypominające. Typowo, surowice odpornościowe są sprawdzane pod kątem ich zdolności do immunoprecypitacji białka według wynalazku lub jego funkcjonalnych odpowiedników, podczas gdy niespokrewnione białka mogą służyć jako kontrola dla specyficzności reakcji immunologicznej. Alternatywnie, techniki opisane do produkcji przeciwciał o pojedynczych łańcuchach (Patenty USA i ) mogą być zaadaptowane do produkcji przeciwciał o pojedynczych łańcuchach przeciwko białku według wynalazku lub jego funkcjonalnemu odpowiednikowi. Zestawy do otrzymywania i przeszukiwania bibliotek prezentacji białka na powierzchni faga są komercyjnie dostępne, np. z Pharmacia. Dodatkowo, przykłady sposobów i odczynników szczególnie zalecanych do zastosowania w otrzymywaniu i przeszukiwaniu biblioteki prezentacji białka na powierzchni faga mogą być znalezione, na przykład, w Patencie USA ; Publikacji PCT Nr W092/18619; Publikacji PCT Nr WO 91/17271; Publikacji PCT Nr WO 20791; Publikacji PCT Nr WO 92/20791; Publikacji PCT Nr WO 92/15679; Publikacji PCT Nr WO 93/01288; Publikacji PCT Nr WO 92/01047; Publikacji PCT Nr WO 92/09690; Publikacji PCT Nr WO 90/02809; Fuchs i wsp. (1991) Bio/Technology 9: ; Hay i wsp. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse i wsp. (1989) Science 246; ; Griffiths i wsp. (1993) EMBO J. 12: Przeciwciała poliklonalne i monoklonalne, które specyficznie wiążą się do białka według wynalazku lub jego funkcjonalnych odpowiedników mogą być stosowane, na przykład, do wykrywania ekspresji genu kodującego białko według wynalazku lub jego funkcjonalny odpowiednik, np. w innym szczepie Aspergillus. Na przykład, białko według wynalazku może być natychmiast wykrywane w konwencjonalnych immunooznaczeniach komórek lub ekstraktów z Aspergillus. Przykłady odpowiednich oznaczeń obejmują, bez ograniczeń, oznaczenie typu Western blot, testy ELISA, oznaczenia radioimmunologiczne i tym podobne.

23 PL B1 23 Przez wiąże się specyficznie rozumie się, że przeciwciało rozpoznaje i wiąże określony antygen, np. białko według wynalazku, lecz nie rozpoznaje i nie wiąże się w sposób istotny do innych niespokrewnionych cząsteczek w próbce. Przeciwciała mogą być oczyszczane, na przykład, sposobami chromatografii powinowactwa, w których antygen polipeptydowy jest immobilizowany na żywicy. Przeciwciało skierowane przeciwko polipeptydowi według wynalazku (np. przeciwciało monoklonalne) może być stosowane do izolacji polipeptydu przy użyciu standardowych technik, takich jakchromatografia powinowactwa lub immunoprecypitacja. Ponadto, takie przeciwciało może być stosowane do wykrywania białka (np. w lizacie komórek lub supernatancie komórek) w celu ustalenia częstości występowania i wzoru ekspresji polipeptydu. Przeciwciała mogą być także stosowane w celach diagnostycznych do monitorowania poziomów białka w komórkach lub tkance, jako część procedury testowania klinicznego, na przykład, do oznaczenia skuteczności danego trybu leczenia lub w diagnostyce grzybicy kropidlakowej. Detekcja może być polepszona przez sprzężenie przeciwciała z wykrywalną substancją. Przykłady wykrywalnych substancji obejmują różne enzymy, grupy prostetyczne, materiały fluorescencyjne, materiały luminescencyjne, materiały bioluminescencyjne i materiały radioaktywne. Przykłady odpowiednich enzymów obejmują peroksydazę chrzanową, fosfatazę alkaliczną, galaktozydazę, lub acetylocholinesterazę; przykłady odpowiednich materiałów fluorescencyjnych obejmują umbelliferon, fluoresceinę, izotiocyjanian fluoresceiny, rodaminę, dichlorotriazynyloaminę fluoresceiny, chlorek dansylu lub fikoerytrynę; przykłady materiałów luminescencyjnych obejmują luminol; przykłady materiałów bioluminescencyjnych obejmują lucyferazę, lucyferynę i akworynę, i przykłady odpowiednich materiałów radioaktywnych obejmują 125 I, 131 I, 35 S, lub 3 H. Zalecanymi epitopami objętymi przez peptyd antygenowy są regiony, które są położone na powierzchni białka, np. regiony hydrofilowe. Do identyfikacji regionów hydrofilowych mogą być użyte wykresy hydrofobowości białek według wynalazku. Peptyd antygenowy białka według wynalazku zawiera przynajmniej 7 (zwłaszcza 10, 15, 20, lub 30) ciągłych reszt aminokwasowych sekwencji aminokwasowej wybranej z grupy składającej się z SEQ ID NR: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 i 39 oraz obejmuje epitop białka tak, że przeciwciało otrzymane przeciwko peptydowi tworzy specyficzny kompleks immunologiczny z białkiem. Zalecanymi epitopami objętymi przez peptyd antygenowy są regiony białka według wynalazku, które są położone na powierzchni białka, np. regiony hydrofilowe, regiony hydrofobowe, regiony alfa, regiony beta, regiony zakrętu, regiony zwrotu i regiony elastyczne. Immunooznaczenia Jakościowe lub ilościowe oznaczenia polipeptydu według niniejszego wynalazku w próbce biologicznej można przeprowadzić przy użyciu dowolnego sposobu znanego w tej dziedzinie. Techniki oparte na przeciwciałach dostarczają szczególnych korzyści w oznaczaniu poziomów określonego polipeptydu w próbce biologicznej. W tych technikach specyficzne rozpoznanie jest dostarczone przez przeciwciało pierwszorzędowe (poliklonalne lub monoklonalne) ale drugorzędowy system detekcji może angażować przeciwciała drugorzędowe sprzężone ze związkiem fluorescencyjnym, enzymem lub innym. W wyniku uzyskuje się immunokompleks. Stosownie do tego, zgodnie z wynalazkiem opisano sposób do rozpoznawania czy dany organizm jest zakażony grzybem Aspergillus składający się z etapów: izolowania próbki biologicznej z tego organizmu podejrzanego o zakażenie grzybem Aspergillus, reagowania tej próbki biologicznej z przeciwciałem według wynalazku, oznaczenia czy powstały immunokompleksy. Ekstrahowane mogą być także tkanki, np. mocznikiem i neutralnym detergentem, w celu uwolnienia białka do analizy Western blot lub oznaczenia dot/slot. Ta technika może być także zastosowana do płynów ustrojowych. Inne oparte na przeciwciałach sposoby użyteczne do wykrywania białka według wynalazku obejmują immunooznaczenia, takie jak test immunosorpcji enzymozależnej (ELISA, ang. enzyme linked immunosorbent assay) i radioimmunooznaczenie (RIA, ang. radioimmunoassay). Na przykład, przeciwciała monoklonalne przeciwko białku według wynalazku mogą być użyte zarówno jako immuno- -absorbent i jako sonda wyznakowana enzymem do wykrywania i ilościowego oznaczania białka według wynalazku. Ilość białka obecnego w próbce może być obliczona przez odniesienie do ilości

