(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 13/3 EP B1 (13) (1) T3 Int.Cl. C07K 14/47 (06.01) C07K 16/ (06.01) C12Q 1/68 (06.01) (4) Tytuł wynalazku: Identyfikacja związanych z nowotworem antygenów do diagnozowania i leczenia () Pierwszeństwo: EP (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 08/22 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 14/01 (73) Uprawniony z patentu: Ganymed Pharmaceuticals AG, Mainz, DE Johannes Gutenberg-Universität Mainz, vertreten durch den Präsidenten, Mainz, DE (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 UGUR SAHIN, Mainz, DE ÖZLEM TÜRECI, Mainz, DE MICHAEL KOSLOWSKI, Oberschleissheim, DE DIRK USENER, Wiesbaden, DE (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Urszula Bartnik POLSERVICE KANCELARIA RZECZNIKÓW PATENTOWYCH SP. Z O.O. ul. Bluszczańska Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 1 2 14P3313PL00 EP B1 Opis [0001] Pomimo międzydyscyplinarnych sposobów podejścia i dokładnego stosowania klasycznych procedur terapeutycznych nowotwory są nadal jedną z głównych przyczyn śmierci. Ostatnie koncepcje lecznicze mają na celu włączenie układu immunologicznego pacjenta do całościowej koncepcji leczniczej, przez stosowanie zrekombinowanych szczepionek przeciwnowotworowych i innych specyficznych zabiegów, takich jak leczenie przeciwciałami. Warunkiem wstępnym do sukcesu takiej strategii jest rozpoznanie przez układ immunologiczny pacjenta antygenów swoistych dla nowotworów lub antygenów związanych z nowotworem lub epitopów, których efektorowe działania mają być interwencyjnie uwydatnione. Komórki nowotworowe znacząco się różnią biologicznie od niezłośliwych komórek, z których one pochodzą. Te różnice są powodowane zmianami genetycznymi nabytymi podczas rozwoju nowotworu i powodują, między innymi, również tworzenie zmienionych jakościowo i ilościowo struktur molekularnych w komórkach rakowych. Struktury tego rodzaju, związane z nowotworami, które są rozpoznawane przez specyficzny układ immunologiczny gospodarza posiadającego nowotwór, są dalej zwane antygenami związanymi z nowotworami. Specyficzne rozpoznawanie antygenów związanych z nowotworami obejmuje mechanizmy komórkowe i humoralne, które są dwoma połączonymi funkcjonalnie elementami: limfocyty T CD 4+ i CD 8+ rozpoznają antygeny po obróbce prezentowane przez cząsteczki MHC (głównego układu zgodności tkankowej) odpowiednio klas II i I, podczas

3 2 1 2 gdy limfocyty B wytwarzają krążące cząsteczki przeciwciał, które bezpośrednio wiążą się z antygenami nie poddanymi obróbce. Potencjalna klinicznoterapeutyczna ważność antygenów związanych z nowotworami wynika z faktu, że rozpoznanie przez układ immunologiczny antygenów na komórkach nowotworowych prowadzi do inicjacji cytotoksycznych mechanizmów efektora i może powodować, w obecności pomocniczych komórek T, eliminację komórek rakowych (Pardoll, Nat. Med. 4:2-31, 1998). Zatem głównym celem immunologii nowotworów jest molekularne określenie tych struktur. Natura molekularna tych antygenów przez dłuższy czas pozostawała zagadkowa. Dopiero po rozwoju właściwych technik klonowania stał się możliwy systematyczny przegląd bibliotek ekspresji nowotworowego cdna, do wyszukiwania związanych z nowotworami antygenów przez analizowanie struktur docelowych cytotoksycznych limfocytów T (CTL) (van der Bruggen i wsp., Science 24: , 1991) lub przez zastosowanie jako sond krążących autoprzeciwciał (Sahin i wsp., Curr. Opin. Immunol. 9:709-16, 1997). W tym celu biblioteki ekspresji cdna zostały przygotowane ze świeżej tkanki nowotworowej i w odpowiednich układach rekombinancyjnych zaszła ekspresja białka. Wyizolowane od pacjentów immunoefektory, mianowicie klony CTL ze specyficznymi nowotworowymi układami lizy lub krążące autoprzeciwciała były używane do klonowania odpowiednich antygenów. [0002] Dzięki takim podejściom w ostatnich latach zostało określone wiele antygenów w różnych nowotworach.

4 3 1 2 [0003] Jednakże sondy stosowane do identyfikacji antygenów w sposobach klasycznych są immunoefektorami (krążące autoprzeciwciała lub klony CTL) od pacjentów mających zazwyczaj zaawansowanego raka. Liczne dane wskazują, że nowotwory mogą prowadzić, na przykład, do indukcji tolerowania i alergizacji komórek T i że w trakcie przebiegu choroby z repertuaru immunoefektora utracone są szczególnie te właściwości, które mogą powodować skuteczne rozpoznanie odporności. Obecne badania pacjentów nie dostarczyły jeszcze żadnych pewnych, poważnych dowodów rzeczywistego działania uprzednio znalezionych i stosowanych antygenów związanych z nowotworem. Zatem nie może być wykluczone, że białka wywołujące spontaniczne odpowiedzi immunologiczne są złymi strukturami docelowymi. [0004] Celem niniejszego wynalazku było dostarczenie struktur docelowych do diagnozowania i leczenia nowotworów. [000] Cel ten zostaje osiągnięty przez treść zastrzeżeń. [0006] Według wynalazku, identyfikowane są geny, które selektywnie lub w nieprawidłowy sposób ulegają ekspresji w komórkach nowotworowych, a zatem dostarczają antygeny związane z nowotworami. Takie geny i/lub ich produkty są użyteczne jako struktury docelowe do sposobów diagnostycznych i leczniczych. [0007] W jednym aspekcie wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznej, zawierającej jeden lub więcej składników wybranych z grupy składającej się z:

5 4 1 2 (i) przeciwciała, które wiąże się do zewnątrzkomórkowej części antygenu związanego z nowotworem, (ii) antysensownego kwasu nukleinowego, który specyficznie hybrydyzuje z kwasem nukleinowym kodującym antygen związany z nowotworem i (iii) sirna ukierunkowanego przeciwko kwasowi nukleinowemu kodującemu antygen związany z nowotworem, wspomniany antygen związany z nowotworem posiada sekwencję kodowaną przez kwas nukleinowy, który jest wybrany z grupy składającej się z: (a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 1, (b) kwasu nukleinowego, który w rygorystycznych warunkach hybrydyzuje z kwasem nukleinowym z (a), (c) kwasu nukleinowego, który jest zdegenerowany w odniesieniu do kwasu nukleinowego z (a) lub (b) i (d) kwasu nukleinowego, który jest co najmniej w 9% identyczny z kwasem nukleinowym z (a), (b) lub (c) do stosowania w sposobie leczenia lub zapobiegania rakowi cechującemu się ekspresją antygenu związanego z nowotworem. [0008] W jednej postaci wynalazku rakiem jest nowotwór płuc, nowotwór piersi, nowotwór prostaty, czerniak, nowotwór okrężnicy, nowotwór żołądka, nowotwór

6 1 2 trzustki, nowotwór ENT, rak nerkowo komórkowy lub rak szyjki macicy, rak jelita grubego lub rak sutka. [0009] W jednej postaci wynalazku antygen związany z nowotworem zawiera sekwencje aminokwasów wybrane z grupy składającej się z SEQ ID NO: 2 i [00] W jednej postaci wynalazku przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym. W kolejnych postaciach wynalazku przeciwciało jest przeciwciałem chimerowym lub humanizowanym, fragmentem przeciwciała naturalnego lub przeciwciała syntetycznego. Przeciwciało może być połączone z czynnikiem użytecznym leczniczo lub diagnostycznie, nazywanym tutaj również czynnikiem leczniczym lub diagnostycznym. [0011] W jednej postaci wynalazku antysensowny kwas nukleinowy zawiera 6-0 sekwencji, w szczególności -, 1- i - sąsiadujących nukleotydów kwasu nukleinowego kodującego antygen związany z nowotworem. [0012] W szczególnych postaciach wynalazku sirna ukierunkowanego na kwas nukleinowy według SEQ ID NO: 1, nić sensownego RNA posiada sekwencję SEQ ID NO: 12, a nić antysensownego RNA posiada sekwencję SEQ ID NO: 13 lub nić sensownego RNA posiada sekwencję SEQ ID NO: 14 a nić antysensownego RNA posiada sekwencję SEQ ID NO: 1. [0013] Kompozycja farmaceutyczna może zawierać nośnik farmaceutycznie kompatybilny i/lub adiuwant. [0014] Wynalazek również dotyczy sposobu in vitro diagnozowania lub monitorowania choroby nowotworowej cechującej się ekspresją antygenu związanego z nowotworem, sposobu, który zawiera wykrywanie lub określanie ilości

7 6 1 2 (i) kwasu nukleinowego, który koduje antygen związany z nowotworem i/lub (ii) antygenu związanego z nowotworem, w próbce biologicznej pobranej od pacjenta, ze wspomnianym antygenem związanym z nowotworem posiadającym sekwencję kodowaną przez kwas nukleinowy, który został wybrany z grupy składającej się z: (a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 1, (b) kwasu nukleinowego, który w rygorystycznych warunkach hybrydyzuje z kwasem nukleinowym z(a) (c) kwasu nukleinowego, który jest zdegenerowany w odniesieniu do kwasu nukleinowego z (a) lub (b) i (d) kwasu nukleinowego, który jest co najmniej w 9% identyczny z kwasem nukleinowym z (a), (b) lub (c). Najlepiej, jeśli biologiczna próbka jest pobrana od pacjenta cierpiącego na wspomnianą chorobę nowotworową, który jest podejrzany, że cierpi lub zapada na wspomnianą chorobę nowotworową lub ma potencjalną możliwość zachorowania na wspomnianą chorobę nowotworową. Opisane są tutaj środki do dokonania wspomnianego wykrywania i/lub określania ilości i będą one oczywiste dla wykwalifikowanej osoby. [001] Najlepiej, jeśli obecność wspomnianego kwasu nukleinowego i/lub wspomnianego antygenu związanego z nowotworem i/lub ilość wspomnianego kwasu nukleinowego i/lub wspomnianego antygenu związanego z nowotworem, która jest zwiększona, w porównaniu z ilością u pacjenta bez wspomnianej choroby nowotworowej, wskazuje

8 7 1 2 na obecność wspomnianej choroby nowotworowej lub możliwości rozwoju wspomnianej choroby nowotworowej. [0016] Sposoby diagnostyczne i/lub monitorujące wynalazku obejmują również postacie wynalazku, w których dzięki wykryciu lub określeniu ilości wspomnianego kwasu nukleinowego i/lub wspomnianego antygenu związanego z nowotworem jest możliwe oszacowanie i/lub prognozowanie zachowania wspomnianej choroby nowotworowej do tworzenia przerzutów, w której to chorobie najlepiej, jeśli obecność wspomnianego kwasu nukleinowego i/lub wspomnianego antygenu związanego z nowotworem i/lub ilość wspomnianego kwasu nukleinowego i/lub wspomnianego antygenu związanego z nowotworem, która jest zwiększona, w porównaniu z ilością u pacjenta bez wspomnianej choroby nowotworowej lub bez przerzutów wspomnianej choroby nowotworowej wskazuje na sposób zachowania wspomnianej choroby nowotworowej do tworzenia przerzutów wspomnianej choroby nowotworowej lub możliwości zachowania wspomnianej choroby nowotworowej do tworzenia przerzutów wspomnianej choroby nowotworowej. [0017] W szczególnych postaciach wynalazku wspomniane wykrywanie lub określanie ilości zawiera (i) łączenie biologicznej próbki z czynnikiem, który wiąże się specyficznie do wspomnianego kwasu nukleinowego kodującego antygen związany z nowotworem lub do wspomnianego antygenu związanego z nowotworem i (ii) wykrywanie formowania lub określania ilości kompleksu pomiędzy czynnikiem i kwasem nukleinowym lub antygenem związanym z nowotworem. W kolejnej postaci wynalazku próbka biologiczna wyizolowana od pacjenta jest

9 8 1 2 porównywana do porównywalnej, prawidłowej próbki biologicznej. [0018] Najlepiej, jeśli sposoby monitorowania według wynalazku obejmują wykrywanie i/lub określanie ilości w pierwszej próbce w pierwszym punkcie czasowym i w następnej próbce w drugim punkcie czasowym, gdzie przebieg choroby jest określany przez porównanie dwóch próbek. [0019] Według wynalazku wykrywanie kwasu nukleinowego lub określanie ilości kwasu nukleinowego może być przeprowadzane z zastosowaniem sondy oligo- lub polinukleotydowej, która specyficznie hybrydyzuje ze wspomnianym kwasem nukleinowym lub może być przeprowadzane przez selektywną amplifikację wspomnianego kwasu nukleinowego np. za pomocą amplifikacji techniką PCR. W jednej postaci wynalazku sonda oligo- lub polinukleotydowa zawiera 6-0 sekwencji, w szczególności -, 1- i - sąsiadujących nukleotydów wspomnianego kwasu nukleinowego. [00] W szczególnych postaciach wynalazku, antygen związany z nowotworem, który ma być wykrywany, lub którego ilość jest określana sposobami według niniejszego wynalazku znajduje się wewnątrz komórki, na powierzchni komórki lub występuje w postaci kompleksu z cząsteczką MHC. Według wynalazku, wykrycie antygenu związanego z nowotworem lub określenie ilości antygenów związanych z nowotworem może być przeprowadzone przy użyciu przeciwciała wiążącego się specyficznie do wspomnianego antygenu związanego z nowotworem.

10 9 1 2 [0021] Lepiej jeśli czynnik, który jest stosowany do wykrywania lub określania ilości w sposobach wynalazku, taki jak sonda oligo- lub polinukleotydowa lub przeciwciało, jest znakowany w wykrywalny sposób, w szczególności za pomocą wykrywalnego markera np. markera radioaktywnego lub markera enzymatycznego. Wynalazek odnosi się również do przeciwciała stosowanego w sposobie leczenia, zapobiegania, diagnozowania lub monitorowania, tj. określania regresji, progresji, przebiegu i/lub początku choroby nowotworowej charakteryzującej się ekspresją antygenu związanego z nowotworem, wspomnianego antygenu związanego z nowotworem posiadającego sekwencję kodowaną przez kwas nukleinowy, który jest wybrany z grupy składającej się z: (a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 1, (b) kwasu nukleinowego, który w rygorystycznych warunkach hybrydyzuje z kwasem nukleinowym z (a), (c) kwasu nukleinowego, który jest zdegenerowany w odniesieniu do kwasu nukleinowego z (a) lub (b) i (d) kwasu nukleinowego, który jest co najmniej w 9% identyczny z kwasem nukleinowym z (a) (b) lub (c), w którym przeciwciało wiąże się do zewnątrzkomórkowej części wspomnianego antygenu związanego z nowotworem i jest połączone z czynnikiem terapeutycznym lub diagnostycznym. W jednej postaci wynalazku, czynnikiem terapeutycznym lub diagnostycznym jest toksyna. [0022] Przeciwciało może być przeciwciałem monoklonalnym. W dalszych postaciach wynalazku,

11 1 2 przeciwciało jest chimerowym lub humanizowanym przeciwciałem lub fragmentem naturalnego przeciwciała. [0023] W pewnych postaciach wynalazku sposoby diagnozowania lub monitorowania choroby nowotworowej są przeprowadzane w próbce biologicznej zawierającej lub podejrzanej o obecność rozprzestrzeniających się komórek guza lub przerzutów komórek guza. Takie biologiczne próbki obejmują, na przykład, krew, surowicę, szpik kostny, wydzieliny, aspirat z oskrzeli i/lub próbki biologiczne z płukania oskrzeli. [0024] Według wynalazku, najlepiej jeśli określenie wiązanie odnosi się do wiązania specyficznego. Specyficzne wiązanie oznacza, że czynnik, taki jak przeciwciało wiąże się silniej do celu takiego jak epitop w stosunku, do którego jest specyficzny, w porównaniu z wiązaniem się do innego celu. Czynnik wiąże się silniej z pierwszym celem w porównaniu z drugim celem, jeżeli wiąże się on z pierwszym celem ze stałą dysocjacji wynoszącą (K D ), która jest niższa niż stała dysocjacji dla drugiego celu. Lepiej, jeśli dla celu, z którym czynnik wiąże się specyficznie stała dysocjacji (K D ) jest więcej niż -krotnie, lepiej więcej niż -krotnie, jeszcze lepiej więcej niż 0- krotnie, a nawet jeszcze lepiej więcej niż 0-krotnie, 0-krotnie, 00-krotnie lub 00-krotnie mniejsza niż stała dysocjacji (K D ) dla celu, do którego czynnik nie wiąże się specyficznie. [002] Takie specyficzne przeciwciała można, na przykład, otrzymać przez immunizację za pomocą wspomnianych poprzednio peptydów.

