TECHNIKI i METODY SORPCJI DESORPCJI i CHROMATOGRAFII w układach ciało stałe ciecz / ciecz ciecz wewnątrz porów sorbentu

Transkrypt

1 TECHNIKI i METDY SRPCJI DESRPCJI i CHRMATGRAFII w układach ciało stałe ciecz / ciecz ciecz wewnątrz porów sorbentu prof. M. Kamiński GDAŃSK 2016

2 UKŁADY / WARUNKI SRPCJI DESRPCJI - ogólnie - Gaz Ciało stałe (G-S) : adsorpcja desorpcja w układach, adsorpcyjna chromatografia elucyjna w układach [S-GC] Gaz Ciecz (G-L) : absorpcja desorpcja w układach, podziałowa chromatografia gazowa w układach [L-GC] Ciecz - Ciało stałe (L-S) : adsorpcja desorpcja w układach [NP - Normal Phase, RP - Reversed Phase, HILIC - Hydrofilic Interaction, IExch Ion Exchange, IExcl Ion Exclusion, LExch Ligand Exchange, AC Affinity Chromatography, ] Ciecz Ciecz (L-L) : ekstrakcja ciec ciecz niemieszająca się z, w tym, [CCC Counter Current Chromatography], ekstrakcja ciecz ciecz immobilizowana na powierzchni porów wypełnienia ziarnistego, niemieszająca się z Ciecz - Płyn nadkrytyczny (L-SF) : ekstrakcja do płynu nadkrytycznego (SFE Superfluid Extraction) Płyn nadkrytyczny Ciało stałe (SF-S) : chromatografia z eluentem nadkrytycznym (SFC Superfluid Chromatography) Wykluczanie steryczne (GPC / SEC ) ( Gel Permeation / Size Exclusion - ChromatograpHy )

3 PERACJE SRPCJI DESRPCJI i CHRMATGRAFII w UKŁADACH CIECZ CAŁ STAŁE. CICZ - CIECZ MECHANIZMY FIZYK-CHEMICZNE - - Polarna / hydrofobowa adsorpcja - desorpcja płyn / powierzchnia sorpcyjna porów - Podział między ciągłą fazę płynną / warstewkę cieczy na powierzchni lub wewnątrz porów - Wymiana jonowa - Zróżnicowanie drogi dyfuzji - Wykluczanie jonowe, wymiana ligandów, powinowactwo, Chromatografia elucyjna, w warunkach: -- GPC/SEC, NP, RP, HILIC, I-Exch, I-Excl, L-Exch,

4 UKŁADY / WARUNKI SRPCJI DESRPCJI - cd Skala stosowania - od mikro, analityczną, modelową, preparatywną, wielkolaboratoryjną, do procesowej (przemysłowej) Warunki stosowania - kresowe - elucyjne [np. GC, LC, HPLC, UPLC, SFC, SFE, ], - Półciągłe - pseudo ciągłe np. sorpcja desorpcja w dwóch / większej liczbie na przemian pracujących kolumn wypełnionych - [np. procesy PSA oczyszczanie gazu wodorowego / odwadniania etanolu z wykorzystaniem zeolitów, jonowymienne oczyszczanie wody, ], - Ciągłe [np. SMB Simulated Moving Bed, z rotacją złoża o kształcie ściany walca, ] ddziaływania - na powierzchni sorpcyjnej [adsorpcyjnej, jonowymiennej, ] prawa adsorpcji, wymiany jonowej / w przestrzeni nieruchomej ciekłej fazy stacjonarnej w warunkach podziału [prawo Nernsta] - w przestrzeni gazowej / płynnej fazy ciekłej

5 ddziaływania - GC / SFC / LC Faza stacjonarna Substancje rozdzielane GC Substancje rozdzielane Składniki eluentu LC (HPLC, TLC) Faza stacjonarna SFC