24 24 PL B1 obecnej w preparacie używanym do standaryzacji przy użyciu komputerowego algorytmu regresji liniowej. W innym oznaczeniu ELISA do wykrycia białka według wynalazku w płynie biologicznym mogą być użyte dwa przeciwciała monoklonalne o różnej specyficzności. W tym oznaczeniu, jedno z przeciwciał stosowane jest jako immuno-absorbent a drugie jako sonda wyznakowana enzymem. Powyższe techniki mogą być przeprowadzane zasadniczo jako oznaczenia jednoetapowe" lub dwuetapowe. Oznaczenie jednoetapowe obejmuje kontakt białka według wynalazku z immobilizowanym przeciwciałem i, bez płukania, kontakt mieszaniny z wyznakowanym przeciwciałem. Inne konwencjonalne sposoby mogą także być zastosowane jako odpowiednie. Oznaczenie dwuetapowe obejmuje płukanie przed kontaktem mieszaniny z wyznakowanym przeciwciałem. Inne konwencjonalne sposoby mogą być także zastosowane jako odpowiednie. Zazwyczaj jest pożądane immobilizowanie jednego składnika systemu oznaczenia na podłożu, i przez to pozwolenie innym składnikom systemu na wejście w kontakt ze składnikiem i łatwe usunięcie z próbki. Odpowiednie znaczniki enzymatyczne obejmują, na przykład, te z grupy oksydaz, które katalizują wytwarzanie nadtlenku wodoru w reakcji z substratem. Aktywność znacznika w postaci oksydazy może być oznaczona przez pomiar stężenia nadtlenku wodoru powstałego w reakcji przeciwciało wyznakowane enzymem/substrat. Oprócz enzymów, inne odpowiednie znaczniki obejmują radioizotopy, takie jak jod ( 125 I, 121 I), węgiel ( 14 C), siarka ( 35 S), tryt ( 3 H), ind ( 112 In), i technet ( 99m Tc), oraz znaczniki fluorescencyjne, takie jak fluoresceina i rodamina, oraz biotyna. Specyficzne wiązanie testowego związku do białka według wynalazku może być wykryte, na przykład, in vitro przez odwracalną lub nieodwracalną immobilizację białka według wynalazku na substracie, np. powierzchni studzienki w 96-studzienkowej polistyrenowej płytce do mikromiareczkowania. Sposoby na immobilizację polipeptydów i innych małych cząsteczek są dobrze znane w tej dziedzinie. Na przykład, płytki do mikromiareczkowania mogą być pokryte białkiem według wynalazku przez dodanie białka w roztworze (typowo w stężeniu 0,05 do 1 mg/ml w objętości μl) do każdego dołka i inkubację płytek w temperaturze pokojowej do 37 C przez 0,1 do 36 godzin. Białka, które nie są związane do płytki mogą być usunięte przez wytrząśnięcie nadmiaru roztworu z płytki i następnie przemycie płytki (jeden raz lub kilkukrotnie) wodą lub buforem. Typowo, białko jest trzymane w wodzie lub buforze. Płytka jest następnie płukana buforem, który nie zawiera związanego białka. Aby zablokować wolne miejsca wiążące białka na płytkach, płytki są blokowane białkiem, które nie jest spokrewnione ze związanym białkiem. Na przykład, odpowiednie jest 300 μl albuminy z surowicy bydlęcej (BSA) w stężeniu 2 mg/ml w Tris-HCI. Odpowiednie substraty obejmują te substraty, które zawierają zdefiniowaną chemię wiązania krzyżowego (np. substraty plastikowe, takie jak polistyren, styren lub substraty polipropylenowe z Corning Costar Corp. (Cambridge, MA), na przykład). Jeśli jest to pożądane, jako substrat może być użyta cząsteczka w postaci kulki, np. agaroza w kulkach lub sefaroza w kulkach. Wiązanie testowego związku do polipeptydu według wynalazku może być wykryte dowolnym z różnych sposobów znanych w tej dziedzinie. Na przykład, specyficzne przeciwciało może być użyte w immunooznaczeniu. Jeżeli jest to pożądane, przeciwciało może być wyznakowane (np. fluorescencyjnie lub radioizotopem) i wykrywane bezpośrednio (zobacz, np. West i McMahon, J. Cell Biol. 74:264, 1977). Alternatywnie, do detekcji może być użyte drugie przeciwciało (np. wyznakowane przeciwciało, które wiąże część Fc przeciwciała anty-an97). W alternatywnym sposobie detekcji, białko według wynalazku jest wyznakowane a wykrywany jest znacznik (np. przez wyznakowanie białka według wynalazku radioizotopem, fluoroforem, chromoforem, lub podobnym). W jeszcze innym sposobie, białko według wynalazku jest wytwarzane jako białko fuzyjne z białkiem, które może być wykryte optycznie, np. zielonym białkiem fluorescencyjnym (które może być wykryte w świetle UV). W alternatywnym sposobie białko według wynalazku może być kowalencyjnie przyłączone do enzymu posiadającego wykrywalną aktywność enzymatyczną lub poddane fuzji z enzymem, takim jak peroksydaza chrzanowa, fosfataza alkaliczna, alfa-galaktozydaza lub oksydaza glukozowa. Geny kodujące wszystkie te enzymy zostały sklonowane i są łatwo dostępne do użytku przez specjalistów w tej dziedzinie. Jeżeli jest to pożądane, białko fuzyjne może zawierać antygen, i taki antygen może być wykrywany i mierzony użyciem przeciwciała poliklonalnego lub monoklonalnego przy użyciu konwencjonalnych sposobów. Odpowiednie antygeny obejmują enzymy (np. peroksydazę chrzanową, alkaliczną fosfatazę i alfa-galaktozydazę) i polipeptydy nieenzymatyczne (np. białka surowicze, takie jak BSA i globuliny oraz białka mleka, takie jak kazeiny).

25 PL B1 25 Epitopy, antygeny i immunogeny Opisano tu również peptyd lub polipeptyd zawierający część polipeptydu według wynalazku niosącą epitop. Epitop tej części polipeptydu jest immunogennym lub antygenowym epitopem polipeptydu według wynalazku. Immunogenny epitop jest zdefiniowany jako część białka, która wywołuje odpowiedź przeciwciała, jeżeli całe białko jest immunogenem. Uznaje się, że te immunogenne epitopy są ograniczone do kilku miejsc na cząsteczce. Z drugiej strony, region cząsteczki białka, do której może związać się przeciwciało jest zdefiniowana jako epitop antygenowy. Liczba immunogennych epitopów białka ogólnie jest mniejsza niż liczba antygenowych epitopów. Zobacz, na przykład, Geysen, Η. M. i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: (1984). W odniesieniu do selekcji peptydów lub polipeptydów niosących antygenowy epitop (tj. który zawiera region cząsteczki białka, do której może związać się przeciwciało), jest dobrze znane w tej dziedzinie, że względnie krótkie syntetyczne peptydy, które naśladują fragment sekwencji białka są zazwyczaj zdolne do wzbudzenia surowicy odpornościowej, która reaguje z częściowo naśladowanym białkiem. Zobacz, na przykład, Sutcliffe, J. G. i wsp., Science 219: (1984). Peptydy zdolne do wzbudzenia surowicy reagującej z białkiem często są reprezentowane w pierwszorzędowej sekwencji białka, mogą być scharakteryzowane przez zestaw prostych reguł chemicznych, i nie są ograniczone do regionów nienaruszonych białek wywołujących odpowiedź immunologiczną (tj. epitopów immunogennych) ani do końców aminowych lub karboksylowych. Peptydy, które są ekstremalnie hydrofobowe i te o długości sześciu lub mniej reszt w ogólności są nieefektywne w indukowaniu przeciwciał, które wiążą te naśladowane białka; efektywne zazwyczaj są dłuższe, rozpuszczalne peptydy, szczególnie te zawierające reszty prolinowe. Sutcliffe i wsp., powyżej, na 661. Na przykład, 18 z 20 peptydów zaprojektowanych według tych wskazówek, zawierających 8-39 reszt pokrywających 75% sekwencji łańcucha polipeptydowego hemaglutyniny HAI wirusa grypy indukowało przeciwciała, które reagowały z białkiem HAI lub nienaruszonym wirusem; oraz 12/12 peptydów z polimerazy MuLV oraz 18/18 z glikoproteiny wirusa wścieklizny indukowało przeciwciała, które precypitowały odpowiednie białka. Niosące epitopy antygenowe peptydy i polipeptydy według wynalazku są zatem użyteczne we wzbudzaniu przeciwciał, w tym przeciwciał monoklonalnych, które wiążą się specyficznie do polipeptydu według wynalazku. Tak więc, wysoki odsetek hybrydom uzyskanych przez fuzję komórek śledziony z dawców immunizowanych peptydem niosącym epitop antygenowy zazwyczaj wydziela przeciwciało reagujące z białkiem natywnym. Sutcliffe i wsp., powyżej, na 663. Przeciwciała otrzymane przez immunizację peptydami lub polipeptydami niosącymi epitop antygenowy są użyteczne w detekcji naśladowanych białek, i przeciwciała specyficzne dla różnych peptydów mogą być użyte do śledzenia przeznaczenia różnych regionów prekursora białka, które przechodzi obróbkę posttranslacyjną. Peptydy i przeciwciała przeciwko peptydom mogą być zastosowane w różnych jakościowych lub ilościowych oznaczeniach naśladowanych białek, na przykład w oznaczeniach kompetycyjnych odkąd pokazano, że te nawet krótkie peptydy (np. około 9 aminokwasów) mogą wiązać i wypierać większe peptydy w oznaczeniach immunoprecypitacyjnych. Zobacz, na przykład Wilson, LA. i wsp., Cell 37: na 777 (1984). Opisane tu przeciwciała przeciwko peptydom są także użyteczne do oczyszczania naśladowanych białek, na przykład, przez dobrze znane w tej dziedzinie sposoby z użyciem chromatografii adsorpcyjnej. Niosące epitopy antygenowe peptydy i polipeptydy według wynalazku zaprojektowane według powyższych wskazówek dogodnie zawierają sekwencję przynajmniej siedmiu, w szczególności przynajmniej dziewięciu a zwłaszcza pomiędzy około 15 a około 30 aminokwasów, zawartą w sekwencji aminokwasowej polipeptydu według wynalazku. Jednakże, peptydy lub polipeptydy zawierające większą część sekwencji aminokwasowej peptydu według wynalazku obejmujące około 30 do około 50 aminokwasów, lub dowolną większą długość oraz obejmujące całą sekwencję aminokwasową polipeptydu według wynalazku, także są uważane za peptydy lub polipeptydy według wynalazku niosące epitop i także są użyteczne do indukowania przeciwciał, które reagują z naśladowanym białkiem. Dogodnie, sekwencja aminokwasowa peptydu niosącego epitop jest wybierana tak, aby zapewnić znaczącą rozpuszczalność w rozpuszczalnikach wodnych (tj. sekwencja zawiera względnie hydrofilowe reszty a wysoce hydrofobowe sekwencje są dogodnie unikane); i sekwencje zawierające reszty prolinowe są szczególnie zalecane. Peptydy i polipeptydy według wynalazku niosące epitop mogą być wytwarzane dowolnym konwencjonalnym sposobem wytwarzania peptydów lub polipeptydów, w tym sposobów z użyciem rekombinowanego DNA z wykorzystaniem cząsteczek kwasu nukleinowego według wynalazku. Na przykład krótka sekwencja aminokwasowa niosąca epitop może być przyłączona do większego poli-