12 [0026] Wynalazek dotyczy także koniugatu pomiędzy przeciwciałem i czynnikiem terapeutycznym lub diagnostycznym, z którym przeciwciało wiąże się specyficznie z zewnątrzkomórkową częścią białka albo polipeptydu, wspomnianego białka lub polipeptydu kodowanego przez kwas nukleinowy wybrany z grupy składającej się z: (a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 1, (b) kwasu nukleinowego, który w rygorystycznych warunkach hybrydyzuje z kwasem nukleinowym z (a), (c) kwasu nukleinowego, który jest zdegenerowany w odniesieniu do kwasu nukleinowego z (a) lub (b) i (d) kwasu nukleinowego, który jest co najmniej w 9% identyczny z kwasem nukleinowym z (a) (b) lub (c), do stosowania w sposobie leczenia, zapobiegania, diagnostyki lub monitorowania choroby nowotworowej znamiennej przez ekspresję białka lub polipeptydu. [0027] W jednej postaci wynalazku, czynnikiem terapeutycznym lub diagnostycznym jest toksyna. [0028] Wynalazek odnosi się również do stosowania zestawu do diagnozowania, in vitro, choroby nowotworowej znamiennej przez ekspresję antygenu związanego z nowotworem, zestawu, który zawiera czynniki do wykrywania lub oznaczania ilości (i) kwasu nukleinowego kodującego antygen związany z nowotworem i/lub (ii) antygenu związanego z nowotworem, wspomnianego antygenu związanego z nowotworem posiadającego sekwencję kodowaną przez kwas nukleinowy, który jest wybrany z grupy składającej się z:

13 (a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego SEQ ID NO: 1, (b) kwasu nukleinowego, który w rygorystycznych warunkach hybrydyzuje z kwasem nukleinowym z (a), (c) kwasu nukleinowego, który jest zdegenerowany w odniesieniu do kwasu nukleinowego z (a) lub (b) i (d) kwasu nukleinowego, który jest co najmniej w 9% identyczny z kwasem nukleinowym z (a) (b) lub (c), [0029] W jednej postaci wynalazku, czynniki do wykrywania kwasu nukleinowego są cząsteczkami kwasu nukleinowego do selektywnego powielania wspomnianego kwasu nukleinowego, które obejmują w szczególności 6-0 sekwencji, w szczególności -, 1- i - sąsiadujących nukleotydów wspomnianego kwasu nukleinowego. Szczegółowy opis wynalazku [00] Według wynalazku, odniesienie takie jak próbka odniesienia lub organizm odniesienia mogą być stosowane do korelacji i porównania wyników uzyskanych opisanymi tutaj sposobami, otrzymanych z próbki badanej lub badanego organizmu, np. pacjenta. Zazwyczaj organizm odniesienia jest zdrowym organizmem, w szczególności organizmem, który nie jest chory na raka. [0031] Wartość odniesienia może być określana z odniesienia empirycznie, przez pomiary wystarczająco dużej liczby odniesień. Najlepiej, jeśli wartość odniesienia jest określana przez pomiar co najmniej 2, lepiej co najmniej 3, lepiej co najmniej, lepiej co najmniej 8, lepiej co najmniej 12, lepiej co najmniej, lepiej co najmniej, lepiej co najmniej 0, lub lepiej co najmniej 0 odniesień.

14 [0032] Według wynalazku pochodna kwasu nukleinowego oznacza, że we wspomnianym kwasie nukleinowym obecne jest jedno lub wiele, tak jak co najmniej 2, co najmniej 4, lub co najmniej 6, a najlepiej do 3, do 4, do, do 6, do, do 1 lub do podstawień nukleotydowych, delecji i/lub addycji. Ponadto, określenie pochodna " obejmuje również chemiczne tworzenie pochodnych kwasu nukleinowego w oparciu o zasady nukleotydowe, cukier lub fosforan. Termin pochodna obejmuje również kwasy nukleinowe, które zawierają nukleotydy i analogi nukleotydów nie występujące naturalnie. [0033] Według wynalazku, najlepiej, jeśli kwasem nukleinowym jest kwas dezoksyrybonukleinowy (DNA) lub kwas rybonukleinowy (RNA). Według wynalazku, kwasy nukleinowe obejmują cząsteczki genomowego DNA, cdna, mrna wytworzone na drodze rekombinacji i syntetyzowane chemicznie. Według wynalazku, kwas nukleinowy może występować w postaci cząsteczki jednoniciowej lub dwuniciowej i liniowej lub koliście zamkniętej wiązaniem kowalencyjnym. [0034] Jak tutaj używano, określenie RNA oznacza cząsteczkę zawierającą co najmniej jedną resztę rybonukleotydu. Przez rybo nukleotyd rozumie się nukleotyd z grupą hydroksylową w pozycji 2 cząsteczki beta-d-rybo-furanozy. Określenie obejmuje dwuniciowe RNA, jednoniciowe RNA, wyizolowane RNA, takie jak częściowo oczyszczone RNA, zasadniczo czyste RNA, syntetyczne RNA, RNA wytworzone drogą rekombinacji, jak również zmodyfikowane RNA, które różni się od naturalnie występującego RNA addycją, delecją,

15 substytucją i/lub zamianą jednego lub więcej nukleotydów. Takie zmiany mogą obejmować addycję materiału nienukleotydowego, np. na końcu(ach) RNA lub wewnątrz cząsteczki, na przykład w jednym lub więcej nukleotydach RNA. Nukleotydy w cząsteczce RNA mogą także zawierać nietypowe nukleotydy, takie jak niewystępujące naturalnie nukleotydy lub chemicznie syntetyzowane nukleotydy lub dezoksynukleotydy. Te zmienione cząsteczki RNA mogą być określane jako analogi lub analogi naturalnie występującego RNA. [003] Najlepiej, jeśli kwasy nukleinowe opisane według wynalazku są wyizolowane. Według wynalazku określenie wyizolowany kwas nukleinowy oznacza, że kwas nukleinowy był (i) amplifikowany w warunkach in vitro, na przykład przez reakcję łańcuchową polimerazy (PCR), (ii) wytwarzany drogą rekombinacji przez klonowanie, (iii) oczyszczany, na przykład przez cięcie i frakcjonowanie w żelu elektroforetycznym lub (iv) syntetyzowany, na przykład, poprzez syntezę chemiczną. Wyizolowany kwas nukleinowy oznacza kwas nukleinowy, który jest dostępny do manipulacji za pomocą technik rekombinacji DNA. [0036] Kwas nukleinowy jest komplementarny do innego kwasu nukleinowego, jeśli dwie sekwencje są zdolne do hybrydyzacji i tworzenia ze sobą stabilnego dupleksu, hybrydyzacji, najlepiej przeprowadzanej w warunkach, które umożliwiają specyficzną hybrydyzację między polinukleotydami (warunki rygorystyczne). Rygorystyczne warunki są opisane, na przykład, w Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook i wsp., Editors, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold

16 1 1 2 Spring Harbor, New York, 1989 lub Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel i wsp., Editors, John Wiley & Sons, Inc., New York i odnoszą się, na przykład do hybrydyzacji w temperaturze 6 C w buforze hybrydyzacyjnym (3,xSSC, 0,02% Ficoll, 0,02% poliwinylopirolidon, 0,02% albumina surowicy bydlęcej, 2, mm NaH 2 PO 4 (ph 7), 0,% SDS, 2 mm EDTA). SSC jest 0,1 M chlorkiem sodu/0,1 M cytrynianu sodu, ph 7. Po hybrydyzacji membrana, na którą przeniesiono DNA jest przemywana, na przykład, w 2xSSC w temperaturze pokojowej, a następnie w 0,1-0,xSSC/0,1xSDS w temperaturze do 68 C. [0037] Według wynalazku, komplementarne kwasy nukleinowe mają co najmniej 40%, w szczególności co najmniej 0%, co najmniej 60%, co najmniej 70%, co najmniej 80%, co najmniej 90%, a najlepiej co najmniej 9%, co najmniej 98% lub co najmniej 99% identycznych nukleotydów. [0038] Określenie odsetek identyczności ma oznaczać odsetek nukleotydów lub reszt aminokwasowych, które są takie same w obu porównywanych sekwencjach, otrzymanych po najlepszym dopasowaniu, przy czym odsetek ten jest jedynie statystyczny, a różnice między dwiema sekwencjami są rozłożone losowo i na całej ich długości. Porównania sekwencji pomiędzy dwoma nukleotydami lub sekwencjami aminokwasowymi są zwykle wykonywane przez porównywanie tych sekwencji po optymalnym ich dopasowaniu, wspomniane dopasowanie jest wykonane segmentami lub okienkami porównania w celu identyfikacji i porównania lokalnych regionów podobieństwa sekwencji. Dla porównania optymalne

17 dopasowanie sekwencji można utworzyć, poza dopasowaniem ręcznym, za pomocą algorytmu lokalnej homologii według Smith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482, za pomocą algorytmu lokalnej homologii według Neddleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, poprzez metodę wyszukiwania podobieństwa Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 8, 2444, lub za pomocą programów komputerowych, które wykorzystują te algorytmy (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N i TFASTA w Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 7 Science Drive, Madison, Wis.). [0039] Odsetek identyczności oblicza się przez określenie liczby identycznych pozycji między dwiema porównywanymi sekwencjami, podzielenie tej liczby przez liczbę porównywanych pozycji i mnożąc uzyskany wynik przez 0, tak aby uzyskać odsetek identyczności między tymi dwiema sekwencjami. [0040] Kwasy nukleinowe kodujące antygeny związane z nowotworem mogą, według wynalazku, występować same lub w połączeniu z innymi kwasami nukleinowymi, w szczególności heterologicznymi kwasami nukleinowymi. W preferowanych postaciach wynalazku kwas nukleinowy jest funkcjonalnie połączony z sekwencjami kontroli ekspresji lub sekwencjami regulatorowymi, które mogą być homologiczne lub heterologiczne w odniesieniu do wspomnianego kwasu nukleinowego. Sekwencja kodująca oraz sekwencje regulatorowe są funkcjonalnie powiązane ze sobą, jeśli są kowalencyjnie połączone ze sobą w taki sposób, że ekspresja lub transkrypcja wspomnianej sekwencji kodującej jest pod kontrolą lub pod wpływem wspomnianej sekwencji regulatorowej. Jeśli

18 sekwencja kodująca ulega translacji do funkcjonalnego białka, wówczas, z sekwencją regulatorową funkcjonalnie związaną ze wspomnianą sekwencją kodującą, indukcja wspomnianej sekwencji regulatorowej wpływa na transkrypcję wspomnianej sekwencji kodującej, bez przesunięcia ramki odczytu w sekwencji kodującej lub wspomniana sekwencja kodująca nie jest zdolna do ulegania translacji do żądanego białka lub peptydu. [0041] Według wynalazku określenie sekwencja kontroli ekspresji lub sekwencja regulatorowa zawiera promotory, wzmacniacze transkrypcji i inne elementy kontroli, które regulują ekspresję genu. W poszczególnych postaciach wynalazku sekwencje kontroli ekspresji mogą być regulowane. Dokładna struktura sekwencji regulatorowych może się różnić w działaniu, w zależności od gatunku lub rodzaju komórek, ale ogólnie zawierają one sekwencje nietranskrybowane na końcu i sekwencje nieulegające translacji na końcu, które są zaangażowane, odpowiednio w inicjację transkrypcji i translacji, takie jak kaseta TATA, sekwencja czapeczki, kaseta CAAT i podobne. Bardziej szczegółowo, sekwencje regulatorowe nietranskrybowane na końcu zawierają region promotora, który zawiera sekwencję promotora do kontroli transkrypcji powiązanego funkcjonalnie genu. Sekwencje regulatorowe mogą również zawierać sekwencje wzmacniające lub umieszczone powyżej sekwencje aktywujące. Według wynalazku kwas nukleinowy może dodatkowo być obecny w kombinacji z innym kwasem nukleinowym, który koduje peptyd kontrolujący sekrecję białka lub peptyd zakodowany przez wspomniany kwas nukleinowy z komórki gospodarza. Według wynalazku kwas

19 nukleinowy może również być obecny w kombinacji z innym kwasem nukleinowym, który koduje peptyd powodujący zakotwiczenie zakodowanego białka lub peptydu w błonie komórkowej komórki gospodarza lub zaszufladkowanie w poszczególnych organellach wspomnianej komórki. Podobnie możliwa jest kombinacja z kwasem nukleinowym, który reprezentuje gen markerowy lub jakikolwiek znacznik. [0042] W preferowanej postaci wynalazku, w której zrekombinowana cząsteczka kwasu nukleinowego jest według wynalazku wektorem, z właściwym z promotorem, który kontroluje ekspresję kwasu nukleinowego, na przykład kwasu nukleinowego kodującego do identyfikowanego według wynalazku antygenu związanego z nowotworem. Określenie wektor jest używane tutaj w jego najbardziej ogólnym znaczeniu i obejmuje każdy pośredniczący nośnik kwasu nukleinowego, który umożliwia, żeby na przykład wspomniany kwas nukleinowy został wprowadzony do prokariotycznych i/lub eukariotycznych komórek i gdzie jest to właściwe został włączony do genomu. Najlepiej, jeśli wektory tego rodzaju były replikowane i/lub ulegały ekspresji w komórkach. Nośnik pośredniczący może zostać przystosowany do użycia, na przykład, w elektroporacji, w bombardowaniu mikropociskami, do podawania w liposomach, w transferowaniu za pomocą agrobakterii lub w insercji za pomocą wirusów DNA lub RNA. Wektory zawierają genomy plazmidów, fasmidów, bakteriofagów lub wirusów. [0043] Opisane tutaj kwasy nukleinowe kodujące antygen związany z nowotworem mogą być stosowane do transfekcji

20 komórek gospodarza. Kwasy nukleinowe oznaczają tutaj zarówno zrekombinowane DNA, jak i RNA. Zrekombinowane RNA może zostać przygotowane przez transkrypcję in vitro matrycy DNA. Ponadto, przed zastosowaniem, może być modyfikowane sekwencjami stabilizującymi, czapeczkowaniem i poliadenylacją. [0044] Według wynalazku określenie komórka gospodarza dotyczy każdej komórki, która może być transformowana lub transfekowana egzogennym kwasem nukleinowym. Określenie komórki gospodarza obejmuje, według wynalazku, komórki prokariotyczne (np. E. coli) lub eukariotyczne (np. komórki dendrytyczne, komórki B, komórki CHO, komórki COS, komórki K62, komórki drożdży i komórki owadów). Szczególne preferencje dawano komórkom ssaków, takim jak komórki ludzi, myszy, chomików, świń, kóz, naczelnych. Komórki mogą pochodzić z różnorodnych rodzajów tkanek i mogą obejmować komórki pierwotne i linie komórkowe. Specyficzne przykłady obejmują keratynocyty, leukocyty krwi obwodowej, komórki macierzyste szpiku kostnego i zarodkowe komórki macierzyste. W kolejnych postaciach wynalazku komórką gospodarza jest komórka prezentująca antygen, w szczególności komórka dendrytyczna, monocyt lub makrofag. Kwas nukleinowy może być obecny w komórce gospodarza w postaci kopii pojedynczej lub w postaci dwóch lub więcej kopii i w jednej postaci wynalazku ulega ekspresji w komórce gospodarza. [004] Według wynalazku określenie ekspresja jest używane w jego najbardziej ogólnym znaczeniu i obejmuje wytwarzanie RNA lub RNA i białka. Obejmuje ono również częściową ekspresję kwasów nukleinowych. Ponadto