6 Pojęcia podstawowe Układ chromatograficzny: faza stacjonarna (w LC z reguły stała powierzchnia sorpcyjna, rzadko ciekła inaczej niż w GC) - składniki rozdzielanej mieszaniny - faza ruchoma (konkurencja oddziaływań na powierzchni sorpcyjnej między molekułami substancji rozdzielanych i molekułami eluentu) + oddziaływania w przestrzeni eluentu - między cząsteczkami (jonami, solwatami) eluentu, a cząsteczkami (jonami, solwatami) będącymi składnikami rozdzielanej mieszaniny. Retencja (k) - spowolnienie elucji względem prędkości przepływu eluentu - u (prędkość ruchu eluentu, obliczana inaczej niż w Inżynierii prędkość poruszania się pasma barwnego, niesorbowanego i wnikającego do wszystkich porów składnika mieszaniny - widoczny przez szklaną ścianę kolumny); Selektywność (α) - zróżnicowanie retencji; Sprawność wypełnienia (H) - miara dyspersji stref w warstwie wypełnienia; Prędkość przepływu eluentu u [mm/s] (, natężenie przepływu eluentu w [ml/min] pór przepływu w kolumnie ΔP [MPa] = K (u*lc*η / dp 2 ) Kolumna o długości (Lc), średnicy (dc), z wypełnieniem ziarnistym (dp, d, A) / monolityczna (dm, d, A) Wypełnienie kolumny / Sorbent - pory wewnątrz-ziarnowe i międzyziarnowe; Porowatość wewnątrz-ziarnowa, między-ziarnowa, całkowita (ε wz, ε mz, ε T ), powierzchnia sorpcyjna (nawet do 750 m 2 /g)

7 Mechanizmy retencji i selektywności rozdzielania w układach ciecz ciało stałe (ciecz ciecz) GPC/SEC - wykluczania ( żelowa, sita molekularnego) - zróżnicowanie czasu / drogi dyfuzji RP hydrofobowość (głównie) oddziaływania van der Waalsa NP polarność, polaryzacja, dyspersja, wiązania wodorowe (oraz niskoenergetyczne oddziaływania van der Waalsa w przypadku bardzo nisko polarnych eluentów i substancji rozdzielanych); HILIC oddziaływania hydrofilowe; IExC wymiana jonów ( ion exchange cation, anion ); Inne: HIC, IPC, LEC, AC, EC,...

8 SPE SPE (Solide Phase Extraction) z elucją stopniową, albo wzbogacaniem i elucją

9 Technika czołowa Eluent ze składnikami rozdzielanymi wprowadza się do kolumny w roztworze ; Najsłabiej sorbowane składniki wypływają z kolumny jako pierwsze; Są jedynym składnikiem / składnikami otrzymywanym / otrzymywanymi w czystej postaci (po rozdzieleniu z eluentem)

10 Schemat przebiegu oczyszczania płynu na sposób czołowy

11 Chromatogram analizy czołowej

12 Ta sama zasada ma miejsce w procesie demineralizacji wody z zastosowaniem wymieniaczy jonowych kationitu / anionitu oraz do regeneracji wymieniaczy.

13 Technika elucyjna najczęściej prawie wyłącznie wykorzystywana w praktyce W technice tej, składniki mieszaniny rozdzielanej są wprowadzane do kolumny / na płytkę TLC w postaci wąskiego lub pasma punktowo (najkorzystniej w roztworze eluentu) i poruszają się wzdłuż kolumny, z szybkością określoną przez ich retencją (energię swobodną powinowactwa do powierzchni sorpcyjnej ΔG) oraz przez prędkość przepływu eluentu (u); Jeżeli różnice energii sorpcji składników rozdzielanych są znaczne, albo kolumna jest dostatecznie długa, możliwe jest całkowite rozdzielenie wszystkich składników mieszaniny wprowadzonej do kolumny / na płytkę TLC; Często, zwłaszcza dla rozdzielania mieszanin o złożonym składzie należy stosować tzw. elucję gradientową, tzn. programowane zmiany siły elucyjnej eluentu w f. czasu rozdzielania: Eluent, podawany w sposób ciągły do kolumny, wypływa z w mieszaninie z poszczególnymi składnikami rozdzielonymi i dla ich wydzielenia musi zostać od nich oddzielony (np. na drodze odparowania, liofilizacji, często po uprzednim wzbogaceniu frakcji eluatu w rozdzielane składniki