26 26 PL B1 peptydu, który działa jako nośnik podczas rekombinowanego wytwarzania i oczyszczania, jak również podczas immunizacji w celu wytworzenia przeciwciał przeciwko peptydowi. Peptydy niosące epitop mogą być także zsyntetyzowane przy użyciu znanych sposobów syntezy chemicznej. Na przykład, Houghten opisał prosty sposób syntezy dużej liczby peptydów, takiej jak mg 248 różnych peptydów o 13 resztach reprezentujących pojedyncze warianty aminokwasowe segmentu polipeptydu HAI, które były przygotowane i scharakteryzowane (przez badania wiązania typu ELISA) w czasie krótszym niż cztery tygodnie. Houghten, R.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: (1985). Ten proces Jednoczesnej Wielotorowej Syntezy Peptydów (SMPS, ang. Simultaneous Multiple Peptide Synthesis) (SMPS) jest dalej opisany w Patencie USA Nr dla Houghten i wsp. (1986). W tej procedurze poszczególne żywice do syntezy w fazie stałej różnych peptydów są trzymane w odrębnych pojemnikach przepuszczalnych dla rozpuszczalnika umożliwiających optymalne użycie wielu identycznych powtarzalnych etapów występujących w sposobach syntezy w fazie stałej. Całkowicie ręczna procedura pozwala na równoczesne przeprowadzenie lub więcej syntez. Houghten i wsp., powyżej, na Niosące epitopy peptydy i polipeptydy według wynalazku niosące epitop są stosowane do indukowania przeciwciał sposobami dobrze znanymi w tej dziedzinie. Zobacz, na przykład, Sutcliffe i wsp., powyżej; Wilson i wsp., powyżej; Chow, M. i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: ; i Bittle, F. J. i wsp., J. Gen. Virol. 66: (1985). Ogólnie, zwierzęta mogą być immunizowane wolnym peptydem; jednakże miano przeciwciała przeciwko peptydowi może być zwiększone przez sprzężenie peptydu z nośnikiem makr o- cząsteczkowym, takim jak hemocyjanina ze skałoczepa Megathura crenulata (KLH, ang. keyhole limpet hemocyanin) lub anatoksyna tężca. Na przykład, peptydy zawierające cysteinę mogą być sprzężone z nośnikiem przy użyciu łącznika, takiego jak ester maleimidobenzoilo-n- -hydroksysukcynimidu (MBS, ang. maleimidobenzoyl-n-hydroxysuccinimide ester), podczas gdy inne peptydy mogą być sprzężone z nośnikiem przy użyciu bardziej ogólnego środka łączącego, takiego jak glutaraldehyd. Zwierzęta, takie jak króliki, szczury i myszy są immunizowane zarówno wolnymi jak i sprzężonymi z nośnikiem peptydami, na przykład, przez śródotrzewnowe i/lub śródskórne wstrzyknięcie emulsji zawierających około 100 μg peptydu lub białka nośnikowego oraz adiuwanta Freunda. Koniecznych może być kilka wstrzyknięć przypominających, w odstępach około dwóch tygodni, w celu otrzymania użytecznego miana przeciwciała przeciwko peptydowi, które może być wykryte, na przykład, przez oznaczenie ELISA przy użyciu wolnego peptydu zaadsorbowanego do powierzchni stałej. Miano przeciwciał przeciwko peptydowi w surowicy z immunizowanego zwierzęcia może być zwiększone przez selekcję przeciwciał przeciwko peptydowi, na przykład, przez adsorpcję peptydu na podłożu stałym i elucję wybranych przeciwciał sposobami dobrze znanymi w tej dziedzinie. Niosące epitop immunogenne peptydy według wynalazku, tj. te części białka, które wywołują odpowiedź w postaci przeciwciał gdy całe białko jest immunogenem, są identyfikowane sposobami znanymi w tej dziedzinie. Na przykład, Geysen i wsp., 1984, powyżej, ujawnia procedurę szybkiej równoczesnej syntezy na podłożach stałych setek peptydów o wystarczającej czystości do reakcji w teście immunosorpcji enzymozależnej. Oddziaływanie zsyntetyzowanych peptydów z przeciwciałami jest wtedy łatwo wykrywane bez usuwania ich z podłoża. W ten sposób specjalista w tej dziedzinie może w sposób rutynowy zidentyfikować peptyd niosący epitop immunogenny pożądanego białka. Na przykład, immunologicznie ważny epitop w białku płaszcza wirusa powodującego chorobę pyska i racic został zlokalizowany przez Geysen i wsp. z rozdzielczością siedmiu aminokwasów przez syntezę nakładającego się zestawu wszystkich 208 możliwych heksapeptydów pokrywających całą sekwencję białka złożonego z 213 aminokwasów. Następnie został zsyntetyzowany kompletny zestaw zastąpionych aminokwasów, w którym wszystkie 20 aminokwasów było podstawionych kolejno w każdej pozycji wewnątrz epitopu i oznaczono specyficzność reakcji z przeciwciałem odpowiadającą poszczególnym aminokwasom. Tak więc, analogi peptydów według wynalazku niosące epitopy mogą być rutynowo wytwarzane przy użyciu tego sposobu. Patent USA Nr dla Geysen (1987) dalej opisuje ten sposób identyfikacji peptydu niosącego epitop pożądanego białka. Ponadto, Patent USA Nr dla Geysen (1990) opisuje ogólny sposób wykrywania lub oznaczania sekwencji monomerów (aminokwasów lub innych związków), które są topologicznym odpowiednikiem epitopu (tj. mimotopem ), która jest komplementarna do określonego paratopu (miejsca wiążącego antygen) przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania. Bardziej ogólnie, Patent