21 1 2 ekspresja może zostać przeprowadzona krótkotrwale lub trwale. Preferowane układy ekspresji w komórkach ssaków obejmują pcdna3.1 i prc/cmv (Invitrogen, Carlsbad, CA), które zawierają marker do selekcji taki jak gen przekazujący oporność na G418 (i zatem umożliwiający selekcję stabilnie transfekowanych linii komórkowych) i wzmacniające promotor sekwencje cytomegalowirusa (CMV). [0046] W takich przypadkach, w których cząsteczka MHC prezentuje antygen związany z nowotworem lub jego część, wektor ekspresji może również obejmować sekwencję kwasu nukleinowego kodującą wspomnianą cząsteczkę MHC. Sekwencja kwasu nukleinowego kodująca cząsteczkę MHC może być obecna na tym samym wektorze ekspresji, co kwas nukleinowy kodujący antygen związany z nowotworem lub jego część lub oba kwasy nukleinowe mogą być obecne w różnych wektorach ekspresji. W ostatnim przypadku dwa wektory ekspresji mogą być kotransfekowane do komórki. Jeśli w komórce gospodarza nie ulega ekspresji ani antygen związany z nowotworem lub jego część ani cząsteczka MHC, oba kodujące kwasy nukleinowe mogą być transfekowane do komórki albo na tym samym wektorze ekspresyjnym, albo na różnych wektorach ekspresyjnych. Jeśli w komórce cząsteczka MHC ulega już ekspresji, do komórki może być transfekowana jedynie sekwencja kwasu nukleinowego kodująca antygen związany z nowotworem lub jego część. [0047] Zestaw do powielania kwasu nukleinowego kodującego antygen związany z nowotworem zawiera, na przykład, parę starterów do powielania, które hybrydyzują z kwasem nukleinowym kodującym antygen związany z nowotworem. Najlepiej, jeśli startery

22 zawierają 6-0 sekwencji, w szczególności -, 1- i - sąsiadujących nukleotydów kwasu nukleinowego nie zachodzących na siebie, żeby uniknąć tworzenia dimerów starterów. Jeden ze starterów będzie hybrydyzował z jedną nicią kwasu nukleinowego kodującego antygen związany z nowotworem, a inny starter będzie hybrydyzował z nicią komplementarną w układzie umożliwiającym powielenie kwasu nukleinowego kodującego antygen związany z nowotworem. [0048] Cząsteczki antysensowne lub antysensowne kwasy nukleinowe mogą być stosowane do regulowania, w szczególności zmniejszania ekspresji kwasów nukleinowych. Określenie cząsteczka antysensowna lub antysensowny kwas nukleinowy odnosi się, według wynalazku, do oligonukleotydu, który jest oligorybonukleotydem, oligodezoksyrybonukleotydem, modyfikowanym oligorybonukleotydem lub modyfikowanym oligodezoksyrybonukleotydem i który w stanach fizjologicznych hybrydyzuje z DNA zawierającym szczególny gen lub do mrna wspomnianego genu, inhibując w ten sposób transkrypcję wspomnianego genu i/lub translację wspomnianego mrna. Według wynalazku cząsteczka antysensowna zawiera również konstrukt, który obejmuje kwas nukleinowy lub jego część w odwrotnej orientacji w odniesieniu do jego naturalnego promotora. Antysensowny transkrypt kwasu nukleinowego lub jego części może tworzyć dupleks z naturalnie występującym mrna, tworząc specyficzny enzym i zatem zapobiegając akumulacji lub translacji mrna do aktywnego enzymu. Inną możliwością jest stosowanie rybosomów do inaktywowania kwasu nukleinowego.

23 Preferowane według wynalazku antysensowne oligonukleotydy posiadają 6-0 sekwencji, w szczególności -, 1- i - sąsiadujących nukleotydów docelowego kwasu nukleinowego i najlepiej, jeśli są całkowicie komplementarne z docelowym kwasem nukleinowym lub jego częścią. [0049] W preferowanych postaciach wynalazku antysensowny oligonukleotyd hybrydyzuje do końca N lub do miejsca położonego przed nim w kierunku, takim jak miejsce inicjacji translacji, miejscem inicjacji transkrypcji lub miejscem promotora. W kolejnych postaciach wynalazku antysensowny oligonukleotyd hybrydyzuje z obszarem 3 nieulegającym translacji lub miejscem składania mrna. [000] W jednej postaci wynalazku oligonukleotyd składa się z rybonukleotydów, dezoksyrybonukleotydów lub ich kombinacji z końcem jednego nukleotydu i końcem 3 innego nukleotydu połączonymi jeden z drugim wiązaniem fosfodiestrowym. Te oligonukleotydy mogą być syntetyzowane w sposób konwencjonalny lub mogą być wytwarzane techniką rekombinacji. [001] W preferowanych postaciach wynalazku oligonukleotyd jest oligonukleotydem zmodyfikowanym. Tutaj oligonukleotyd może być modyfikowany bardzo różnymi sposobami, bez uszkadzania jego zdolności do wiązania się z jego celem, żeby na przykład zwiększyć jego stabilność lub skuteczność terapeutyczną. Według wynalazku określenie oligonukleotyd zmodyfikowany oznacza oligonukleotyd, w którym (i) co najmniej dwa z jego nukleotydów są połączone ze sobą syntetycznym wiązaniem międzynukleozydowym (tj. wiązaniem

24 międzynukleozydowym, które nie jest wiązaniem fosfodiestrowym) i/lub (ii) grupa chemiczna nie znajdowana zazwyczaj w kwasach nukleinowych jest połączona kowalencyjnie z oligonukleotydem. Preferowanymi syntetycznymi wiązaniami międzynukleozydowymi są wiązania fosforotionianowe, fosfonianów alkilu, fosforoditionianowe, estrów kwasu fosforowego, fosfonotionianów alkilu, fosforoamidatowe, karbaminianowe, węglanowe, tri estrowe, kwasu fosforowego, acetamidowe, estrów karboksymetylu i peptydowe. [002] Określenie oligonukleotyd zmodyfikowany obejmuje również oligonukleotydy mające zmodyfikowaną kowalencyjnie zasadę i/lub cukier. Oligonukleotydy zmodyfikowane obejmują, na przykład, oligonukleotydy z resztami cukrowymi, które są związane kowalencyjnie z grupami organicznymi o niskiej masie cząsteczkowej, innymi niż grupa hydroksylowa w pozycji 3 i grupa fosforanowa w pozycji. Oligonukleotydy zmodyfikowane mogą zawierać, na przykład, resztę 2 -O-alkilowanej rybozy lub zamiast rybozy innego cukru, takiego jak arabinoza. [003] Należy rozumieć, że wszystkie postacie wynalazku opisane powyżej w odniesieniu do oligonukleotydów można również zastosować do polinukleotydów. [004] Przez małe interferujące RNA lub sirna, jak się tutaj stosuje, rozumie się izolowaną cząsteczkę RNA, która lepiej jeśli ma długość większą niż nukleotydów, jeszcze lepiej długość większą niż 1 nukleotydów, a najlepiej długość 18, 19,, 21, 22, 23, 24, 2, 26, 27, 28, 29 lub nukleotydów i która

25 jest stosowana do identyfikacji docelowego genu lub mrna, które ma być degradowane. Najbardziej preferowanym rozmiarem sirna jest 19-2 nukleotydów. [00] sirna według wynalazku może obejmować RNA częściowo oczyszczone, RNA zasadniczo czyste, RNA syntetyczne lub RNA wytworzone rekombinacyjnie, a także zmienione RNA, które różni się od RNA występującego naturalnie addycją, delecją, podstawieniem i/lub zamianą jednego lub więcej nukleotydów. Takie zmiany mogą obejmować dodanie materiału nienukleotydowego do końca(ów) sirna lub do jednego lub więcej wewnętrznych nukleotydów sirna, modyfikacje, które czynią sirna opornym na trawienie nukleazą (np. zastosowanie rybonukleotydów podstawionych 2 - lub modyfikacji szkieletu cukrowo fosforanowego), lub podstawienie dezoksyrybonukleotydami jednego lub więcej nukleotydów w sirna. Ponadto sirna może być zmodyfikowany, żeby zwiększyć jego stabilność, jak opisano powyżej, dla zmodyfikowanych oligonukleotydów, w szczególności przez wstawienie jednego lub więcej wiązań fosforotionianowych. [006] Jedna lub obie nici sirna mogą również zawierać sekwencje nawisów od strony 3'. Jak tutaj się stosuje sekwencje nawisów od strony 3' odnoszą się do co najmniej jednego niesparowanego nukleotydu rozciągającego się z końca 3 nici RNA. Zatem w jednej postaci wynalazku sirna obejmuje co najmniej jedną sekwencję nawisów od strony 3' o długości od 1 do około 6 nukleotydów (które obejmują rybonukleotydy lub dezoksynukleotydy) lepiej o długości od 1 do około nukleotydów, jeszcze lepiej o długości od 1 do około 4

26 2 1 2 nukleotydów, a szczególnie dobrze o długości od około 2 do około 4 nukleotydów. W postaci wynalazku, w której obie nici cząsteczki sirna obejmują sekwencje nawisów od strony 3', długość sekwencji nawisów może być równa lub różna dla każdej nici. W najbardziej preferowanej postaci wynalazku sekwencje nawisów od strony 3' znajdują się na obu niciach sirna i mają długość 2 nukleotydów. Na przykład, każda nić sirna z wynalazku może zawierać sekwencje nawisów od strony 3' z kwasem dideoksytymidylowym ("TT") lub kwasem diurydylowym ("uu"). [007] W celu zwiększenia stabilności sirna sekwencje nawisów od strony 3' również mogą być stabilizowane przeciwko degradacji. W jednej postaci wynalazku sekwencje nawisów są stabilizowane przez włączenie nukleotydów puryny, takich jak nukleotydy adenozyny lub guanozyny. Alternatywnie, podstawienie nukleotydów pirymidynowych zmodyfikowanymi analogami, np. podstawienie nukleotydów urydyny w sekwencje nawisów od strony 3' 2 deoksytymidyną jest tolerowane i nie wpływa na skuteczność degradacji RNAi. W szczególności brak obecności 2 -hydroksylu w 2 -deoksytymidynie znacząco zwiększa w pożywce hodowli tkankowej oporność na nukleazę sekwencji nawisów od strony 3'. [008] Sensowne i antysensowne nici sirna mogą zawierać dwie komplementarne jednoniciowe cząsteczki RNA lub mogą zawierać pojedynczą cząsteczkę, w której dwie komplementarne części mają sparowane zasady i są kowalencyjnie połączone przez jednoniciowy obszar spinki do włosów. To jest, region sensowny i region antysensowny mogą być połączone kowalencyjnie przez

27 cząsteczkę linkerową. Cząsteczka linkerowa może być linkerem polinukleotydowym lub linkerem nienukleotydowym. Bez chęci wiązania się z jakąkolwiek teorią uważa się, że obszar spinki do włosów cząsteczki sirna drugiego rodzaju jest cięty wewnątrzkomórkowo przez białko Dicer (lub jego odpowiednik), żeby utworzyć sirna dwóch niezależnych cząsteczek sparowanego zasadami RNA. [009] Jak się tutaj stosuje docelowe RNA odnosi się do cząsteczki RNA, której ekspresję zamierza się obniżyć. [0060] sirna może ulegać ekspresji z wektorów ekspresji pol III bez zmiany miejsca docelowego, tak jak uważa się, że jedynie skuteczna jest ekspresja RNA pod promotorem pol III, gdy pierwszym ulegającym transkrypcji nukleotydem jest puryna. [0061] sirna według wynalazku może być ukierunkowany do jakiegokolwiek odcinka w przybliżeniu 19-2 sąsiadujących nukleotydów w każdej docelowej sekwencji mrna ( sekwencja docelowa ). Techniki do wybrania sekwencji docelowych dla sirna są podane, na przykład, w Tuschl T. i wsp., "The sirna User Guide", revised Oct. 11, 02, ujawnienie w całości jest tutaj włączone jako odnośnik. "The sirna User Guide" jest dostępny w internecie na stronie internetowej prowadzonej przez Dr. Thomas Tuschl, Laboratory of RNA Molecular Biology, Rockefeller University, New York, USA, która może być znaleziona przez dostęp na stronie internetowej Rockefeller University za pomocą hasła sirna. Zatem nić sensowna niniejszego sirna zawiera sekwencję nukleotydów zasadniczo identyczną z każdym sąsiadującym

28 odcinkiem wynoszącym od około 19 do około 2 nukleotydów w docelowym mrna. [0062] Ogólnie, sekwencja docelowa w docelowym mrna może być wybrana z danej sekwencji cdna odpowiadającej docelowemu mrna, najlepiej rozpoczynającej się 0 do 0 nt w dół (tj. w kierunku 3 ) od kodonu start. Jednakże sekwencja docelowa może być umieszczona w nieulegającym translacji regionie lub 3 lub w regionie w pobliżu kodonu start. [0063] sirna może być otrzymany z zastosowaniem wielu technik znanych wykwalifikowanym w dziedzinie. Na przykład sirna może być syntetyzowany chemicznie, lub wytwarzany drogą rekombinacji z zastosowaniem sposobów znanych w dziedzinie, takich jak układ in vitro Drosophila opisany w opublikowanym zgłoszeniu 02/ Tuschl i wsp., którego ujawnienie w całości jest tutaj włączone jako odnośnik. [0064] Najlepiej, jeśli sirna jest syntetyzowany chemicznie z zastosowaniem właściwie chronionych fosforamidami rybonukleozydów i konwencjonalnego syntezatora DNA/RNA. sirna może być syntetyzowany jako dwie osobne komplementarne cząsteczki RNA lub jako pojedyncza cząsteczka RNA z dwoma komplementarnymi regionami. [006] Alternatywnie sirna może również ulegać ekspresji na zrekombinowanym kolistym lub liniowym plazmidzie DNA z zastosowaniem jakiegokolwiek odpowiedniego promotora. Takie postacie są włączone według niniejszego wynalazku, gdy zrobione jest tutaj odniesienie do podawania sirna lub włączenie sirna do kompozycji farmaceutycznych. Odpowiednie promotory do

29 ekspresji sirna wynalazku z plazmidu obejmują, na przykład, sekwencje promotorowe U6 lub H1 pol RNA III i promotor cytomegalowirusa. [0066] Selekcja innych właściwych promotorów mieści się w zakresie dziedziny wynalazku. Plazmidy rekombinacyjne mogą również zawierać dające się indukować i regulować promotory do ekspresji sirna w poszczególnych tkankach lub w określonym środowisku wewnątrzkomórkowym. [0067] Ulegające ekspresji na zrekombinowanym plazmidzie sirna albo może być izolowane z układów ekspresji hodowanych komórek standardowymi technikami, albo może ulegać ekspresji wewnątrzkomórkowo. Poniżej, bardziej szczegółowo jest dyskutowane zastosowanie plazmidów rekombinacyjnych do dostarczania sirna do komórek in vivo. sirna może ulegać ekspresji z plazmidów rekombinacyjnych albo jako dwie osobne komplementarne cząsteczki RNA albo jako pojedyncza cząsteczka RNA z dwoma komplementarnymi regionami. [0068] Selekcja plazmidów właściwych do ekspresji sirna, sposoby insercji do plazmidu sekwencji kwasu nukleinowego do ekspresji sirna i sposoby dostarczania plazmidów rekombinacyjnych do będących przedmiotem zainteresowania komórek mieszczą się w zakresie dziedziny wynalazku. [0069] sirna może również ulegać ekspresji in vivo wewnątrzkomórkowo ze zrekombinowanych wektorów wirusowych. Zrekombinowane wektory wirusowe zawierają sekwencje kodujące sirna i jakikolwiek właściwy promotor do ekspresji sekwencji sirna. Zrekombinowane wektory wirusowe mogą również zawierać dające się indukować lub regulować promotory do ekspresji sirna w