14 Technika elucyjna, substancja B sjest silniej sorbowana niż substancja A

15 Chromatogram analizy elucyjnej

16 Klasyczna elucyjna technika kolumnowa (LC) 1) przygotowanie kolumny i wypełnienia, wypełnienie, kondycjonowanie, 2) dozowanie, elucja, detekcja, kolekcja frakcji, 3) re-kondycjonowanie, 2 ) dozowanie,,albo rozładowanie, 1 )

17

18

19 Najczęściej HPLC Widok pasm rozdzielania kilku składników ekstraktu acetonowego trawy - przez szklaną ścianę kolumny HPLC typu CN (faza stacjonarna alkilonitryl związany na powierzchni porów wewnątrz ziaren żelu krzemionkowego, eluent heksan MTBE - THF; kolejność pasm - od dołu: caroteny, produkt rozkładu chlorofilu, chlorofil A, carotenoidy-i, chlorofil B, carotenoidy-ii carotenoidy II chlorofil B Tu NP HPLC warunki bezwodne! kierunek przepływu eluentu carotenoidy I chlorofil A Warunki rozdzielania Kolumna 150x3mm, Separon CN 5 um,eluent: heksan:mtbe:thf=55:8:6,4 (v/v/v), próbka 30 ul ekstraktu acetonowego z trawy, temperatura pokojowa Natężenie przepływu eluentu w=0.8 ml/min produkt utleniania chlorofili

20 Thin Layer Chromatography (TLC) Chromatografia cienkowarstwowa (planarna), odkryta jako bibułowa 1889 (PC - Paper Chromatography) Tu: wynik rozdzielania mieszaniny kilku nisko i średnio polarnych barwników na żelu krzemionkowym na płytce szklanej; Widać także, że na starcie pozostaje składnik / mieszanina polarnych składników ; Dla tych składników mieszaniny - eluent o zbyt niskiej sile elucyjnej

21 ZIARNISTA / MNLITYCZNA WARSTWA PRWATA PAKWANEJ MNLITYCZNEJ KLUMNY ADSRPCYJNEJ / CHRMATGRAFICZNEJ Pojęcia / definicja : średnica ziaren (dp [μm]), średnica porów (d [nm, A]), rozkład średnic / wielkości porów f(d), średnica kolumny (dc [mm]), długość warstwy wypełnienia kolumny (Lc [mm, m]), liniowa prędkość przepływu płynu (u [mm/sek], [m/sek]), lepkość dynamiczna eluentu (η [Pa sek]), natężenie przepływu cieczy (eluentu) (w), (V) [ml/min, m 3 /sek], liczba Reynoldsa (Re [1])porowatość międzyziarnowa (ε m/z ), porowatość wewnątrz-ziarnowa (ε w/z ), porowatość całkowita (ε t ), opór przepływu ( P), przepuszczalność kolumn (K - [m -2 ]), zredukowana przepuszczalność wypełnienia (Φ [1]), Zjawiska : wykluczanie molekularne (permeacja), adsorpcja polarna, hydrofobowa, hydrofilowa, wymiana jonowa anionów (AX)/ kationów (CX), wymiana ligandów (LE)

22

23 DYSPERSJA MASY Wiele zjawisk przyczynia się do dyspersji stref rozdzielanych substancji Wzrost dyspersji = spadek sprawności kolumny wzrasta H i spada N Im niższa wartość wysokości równoważnej półce teoretycznej (HETP, H), tym wyższa wartość liczby półek teoretycznych tym wyższa sprawność rozdzielania - także - kolumny