27 PL B1 27 USA Nr dla Geysen (1989) opisuje sposób wykrywania lub oznaczania sekwencji monomerów, które są topologicznymi odpowiednikami liganda, który jest komplementarny do miejsca wiążącego ligand określonego receptora będącego przedmiotem zainteresowania. Podobnie, Patent USA Nr dla Houghten, R. A. i wsp. (1996) dotyczący Mieszanin Całkowicie Alkilowanych Oligopeptydów ujawnia liniowe C1-C7-alkilo całkowicie alkilowane oligopeptydy oraz zestawy i biblioteki takich peptydów, jak również sposoby stosowania takich zestawów i bibliotek oligopeptydów do oznaczania sekwencji całkowicie alkilowanego oligopeptydu, który w sposób preferencyjny wiąże się do cząsteczki akceptorowej będącej przedmiotem zainteresowania. Tak więc, niepeptydowe analogi peptydów według wynalazku niosących epitop także mogą być wytworzone w sposób rutynowy przy użyciu tych sposobów. Zastosowanie enzymów lipolitycznych w procesach przemysłowych. Wynalazek dotyczy także zastosowania enzymu lipolitycznego według wynalazku w pewnych procesach przemysłowych. Pomimo długiego doświadczenia w zakresie tych procesów, enzymy lipolityczne według wynalazku cechują się szeregiem znaczących zalet względem enzymów dotychczas stosowanych. W zależności od określonego zastosowania te zalety mogą obejmować aspekty, takie jak niższe koszty produkcji, wyższa specyficzność względem substratu, mniejsza antygenność, mniejsze niepożądane aktywności uboczne, wyższe wydajności w porównaniu z produkcją przy użyciu odpowiedniego mikroorganizmu, bardziej odpowiednie zakresy ph i temperatury, lepsze smaki produktu końcowego, jak również jakość żywności i aspekty koszerności. Niniejszy wynalazek także dotyczy sposobów wytwarzania ciasta lub wyrobu piekarniczego obejmujących dodawanie do ciasta skutecznej ilości enzymu lipolitycznego według niniejszego wynalazku, która polepsza jedną lub więcej właściwości ciasta lub wyrobu piekarniczego otrzymanego z ciasta w porównaniu z ciastem lub wyrobem piekarniczym, do którego polipeptyd nie został dodany. Określenie dodawanie do ciasta jest zdefiniowane tutaj jako dodawanie enzymu lipolitycznego według wynalazku do ciasta, do dowolnego składnika, z którego ciasto jest przygotowywane i/lub do wolnej mieszaniny składników ciasta, z których ciasto jest wytwarzane. Innymi słowy, enzym lipolityczny według wynalazku może być dodany na dowolnym etapie wytwarzania ciasta i może być dodany na jednym, dwóch lub większej liczbie etapów. Enzym lipolityczny według wynalazku jest dodawany do składników ciasta, które jest zagniatane i pieczone w celu wytworzenia wyrobu piekarniczego przy użyciu sposobów dobrze znanych w tej dziedzinie. Zobacz, na przykład, Patent USA Nr , EP- A , JP-A , JP-A i JP-A Określenie skuteczna ilość jest zdefiniowane tutaj jako ilość enzymu lipolitycznego według wynalazku, która jest wystarczająca do dostarczenia mierzalnego efektu na przynajmniej jednej będącej przedmiotem zainteresowania właściwości ciasta i/lub wyrobu piekarniczego. Określenie polepszona właściwość jest zdefiniowana tutaj jako dowolna właściwość ciasta i/lub wyrobu piekarniczego uzyskanego z ciasta, szczególnie wyrobu piekarniczego, która jest ulepszona przez działanie enzymu lipolitycznego według wynalazku w porównaniu do ciasta lub produktu, do którego enzym lipolityczny według wynalazku nie jest włączony. Ulepszona właściwość może obejmować, lecz bez ograniczenia, zwiększoną wytrzymałość ciasta, zwiększoną elastyczność ciasta, ulepszoną rozciągliwość ciasta, ulepszony smak wyrobu piekarniczego, ulepszone właściwości opóźniające czerstwienie wyrobu piekarniczego. Ulepszona właściwość może być ustalona przez porównanie ciasta i/lub wyrobu piekarniczego wytwarzanego z i bez dodania polipeptydu według niniejszego wynalazku zgodnie ze sposobami według niniejszego wynalazku, które są opisane poniżej w Przykładach. Cechy organoleptyczne mogą być ocenione przy zastosowaniu procedur dobrze ustalonych w przemyśle piekarniczym i mogą obejmować, na przykład ocenę przez zespół przeszkolonych osób testujących smak. Określenie zwiększona wytrzymałość ciasta jest zdefiniowane tutaj jako właściwość ciasta, która nadaje mu ogólnie bardziej elastyczne właściwości i/lub wymaga więcej pracy włożonej do zarobienia i ukształtowania. Określenie zwiększona elastyczność ciasta jest zdefiniowane tutaj jako właściwość ciasta, która nadaje mu większą tendencję do ponownego przyjmowania jego oryginalnego kształtu po poddaniu pewnemu fizycznemu naprężeniu. Określenie zwiększona stabilność ciasta jest zdefiniowane tutaj jako właściwość, która nadaje mu mniejszą podatność na obróbkę mechaniczną, lepiej przez to utrzymując jego kształt i objętość. Określenie zmniejszona lepkość ciasta jest zdefiniowane tutaj jako właściwość ciasta, która nadaje mu mniejszą tendencję do przylegania do powierzchni, np. w urządzeniu wytwarzającym ciasto