30 poszczególnych tkankach lub określonym środowisku wewnątrzkomórkowym. sirna może ulegać ekspresji ze zrekombinowanego wektora wirusowego albo jako dwie osobne komplementarne cząsteczki RNA albo jako pojedyncza cząsteczka RNA z dwoma komplementarnymi regionami. [0070] Określenie peptyd obejmuje oligo- i polipeptydy i odnosi się do substancji zawierających dwa lub więcej lepiej 3 lub więcej, lepiej 4 lub więcej, lepiej 6 lub więcej, lepiej 8 lub więcej, lepiej lub więcej, lepiej 13 lub więcej, lepiej 16 lub więcej, lepiej 21 lub więcej i lepiej aż do 8,,,, 40 lub 0, w szczególności 0 aminokwasów połączonych kowalencyjnie wiązaniem peptydowym. Określenie białko odnosi się do wielkich peptydów najlepiej do peptydów zawierających więcej niż 0 reszt aminokwasowych, ale zasadniczo określenia peptydy i białka są synonimami i są tutaj stosowane wymiennie. [0071] Najlepiej, jeśli opisane według wynalazku białka i peptydy zostały wyizolowane. Określenia wyizolowane białko lub wyizolowany peptyd oznaczają, że białko lub peptyd został oddzielony od swojego środowiska naturalnego. Wyizolowane białko może być w stanie zasadniczo oczyszczonym. Określenie zasadniczo oczyszczony oznacza, że białko lub peptyd jest zasadniczo wolny od innych substancji, z którymi w naturze lub in vivo jest związany. [0072] Takie białka i peptydy mogą być stosowane, na przykład, do wytwarzania przeciwciał i w testach immunologicznych lub diagnostycznych lub jako

31 1 2 terapeutyki. Opisane białka i peptydy według wynalazku mogą być wyizolowane z próbek biologicznych, takich jak tkanki lub homogenaty komórkowe i mogą również ulegać ekspresji w licznych pro- lub eukariotycznych rekombinacyjnych systemach ekspresyjnych. [0073] Do celów niniejszego wynalazku pochodne białek lub peptydów lub sekwencji aminokwasów zawierają warianty aminokwasów z insercją, warianty aminokwasów z delecją i/lub warianty aminokwasów z podstawieniem. [0074] Warianty aminokwasów z insercją obejmują fuzje na końcu aminowym i/lub karboksylowym i również insercje pojedynczego lub dwóch lub większej liczby aminokwasów w określonej sekwencji aminokwasów. W przypadku wariantów sekwencji aminokwasów posiadających insercję, jedna reszta lub więcej reszt aminokwasu zostaje wstawionych w określone miejsce w sekwencji aminokwasów, chociaż możliwe jest również losowe wstawienie z odpowiednią selekcją powstałego produktu. Warianty aminokwasów z delecją charakteryzują się usunięciem z sekwencji jednego lub większej liczby aminokwasów. Warianty aminokwasów z podstawieniem charakteryzują się tym, że co najmniej jedna reszta sekwencji jest usunięta, a w jej miejsce jest wstawiona inna reszta. Preferowane są modyfikacje zachodzące w pozycjach sekwencji aminokwasów, które nie są konserwowane pomiędzy homologicznymi białkami lub peptydami i/lub modyfikacje polegające na zastąpieniu aminokwasów innymi o podobnych właściwościach, takich jak hydrofobowość, hydrofilność, elektroujemność, objętość łańcucha bocznego i podobne (podstawienia konserwowane). Na przykład konserwatywne podstawienia

32 odnoszą się do wymiany jednego aminokwasu z innym aminokwasem, wymienionym poniżej, z tej samej grupy, co aminokwas podstawiany: 1. małe alifatyczne reszty niepolarne lub w niewielkim stopniu polarne: Ala, Ser, Thr (Pro, Gly) 2. reszty naładowane ujemnie i ich amidy: Asn, Asp, Glu, Gln 3. reszty naładowane dodatnio: His, Arg, Lys 4. wielkie alifatyczne reszty niepolarne: Met, Leu, Ile, Val (Cys). wielkie reszty kwasów aromatycznych: Phe, Tyr, Trp. [007] Dzięki ich szczególnej roli w strukturze białka, trzy reszty są przedstawione w nawiasach. Gly jest jedyną resztą bez łańcucha bocznego, a zatem nadaje łańcuchowi elastyczność. Pro posiada niezwykłą geometrię, która znacznie ogranicza łańcuch. Cys może tworzyć mostki dwusiarczkowe. [0076] Opisane powyżej warianty aminokwasów mogą być łatwo przygotowane za pomocą znanych technik syntezy peptydów, takich jak na przykład synteza na fazie stałej (Merrifield, 1964) i podobnych sposobów lub przez rekombinację DNA. Manipulację sekwencji DNA do przygotowania białek i peptydów posiadających podstawienia, insercje lub delecje opisano w szczegółach na przykład w Sambrook i wsp., (1989). [0077] Według wynalazku pochodne białek i peptydów obejmują również pojedyncze lub wielokrotne podstawienia, delecje lub addycje jakichkolwiek cząsteczek związanych z białkiem lub z peptydem, takich jak węglowodany, lipidy i/lub białka lub peptydy.

33 Określenie pochodna rozciąga się również na wszystkie funkcjonalne ekwiwalenty chemiczne wspomnianych białek i peptydów. [0078] Według wynalazku najlepiej, jeśli część lub fragment antygenu związanego z nowotworem posiada właściwości funkcjonalne białka lub peptydu, z którego pochodzi. Takie właściwości funkcjonalne obejmują interakcje z przeciwciałami, interakcje z innymi peptydami lub białkami, selektywne wiązanie kwasów nukleinowych i aktywność enzymatyczną. Szczególną właściwością jest zdolność do tworzenia kompleksu z cząsteczkami MHC i gdzie jest to odpowiednie wywoływanie odpowiedzi immunologicznej, najlepiej przez stymulację komórek cytotoksycznych lub komórek pomocniczych T. Najlepiej, jeśli część lub fragment antygenu związanego z nowotworem zawiera sekwencję co najmniej 6, w szczególności co najmniej 8, co najmniej, co najmniej 12, co najmniej 1, co najmniej, co najmniej lub co najmniej 0 kolejnych aminokwasów antygenu związanego z nowotworem. Najlepiej, jeśli część lub fragment antygenu związanego z nowotworem zawiera sekwencję wynoszącą aż do 8, w szczególności aż do, aż do 12, aż do 1, aż do lub aż do kolejnych aminokwasów antygenu związanego z nowotworem. Najlepiej, jeśli część lub fragment antygenu związanego z nowotworem jest częścią antygenu związanego z nowotworem, która odpowiada części nieprzezbłonowej, w szczególności zewnątrzkomórkowej części antygenu lub jest w niej zawarta. [0079] Preferowane części lub fragmenty antygenu związanego z nowotworem według wynalazku są szczególnie

34 odpowiednie do stymulacji in vivo cytotoksycznych limfocytów T jak również do wytwarzania limfocytów obwodowych i stymulowanych limfocytów T do adoptywnego transferu terapeutycznego ex vivo. [0080] Część lub fragment kwasu nukleinowego kodującego antygen związany z nowotworem odnosi się według wynalazku, jak określono powyżej, do części kwasu nukleinowego, który koduje, co najmniej antygen związany z nowotworem i/lub do części lub fragmentu wspomnianego antygenu związanego z nowotworem. Najlepiej, jeśli część lub fragment kwasu nukleinowego kodującego antygen związany z nowotworem jest tą częścią kwasu nukleinowego, która odpowiada otwartej ramce odczytu. [0081] Surowice odpornościowe, które zawierają specyficzne przeciwciała specyficznie wiążące się do białka docelowego mogą być przygotowane różnymi standardowymi procedurami, patrz na przykład, "Monoclonal Antibodies: A Practical Approach" by Philip Shepherd, Christopher Dean ISBN ; "Antibodies: A Laboratory Manual" by Ed Harlow, David Lane, ISBN: i "Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO" by Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow ISBN Zatem możliwe jest również wytworzenie afinicznych i specyficznych przeciwciał, które rozpoznają kompleks białek błonowych w ich natywnej postaci (Azorsa i wsp., J. Immunol. Methods 229: 3-48, 1999; Anderson i wsp., J. Immunol. 143: , 1989; Gardsvoll, J. Immunol. Methods 234: 7-116, 00). Jest to szczególnie istotne do przygotowania przeciwciał, które

35 mają być stosowane w terapii, ale istotne również do wielu zastosowań diagnostycznych. W tym względzie możliwa jest immunizacja całym białkiem, częścią zewnątrzkomórkową sekwencji jak również komórkami z ekspresją cząsteczki docelowej w jej postaci zwiniętej wykazującej właściwości fizjologiczne. Tradycyjnie przeciwciała monoklonalne są przygotowywane z zastosowaniem technologii hybrydoma (odnośnie szczegółów technicznych patrz: "Monoclonal Antibodies: A Practical Approach" by Philip Shepherd, Christopher Dean ISBN , "Antibodies: A Laboratory Manual" by Ed Harlow, David Lane ISBN: , "Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO" by Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow ISBN: ). [0082] Wiadome jest, że jedynie antydeterminanta, mała część cząsteczki przeciwciała, jest zaangażowana w wiązanie przeciwciała do jego epitopu (cf. Clark, W.R. (1986), The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley & Sons, Inc., New York, Roitt, I. (1991), Essential Immunology, 7th Edition, Blackwell Scientific Publications, Oxford). Regiony pfc i Fc są, na przykład, efektorami kaskady układu dopełniacza, ale nie są zaangażowane w wiązanie antygenu. Przeciwciało, z którego enzymatycznie usunięto region pfc lub które utworzono bez regionu pfc, nazywane fragmentem F(ab ) 2, posiada oba miejsca wiązania antygenu całego przeciwciała. Podobnie przeciwciało, z którego enzymatycznie usunięto region Fc lub które utworzono bez wspomnianego regionu Fc, nazywane fragmentem Fab, posiada jedno miejsce wiązania antygenu nienaruszonej

36 3 1 2 cząsteczki przeciwciała. Co więcej fragmenty Fab składające się z kowalencyjnie związanego lekkiego łańcucha przeciwciała z częścią ciężkiego łańcucha wspomnianego przeciwciała, są nazywane Fd. Fragmenty Fd są głównymi determinantami specyficzności przeciwciała (pojedynczy fragment Fd może być związany z aż dziesięcioma różnymi łańcuchami lekkimi, bez zmiany specyficzności przeciwciała) i fragmenty Fd, gdy są izolowane, zachowują zdolność wiązania się do epitopu. [0083] W części przeciwciała wiążącej antygen umieszczone są określające komplementarność regiony (CDR), które oddziałują bezpośrednio z epitopem antygenu i regiony zrębowe (FR), które utrzymują trzeciorzędową strukturę antydeterminanty. Zarówno fragment Fd łańcucha ciężkiego jak i lekki łańcuch immunoglobulin IgG zawierają cztery regiony zrębowe (FR1 do FR4), które w każdym przypadku są oddzielone przez trzy określające komplementarność regiony (CDR1 do CDR3). CDR, a w szczególności regiony CDR3, a jeszcze bardziej szczególnie region CDR3 łańcucha ciężkiego są w znacznym stopniu odpowiedzialne za specyficzność przeciwciała. [0084] Wiadomo, że regiony nie-cdr przeciwciał ssaków mogą być zastąpione podobnymi regionami przeciwciał o takiej samej lub różnej specyficzności, z zachowaną specyficznością do epitopu oryginalnego przeciwciała. Umożliwia to opracowanie przeciwciał humanizowanych, w których, żeby utworzyć funkcjonalne przeciwciało, CDRy nie człowieka są kowalencyjnie związane z regionami FR i/lub Fc/pFc człowieka.

37 [008] Jako następny przykład, WO 92/04381 opisuje wytwarzanie i stosowanie humanizowanych mysich przeciwciał RSV, w których co najmniej część mysich regionów FR została zastąpiona regionami FR pochodzenia ludzkiego. Przeciwciała tego rodzaju, włączając fragmenty nienaruszonych przeciwciał ze zdolnością wiązania antygenu, są często nazywane przeciwciałami chimerowymi. [0086] Według wynalazku określenie przeciwciało obejmuje również fragmenty F(ab ) 2, Fab, Fv i Fd przeciwciał, przeciwciała chimerowe, w których regiony Fc i/lub FR i/lub CDR1 i/lub CDR2 i/lub regiony CDR3 lekkiego łańcucha zostały zastąpione sekwencjami homologicznymi człowieka lub nie człowieka, fragment F(ab ) 2 przeciwciał chimerowych, w których regiony FR i/lub CDR1 i/lub CDR2 i/lub regiony CDR3 lekkiego łańcucha zostały zastąpione sekwencjami homologicznymi człowieka lub nie człowieka, fragment Fab przeciwciał chimerowych, w których regiony FR i/lub CDR1 i/lub CDR2 i/lub regiony CDR3 lekkiego łańcucha zostały zastąpione sekwencjami homologicznymi człowieka lub nie człowieka i fragment Fd przeciwciał chimerowych, w których regiony FR i/lub CDR1 i/lub CDR2 zostały zastąpione sekwencjami homologicznymi człowieka lub nie człowieka. Określenie przeciwciało zawiera również przeciwciała jednołańcuchowe. [0087] Białka i peptydy, które wiążą się specyficznie z antygenami związanymi z nowotworem, mogą być dostarczone, na przykład, z bibliotek zdegenerowanych peptydów, które to peptydy mogą być przygotowane po prostu w roztworze w postaci zamrożonej lub jako

38 biblioteka fagowa. Możliwe jest także przygotowanie kombinatorycznych bibliotek peptydów z jednym lub większą liczbą aminokwasów. Mogą być również przygotowane biblioteki wytworzonych syntetycznie peptoidów i reszt niepeptydowych. [0088] Przeciwciała mogą być również połączone ze specyficznymi substancjami diagnostycznymi do uwidaczniania komórek i tkanek z ekspresją antygenów związanych z nowotworem. Mogą być one również połączone z terapeutycznie użytecznymi substancjami. [0089] Substancje diagnostyczne obejmują każdy znacznik, który działa żeby: (i) dostarczyć możliwy do wykrycia sygnał, (ii) oddziaływać z drugim znacznikiem, żeby zmodyfikować wykrywalny sygnał dostarczany przez pierwszy lub drugi znacznik, np. FRET (transfer energii rezonansu fluorescencji), (iii) oddziaływać na ruchliwość, np. ruchliwość elektroforetyczną przez ładunek, hydrofobowość, kształt lub inne fizyczne parametry lub (iv) dostarczać cząsteczkę wychwytującą, np. powinowactwo, przeciwciało/antygen, kompleksowanie jonowe. Odpowiednimi jako znacznik są struktury takie jak znaczniki fluorescencyjne, znaczniki luminescencyjne, znaczniki chromoforowe, znaczniki radioizotopowe, znaczniki izotopowe, najlepiej stabilne znaczniki izotopowe, znaczniki izobaryczne, znaczniki enzymatyczne, znaczniki cząstkami, w szczególności znaczniki cząstkami metalu, znaczniki cząstkami magnetycznymi, znaczniki cząstkami polimeru, małe cząsteczki organiczne takie jak biotyna, ligandy receptorów lub cząsteczki wiążące, takie jak komórkowe białka adhezyjne lub lektyny, sekwencje znakujące