24 Zależności najprostsze, aktualne dla CGC w przypadku HPLC aktualne co do zasady H min A BC u opt B C H min A B C

25 Dyspersja stref zjawisko niekorzystne, jednak, nieuniknione u - liniowa prędkość fazy ruchomej Zjawiska powodujące dyspersję - Dyfuzja wirowa (A); - Dyfuzja molekularna (B); - pory przenoszenia masy (C) 1. w fazie ruchomej (Cm), 2. w fazie stacjonarnej (Cs) Równanie Van Deemter a, H = B/u + A + Cu C = (Cm + Cs) u bardziej adekwatne dla LC równania: Knox a : h = B/v + A v Cv B=0.5; A=2 (1); C=0.1 (0.05) h=h/dp v=udp/dm ν - tzw. zredukowana prędkość przepływu eluentu (Pe) [1] D M współczynnik dyfuzji molekularnej substancji rozdzielanej w eluencie [m 2 /sek] d p średnica ziaren wypełnienia kolumny; wielkość ziaren wypełnienia kolumny [m]

26 Modification of the van Deemter Equation: the Giddings Equation Giddings realized that the eddy diffusion and resistance to mass transfer in the mobile phase must be treated dependently: H 5 i 1 1 A 1 1 C u 1 B u C u s C m u H e

27

28 H L C S 1 / 2 ( ) 5,54 l L l N C 5,54( H S 2 1/ 2 ) 2 H= Lc (μ 2 / (M 1 ) 2 ) N= Lc/H = (μ 2 / (M 1 ) 2 ) -1 As 0,1 b a u L C t 0

29 Informacje niesione z chromatogramem i podstawowe zależności Rs -rozdzielczość pików -zależność teoretyczna R S k2 k 1 2 N 2 t R czas retencji t M czas martwy kolumny retencja substancji niesorbowanej, wnikającej do porów wypełnienia kolumny k współczynnik retencji k t R t -współczynnik rozdzielenia k2 tr2 tm k1 tr 1 tm N-liczba półek teoretycznych t N 5,54 w Rs=(t Rn+1 t Rn ) / ½(S n+1 + S n ) - zależność obliczeniowa M t M R h 2

30

31

32 F. Steiner, THERM FISHER SCIENTIFIC, Technical Informations

33 (Rs) R-rozdzielczość pików zależność teoretyczna R S k k N 2 selektywność współczynnik retencji sprawność Wpływa : rodzaj fazy stacjonarnej, skład fazy ruchomej, temperatura, ph, dodatek do eluentu substancji solwatujących / tworzących pary jonowe moc / siła elucyjna zastosowanego eluentu, w RP także: ph - dodatki cofające dysocjację elektrolityczną, dodatki solwatujące, zwłaszcza, jeśli zmieniają hydrofobowość średnica ziaren wypełnienia, prędkość przepływu eluentu i w mniejszym stopniu, ale nie bez znaczenia - lepkość fazy ruchomej oraz współczynnik dyfuzji, a więc, także temperatura

34 k opt = (7.0)

35 V o = V c ε t u = w / (Fc ε ) t

36 pór przepływu w kolumnie wypełnionej wypełnieniem ziarnistym Φ = (dp) 2 / K obliczana na podstawie wartości przepuszczalności K K = u Lc η / ΔP

37

38 CHRMATGRAFIA WYKLUCZANIA (dawniej żelowa GPC/SEC) Rozdzielanie mieszanin pod względem zróżnicowania wielkości (wymiarów) cząsteczek / cząstek Wykluczanie steryczne - permeacja porów wypełnienia ziarnistego, albo monolitycznego kolumny, o różnych wartościach średnich średnic porów oraz o określonym stopniu zróżnicowania rozkładu średnic porów w wypełnieniu kolumny, korzystnie - z eliminacją wszystkich oddziaływań sorpcyjnych na powierzchni porów wypełnienia. Rozdzielanie ma miejsce dzięki zróżnicowaniu wymiarów porów wypełnienia dzięki zróżnicowaniu drogi dyfuzji cząsteczek (m,olekuł) / cząsteczek o różnej wielkości (zróżnicowaniu wartości ich tzw. średnic hydrodynamiczmnych