28 28 PL B1 i jest zarówno wyznaczana empirycznie przez wykwalifikowanego piekarza degustującego lub mierzona przez zastosowanie urządzenia analizującego teksturę (np. TAXT2), jak to jest znane w tej dziedzinie. Określenie ulepszona rozciągliwość ciasta jest zdefiniowane tutaj jako właściwość ciasta, dzięki której może ono być poddane zwiększonemu naprężeniu lub rozciągnięciu bez rozerwania. Określenie ulepszona podatność na przetwarzanie automatyczne ciasta jest zdefiniowane tutaj jako właściwość ciasta, która nadaje mu ogólnie mniejszą lepkość i/lub większą jędrność i/lub większą elastyczność. Określenie zwiększona objętość produktu piekarniczego jest mierzone jako specyficzna objętość danego bochenka chleba (objętość/masa) ustalonej typowo w tradycyjnym sposobie wypierania siemienia rzepakowego (ang. rapeseed displacement method). Określenie ulepszona struktura miąższu wyrobu piekarniczego jest zdefiniowane tutaj jako właściwość wyrobu piekarniczego charakteryzująca się delikatniejszymi i/lub cieńszymi ścianami komórek w miąższu i/lub bardziej jednolitym/homogennym rozmieszczeniem komórek w miąższu i jest zazwyczaj wyznaczana empirycznie przez wykwalifikowanego piekarza degustującego. Określenie ulepszona delikatność wyrobu piekarniczego jest przeciwna do jędrności i jest zdefiniowane tutaj jako właściwość wyrobu piekarniczego, dzięki której jest łatwiej ściskany i jest ona wyznaczana zarówno empirycznie przez wykwalifikowanego piekarza degustującego lub mierzona przy zastosowaniu urządzenia analizującego teksturę (np. TAXT2), jak jest to znane w tej dziedzinie. Określenie ulepszony smak wyrobu piekarniczego jest wyznaczany przez zespół przeszkolonych osób testujących smak. Określenie ulepszone właściwości wyrobu piekarniczego opóźniające czerstwienie jest zdefiniowane tutaj jako właściwości produktu piekarniczego, dzięki którym posiada on zmniejszoną szybkość pogarszania się parametrów jakości, np. miękkości i/lub elastyczności podczas przechowywania. Określenie ciasto jest zdefiniowane tutaj jako mieszanina mąki i innych składników wystarczająco jędrna do zagniatania i wałkowania. Ciasto może być świeże, mrożone, wstępnie wyrobione lub wstępnie upieczone. Wytwarzanie mrożonego ciasta jest opisane przez Kulp i Lorenz we Frozen and Refrigerated Doughs and Batters. Określenie wyrób piekarniczy jest zdefiniowane tutaj jako dowolny produkt przygotowany z ciasta, zarówno o charakterze miękkim jak i chrupiącym. Przykładami wyrobów piekarniczych, typu czy to białego, lekkiego lub ciemnego, które mogą być w sposób dogodny wytwarzane według niniejszego wynalazku są chleb (w szczególności chleb biały, pełnoziarnisty lub żytni), typowo w postaci kromek lub bochenków, chleb typu francuskiej bagietki, makaron, pita, tortille, paszteciki taco, ciastka, naleśniki, biszkopty, ciasteczka, ciastka z nadzieniem, ciasto parowane, oraz pieczywo chrupkie, i tym podobne. Enzym lipolityczny według niniejszego wynalazku i/lub enzymy dodatkowe do zastosowania w sposobach według niniejszego wynalazku mogą być w dowolnej postaci odpowiedniej do użycia w danym procesie, np. w postaci suchego proszku, proszku zbrylonego, lub granulatu, w szczególności granulatu niewytwarzającego pyłu, ciekłej, w szczególności stabilizowanej cieczy, lub enzymu zabezpieczonego, tak jak opisano w W001/11974 i W002/ Granulaty i proszki zbrylone mogą być przygotowane przy użyciu konwencjonalnych sposobów, np. przez natryskiwanie enzymu lipolitycznego według wynalazku na nośnik w granulatorze z ciekłym złożem. Nośnik może składać się z poszczególnych rdzeni posiadających odpowiedni rozmiar cząsteczki. Nośnik może być rozpuszczalny lub nierozpuszczalny, np. sól (taka jak NaCl lub siarczan sodu), cukier (taki jak sacharoza lub laktoza, alkohol cukrowy (taki jak sorbitol), skrobia, ryż, kasza kukurydziana lub soja. Enzym lipolityczny według wynalazku i/lub dodatkowe enzymy mogą być zawarte w preparatach o wolnym uwalnianiu składnika. Sposoby wytwarzania preparatów o wolnym uwalnianiu składnika są dobrze znane w tej dziedzinie. Dodanie stabilizatorów dopuszczalnych w żywności, takich jak cukier, alkohol cukrowy lub poliole i/lub kwas mlekowy lub inny kwas organiczny według opracowanych sposobów może, na przykład, stabilizować ciekłe preparaty enzymatyczne. Enzym lipolityczny według wynalazku może także być włączony do kompozycji drożdży, jak ujawniono w EP-A , EP-A i W002/ W celu włączenia (dodawania) do wstępnych mieszanin mąki zalecane jest, by polipeptyd według wynalazku był w postaci produktu suchego, np. niepylącego granulatu, podczas gdy do włączenia do cieczy zalecana jest postać ciekła.

29 PL B1 29 Do ciasta może być włączony jeden lub więcej dodatkowych enzymów. Dodatkowy enzym może być dowolnego pochodzenia, w tym pochodzenia ssaczego lub roślinnego i w szczególności mikrobiologicznego (bakteryjnego, drożdżowego lub grzybowego) i może być uzyskany technikami konwencjonalnie stosowanymi w tej dziedzinie. W zalecanym wykonaniu dodatkowym enzymem może być amylaza, taka jak alfa-amylaza (użyteczna do dostarczania cukrów fermentowalnych przez drożdże i opóźniająca czerstwienie) lub beta- -amylaza, glukanotransferaza cyklodekstranu, peptydaza, w szczególności, egzopeptydaza (użyteczna we wzmacnianiu smaku), transglutaminaza, lipaza (użyteczna do modyfikacji lipidów obecnych w cieście lub składnikach ciasta w celu niezmiękczenia ciasta), fosfolipaza, celulaza, hemicelulaza, w szczególności pentozonaza, taka jak ksylonaza (użyteczna do częściowej hydrolizy pentoz, które zwiększają rozciągliwość ciasta), proteaza (użyteczna do zmiękczania glutenu, w szczególności kiedy stosowana jest ciężka mąka pszenna), izomeraza wiązań dwusiarczkowych w białku, np. izomeraza wiązań dwusiarczkowych w białku, jak ujawniono w WO 95/00636, glikozylotransferaza, peroksydaza (użyteczna do polepszania konsystencji ciasta), laktaza, lub oksydaza, np. oksydaza glukozy, oksydaza heksozy, oksydaza aldozy, oksydaza piranozy, lipooksygenaza lub oksydaza L-arainokwasu (użyteczna w polepszaniu konsystencji ciasta). W przypadku gdy jedna lub więcej dodatkowych aktywności enzymatycznych ma być dodanych w sposobach według niniejszego wynalazku, te aktywności mogą być dodane osobno lub razem z polipeptydem według wynalazku, opcjonalnie jako składnik(składniki) kompozycji polepszającej chleb i/lub polepszającej ciasto. Inne aktywności enzymatyczne mogą być dowolnymi enzymami opisanymi powyżej i mogą być dawkowane według opracowanych praktyk piekarniczych. Niniejszy wynalazek dotyczy także sposobu wytwarzania wyrobu piekarniczego obejmującego pieczenie ciasta uzyskanego sposobem według niniejszego wynalazku w celu uzyskania wyrobu piekarniczego. Pieczenie ciasta w celu uzyskania wyrobu piekarniczego może być wykonane przy użyciu sposobów dobrze znanych w tej dziedzinie. Zgodnie z wynalazkiem opisano także odpowiednio ciasta i wyroby piekarnicze wytworzone sposobami według niniejszego wynalazku. Zgodnie z wynalazkiem opisano także mieszaninę wstępną, np. w postaci kompozycji mąki, do ciasta i/lub wyrobów piekarniczych wytworzonych z ciasta, w których wstępna mieszanina zawiera polipeptyd według niniejszego wynalazku. Określenie mieszanina wstępna jest zdefiniowane tutaj jako rozumiane w jego konwencjonalnym znaczeniu, tj. jako mieszanina środków piekarniczych, ogólnie obejmujących mąkę, które mogą być zastosowane nie tylko w przemysłowych fabrykach/urządzeniach do wypieku pieczywa, ale także w piekarniach detalicznych. Mieszanina wstępna może być przygotowana przez zmieszanie polipeptydu lub kompozycji polipeptydu według niniejszego wynalazku polepszającej chleb i/lub polepszającej ciasto z odpowiednim nośnikiem, takim jak mąka, skrobia, cukier lub sól. Mieszanina wstępna może zawierać inne aktywności polepszające ciasto i/lub aktywności polepszające chleb, np. dowolną aktywność, w tym enzymatyczną, wymienioną powyżej. Zgodnie z wynalazkiem opisano także dodatki piekarnicze w postaci granulatu lub zbrylonego proszku, który zawiera polipeptyd według niniejszego wynalazku. Dodatek piekarniczy dogodnie posiada wąski rozkład rozmiaru cząsteczki, w którym ponad 95% (masowo) cząsteczek jest w zakresie od 25 do 500 μm. Przy wytwarzaniu ciasta i chleba niniejszy wynalazek może być stosowany w kombinacji z substancjami pomagającymi w przetwarzaniu zdefiniowanymi wcześniej, takimi jak chemiczne substancje pomagające w przetwarzaniu, takie jak oksydanty (np. kwas askorbinowy), środki redukujące (np. L-cysteina), oksydoreduktazy (np. oksydaza glukozy) i/lub inne enzymy, takie jak enzymy modyfikujące polisacharydy (np. -amylaza, hemicelulaza, enzymy rozgałęziające, itp.) i/lub enzymy modyfikujące białka (endopeptydaza, egzopeptydaza, enzymy rozgałęziające, itp.). P r z y k ł a d 1 Fermentacja Aspergillus niger Enzymy lipolityczne kodowane przez sekwencję nukleotydową dostarczoną tutaj zostały uzyskane przez skonstruowanie plazmidów ekspresyjnych zawierających sekwencje DNA, transformację szczepu A. nidulans tym plazmidem i hodowlę szczepów Aspergillus niger w następujący sposób. Świeże spory ( ) szczepów A. niger zostały zaszczepione w 20 ml pożywki CSL (kolba 100 ml, korek) hodowane przez godziny w 34 C i 170 rpm. Po zaszczepieniu 5-10 ml hodowli wstępnej w 100 ml pożywki CSM (kolba 500 ml, korek) szczepy podlegały fermentacji w 34 C i 170 rpm przez 3-5 dni.