39 zawierające kwasy nukleinowe i/lub reszty aminokwasowe, które mogą być wykryte przez zastosowanie czynników wiążących itd. Substancje diagnostyczne zawierają, w nieograniczony sposób siarczan baru, amid kwasu octowego, kwas jopanowy, ipodat wapnia, sól sodową kwasu 3,-diacetamido-2,4,6-trijodobenzoesowego, sól megluminową kwasu 3,-diacetamido-2,4,6- trijodobenzoesowego, metrizamid, trypanonian sodu i radiodiagnostyczne obejmując emitery pozytonowe takie jak fluorodeoksyglukoza (18F) i węgiel C-11, emitery gama takie jak jod-123, technet-99m, jod-131 i ind-111, nuklidy do magnetycznego rezonansu jądrowego takie jak fluor i gadolin. [0090] Według wynalazku określenie substancja terapeutycznie użyteczna oznacza każdą cząsteczkę, która może wywrzeć działanie terapeutyczne. Najlepiej, jeśli substancja terapeutycznie użyteczna według wynalazku jest selektywnie kierowana do komórki, w której ulega ekspresji jeden lub więcej antygenów związanych z nowotworem i zawiera czynniki przeciwnowotworowe, radioaktywne związki znakowane jodem, toksyny, leki cytostatyczne lub cytolityczne itd. Czynniki przeciwnowotworowe obejmują, na przykład, aminoglutetymid, azatioprynę, siarczan bleomycyny, busulfan, karmostynę, chlorambucyl, cisplatynę, cyklofosfamid, cyklosporynę, cytarabidynę, dakarbazynę, daktynomycynę, daunorubinę, doksorubicynę, taksol, etopozyd, fluorouracyl, interferon-α, lomustynę, merkaptopurynę, metotreksat, mitotan, prokarbazynę HCl, tioguaninę, siarczan winblastyny i siarczan winkrystyny. Inne czynniki przeciwnowotworowe są

40 opisane, na przykład, w Goodman and Gilman, "The Pharmacological Basis of Therapeutics", 8th Edition, 1990, McGraw-Hill, Inc., w szczególności rozdział 2 (Antineoplastic Agents (Paul Calabresi and Bruce A. Chabner). Toksynami mogą być białka takie jak przeciwwirusowe białko szkarłatki, toksyna cholery, toksyna krztuśca, rycyna, gelonina, abryna, egzotoksyna błonicza lub egzotoksyna pałeczki. Resztami toksyny mogą być także radionuklidy emitujące promieniowanie o wysokiej energii, takie jak kobalt-60. [0091] Określenie główny kompleks zgodności tkankowej lub MHC odnosi się do kompleksu genów obecnych u wszystkich kręgowców. Białka lub cząsteczki MHC są zaangażowane w sygnalizację pomiędzy limfocytami, a komórkami prezentującymi antygen w prawidłowych reakcjach immunologicznych przez wiązanie peptydów i prezentowanie ich do rozpoznania przez receptory komórek T (TCR). Cząsteczki MHC wiążą peptydy w wewnątrzkomórkowym przedziale przetwarzającym i prezentują te peptydy na powierzchni komórek prezentujących antygen do rozpoznania przez komórki T. Region ludzkiego MHC określany również jako HLA jest umieszczony na chromosomie 6 i obejmuje region klasy I i region klasy II. W jednej, preferowanej postaci wynalazku cząsteczka MHC jest cząsteczką HLA. [0092] Zmniejszać lub hamować, jak się tutaj używa oznacza zdolność do powodowania całościowego zmniejszania poziomu, lepiej o % lub więcej, jeszcze lepiej, jeśli o 0% lub więcej, a najlepiej, jeśli o 7% lub więcej, np., poziomu białka lub mrna w porównaniu do próbki referencyjnej (np. próbki nie

41 traktowanej sirna). To zmniejszanie lub inhibicja RNA lub ekspresji białka może wystąpić przez trawienie lub degradację docelowego mrna. Testy do ekspresji białek lub kwasów nukleinowych są znane w dziedzinie i obejmują, na przykład, badanie ELISA, analizę ekspresji białek techniką western blot i northern blot lub w przypadku RNA technika ilościowej oceny mrna. [0093] Określenie pacjent oznacza według wynalazku człowieka, zwierzę naczelne, nie człowieka lub inne zwierzę, w szczególności ssaka, takiego jak krowa, koń, świnia, owca, koza, pies, kot lub gryzonia takiego jak mysz i szczur. W szczególnie preferowanej postaci wynalazku pacjentem jest człowiek. [0094] Ekspresja nieprawidłowa według wynalazku oznacza, że ekspresja jest zmieniona, najlepiej zwiększona w porównaniu ze stanem u człowieka zdrowego [009] Według wynalazku najlepiej, jeśli określenie zwiększona lub zwiększona ilość odnosi się do zwiększenia o co najmniej %, w szczególności o co najmniej %, o co najmniej 0%, lub o co najmniej 0%. Ilość substancji w badanej próbce, takiej jak próbka biologiczna, jest także zwiększona w porównaniu z próbką referencyjną, jeśli jest ona wykrywalna w próbce badanej, a jest nieobecna lub nie jest wykrywalna w próbce referencyjnej. [0096] Według wynalazku określenie choroba odnosi się do każdego stanu patologicznego, w którym antygeny związane z nowotworem ulegają ekspresji lub ekspresji nieprawidłowej. Ekspresja nieprawidłowa według wynalazku oznacza, że ekspresja jest zmieniona, najlepiej zwiększona w porównaniu ze stanem u osoby

42 zdrowej. Zwiększenie ekspresji odnosi się do zwiększenia o co najmniej %, w szczególności o co najmniej %, o co najmniej 0%, lub o co najmniej 0%. W jednej postaci wynalazku antygen związany z nowotworem ulega ekspresji jedynie w tkance osoby chorej, podczas gdy ekspresja u osoby zdrowej jest zahamowana. Przykładem takiej choroby jest rak, gdzie według wynalazku określenie rak obejmuje białaczki, nasieniaki, czerniaki, potworniaki, chłoniaki, nerwiaki niedojrzałe, glejaki, rak odbytnicy, rak śluzówki macicy, rak nerki, rak nadnercza, rak grasicy, rak krwi, rak skóry, rak mózgu, rak szyjki macicy, rak jelita, rak wątroby, rak okrężnicy, rak żołądka, rak jelita, rak głowy i szyi, rak żołądkowo-jelitowy, rak węzłów chłonnych, rak przełyku, rak jelita grubego, rak trzustki, rak ucha, nosa i gardła (ENT), rak piersi, rak prostaty, rak macicy, rak jajnika i rak płuc i ich przerzuty. Ich przykładami są nowotwory płuc, nowotwory sutka, nowotwory prostaty, nowotwory okrężnicy, nowotwory miąższu nerki, nowotwory szyjki macicy lub przerzuty typów raka lub guzów opisanych powyżej. Określenie rak według wynalazku obejmuje również przerzuty raka. [0097] Przez określenie guz rozumie się nieprawidłową grupę komórek lub tkankę, która rośnie dzięki gwałtownej, niekontrolowanej proliferacji komórkowej i kontynuuje wzrost po ustaniu bodźca, który zapoczątkował nowy wzrost. Guzy wykazują częściowy lub całkowity brak uporządkowania strukturalnego i koordynacji funkcjonalnej z prawidłową tkanką i

43 zazwyczaj tworzy odrębną masę tkanki, która może mieć charakter albo łagodny albo złośliwy. [0098] Przez określenie przerzut rozumie się rozprzestrzenianie się komórek raka z jego oryginalnego miejsca do innej części ciała. Tworzenie się przerzutu jest bardzo złożonym procesem i zależy od oddzielenia się złośliwych komórek od guza pierwotnego, nacieku pozakomórkowego matriksu, penetracji śródbłonka błony podstawnej, żeby przedostać się do jamy ciała i naczyń, a następnie, po przeniesieniu przez krew infiltracji organów docelowych. Na koniec, wzrost nowego guza na miejscu docelowym zależy od angiogenezy. Przerzut guza często występuje nawet po usunięciu guza pierwotnego, ponieważ komórki guza lub składniki mogą pozostać i rozwijać potencjał przerzutowy. W jednej postaci wynalazku określenie przerzut według wynalazku odnosi się do przerzutu odległego, który odnosi się do przerzutu, który jest odległy od guza pierwotnego i regionalnego układu węzła chłonnego. [0099] Według wynalazku próbką biologiczną może być próbka tkanki, obejmując płyny ustrojowe i/lub próbkę komórkową i może zostać otrzymana w sposób konwencjonalny, taki jak biopsja tkanki, obejmując biopsję sztancową i przez pobranie krwi, zasysanie oskrzelowe, plwocinę, mocz, kał i inne płyny ustrojowe. Według wynalazku określenie próbka biologiczna obejmuje również frakcje biologicznych próbek. [00] Według wynalazku określenie komórka immunoreaktywna oznacza komórkę, która może dojrzeć do komórki odpornościowej (takiej jak komórka B, komórka pomocnicza T lub cytolityczna komórka T) o odpowiedniej

44 stymulacji. Immunoreaktywne komórki zawierają krwiotwórcze komórki szpiku CD34 +, niedojrzałe i dojrzałe komórki T i niedojrzałe i dojrzałe komórki B. Jeśli pożądane jest wytwarzanie cytolitycznych lub pomocniczych komórek T rozpoznających antygen związany z nowotworem, komórka immunoreaktywna zostaje zetknięta z komórką, w której zachodzi ekspresja antygenu związanego z nowotworem w warunkach, które sprzyjają wytwarzaniu, różnicowaniu i/lub selekcji cytolitycznych komórek T i komórek pomocniczych T. Różnicowanie prekursorów komórek T w cytolityczne komórki T, gdy zostają wystawione na działanie antygenu jest podobne do klonalnej selekcji układu immunologicznego. [01] Określenia komórka T i limfocyt T są tutaj używane wymiennie i obejmują komórki pomocnicze T i komórki cytotoksyczne T, które zawierają cytolityczne komórki T. [02] Niektóre sposoby terapeutyczne opierają się na reakcji układu immunologicznego pacjenta, która powoduje lizę komórek prezentujących antygen, takich jak komórki raka, które prezentują jeden lub więcej antygenów związanych z nowotworem. W takim połączeniu, na przykład autologiczne, cytotoksyczne limfocyty T specyficzne dla kompleksu antygenu związanego z nowotworem i cząsteczki MHC są podawane pacjentowi posiadającemu nieprawidłowość komórkową. Znane jest wytwarzanie in vitro takich cytotoksycznych limfocytów T. Przykład sposobu różnicowania komórek T może być znaleziony w WO-A Ogólnie, od pacjenta zostaje pobrana próbka zawierająca komórki takie jak komórki krwi i komórki zostają zetknięte z komórką, która

45 prezentuje kompleks i która może spowodować propagację cytotoksycznych limfocytów T (np. komórek dendrytycznych). Komórką docelową może być komórka transfekowana, taka jak komórka COS. Te komórki transfekowane prezentują na swojej powierzchni pożądany kompleks i gdy zostaną zetknięte z cytotoksycznymi limfocytami T stymulują propagację tych ostatnich. Następnie są podawane pacjentowi rozpowszechniane klonalnie autologiczne, cytotoksyczne limfocyty T. [03] W innym sposobie selekcji specyficznie antygenowych, cytotoksycznych limfocytów T, fluorogeniczne tetramery MHC I klasy kompleksów cząsteczka/peptyd są stosowane do otrzymywania specyficznych klonów cytotoksycznych limfocytów T (Altman i wsp., Science 274:94-96, 1996, Dunbar i wsp., Curr. Biol. 8: , 1998). [04] W sposobach terapeutycznych o których mowa jako transferze adoptywnym (Greenberg, J. Immunol. 136():1917, 1986, Riddel i wsp., Science 27:238, 1992; Lynch i wsp., Eur. J. Immunol. 21: , 1991, Kast i wsp., Cell 9: , 1989), komórki prezentujące pożądany kompleks (np. komórek dendrytycznych) zostają połączone z cytotoksycznymi limfocytami T pacjenta, który ma być leczony, powodując namnożenie specyficznych cytotoksycznych limfocytów T. Namnożone cytotoksyczne limfocyty T są następnie podawane pacjentowi posiadającemu nieprawidłowość komórkową znamienną przez szczególnie nieprawidłowe komórki prezentujące specyficzny kompleks. Następnie cytotoksyczne limfocyty T powodują lizę nieprawidłowych

46 4 1 2 komórek osiągając w ten sposób pożądany efekt terapeutyczny. [0] Ponadto, komórki prezentujące pożądany kompleks (np. komórki dendrytyczne) mogą zostać połączone z cytotoksycznymi limfocytami T osób zdrowych lub innych gatunków (np. myszy), co może skutkować namnażaniem specyficznych cytotoksycznych limfocytów T o wysokim powinowactwie. Receptor komórki T o wysokim powinowactwie, tych namnożonych specyficznych limfocytów T, może być klonowany i opcjonalnie humanizowany do innych rozmiarów, a otrzymane w ten sposób receptory komórki T mogą być transdukowane przez transfer genu do komórek T pacjentów, na przykład stosując wektory retrowirusowe. Następnie może być przeprowadzony transfer adoptywny z zastosowaniem tych zmienionych genetycznie limfocytów T. (Stanislawski i wsp., Nat Immunol. 2:962-70, 01, Kessels i wsp., Nat Immunol. 2:97-61, 01). [06] Cytotoksyczne limfocyty T mogą być również tworzone in vivo w sposób znany per se. Jeden sposób stosuje nieulegające proliferacji komórki z ekspresją kompleksu. Będą tutaj stosowane komórki takie, w których zazwyczaj zachodzi ekspresja kompleksu, takie jak naświetlone komórki nowotworu lub komórki transfekowane jednym lub oboma genami koniecznymi do prezentacji kompleksu (t.j peptydu antygenicznego i prezentującej cząsteczki MHC). Inną preferowaną postacią jest wprowadzenie antygenu związanego z nowotworem w postaci zrekombinowanego RNA, który może być wprowadzony do komórek, na przykład przez transfer liposomalny lub przez elektroporację. Powstałe komórki

47 prezentują kompleks będący przedmiotem zainteresowania i są rozpoznawane przez autologiczne cytotoksyczne limfocyty T, które następnie się namnażają. [07] Podobny skutek może zostać osiągnięty przez połączenie antygenu związanego z nowotworem lub jego fragmentu z adiuwantem w celu umożliwienia wprowadzenia in vivo do komórek prezentujących antygen. Antygen związany z nowotworem lub jego fragment może być reprezentowany przez białko, przez DNA (np. w wektorze) lub przez RNA. Antygen związany z nowotworem jest przetwarzany, żeby wytworzyć partnera peptydowego dla cząsteczki MHC, podczas gdy jego fragment może być prezentowany bez konieczności dalszego przetwarzania. Ten ostatni jest szczególnie przypadkiem, gdy mogą się one wiązać z cząsteczkami MHC. Preferencja jest dawana postaciom podawania, w których kompletny antygen jest przetwarzany in vivo przez komórkę dendrytyczną, ponieważ może to również wytworzyć odpowiedzi pomocniczej komórki T, ponieważ są one potrzebne do skutecznej odpowiedzi immunologicznej (Ossendorp i wsp., Immunol Lett., 74:7-9, 00, Ossendorp i wsp., J. Exp. Med. 187: , 1998). Ogólnie, jest możliwe podanie pacjentowi skutecznej ilości antygenu związanego z nowotworem na przykład wstrzyknięciem śródskórnym. Jednakże wstrzyknięcie może być również wykonane międzywęzłowo do węzłów chłonnych (Maloy i wsp., Proc Natl Acad Sci USA 98:3299-3, 01). [08] Najlepiej jeśli określenia według wynalazku immunizacja lub szczepienie odnoszą się do wzrostu lub aktywacji odpowiedzi immunologicznej na antygen. Możliwe jest stosowanie modeli zwierzęcych do badania