39 Dzięki regulacji rozmiarów porów, które działają niczym sito, ale odwrotne, możliwe staje się rozdzielenie mieszanin różniących się wielkością cząsteczek / cząstek

40 Chromatografia wykluczania (żelowa) GPC/SEC mechanizm rozdzielania Wykluczanie Technika rozdzielania pod względem wielkości cząsteczek / cząstek w warunkach eliminacji, albo co najmniej - minimalizacji sorpcji. rozdzielaniu powinna decydować tylko różnica czasu dyfuzji molekuł / cząstek koloidalnych w przestrzeni porów wypełnienia kolumny. Idea niemożliwa do realizacji z zastosowaniem TLC wymaga długiej kolumny. Częściowe wykluczanie Brak wykluczania Technika wykorzystywana dla substancji lipofilowych, (THF, CH2Cl2, ) albo hydrofilowych (bufory z dodatkiem EDTA, ). Nie wolno skokowo zmienić polarności!!!

41 Gel Permeation: 1958

42 min

43 Kalibracja w zakresie rozkładu masy molekularnej i postępowanie w celu określenia polidyspersyjności kopolimeru o bimodalnej charakterystyce polidyspersyjności

44

45

46 Kolumny o różnych zakresach / porowatości średnic / wielkości porów

47 Układy chromatograficzne typu GPC / SEC W warunkach nie-wodnych liofilowych / lipofilowych Eluenty: THF, dioksan, czterochloroetylen, chlorobenzen, toluen, ksylen, ; Fazy stacjonarne: kopolimer styren-diwinylobenzen; do badań rozkładu masy cząsteczkowej polimerów nisko i średnio polarnych, a także lipidów, fosfolipidów itp.. W warunkach wodnych Eluenty: dimetyloformamid, metanol, acetonitryl i ich mieszaniny z wodą i z wodnymi roztworami soli, kwasów i zasad, roztwory buforowe bez dodatku składników organicznych: Fazy stacjonarne: polidekstrany, policukry, poliwęglany, szkła porowate, silanizowany żel krzemionkowy, diole związane z pow. nośninka,.

48 Zakres zastosowań chromatografii wykluczania GPC/SEC - Badanie rozkładu masy molekularnej różnego typu materiałów polimerów / biopolimerów -trzymywanie frakcji polimerów o mało zróżnicowanej wielkości masy molekularnej (nisko dyspersyjnych), -Wstępne frakcjonowanie złożonych mieszanin pod względem wielkości cząsteczek / cząstek - najczęściej rozdzielanie wstępne materiałów w badaniach biochemicznych, mikrobiologicznych oraz w biotechnologii, biologii molekularnej, medycynie - znaczanie składników różniących się znacznie masą molekularną (wielkością cząsteczek / cząstek), np. oznaczanie zawartości pektyn, antyutleniacza w olejach i smarach, wiskozatora, składu grupowego środków myjących itp., - Przygotowanie próbki / wsadu do badań / rozdzielania w innych warunkach (zwłaszcza wyodrębnianie frakcji nisko-molekularnej z materiału o wyższej masie cząsteczkowej, np.. WWA, pestycydów, niektórych witamin,... z tłuszczów, osadów itp.) -dsalanie białek