30 30 PL B1 Supernatanty pozbawione komórek zostały uzyskane przez wirowanie w probówkach Greinera 50 ml (30 minut, 5000 rpm). Supernatanty wstępnie przefiltrowano przez filtr z mikrowłóknami GF/A Whatman Glass (150 mm AE) w celu usunięcia większych cząstek, doprowadzono do ph przy użyciu 4 N KOH (jeśli konieczne) i przefiltrowano sterylnie przez filtr 0,2 μm (nakładany na butelkę) z podciśnieniem w celu usunięcia materiału grzybowego. Supernatanty przechowywano w 4 C (lub - 20 C). Pożywka CSL składała się z (w ilości na litr): 100 g kostek zmacerowanej kukurydzy (Roquette), 1 g NaH 2 PO 4 *H 2 O, 0,5 g MgSO 4 *7H 2 O, 10 g glukozy*h 2 O i 0,25 g Basildonu (środek przeciwpieniący). Składniki rozpuszczono w wodzie destylowanej i ph doprowadzono do 5,8 przy użyciu NaOH lub H 2 SO 4 ; 100 ml kolby z korkiem i kulką z pianki napełniono 20 ml bulionu fermentacyjnego i sterylizowano przez 20 minut w 120 C po czym, po schłodzeniu do temperatury pokojowej do każdej kolby dodano 200 μl roztworu zawierającego 5000 IU/ml penicyliny i 5 mg/ml streptomycyny. Pożywka CSM składała się z (w ilości na litr) : 150 g maltozy*h 2 O, 60 g Soytonu (pepton), 1 g NaH 2 PO 4 *H 2 O, 15 g MgS0 4 *7H 2 0, 0,08 g Tween 80, 0,02 g Basildonu (środek przeciwpieniący), 20 g MES, 1 g L-argininy. Składniki rozpuszczono w wodzie destylowanej i doprowadzono ph do 6,2 przy użyciu NaOH lub H 2 SO 4 ; kolby 500 ml z korkiem i kulką z pianki napełniono 100 ml bulionu fermentacyjnego i sterylizowano przez 20 minut w 120 C po czym po schłodzeniu do temperatury pokojowej do każdej kolby dodano 1 ml roztworu zawierającego 5000 IU/ml penicyliny i 5 mg/ml streptomycyny. P r z y k ł a d 2 Oczyszczanie enzymów lipolitycznych według wynalazku Etap 1 - Wytwarzanie ultraprzesączów. Supernatanty kultur uzyskanych jak w Przykładzie 1 ultrafiltrowano w celu usunięcia drobnocząsteczkowych zanieczyszczeń, które mogłyby wpływać na oznaczenia aktywności enzymatycznych i testów piekarniczych. Ultrafiltrację 30 ml supernatantu wykonano w systemie Millipore Labscale TFF wyposażonym w filtr zatrzymujący cząsteczki o wielkości powyżej 10 kda. W zależności od ich koloru, próbki przemyto 3-5 razy 40 ml objętościami zimnego 100 mm buforu fosforanowego ph 6,0 zawierającego 0,5 mm CaCl 2. Końcowa objętość roztworu enzymu wynosiła 30 ml i jest dalej określana jako ultraprzesącz. Etap 2 - Oznaczanie stężenia enzymów lipolitycznych przy użyciu A280 i HPSEC. Stężenie enzymów lipolitycznych w ultraprzesączu obliczono z ekstynkcji w 280 nm (A280) przypisanej enzymom lipolitycznym i obliczonego molekularnego współczynnika ekstynkcji enzymów lipolitycznych. Pomiar A280 wykonano w spektrofotometrze Uvikon XL Secomam (Beun de Ronde, Abcoude, Holandia). Molekularny współczynnik ekstynkcji enzymu może być obliczony z liczby reszt tyrozyny, tryptofanu i cysteiny na cząsteczkę enzymu (S.C. Gill i P.H. von Hippel, Anal. Biochem. 182, (1989)). Molekularne współczynniki ekstynkcji tych aminokwasów wynoszą odpowiednio 1280, 5690 i 120 M -1 cm -1. Liczba reszt tyrozyny, tryptofanu i cysteiny w enzymach lipolitycznych według wynalazku może być wywnioskowana z sekwencji białek wybranych z grupy składającej się z NR ID. SEKW.: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 i 39. Obliczone współczynniki ekstynkcji enzymów lipolitycznych według wynalazku są zebrane w Tabeli 2. Enzym Iipolityczny NR ID. SEKW.: T a b e l a 2 # aminokwasów Obliczona M. W. (Da) Obliczony współczynnik ekstynkcji w 280 nm Trp Tyr Cys M -1.cm -1 (1 mg/ml) -1.cm NBE NBE NBE NBE NBE NBE

31 PL B NBE NBE NBE NBE NBE NBE NBE cd. Tabeli 2 Ekstynkcja ultraprzesączu w 280 nm (A280), która jest przyporządkowana enzymom lipolitycznym zależy od czystości próbki enzymu. Tę czystość oznaczono przy użyciu HPSEC (ang. High Performance Size Exclusion Chromatography, Wysokowydajna chromatografia na sitach molekularnych) na kolumnie TSK SW-XL(300*7,8 mm; zakres MW kda). Bufor do elucji składał się z 25 mm buforu fosforanu sodu ph 6,0 i został użyty przy przepływie 1 ml/min. Wstrzykiwano próbki o objętości μl. Mierzono absorbancję w 280 nm. A280 w ultrafiltracie przypisaną enzymowi lipolitycznemu według wynalazku uzyskano ze stosunku powierzchni piku odpowiedniego piku enzymu lipolitycznego w chromatogramie do całkowitej powierzchni pików absorbujących w 280 nm. Stężenie enzymu lipolitycznego w ultraprzesączu obliczono następnie poprzez pomnożenie A280 ultraprzesączu przez stosunek opisany powyżej i podzieleniu przez obliczony współczynnik ekstynkcji (roztwór 1 mg/ml - kolumna najbardziej po prawej stronie w Tabeli 2) dla każdego enzymu lipolitycznego. P r z y k ł a d 3 Pomiary aktywności Supernatanty wolne od komórek uzyskane w Przykładzie 1 poddano oznaczeniom na aktywność lipazy, fosfolipazy i galaktolipazy jak zebrano w Tabeli 3. T a b e l a 3. Aktywności enzymów lipolitycznych w supernatantach wolnych od komórek, takich jak przygotowane w Przykładzie 1. Enzym lipolityczny lipaza fosfolipaza A lizofosfolipaza galaktolipaza NBE NBE NBE NBE NBE NBE NBE NBE NBE NBE = brak różnicy z kontrolą; +/++/+++ = wyższe niż kontrola; Aktywność lipazy oznaczono spektrofotometrycznie przy użyciu 2,3-merkapto-1-propanolotrimaślanu (TBDMP) jako substratu. Lipaza hydrolizuje wiązanie siarczkowe TBDMP uwalniając przez to kwas tiobutanowy, który w następnej reakcji z 4,4-ditiodipirydyną (DTDP) tworzy 4-tiopirydon. Ten ostatni jest w tautomerycznej równowadze z 4-merkaptopirydyną, która absorbuje w 334 nm. Reakcja jest przeprowadzana w 0,1 M buforze octanowym ph 5,0 zawierającym 0,2% Triton-X100, 0,65 mm TBDMP i 0,2 mm DTDP w 37 C. Jedna jednostka lipazy jest zdefiniowana jako ilość enzymu, która uwalnia 1 mikromol kwasu 4-tiobutanowego w ciągu minuty w ustalonych warunkach reakcji.