48 wpływu immunizacji na raka przez stosowaniu antygenu związanego z nowotworem lub kodującego w tym celu kwasu nukleinowego. Na przykład komórki ludzkiego raka mogą zostać wprowadzone do myszy, żeby wytworzyć guz i podany może zostać jeden lub więcej kwasów nukleinowych kodujących antygeny związane z nowotworem. Wpływ na komórki raka (na przykład zmniejszenie rozmiaru guza) może być mierzony jako pomiar skuteczności immunizacji za pomocą kwasu nukleinowego. [09] Do indukowania odpowiedzi immunologicznej lub do zwiększenia odpowiedzi immunologicznej najlepiej, jeśli razem z jednym lub większą ilością adiuwantów, podawany jest jako część kompozycji do immunizacji lub szczepienia jeden lub więcej antygenów związanych z nowotworem. Adiuwant jest substancją, która jest wbudowana w antygen lub podawana razem z tym ostatnim i która zwiększa odpowiedź immunologiczną. Adiuwanty mogą zwiększyć odpowiedź immunologiczną przez zapewnienie zbiornika antygenu (zewnątrzkomórkowo lub w makrofagach), aktywowanie makrofagów i/lub stymulowanie szczególnych limfocytów. Adiuwanty są znane i obejmują w sposób nieograniczający monofosforylowy lipid A (MPL, SmithKline Beecham), saponiny takie jak QS21 (SmithKline Beecham), DQS21 (SmithKline Beecham; WO 96/33739), QS7, QS17, QS18 i QS-L1 (So i wsp., Mol. Cells 7: , 1997), niekompletny adiuwant Freunda, kompletny adiuwant Freunda, witaminę E, montanid, ałun, oligonukleotydy CpG (cf. Kreig i wsp., Nature 374:46-9, 199) i różne emulsje oleju w wodzie przygotowane z olejów biologicznie degradowalnych takich jak skwalen i/lub tokoferol. Najlepiej, jeśli peptydy podawane są w

49 mieszaninie z DQS21/MPL. Stosunek DQS21 do MPL zazwyczaj wynosi około 1: do :1, lepiej około 1: do :1, a w szczególności około 1:1. Do podawania ludziom, formulacja szczepionki zazwyczaj zawiera DQS21 i MPL w zakresie od około 1 µg do około 0 µg. [01] Podawane być również mogą inne substancje, które stymulują odpowiedź immunologiczną u pacjenta. Jest możliwe, na przykład, stosowanie w szczepionce cytokin dzięki ich regulatorowym właściwościom względem limfocytów. Takie cytokiny na przykład zawierają interleukinę 12 (IL-12), która wykazała, że powoduje wzrost ochronnych działań szczepionek (cf. Science 268: , 199), GM-CSF i IL-18. [0111] Istnieje wiele związków, które wzmacniają odpowiedź immunologiczną i które mogą zatem być stosowane w szczepionce. Wspomniane związki zawierają kostymulujące cząsteczki dostarczane w postaci białek lub kwasów nukleinowych takich jak B7-1 i B7-2 (odpowiednio CD80 i CD86). [0112] Białka i peptydy mogą być podawane w sposób znany per se. W jednej postaci wynalazku kwasy nukleinowe są podawane sposobami ex vivo, tj. przez usunięcie pacjentowi komórek, modyfikację genetyczną wspomnianych komórek w celu wprowadzenia antygenu związanego z nowotworem i ponownego wprowadzenia pacjentowi zmienionych komórek. Ogólnie to obejmuje wprowadzania in vitro do komórek pacjenta funkcjonalnej kopi genu i ponowne wprowadzenia pacjentowi genetycznie zmienionych komórek. Funkcjonalna kopia genu znajduje się pod funkcjonalną kontrolą elementów regulatorowych, które umożliwiają, żeby gen ulegał ekspresji w

50 genetycznie zmienionych komórkach. Wykwalifikowanym pracownikom znane są sposoby transfekcji i transdukcji. Kwasy nukleinowe mogą być podawane in vivo przy użyciu wektorów takich jak wirusy i kontrolowane docelowo liposomy. Jeśli według wynalazku czynione jest odniesienie do podawania lub wprowadzania do kompozycji farmaceutycznych kwasów nukleinowych, obejmuje ono postacie wynalazku, w których w takich wektorach obecny jest kwas nukleinowy. [0113] W preferowanej postaci wynalazku wirus lub wirusowy wektor do podawania kwasu nukleinowego kodującego antygen związany z nowotworem zostaje wybrany z grupy składającej się z adenowirusów, wirusów związanych z adenowirusem, wirusów ospy, obejmując wirus krowianki i osłabione wirusy ospy, wirus Semliki Forest, retrowirusy, wirus sindbis i wirusopodobne cząstki Ty. Szczególne preferencje są dawane adenowirusom i retrowirusom. Retrowirusy są zazwyczaj niesprawne replikacyjnie (tj. nie są one zdolne do tworzenia cząstek zakaźnych). [0114] Sposoby wprowadzania kwasów nukleinowych do komórek in vitro lub in vivo obejmują transfekcję kwasu nukleinowego strontami z fosforanem wapnia, transfekcję kwasu nukleinowego związanego z DEAE, transfekcję lub infekcję z powyższymi wirusami przenoszącymi kwasy nukleinowe będące przedmiotem zainteresowania, transfekcję za pośrednictwem liposomów i podobne. W szczególnych postaciach wynalazku preferowane jest kierowanie kwasu nukleinowego do poszczególnych komórek. W takich postaciach wynalazku nośnik stosowany do podawania kwasu nukleinowego do komórki (np.

51 0 1 2 retrowirus lub liposom) może mieć wiązanie docelowe cząsteczki kontrolnej. Na przykład cząsteczka taka jak przeciwciało specyficzne dla białka powierzchniowego błony na komórce docelowej lub ligand dla receptora na komórce docelowej mogą być włączone do lub związane z nośnikiem kwasu nukleinowego. Preferowane przeciwciała obejmują przeciwciała, które wiążą się selektywnie z antygenem związanym z nowotworem. Jeśli pożądane jest podawanie kwasu nukleinowego za pośrednictwem liposomów, białka wiążące się z białkiem powierzchniowym błony związane z endocytozą mogą być włączone do preparatu liposomowego w celu umożliwienia docelowego sterowania i/lub wchłaniania. Takie białka obejmują białka kapsydu lub ich fragmenty, które są specyficzne dla poszczególnego typu komórek, przeciwciała dla białek, które są internalizowane, białka kierowane do miejsca wewnątrzkomórkowego, i tym podobne. [011] Kompozycje terapeutyczne mogą być podawane w postaci preparatów farmaceutycznie kompatybilnych. Takie preparaty mogą zazwyczaj zawierać farmaceutycznie kompatybilne stężenia soli, substancje buforujące, środki konserwujące, nośniki, uzupełniające substancje wzmacniające odporność, takie jak adiuwanty, np. oligonukleotydy CpG, cytokiny, chemokiny, saponiny, GM- CSF i/lub RNA oraz, w razie potrzeby, inne związki aktywne terapeutycznie. [0116] Terapeutycznie aktywne związki można podawać dowolną typową drogą, w tym poprzez wstrzyknięcie lub infuzję. Podawanie może być przeprowadzane, na przykład, doustnie, dożylnie, dootrzewnowo,

52 1 1 2 domięśniowo, podskórnie lub przezskórnie. Najlepiej, jeśli przeciwciała są podawane terapeutycznie w postaci aerozolu do płuc. Najlepiej, jeśli antysensowne kwasy nukleinowe są podawane powolnym podawaniem dożylnym. [0117] Opisane tutaj kompozycje są podawane w ilościach skutecznych. Skuteczna ilość odnosi się do ilości, która daje pożądaną reakcję lub pożądany skutek, sama lub w połączeniu z kolejnymi dawkami. W przypadku leczenia szczególnej choroby lub szczególnego stanu znamiennego przez ekspresję jednego lub więcej antygenów związanych z nowotworem, najlepiej, jeśli pożądana reakcja dotyczy hamowania przebiegu choroby. To obejmuje spowolnienie postępu choroby i, w szczególności, przerywanie lub odwrócenie postępu choroby. Reakcją pożądaną w leczeniu choroby lub stanu może być również opóźnianie wystąpienia lub zapobieganie wystąpieniu wspomnianej choroby lub wspomnianego stanu. Według wynalazku, diagnozowanie lub leczenie raka może także zawierać diagnozowanie lub leczenie przerzutów raka, które już powstały lub które się utworzą. Według wynalazku, określenie leczenie obejmuje leczenie terapeutyczne i profilaktyczne, tj. profilaktykę. [0118] Skuteczna ilość kompozycji będzie zależała od leczonego stanu, powagi choroby, poszczególnych parametrów pacjenta, w tym wieku, stanu fizjologicznego, wzrostu i wagi, czasu trwania leczenia, rodzaju terapii towarzyszącej (jeśli występuje), specyficznej drogi podawania i czynników podobnych.

53 2 1 2 [0119] Najlepiej, jeśli kompozycje farmaceutyczne są sterylne i zawierają skuteczną ilość terapeutycznie aktywnej substancji do wytworzenia pożądanej reakcji lub pożądanego skutku. [01] Podawane dawki kompozycji mogą zależeć od różnych parametrów, takich jak rodzaj podawania, stan pacjenta, pożądany okres podawania, itp. W przypadku, gdy reakcja pacjenta przy dawce początkowej była niewystarczająca, stosowane mogą być większe dawki (lub efektywnie wyższe dawki skutecznie osiągnięte przez bardziej zlokalizowaną inną drogę podawania). [0121] Farmaceutyczne kompozycje na ogół są podawane w ilościach farmaceutycznie kompatybilnych i w kompozycjach farmaceutycznie kompatybilnych. Określenie farmaceutycznie kompatybilne odnosi się do nietoksycznego materiału, który nie oddziałuje z działaniem aktywnego składnika kompozycji farmaceutycznej. Preparaty tego typu mogą zazwyczaj zawierać sole, substancje buforujące, konserwanty, nośniki oraz, gdy jest to właściwe, inne związki aktywne terapeutycznie. Sole, gdy są stosowane w medycynie powinny być farmaceutycznie kompatybilne. Jednakże sole, które nie są farmaceutycznie kompatybilne mogą być stosowane do przygotowywania farmaceutycznie kompatybilnych soli i są objęte wynalazkiem. Farmakologicznie i farmaceutycznie kompatybilne sole tego typu obejmują w sposób nieograniczający takie preparaty, które są otrzymane z następujących kwasów: solnego, bromowodorowego, siarkowego, azotowego, fosforowego, maleinowego, octowego, salicylowego, cytrynowego, mrówkowego,

54 3 1 2 malonowego, kwasu bursztynowego i tym podobnych. Farmaceutycznie kompatybilne sole mogą być również wytworzone jako sole metali alkalicznych lub sole metali ziem alkalicznych, takie jak sole sodowe, sole potasowe lub sole wapniowe [0122] Kompozycja farmaceutyczna może zawierać farmaceutycznie kompatybilny nośnik. Według wynalazku, określenie farmaceutycznie kompatybilny nośnik odnosi się do jednego lub więcej kompatybilnych stałych lub ciekłych wypełniaczy, rozcieńczalników lub substancji do tworzenia kapsułek, które są odpowiednie do podawania ludziom. Określenie nośnik odnosi się do składnika organicznego lub nieorganicznego, naturalnego lub syntetycznego, z którym składnik aktywny jest połączony w celu ułatwienia stosowania. Składniki kompozycji farmaceutycznej są zwykle takie, że nie występuje wzajemne oddziaływanie, które znacznie upośledza żądaną skuteczność farmaceutyczną. [0123] Kompozycje farmaceutyczne mogą zawierać odpowiednie substancje buforujące, takie jak kwas octowy w postaci soli, kwas cytrynowy w postaci soli, kwas borny w postaci soli i kwas fosforowy w postaci soli. [0124] Kompozycje farmaceutyczne mogą, gdy jest to właściwe, zawierać również odpowiednie środki konserwujące, takie jak chlorek benzalkoniowy, chlorobutanol, paraben i tiomersal. [012] Kompozycje farmaceutyczne zazwyczaj są dostarczane w jednolitej postaci dawkowania i mogą być przygotowane w sposób znany per se. Kompozycje farmaceutyczne mogą być w postaci, na przykład,

55 4 1 2 kapsułek, tabletek, pastylek, roztworów, zawiesin, syropów, eliksirów lub w postaci emulsji. [0126] Kompozycje odpowiednie do podawania pozajelitowego zazwyczaj zawierają sterylny wodny lub niewodny preparat aktywnego związku, który najlepiej, jeśli jest izotoniczny z krwią biorcy. Roztwór Ringera i izotoniczny roztwór chlorku sodu są przykładami kompatybilnych nośników i rozpuszczalników. Ponadto, zazwyczaj jałowe, stałe oleje są stosowane jako roztwór lub środek zawieszający. [0127] Niniejszy wynalazek jest opisany szczegółowo poniżej za pomocą figur i przykładów, które są stosowane jedynie tylko w celach ilustracyjnych i nie mają na celu ograniczania. Dzięki opisowi i przykładom kolejne postacie wynalazku, które są także obejmowane wynalazkiem są dostępne dla wykwalifikowanego pracownika. Figury: [0128] Fig. 1. ekspresja mrna ISC-468 A. badania RT-PCR ze specyficznymi starterami ISC-468 nie wykazały istotnej ekspresji we wszystkich badanych prawidłowych tkankach z wyjątkiem łożyska. B. ekspresja mrna ISC-468 w nowotworach głowy i szyi, wątroby, nerek i okrężnicy. C. ekspresja mrna ISC-468 w nowotworze piersi, jajnika i żołądka. Fig. 2. Analiza ilościowa PCR ekspresji mrna ISC-468 w prawidłowych tkankach kontrolnych i rakach piersi

56 1 2 badanie PCR w czasie rzeczywistym ze specyficznymi starterami ISC-468 wykazało selektywną ekspresję mrna w komórkach pochodzących z biopsji prawidłowych jąder, łożyska, żołądka i PBMC i we wszystkich komórkach pochodzących z raka piersi. Fig. 3. ekspresja mrna ISC-469 (A) RT-PCR i B) PCR w czasie rzeczywistym (badanie ze specyficznymi starterami dla ISC-468) wykazały selektywną ekspresję mrna w komórkach pochodzących z biopsji prawidłowych jąder, łożyska i w 80% z raka piersi. Fig. 4. Analiza immunofluorescencyjna ekspresji ISC-468 (A) Specyficzność przeciwciał anty-isc-468 została potwierdzona barwieniem ISC-eGFP-468 stransfekowanych komórek. (B) Barwienie komórek utrwalonych MeOH albo transfekowanych dupleksami RNAi specyficznymi dla ISC-468 lub komórek niewyciszającymi dupleksami kontrolnymi (C) Barwienie nieutrwalonych komórek albo transfekowanych dupleksami RNAi specyficznymi dla SCI-468 albo nie wyciszonych dupleksami komórek kontrolnych. Fig.. Immunochistochemiczna analiza ekspresji ISC-468 Nie stwierdzono wykrywalnej ekspresji w prawidłowej tkance piersi (A) 0x, (B) 0x. W przeciwieństwie do tego, mocne i jednorodne zabarwienie błony obserwowano w próbkach nowotworu piersi (C) 0x, (D) 0x. Fig. 6. Wyciszenie indukowanej RNAi ekspresji mrna ISC- 468