49 Zasady doboru fazy stacjonarnej dla GPC/SEC Rozkład wielkości (szczególnie średnic hydrodynamicznych) porów wewnątrz ziaren wypełnienia kolumny chromatograficznej / w strukturze mikroporowatego wypełnienia monolitycznego kolumny, powinien być dostosowany do rozkładu wartości hydrodynamicznych średnic cząsteczek rozdzielanych, a więc do rozkładu masy cząsteczkowej badanej / rozdzielanej mieszaniny. Powinien mieć miejsce brak oddziaływań sorpcyjnych między składnikami rozdzielanej mieszaniny i powierzchnią porów wypełnienia kolumny. Faza stacjonarna musi być odporna na składniki eluentu i na składniki rozdzielanej mieszaniny - nie może się w nich rozpuszczać, ani złoże nie powinno pęcznieć po wypełnieniu kolumny. Jeżeli ma miejsce pęcznienie ziaren wypełnienia, powinno zostać zakończone przed wypełnieniem kolumny ziarnistym materiałem porowatym fazą stacjonarną.

50 Kolumna ochronna (tzw. prekolumna ) APARAT GPC/SEC Dozowanie stosowana rzadko w celu nasycania eluentu fazą stacjonarną Termostat Schemat ideowy najprostszego układu aparatu chromatograficznego - HPLC do chromatografii GPC/SEC warunki z reguły izokratyczne, detekcja RID / LLSD

51

52

53 PLIDYSPERSYJNŚC PLIMERU

54

55

56 PCV i plastyfikatory PCV - oznaczanie rozkładu masy molekularnej oraz zawartości plastyfikatorów

57

58 olej BHT H2 Fosfo-gliko-lipidy

59 dsalanie

60 Chromatografia sorpcyjna adsorpcyjna / podziałowa / mieszana -- mechanizmy sorpcji i retencji, porównanie -- Układy RP / N P Układy NP / NP-w / HILIC Mechanizmy sorpcji i oddziaływania między-cząsteczkowe M. Kamiński WCh-PG-Gdańsk 2013

61 RP // NP

62

63 Żel krzemionkowy jako adsorbent / baza do wytwarzania sorbentów z chemicznie związanymi adsorbentami typu DIL, CN, NH2, AMID, / C18, C8, C4, PHENYL, CN, / SCX (SA), SAX (SB),. Korzystne - stosowanie wysokiej czystości sorbentów wolnych od metali ciężkich Purospher, Chromolith. Zanieczyszczenia jonami metalu Na + - Si Si H Grupy silanolowe wolne Fe - 2+ Si - Si H Si H Si H geminalne H Si H H H Si Me Si H Si H wicynalne Si Si Si Si

64 Mechanizm wiązania różnych grup funkcyjnych z żelem krzemionkowym z zastosowaniem tworzenia wiązanń siloksanowych z wykorzystaniem chloro trialkilo silanów w warunkach bezwodnych na przykładzie C18 H H Si Si H Si H Si H X H CH 3 Si Si CH 3 Si H H Si CH 3 Si Si CH 3 H CH 3 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 Si CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH C 2 6 H 13 CH 3 Endcapping CH 3 H Si Si CH 3 CH 3 Si CH 3 Si CH H 3 Si CH 3 H Si Si CH CH 3 3 Si CH3 CH 3 Pomimo endcapping u wolne grupy silanolowe są wciąż dostępne nieporządane oddziaływania (asymetria)

65 C H 2 C H 2 C H 2 C H 2 C H 2 C H 2 S i S i C H 2 C H 2 C H 2 C H 2 C H 2 C H C 2 6 H 13 S i H S i S i CH 3 H S i C H 2 C H 2 C H 2 C H 2 C H 2 C H 2 C H 2 C H 2 C H 2 C H 2 C H 2 C H C 2 6 H 13 Purospher STAR RP-18 charakteryzuje się prawie całkowitym pokryciem powierzchni. Zapobiega to polarnym oddziaływaniom S i S i C H 2 C H 2 C H 2 C H 2 C H 2 C H 2 C H 2 C H 2 C H 2 C H 2 C H 2 C H 2 C 6 H 13