32 32 PL B1 Fosfolipazę A oznaczono spektrofotometrycznie przy użyciu 1,2-ditiodioktanoilo-fosfatydylocholiny jako substratu. Fosfolipaza A hydrolizuje wiązanie siarczkowe w pozycji 1 (PLA1) lub pozycji 2 (PLA2) uwalniając przez to kwas 4-tio-oktanowy, który następnie reaguje z 4,4'-ditiopirydyną tworząc 4-tiopirydon. Ten ostatni jest w tautomerycznej równowadze z 4-merkaptopirydyną, która absorbuje w 334 nm. Reakcja jest przeprowadzana w 0,1 M buforze octanowym ph 4,0 zawierającym 0,2% Triton-X100, 0,65 mm substrat i 0,2 mm DTDP w 37 C. Jedna jednostka fosfolipazy A lipazy jest zdefiniowana jako ilość enzymu, która uwalnia 1 mikromol kwasu 4 tio-oktanowego w ciągu minuty w ustalonych warunkach reakcji. Aktywność lizofosfolipazy oznaczono z zastosowaniem spektroskopii 31 P-NMR przy użyciu lizofosfatydylocholiny jako substratu. Lizofosfolipaza hydrolizuje wiązanie estrowe uwalniając przez to kwas tłuszczowy od części glicerolowej. Tak powstała glicerolofosfocholina jest mierzona przy użyciu NMR. Reakcja jest przeprowadzana w 50 mm buforze kwasu octowego ph 4,5 zawierającego ponadto 1 mg/ml lizofosfatydylocholiny i 5 mm CaCl 2 przez 30 minut w 55 C. Jedna jednostka fosfolipazy (LPC) jest zdefiniowana jako ilość enzymu, która tworzy 1 mikromol 4-glicerolofosfocholiny w ciągu minuty w ustalonych warunkach reakcji. Aktywność galaktolipazy oznaczono z zastosowaniem spektroskopii H-NMR przy użyciu digalaktozylodiglicerydu jako substratu, według sposobu opisanego przez Hirayama i Matsuda (1972) Agric. Biol. Chem. 36, Galaktolipaza hydrolizuje wiązanie estrowe pomiędzy kwasami tłuszczowymi i rdzeniem glicerolowym uwalniając przez to obydwa kwasy tłuszczowe. Reakcja jest przeprowadzana w 50 mm buforze kwasu octowego ph 4,5 zawierającego ponadto 4 mm CaCl 2, 0,2% TritonX-100 i 1 mg/ml digalaktozylodiglicerydu (Lipid Products) przez 30 minut w 30 C. Jedna jednostka galaktolipazy jest zdefiniowana jako ilość enzymu, który tworzy 1 mikromol kwasu tłuszczowego w ciągu minuty w ustalonych warunkach reakcji. Ultraprzesącze uzyskane w Przykładzie 2 poddano pomiarom aktywności enzymu FAU. Aktywność grzybowej alfa-amylazy mierzono przy użyciu tabletek testowych Phadebas Amylase (Pharmacia). Tabletki Phadebas zawierają substrat skrobiowy nierozpuszczalny w wodzie i niebieski barwnik związany przez wiązanie krzyżowe do substratu. Substrat jest hydrolizowany przez grzybową amylazę uwalniając zabarwione rozpuszczalne maltodekstryny, które przechodzą do roztworu. Krzywą kalibracyjną przygotowano przy użyciu roztworu zawierającego referencyjną aktywność grzybowej alfa-amylazy. Z odniesienia i nieznanych próbek przygotowano odpowiednie rozcieńczenia w 50 mm buforze kwasu jabłkowego ph 5,5. Próbki 5 ml inkubowano w 30 C przez 5 minut, dodano tabletkę Phadebas i po 15 minutach reakcja została zatrzymana przez dodanie 1,0 ml 0,5 N wodorotlenku sodu. Mieszaninę pozostawiono do ostygnięcia do temperatury pok o- jowej, po czym dodano 4,0 ml wody, wstrząśnięto ręcznie i po 15 minutach próbki zostały żwirowane w 4700 rpm przez 10 minut. Zmierzono ekstynkcję górnych warstw w 620 nm. OD 620 nm jest miarą aktywności grzybowej alfa amylazy. Jedna jednostka grzybowej amylazy (FAU) jest zdefiniowana tutaj jako ilość enzymu, która przekształca 1 gram skrobi (100% suchej masy) w ciągu godziny w produkt posiadający transmisję w 620 nm po reakcji z roztworem jodu o znanym stężeniu w ustalonych warunkach reakcji. T a b e l a 4. FAU i białko w ultraprzesączach takich, jak przygotowane w Przykładzie 2. enzym lipolityczny białko (mg/ml) z analizy 280 nm drożdżowa amylaza (FAU/ml) NBE28 2,3 4,5 NBE029 1,3 3,0 NBE030 0,4 2,6 NBE031 0,1 2,5 NBE032 1,0 0,3 NBE033 n.o. 0,3 NBE034 n.o. 2,7

33 Upieczony wypiek Ciasto PL B NBE036 n.o. 3,4 cd. Tabeli 4 NBE038 2,0 3,7 NBE039 2,2 0,6 NBE043 0,1 0,2 NBE045 n.o. 4,0 NBE042 1,6 1,5 Dodatkowo do aktywności wspomnianych w Tabeli 4, obecne były także mniejsze aktywności glukoamylazy, jednak w tak małych ilościach, że te enzymy nie wpływały na doświadczenia piekarnicze opisane w przykładzie 4. P r z y k ł a d 4 Doświadczenia piekarnicze - bochenki testowe Bochenki testowe pieczono ze 150 g porcji ciasta uzyskanego przez zmieszanie 200 g mąki (Kolibri /Ibis w stosunku 80/20), 1,4 g suszonych drożdży piekarniczych (Fermipan ), 4 g soli, 3 g cukru, 10 mg kwasu askorbinowego, 116 g wody i 2 g tłuszczu. Po mieszaniu przez 6 minut i 15 sekund w mikserze szpilowym ciasto podzielono na porcje 150 g i pozostawiono do wyrośnięcia przez 45 minut w 30 C, podziurawiono, pozostawiono do wyrośnięcia przez następne 25 minut, zarobiono i uformowano. Wyrastanie zachodziło we względnej wilgotności %. Po końcowym wyrośnięciu trwającym 70 minut w 30 C, ciasto pieczono przez 20 minut w 225 C. Różne efekty (Tabele 5 i 6) różnych enzymów lipolitycznych w doświadczeniach piekarniczych porównywano z kontrolą zawierającą tę samą ilość grzybowej amylazy, którą dodano zamiast dawki ultraprzesączu (dla aktywności grzybowej amylazy w ultraprzesączach zobacz Tabelę 4). Było to konieczne, ponieważ ilości grzybowej amylazy dodane z enzymami lipolitycznymi specyficznie wpływały na objętość bochenka, nie na inne parametry. Objętość wypieków z kontrolną ilością dodanej grzybiczej amylazy była przyjmowana jako 100%. T a b e l a 5 Efekt Wynik Lepkość ciasta Za lepkie Lepkie Wypiek kontrolny Dużo Iepsza Wyśmienicie suche Rozciągliwość ciasta Za krótkie Krótsze niż kontrola Wypiek kontrolny Dobra Zbyt długie Struktura miąższu Słaba Nie-jednolita Wypiek kontrolny Dobra Wyśmienita Kolor skórki Prawie biały Zbyt jasny Wypiek kontrolny Kolor miąższu Dużo za żółty Za żółty Wypiek kontrolny Czerstwienie Dużo za jędrne Za jędrne Wypiek kontrolny Wyśmienity Wyśmienity Miększy Zbyt ciemny Absolutnie biały Wyśmienity Objętość bochenka oznaczono przy użyciu Urządzenia do Pomiaru Objętości Pieczywa BVM-3 (ang. Bread Volume Measurer BVM-3) (RI Cards Instruments AB, Viken, Szwecja). Zasada tego pomiaru polega na odbiciu ultradźwięku mierzonego przez czujnik wokół obracającego się pieczywa. Jako czas pomiaru wybrano 45 sekund. Lepkość i rozciągliwość ciasta ocenił wykwalifikowany piekarz przy użyciu skali przedstawionej w Tabeli 5. Mierzono średnią z dwóch bochenków na jeden obiekt. Po tych testach kawałki ciasta wygładzono i pozostawiono do pierwszego wyrośnięcia przez 45 minut w 30 C, po czym ciasto podziurawiono, zarobiono, uformowano, pozostawiono do wyrośnięcia przez 75 minut w 30 C. Względna wilgotność podczas etapów wyrastania była ustawiona na 85%.