57 6 1 2 Transfekowanie komórek dupleksami sirna specyficznymi dla ISC-468 wywołuje wyraźne wyciszenie ekspresji mrna w porównaniu z komórkami grupy kontrolnej. Fig. 7. Badanie proliferacji komórek Transfekowanie komórek dupleksami sirna specyficznymi dla ISC-468 wywołuje wyraźne osłabienie proliferacji komórek w porównaniu z proliferacją komórek grupy kontrolnej. Fig. 8. Badanie cyklu komórkowego Transfekowanie komórek dupleksami sirna specyficznymi dla ISC-468 wywoływało zatrzymanie G1/S w komórkach raka piersi (A) MCF-7 i (B) BT-49 w porównaniu z komórkami grupy kontrolnej. Fig. 9. Fosforylacja AKT Transfekowanie komórek dupleksami sirna specyficznymi dla ISC-468 wywołuje wyraźne osłabienie fosforylacji AKT w porównaniu z komórkami grupy kontrolnej. Fig.. Inhibicja proliferacji za pośrednictwem przeciwciał Inkubacja komórek HCF-7 nowotworu piersi z przeciwciałami specyficznymi przeciwko ISC-468 wywoływało zmniejszenie proliferacji w porównaniu z komórkami grupy kontrolnej inkubowanymi z nierelewantnym przeciwciałem. Fig. 11. Badanie proliferacji komórek Transfekowanie komórek dupleksami sirna specyficznymi dla ISC-468 wywołuje znaczne osłabienie (A) chemotaksji (B) chemokinezy i (C)

58 7 1 2 nacieków nowotworów w porównaniu z komórkami grupy kontrolnej. Fig. 12. Korelacje z receptorem estrogenów Poziom ekspresji mrna ISC-468 w próbkach nowotworów piersi koreluje ze stanem receptora androgenów. Przedstawione są, mediana, ty i 90 percentyl ze słupkami błędu. Fig. 13. Traktowanie 17β-estradiolem Ekspresję mrna ISC-468 indukowano przez podanie 0 nm 17ß-estradiolu do komórek linii komórkowej MCF-7 z raka piersi z obecnością receptora estrogenów. Nie stwierdzano indukcji w linii komórkowej MDA-MB-231 nie posiadającej receptora estrogenów. Fig. 14. Sekwencje Przedstawione są sekwencje, do których odniesiono się w niniejszym opisie. Przykłady: Materiał i sposoby [0129] Techniki i sposoby wymienione w niniejszym dokumencie są wykonywane w sposób znany per se i opisane na przykład w Sambrook i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition (1989) Cold Spring Harbor Lab oratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Wszystkie sposoby, w tym zastosowanie zestawów i odczynników są przeprowadzane według instrukcji producentów. Ekstrakcja RNA, przygotowywanie cdna za pomocą starterów poly=d(t) i badanie konwencjonalną techniką RT-PCR [01] Całkowite RNA zostało ekstrahowane z materiału tkanki natywnej przy użyciu izotiocyjanianu guanidyny

59 8 1 2 jako czynnika chaotropowego (Chomczynski & Sacchi, Anal. Biochem. 162:16-9, 1987). Po ekstrakcji kwaśnym fenolem i wytrąceniu izopropanolem, wspomniane RNA rozpuszczano w wodzie traktowanej DEPC. Syntezę pierwszej nici cdna z 4 µg całkowitego RNA przeprowadzono w µl mieszaniny reakcyjnej za pomocą Superscript II (Invitrogen), według instrukcji producenta. Zastosowanym starterem był oligonukleotyd DT (18). Integralność i jakość cdna zostały sprawdzone przez amplifikację p3 w cyklach PCR ((SEK ID NO:, 6), temperatura hybrydyzacji wynosiła 67 C). Archiwum pierwszej nici cdna przygotowano z wielu tkanek prawidłowych i jednostek nowotworów. Do badań ekspresji, 0, µl tych cdna amplifikowano w µl mieszaniny reakcyjnej, stosując startery specyficzne dla GOI (patrz niżej) oraz 1 U polimerazy DNA HotStarTaq (Qiagen). Każda mieszanina reakcyjna zawierała µm dntp, 0,3 µm każdego startera i 3 µl x buforu reakcyjnego. Startery wybrano tak, żeby znajdowały się w dwóch różnych egzonach i eliminacja wpływu przez zanieczyszczenie genomowym DNA jako powodu fałszywie dodatnich wyników została potwierdzona przez badanie jako matrycy DNA nie podlegającego odwrotnej transkrypcji. Po 1 minutach w temperaturze 9 C, żeby aktywować polimerazę DNA HotStarTaq, przeprowadzono 3 cykli PCR (0, min w temperaturze 94 C, 0, minuty w konkretnej temperaturze hybrydyzacji, 0, minuty w temperaturze 72 C i końcowa elongacja w temperaturze 72 C przez 6 minut). µl tej reakcji frakcjonowano i analizowano na żelu agarozowym barwionym bromkiemu etydyny.

60 9 1 2 Przygotowanie cdna z przypadkowym startem replikacji heksasmerów i ilościowa reakcja PCR w czasie rzeczywistym [0131] Ekspresję kilku genów kwantyfikowano techniką PCR w czasie rzeczywistym. Produkty reakcji PCR wykrywano z zastosowaniem SYBR Green jako interkalującego barwnika reporterowego. Fluorescencja reporterowa SYBR Green jest tłumiona w roztworze i barwnik jest aktywny jedynie po związaniu fragmentów dwuniciowego DNA. Wzrost fluorescencji SYBR Green, jako wyniku specyficznej amplifikacji z zastosowaniem starterów specyficznych do GOI po każdym cyklu reakcji PCR jest wykorzystywany się do kwantyfikacji. Ekspresja genu docelowego jest kwantyfikowana całkowicie lub w odniesieniu do ekspresji genu kontrolnego ze stałą ekspresją w tkankach, które mają być badane. Po standaryzacji próbek ekspresję mierzono względem 18s RNA jako tak zwanym genem metabolizmu podstawowego stosując sposób ΔΔ-CT (PE Biosystems, USA). Reakcje przeprowadzano w dwóch powtórzeniach i określano trzykrotnie. Zestaw QuantiTect SYBR Green PCR (Qiagen, Hilden) zastosowano według instrukcji producenta. cdna syntetyzowano z losowymi starterami (Invitrogen) stosując protokół opisany powyżej. Każdą µl porcję rozcieńczonego cdna używano do reakcji PCR w całkowitej objętości wynoszącej µl: starter przedni 0 nm, starter wsteczny 0 nm, początkowa denaturacja w temperaturze 9 C przez 1 min, temperatura 9 C przez sekund, przyłączanie przez sek, temperatura 72 C przez sec, 40 cykli. Sekwencje stosowanych starterów podano w odpowiednich przykładach.

61 Klonowanie i analiza sekwencji [0132] Klonowanie genów pełnej długości i fragmentów genów odbyło się za pomocą konwencjonalnych sposobów. Aby ustalić sekwencję amplifikowano odpowiednie antygeny z zastosowaniem polimerazy proofreading pfu (Stratagene). Po zakończeniu reakcji PCR, adenozyna była ligowana za pomocą polimerazy DNA HotStarTaq do końców amplikonu w celu klonowania fragmentów do wektora TOPO-TA, zgodnie z instrukcjami producenta. Sekwencjonowanie przeprowadzono przez serwis komercyjny. Sekwencje analizowano stosując konwencjonalne programy i algorytmy do przewidywania. Analiza proliferacji komórek [0133] 24 godz. po transfekcji dupleksów sirna 1x 4 komórek hodowano w pożywce z dodatkiem różnych stężeń FCS przez 48 godzin. Proliferację analizowano przez pomiar inkorporacji BrdU do nowo syntetyzowanych nici DNA stosując zestaw proliferacji komórek DELFIA (Perkin Elmer) według instrukcji producenta na liczniku Multilabel Wallac Victor2 counter (Perkin Elmer). Analiza cyklu komórkowego i apoptoza [0134] Komórki hodowano w pożywce z dodatkiem FCS w różnych stężeniach, zbierano po 48 godzinach i barwiono jodkiem propidyny przed analizą zawartości DNA cytometrią przepływową. Komórki apoptotyczne i komórki w fazach S/G2/M cyklu komórkowego były kwantyfikowane przy użyciu oprogramowania CellQuest (Becton- Dickinson). Migracja komórek [013] Oznaczania migracji komórek przeprowadzano w komorach typu transwell z membranami o porach 8,0 µm

62 (BD Biosciences) na komórkach hodowanych w pożywce bez surowicy przez 12 godz. przed doświadczeniami. Dla badań sirna komórki zostały przeniesione, jak opisano powyżej, w warunki wolne od surowicy w 24 godziny po transfekcji dupleksami sirna. Do górnej komory dodano 4x 4 komórek w 400 µl pożywki bez surowicy. Komory dolne zawierały 800 µl pożywki hodowlanej uzupełnionej albo FCS, PDGF-BB (Sigma-Aldrich) lub SDF-1α/CXCL12 (R & D Systems) jako chemoatraktantami. Po 24 godzinach komórki, które migrowały do dolnej strony membrany utrwalano lodowatym metanolem, błony wycięto, umieszczono na szkiełkach podstawowych i zanurzano w Hoechst (Dako) do mikroskopii fluorescencyjnej. Dla każdej membrany liczono komórki w pięciu losowych polach widzenia (powiększenie 0x). Wszystkie doświadczenia wykonywano w trzech powtórzeniach. Wpływ na chemokinezę komórek analizowano stosując takie same ustawienie doświadczenia z (i) nie dodawaniem chemoatraktanta do górnej i dolnej komory i (II) z chemoatraktantem dodawanym zarówno do komory górnej jak i dolnej. Oznaczanie nacieku in vitro [0136] Oznaczania nacieku in vivo przeprowadzano w komorach typu transwell z membranami o porach 8,0 µm (BD Biosciences) na komórkach hodowanych w pożywce bez surowicy przez 12 h przed doświadczeniami. Górne komory przygotowano z 0 µl Matrigel (BD Biosciences) rozcieńczonego do 1 mg/ml w pożywce wolnej od surowicy. Komory były inkubowane w temperaturze 37 C przez godzin do żelowania. Do doświadczeń z sirna komórki przenoszono do warunków wolnych od surowicy 24 godziny

63 po transfekcji dupleksami sirna, jak opisano powyżej. Do górnej komory dodano 1x komórek w 400 µl pożywki hodowlanej wolnej od surowicy. Dolne komory zawierały 800 µl pożywki hodowlanej z dodatkiem FCS jako chemoatraktantu. Po 24 godzinach komórki naciekowe na dolnej stronie membrany utrwalano lodowatym metanolem, membrany wycięto, umieszczano na szkiełkach podstawowych i zanurzano w Hoechst (Dako) do mikroskopii fluorescencyjnej. Dla każdej membrany liczono komórki w pięciu przypadkowych polach widzenia (powiększenie 0x). Wszystkie doświadczenia wykonywano w trzech powtórzeniach. Przykład 1: Identyfikacja ISC-468 jako diagnostycznoterapeutycznego środka celowanego w raka [0137] ISC-468 (SEQ ID NO: 1) koduje białko składające się z 212 aminokwasów (SEQ ID NO: 2) i masie cząsteczkowej 23,6 kda. Zostało to wcześniej opisane jako specyficzne białko łożyska ulegające ekspresji podczas ciąży (Fant in. Mol Reprod Dev. 63:4-6, 02). [0138] Przewidziane jest, że białko posiada możliwy do trawienia peptyd sygnałowy z 1-23 aminokwasów, po którym następuje krótka, przypuszczalnie transbłonowa domena (aa 2-47), jak analizowano narzędziami bioinformatycznymi (TMpred, SOUSI). Przewidziane jest, że pozostałe białko jest zewnątrzkomórkowe i zatem dla przeciwciał monoklonalnych może być stosowane według wynalazku jako struktura docelowa. [0139] Według wynalazku, para starterów specyficzna dla genu (SEK ID NO: 3, 4) ISC-468 była stosowana w analizach reakcji RT-PCR do amplifikacji cdna

64 63 1 pochodzącego z całościowego zestawu tkanek prawidłowych i nowotworowych. Zgodnie z oczekiwaniami, potwierdzono, że łożysko było jedyną zdrową tkanką, w której ten gen ulega ekspresji (Fig.1). Żadna jakakolwiek znacząca ekspresja nie została wykryta w żadnej innej prawidłowej tkance narządu. Najbardziej nieoczekiwanie, gdy badano wycinek raka, wykryto, wysoki i znaczący poziom ekspresji w licznych, różnych rodzajach nowotworów, obejmując nowotwory okrężnicy, trzustki, przełyku, żołądka, płuc, piersi, jajnika, głowy i szyi, nerek, prostaty i wątroby (Fig. 1 i 2, a także tab.1). Ilościowa analiza RT-PCR w czasie rzeczywistym ekspresji ISC-468 w 60 próbkach nowotworu piersi wykazała, że w 80% wszystkich próbek zachodzi ekspresja ISC-468 na znaczącym poziomie (Fig. 3A, B). Tab.1:Ekspresja ISC-468 w tkankach prawidłowych i nowotworowych Tkanki Ekspresja Typ nowotworu Ekspresja prawidłowe Mózg - Nowotwór + okrężnicy Mięsień sercowy - Nowotwór + trzustki Mięsień - Nowotwór + szkieletowy przełyku Mięsień sercowy - Nowotwór + żołądka Żołądek - Rak płuc + Okrężnica - Rak piersi +++ Trzustka - Nowotwór + jajnika

65 64 Nerka - Nowotwór głowy + i szyi Wątroba - Nowotwór nerki + Jądro - Nowotwór + prostaty Grasica - Nowotwór ++ wątroby Pierś - Jajnik - Macica - Skóra - Płuco - Łożysko +++ Węzły chłonne - Śledziona - PBMC - Prostata - [0140] Selektywna i wysoka ekspresja transkryptów ISC- 468 w guzach nie była wcześniej znana i może być stosowana według wynalazku do molekularnych sposobów diagnostycznych, takich jak RT-PCR do wykrywania rozprzestrzeniania się komórek nowotworu w surowicy i szpiku kostnym i do wykrywania przerzutów do innych tkanek. Cząsteczka ta może być następnie wykorzystana w podejściach terapeutycznych jako specyficznie docelowa. [0141] Następujące peptydy, między innymi, zostały wybrane do wytwarzania specyficznych przeciwciał ISC 468 według wynalazku: SEK ID NR: 7, 8, 9,, Specyficzność przeciwciał została potwierdzona przez

66 6 1 2 analizę immunofluorescencyjną transfekowanych komórek ISC-468-EGFP (Fig. nr 4A). [0142] Subkomórkową lokalizacją ISC-468 w liniach komórkowych MCF-7 i BT-49 nowotworu piersi z endogenną ekspresją analizowano metodą analiz immunofluorescencji. Barwienie albo utrwalonych MeOH (Fig.4B) lub nieutrwalonych (Fig.4C) komórek ujawniło, że ISC-468 jest zlokalizowany w błonie plazmatycznej komórek z ekspresją. Specyficzność barwienia została potwierdzona przez wywołane RNAi wyciszenie ekspresji ISC-468, powodujące utratę barwienia błony plazmatycznej. [0143] Ponadto, specyficzne przeciwciała ISC-468 zostały użyte do analizy immunohistochemicznej ekspresji ISC -468 w próbkach klinicznych pochodzących z prawidłowej piersi i nowotworu piersi. Ekspresja ISC- 468 nie była wykrywalna w próbkach pochodzących ze zdrowej piersi (Fig. A, B). W przeciwieństwie, próbki z nowotworu piersi wykazały silną i jednorodną ekspresję ISC-468 (Fig. C, D). Sygnały były wyraźniejsze w błonie plazmatycznej komórek rakowych z ekspresją, potwierdzając, że ISC-468 jest białkiem błonowym selektywnie ulegającym ekspresji w komórkach rakowych. [0144] Domeny zewnątrzkomórkowe ISC-468 mogą być stosowane według wynalazku jako struktura docelowa immunodiagnostyki i leczenia za pomocą przeciwciał monoklonalnych. Ponadto, ISC-468 może być stosowane jako szczepionka (RNA, DNA, białka, peptydy) do indukowania odpowiedzi immunologicznych specyficznych