34 Objętość (%) Lepkość ciasta Rozciągliwość ciasta Stabilność ciasta Struktura miąższu Kolor skórki Kolor miąższu Wystająca góra Czerstwienie 34 PL B1 Następnie określono stabilność wyrośniętego ciasta na podstawie obecności pęcherzyków, zerwano boczną skórkę i nieregularne zakrzywione powierzchnie skórki. Porcje ciasta pieczono przez 20 minut w 225 C. Objętości bochenków ustalono przy użyciu sposobu BVM: w tabeli średnia jest przedstawiona dla 2 wypieków, które zostały upieczone z tego samego objektu. Strukturę miąższu ocenił wykwalifikowany piekarz przy użyciu skali przedstawionej w Tabeli 5. Po przechowywaniu kromek przez trzy dni w torbach polietylenowych w temperaturze pokojowej zmierzono jędrność miąższu przy użyciu Urządzenia do Analizy Tekstury Stevensa (ang. Stevens Texture Analyser). Dwie kromki o grubości 2 cm ze środka każdego bochenka analizowano z zastosowaniem urządzenia do analizy tekstury przy użyciu sondy o średnicy 1,5 cala, głębokości ściśnięcia 5 mm (25%) i szybkości ściskania 0,5 mm/sek. W tabeli pokazano średnią z dwóch pomiarów. Kolor skórki ocenił wykwalifikowany piekarz według skali przedstawionej w Tabeli 5. Jako odniesienia użyto standardowego przepisu na duński chleb paczkowany. Kolor miąższu ocenił wykwalifikowany piekarz według skali przedstawionej w Tabeli 5. Kolor skórki wypieków kontrolnych określano jako normalny (3). Jako pozytywną kontrolę użyto wypieki dwóch obiektów z takim samym składem jak kontrola z dodatkiem 0,5% mąki sojowej. Procedury wyrastania i pieczenia są te same, jak te dla kontroli bez mąki sojowej. Ta druga jest oceniona jako wyśmienita. Wystawanie góry wypieku oceniono na podstawie zwisania góry w porównaniu z formą piekarniczą, im niższe brzegi góry tym niższa ocena. Im mniejsze zwisanie, tym lepsza ocena. Czerstwienie wypieku oceniano przez poczucie jędrności twardości miąższu kromek wypieku. Przed pokrojeniem wypiek był trzymany w plastikowej torbie w temperaturze pokojowej przez 4 dni. Im miększy jest miąższ kromek, tym lepsza ocena. Enzym lipolityczny T a b e l a 6. Skuteczność enzymów lipolitycznych według wynalazku w pieczeniu. Parametr NBE NBE NBE NBE NBE NBE NBE NBE NBE NBE NBE NBE NBE

35 Kształt PL B1 35 P r z y k ł a d 5 Doświadczenia piekarnicze 2 - batard Użyteczność w pieczeniu enzymów lipolitocznych według wynalazku testowano na francuskim typie chleba zwanego batard. Wytwarzanie batardów w standardowym procesie piekarniczym wykonano przez zmieszanie 3000 g mąki pszennej w około 20 C, 70 g prasowanych drożdży, 60 g soli, 68 ppm kwasu askorbinowego, 30 ppm Bakezyme HS2000 (grzybowa hemicelulaza), 7 ppm Bakezyme P500 (grzybowa -amylaza) i 1680 ml wody (8-10 C) w mikserze spiralnym (Diosna: 2 minuty przy szybkości 1; moc 100 Wh przy szybkości 2). Temperatura ciasta wynosiła 27 C. Podatność na przetwarzanie automatyczne ciasta analizował ręcznie piekarz. Ciasto poddano objętościowemu rośnięciu przez 15 minut w komorze do wyrastania w 32 C i 90% RH. Następnie ciasto podzielono na 6 części 350 g, wygładzono i pozostawiono do wyrośnięcia przez 15 minut w 32 C i 90% RH. Na końcu tego okresu kawałki ciasta zarobiono i ukształtowano oraz poddano końcowemu wyrastaniu przez 90 minut w 32 C i 90% RH. Całkowicie wyrośnięte ciasta pocięto wzdłuż kawałka ciasta i pieczono w piekarniku w 240 C przez 30 minut z dodaniem pary na początku. Po schłodzeniu do temperatury pokojowej oznaczono objętości bochenków przy użyciu sposobu BVM (zobacz przykład 4). Przerwa, postrzępienie i kształt wypieków analizował wykwalifikowany piekarz bezpośrednio po schłodzeniu do temperatury pokojowej przy użyciu skali z Tabeli 7. Po 16 godzinach (przez noc) przechowywania w zamkniętym pudełku w temperaturze pokojowej wykwalifikowany piekarz oceniał jakość miąższu. Objętość wypieków (Tabela 8) wzięto z obiektu 1. T a b e l a 7 Efekt Wynik Przerwa i postrzępienie Ekstremalnie słaby i miękki Słaby i miękki Wypiek kontrolny Cienka i chrupiąca skórka twarda przerwa na przecięciu Skórka zbyt cienka, zbyt twarda Struktura miąższu Uboga Niejednorodna Wypiek kontrolny Dobra Wyśmienita Wysokość Płaski Pośredni Wypiek kontrolny Większy niż (3) Dużo większy niż (3) Cięcie Cięcie zamknięte Cięcie zamknięte Wypiek kontrolny Całkowicie otwarte Całkowicie otwarte; rozdarte T a b e l a 8. Efektywność enzymów lipolitycznych według wynalazku w pieczeniu Enzym lipolityczny Dawka* Objętość kromki (%) Parametr Przerwa & Postrzępienie Kształt Struktura miąższu Żaden NBE028 0, NBE NBE031 2, NBE036 n.o NBE NBE NBE045 n. o NBE * w ppm w oparciu o masę mąki i masę enzymu oznaczoną przy użyciu sposobu A280.

36 36 PL B1 LISTA SEKWENCJI

37 PL B1 37

38 38 PL B1

39 PL B1 39

40 40 PL B1

41 PL B1 41

42 42 PL B1

43 PL B1 43

44 44 PL B1

45 PL B1 45

46 46 PL B1

47 PL B1 47

48 48 PL B1

49 PL B1 49

50 50 PL B1

51 PL B1 51

52 52 PL B1

53 PL B1 53

54 54 PL B1

55 PL B1 55

56 56 PL B1

57 PL B1 57

58 58 PL B1

59 PL B1 59

60 60 PL B1

61 PL B1 61

62 62 PL B1

63 PL B1 63

64 64 PL B1

65 PL B1 65

66 66 PL B1

67 PL B1 67

68 68 PL B1

69 PL B1 69

70 70 PL B1

71 PL B1 71

72 72 PL B1

73 PL B1 73

74 74 PL B1

75 PL B1 75

76 76 PL B1

77 PL B1 77

78 78 PL B1

79 PL B1 79

80 80 PL B1

81 PL B1 81

82 82 PL B1

83 PL B1 83

84 84 PL B1

85 PL B1 85

86 86 PL B1

87 PL B1 87

88 88 PL B1

89 PL B1 89

90 90 PL B1

91 PL B1 91

92 92 PL B1

93 PL B1 93

94 94 PL B1

95 PL B1 95

96 96 PL B1

97 PL B1 97

98 98 PL B1

99 PL B1 99

100 100 PL B1

101 PL B1 101