67 dla nowotworu (odpowiedzi immunologiczne za pośrednictwem komórek T i B). [014] Indukowane RNAi wyciszenie ekspresji ISC-468 osiągnięto przez transfekcję komórek dupleksami sirna ukierowanymi specyficznie do mrna ISC-468 (SEQ ID NO: 12-1). Transfekcja linii komórkowych MCF-7 i BT-49 nowotworu piersi z endogenną ekspresją spowodowała stabilne i specyficzne zmniejszenie ekspresji mrna ISC- 468 (Fig. 6). [0146] Przeprowadzono kilka testów in vitro komórek w oparciu o RNAi, żeby uzyskać wgląd w fizjologiczną rolę ekspresji ISC-468. Transfekcja linii komórkowych MCF-7 i BT-49 nowotworu piersi dupleksami sirna powodowała wyraźne zmniejszenie proliferacji komórek w porównaniu do odpowiednich kontroli, jak wynika z analizy w opartym na BrdU teście proliferacji (Fig. 7). Oparta na FACS analiza cyklu komórkowego wykazała, że anulowanie proliferacji komórek wynikało z zahamowania G1/S (Fig.8 A, B). Dodatkowo, można wykazać, że indukowane RNAi wyciszenie ISC-468 gruntownie wpływa na ścieżkę sygnalizacji AKT w komórkach raka z endogenną ekspresją poprzez inhibicję fosforylacji AKT (Fig. 9). Co więcej, proliferacja komórek MCF-7 była tłumiona, gdy komórki inkubowano ze specyficznymi przeciwciałami ISC-468 wytworzonymi przeciwko specyficznym peptydom ISC-468 (SEQ ID NO:, 11) w porównaniu do nierelewantnego kontrolnego przeciwciała (Fig. ). Wyniki te wskazują, że ISC-468 jest czynnikiem krytycznym dla proliferacji komórek nowotworowych, prawdopodobnie przez pośredniczenie indukowanej czynnikiem wzrostu aktywacji ścieżki sygnalizacji AKT i innych. ISC-468 może sam

68 stanowić receptor, koreceptor lub związany z błoną chaperon dla czynników wzrostu, chemokin lub innych substancji. [0147] Ponadto, analizowano wpływ ekspresji ISC-468 na zdolność migracji komórek rakowych. Indukowane RNAi wyciszenie ekspresji ISC-468 w liniach komórkowych MCF- 7 i BT-49 nowotworu piersi spowodowało wyraźną niewydolność chemotaksji, chemokinezy i nacieki komórek, jak oceniano w przezstudzienkowych testach migracji komórek (Fig.11 A, B, C). Chemotaksja, chemokineza i inwazyjność są kluczowymi czynnikami dla przerzutów komórek rakowych do innych narządów. W związku z tym, ekspresja ISC-468 w komórkach rakowych może być pozytywnym czynnikiem dla przerzutów komórek rakowych. [0148] W nowotworach piersi, może być wykazane, że ekspresja ISC-468 jest skorelowana ze stanem receptora estrogenowego guza. Ilościowa analiza ekspresji ISC-468 w RT-PCR w czasie rzeczywistym w 60 próbkach nowotworów piersi ujawniła, że nowotwory piersi z receptorem estrogenu, wykazywały znacząco wyższy poziom ekspresji ISC-468 niż nowotwory bez receptora (Fig.12). Odpowiednio, ekspresja ISC-468 może być indukowana w linii komórkowej MCF-7 nowotworu piersi z receptorem estrogenu przez leczenie 17ß-estradiolem (Fig. 13). Wykaz sekwencji [0149]

69 68 <1> Ganymed Pharmaceuticals AG et al. 1 <1> Identyfikacja antygenów towarzyszących nowotworom, w diagnostyce i terapii <1> PCT <140> <141> <> EP <11> <160> 1 <170> Patentln wersja 3.3 <2> 1 <211> 1126 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1

70 69 <2> 2 <211> 212 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

71 <2> 3 <211> 21 70

72 71 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd <400> 3 aaatttggca gctgccttca c <2> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd <400> 4 tgatgccaca ttcagtaaca c 21 <2> <211> <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd <400> cgtgagcgct tcgagatgttcc g 21 <2> 6 <211> <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd 40 4 <400> 6 cctaaccagc tgcccaactg tag 23 <2> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens

73 72 <400> 7 <2> 8 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 1 <2> 9 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 2 <2> <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 <2> 11 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11

74 73 <2> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> nić sensowna sirna <2> <221> cecha mieszana <222> (1).. (19) <223> zasady rybonukleotydowe <400> ccaugagagu agccagcaat t <2> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> nić antysensowna sirna <2> <221> cecha mieszana <222> (1).. (19) <223> zasady rybonukleotydowe <400> 13 uugcuggcua cucucaugga g 21 <2> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> nić sensowna sirna <2> <221> cecha mieszana <222> (1).. (19) <223> zasady rybonukleotydowe <400> 14

75 74 gguucaggac aaaguccaat t 21 1 <2> 1 <211> 21 <211> DNA <213> Sekwencja sztuczna <2> <223> nić antysensowna sirna <2> <221> cecha mieszana <222> (1).. (19) <223> zasady rybonukleotydowe <400> 1 uuggacuuug uccugaaccg g Zastrzeżenia 1. Kompozycja farmaceutyczna, zawierająca jeden lub więcej składników wybranych z grupy składającej się z: (i) przeciwciała, które wiąże się z zewnątrzkomórkową częścią antygenu związanego z nowotworem, (ii) antysensownego kwasu nukleinowego, który hybrydyzuje specyficznie z kwasem nukleinowym kodującym antygen związany z nowotworem i (iii) sirna skierowany przeciwko kwasowi nukleinowemu kodującemu antygen związany z nowotworem, wspomniany antygen związany z nowotworem mający sekwencję kodowaną przez kwas nukleinowy, który jest wybrany z grupy składający się z: (a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego z SEQ ID NO: 1,

76 7 1 2 (b) kwasu nukleinowego, który w rygorystycznych warunkach hybrydyzuje z kwasem nukleinowym z(a), (c) kwasu nukleinowego, który jest zdegenerowany w odniesieniu do kwasu nukleinowego z (a) lub (b), oraz (d) kwasu nukleinowego, który jest co najmniej w 9% identyczny z kwasem nukleinowym z (a), (b) lub (c) do stosowania w sposobie leczenia lub zapobiegania chorobie nowotworowej znamiennej przez ekspresję antygenu związanego z nowotworem. 2. Kompozycja farmaceutyczna jak zastrzeżono w zastrzeżeniu 1 do stosowania w sposobie leczenia lub zapobiegania chorobie nowotworowej, znamiennej przez ekspresję antygenu związanego z nowotworem według zastrzeżenia 1, w której przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym, chimerowym lub humanizowanym lub fragmentem przeciwciała. 3. Kompozycja farmaceutyczna jak zastrzeżono w zastrzeżeniu 1 lub 2 do stosowania w sposobie leczenia lub zapobiegania chorobie nowotworowej znamiennej przez ekspresję antygenu związanego z nowotworem według zastrzeżenia 1, w której przeciwciało jest połączone z czynnikiem terapeutycznym lub diagnostycznym. 4. Kompozycja farmaceutyczna jak zastrzeżono w którymkolwiek z zastrzeżeń 1-3 do stosowania w sposobie leczenia lub zapobiegania chorobie nowotworowej znamiennej przez ekspresję antygenu związanego z nowotworem, według zastrzeżenia 1, w której rak jest nowotworem płuc, nowotworem piersi,

77 nowotworem prostaty, czerniakiem, nowotworem jelita grubego, nowotworem żołądka, nowotworem trzustki, nowotworem ENT, nowotworem nerki lub nowotworem szyjki macicy, nowotworem jelita grubego lub nowotworem sutka.. Kompozycja farmaceutyczna jak zastrzeżono w którymkolwiek z zastrzeżeń 1-4 do stosowania w sposobie leczenia lub zapobiegania chorobie nowotworowej znamiennej przez ekspresję antygenu związanego z nowotworem, według zastrzeżenia 1, w której antygen związany z nowotworem zawiera sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z SEQ ID NO: 2 i Sposób in vitro diagnozowania lub monitorowania choroby nowotworowej znamiennej przez ekspresję antygenu związanego z nowotworem, który to sposób obejmuje wykrywanie lub określenie ilości (i) kwasu nukleinowego, który koduje antygen związany z nowotworem, i/lub (ii) antygenu związanego z nowotworem, w próbce biologicznej wyizolowanej od pacjenta, ze wspomnianym antygenem związanym z nowotworem mającym sekwencję kodowaną przez kwas nukleinowy, który jest wybrany z grupy składającej się z: (a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego z SEQ ID NO: 1, (b) kwasu nukleinowego, który w rygorystycznych warunkach hybrydyzuje z kwasem nukleinowym z (a), (c) kwasu nukleinowego, który jest zdegenerowany w odniesieniu do kwasu nukleinowego z (a) lub (b) i

78 (d) kwasu nukleinowego, który jest co najmniej w 9% identyczny z kwasem nukleinowym z (a), (b) lub (c). 7. Sposób jak zastrzeżono w zastrzeżeniu 6, w którym wykrywanie i oznaczanie ilości obejmuje (i) kontaktowanie próbki biologicznej z czynnikiem, który wiąże się specyficznie z kwasem nukleinowym kodującym antygen związany z nowotworem lub z antygenem związanym z nowotworem i (ii) wykrywanie tworzenia lub oznaczania ilości kompleksu pomiędzy czynnikiem i kwasem nukleinowym lub antygenem związanym z nowotworem. 8. Sposób jak zastrzeżono w zastrzeżeniu 7, w którym czynnikiem, który wiąże się specyficznie z kwasem nukleinowym kodującym antygen związany z nowotworem jest oligonukleotyd lub polinukleotyd, który hybrydyzuje specyficznie ze wspomnianym kwasem nukleinowym. 9. Sposób jak zastrzeżono w zastrzeżeniu 7, w którym czynnik, który wiąże się specyficznie z antygenem związanym z nowotworem jest przeciwciałem wiążącym się specyficznie ze wspomnianym antygenem związanym z nowotworem.. Sposób jak zastrzeżono w którymkolwiek z zastrzeżeń od 6 do 9, w którym wspomniane monitorowanie wspomnianej choroby nowotworowej obejmuje określanie regresji, przebiegu lub początku wspomnianej choroby w próbce pochodzącej od pacjenta, który ma tę chorobę lub jest podejrzewany o zachorowanie na wspomnianą chorobę.

79 Sposób jak zastrzeżono w zastrzeżeniu, który obejmuje wykrywanie lub oznaczanie ilości w pierwszej próbce w pierwszym punkcie czasowym i w kolejnej próbce w drugim punkcie czasowym i porównanie obu próbek. 12. Sposób jak zastrzeżono w którymkolwiek z zastrzeżeń 7-11, w którym czynnik jest znakowany w sposób wykrywalny. 13. Sposób jak zastrzeżono w którymkolwiek z zastrzeżeń 6-12, w którym próbka zawiera płyny ustrojowe i/lub tkanki ciała. 14. Sposób jak zastrzeżono w którymkolwiek z zastrzeżeń 6-13, w którym antygen związany z nowotworem zawiera sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z SEQ ID NO: 2 i Przeciwciało do stosowania w sposobie leczenia, zapobiegania, diagnozowania lub monitorowania choroby nowotworowej znamiennej przez ekspresję antygenu związanego z nowotworem, wspomniany antygen związany z nowotworem posiadający sekwencję kodowaną przez kwas nukleinowy, który jest wybrany z grupy składającej się z: (a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego z SEQ ID NO: 1, (b) kwasu nukleinowego, który w rygorystycznych warunkach hybrydyzuje z kwasem nukleinowym z (a), (c) kwasu nukleinowego, który jest zdegenerowany w odniesieniu do kwasu nukleinowego z (a) lub (b) i (d) kwasu nukleinowego, który jest co najmniej w 9% identyczny z kwasem nukleinowym z (a), (b) lub (c),

80 w którym przeciwciało wiąże się do zewnątrzkomórkowej części wspomnianego antygenu związanego z nowotworem i jest połączone z czynnikiem terapeutycznym lub diagnostycznym. 16. Przeciwciało jak zastrzeżono w zastrzeżeniu 1 do stosowania w sposobie leczenia, zapobiegania, diagnozowania lub monitorowania choroby nowotworowej znamiennej przez ekspresję antygenu związanego z nowotworem, według zastrzeżenia 1, które jest przeciwciałem monoklonalnym, chimerowym lub humanizowanym lub jest fragmentem przeciwciała. 17. Przeciwciało jak zastrzeżono w zastrzeżeniu 1 lub 16 do stosowania w sposobie leczenia, zapobiegania, diagnozowania lub monitorowania choroby nowotworowej znamiennej przez ekspresję antygenu związanego z nowotworem, według zastrzeżenia 1, w którym antygen związany z nowotworem zawiera sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z SEQ ID NO:2 i Przeciwciało jak zastrzeżono w którymkolwiek z zastrzeżeń 1, 16 lub 17 do stosowania w sposobie leczenia, zapobiegania, diagnozowania lub monitorowania choroby nowotworowej znamiennej przez ekspresję antygenu związanego z nowotworem, według zastrzeżenia 1, w którym czynnikiem terapeutycznym lub diagnostycznym jest toksyna. 19. Kompozycja farmaceutyczna jak zastrzeżono w którymkolwiek z zastrzeżeń 1- do stosowania w sposobie leczenia lub zapobiegania chorobie nowotworowej znamiennej przez ekspresję antygenu związanego z nowotworem według zastrzeżenia 1 do

81 hamowania rozwoju nowotworu u pacjenta, przy czym kompozycja farmaceutyczna jest przeznaczona do podawania w ilości skutecznej.. Koniugat przeciwciała i czynnika terapeutycznego lub diagnostycznego, gdzie przeciwciało wiąże się specyficznie do zewnątrzkomórkowej części białka albo polipeptydu, przy czym wspomniane białko lub polipeptyd jest kodowany przez kwas nukleinowy wybrany z grupy składającej się z: (a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego z SEQ ID NO: 1, (b) kwasu nukleinowego, który w rygorystycznych warunkach hybrydyzuje z kwasem nukleinowym z (a), (c) kwasu nukleinowego, który jest zdegenerowany w odniesieniu do kwasu nukleinowego z (a) lub (b), oraz (d) kwasu nukleinowego, który jest co najmniej w 9% identyczny z kwasem nukleinowym z (a), (b) lub (c) do stosowania w sposobie leczenia, zapobiegania, diagnozowania lub monitorowania choroby nowotworowej znamiennej przez ekspresję białka lub polipeptydu. 21. Koniugat według zastrzeżenia do stosowania w sposobie leczenia, zapobiegania, diagnozowania lub monitorowania choroby nowotworowej znamiennej przez ekspresję białka lub polipeptydu według zastrzeżenia, w którym czynnikiem terapeutycznym lub czynnikiem diagnostycznym jest toksyna. 22. Stosowanie zestawu do diagnozowania in vitro choroby nowotworowej znamiennej przez ekspresję

82 81 1 antygenu związanego z nowotworem, który to zestaw zawiera czynniki do wykrywania i określania ilości (i) kwasu nukleinowego, który koduje antygen związany z nowotworem i/lub (ii) antygenu związanego z nowotworem, wspomniany antygen związany z nowotworem mający sekwencję kodowaną przez kwas nukleinowy, który jest wybrany z grupy składającej się z: (a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego z SEQ ID NO: 1 (b) kwasu nukleinowego, który w rygorystycznych warunkach hybrydyzuje z kwasem nukleinowym z (a), (c) kwasu nukleinowego, który jest zdegenerowany w odniesieniu do kwasu nukleinowego z (a) lub (b), oraz (d) kwasu nukleinowego, który jest co najmniej w 9% identyczny z kwasem nukleinowym z (a), (b) lub (c). Ganymed Pharmaceuticals AG 2 Johannes Gutenberg-Universität Mainz, vertreten durch den Präsidenten Zastępca:

83 82

84 83

85 84

86 8

87 86

88 87

89 88

90 89

91 90

92 91

93 92

94 93

95 94

96 9

97 96

98 97