66 o- m- p- H N + H N + H N + H N H NH 2 NH 2

67 H H C H 3 H 3 C etylowy propylowy

68 Si NP Si H C H 3 CH3 Si H Si Si H Si H Si Si H Si Si Si H H faza stacjonarna: Si 2 faza ruchoma: Heksan- C 6 H 14

69 Si NP Si H Si H C H 3 CH3 Si Si H Si H Si Si H faza stacjonarna: Si 2 Si Si H faza ruchoma: C 6 H 14 : C 4 H 8 2 heksan: dioksan 8:2 v/v Si H

70 H RP CH 3 Si Si Si Si CH 3 CH 3 CH 3 H 2 H 2 C H 3 H C H 3 H Si CH 3 Si Si CH 3 CH 3 faza stacjonarna: Si 2 /C4 faza ruchoma: MeH/ H 2, 1:1

71 NP RP hydrofobowość polarność polarność hydrofobowość

72 NP NP RP NP RP Porównanie różnych warunków rozdzielania bez przeładowania i z przeładowaniem

73 W celu charakterystyki różnego typu adsorbentów trzeba uwzględniać różnego rodzaju oddziaływania powierzchniowe Test Tanaka Pojemność wymiany jonowej (E,F) F Pojemność adsorpcyjna (A) 0,0 0,3 0,6 A 9,0 6,0 3,0 1,4 Hydrofobowość (B) 1,5 1,6 B A: k (Pentylobenzen) 9.59 B: (Pentyl-/ Butylobenzen) 1.51 C: (Trifenylene/ o-terfenyl) 1.63 D: (Caffeine/ Phenol) 1.44 E: (Benzyloamina/Fenol; ph7.6) 1.23 F: (Benzyloamina/Fenol; ph2.7) 1.12 E 0,0 0,8 1,2 0,4 1,0 1,8 0,6 0,2 D Pojemność silanolowa (D) 2,4 C Selektywność (C)

74 Niekiedy ten sam sorbent może służyć w warunkach RP i NP., lub RP i HILIC

75

76 Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) apowerful separation technique Bogusław Buszewski & Sylwia Noga Abstract Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) provides an alternative approach to effectively separate small polar compounds on polar stationary phases. The purpose of this work was to review the options for the characterization of HILIC stationary phases and their applications for separations of polar compounds in complex matrices. The characteristics of the hydrophilic stationary phase may affect and in some cases limit the choices of mobile phase composition, ion strength or buffer ph value available, since mechanisms other than hydrophilic partitioning could potentially occur. Enhancing our understanding of retention behavior in HILIC increases the scope of possible applications of liquid chromatography. ne interesting option may also be to use HILIC in orthogonal and/or two-dimensional separations. Bioapplications of HILIC systems are also presented. Keywords Hydrophilic interaction liquid chromatography.stationary phase. Separation mechanism. Bioapplication

77

78 HILIC Hydrophilic Interaction Chromatography (Hydrophilic Interaction Liphophilic Interaction Chromatography) UKŁAD RZDZIELCZY : Polarna, lub względnie polarna faza stacjonarna (typu NP : NH2, DIL, CN, Si-H, Amid, wymieniacze jonowe // eluent zawierający wodę, wodny roztwór buforowy w znacznym udziale oraz rozpuszczalne w wodzie składniki organiczne, zwłaszcza AcCN. Ze wzrostem polarności eluentu rośnie jego siła elucyjna // substancje rozdzielane polarne, ale niejonowe, np. cukry, a także dysocjujące elektrolitycznie, ale jako słabe kwasy lub zasady org. -- wzrost zawartości wody / buforu / soli nieorganicznej w eluencie powoduje wzrost jego siły elucyjnej - odwrotnie niż w RP!!!

79 Faza stacjonarna - polarna Faza ruchoma polarna, z zawartością rozpuszczalnika organicznego i substancji zdolnej do dysocjacji elektrolitycznej np. H2 CH 3 CN + CH 3 CH, lub TEA, lub NH 4 C, Niekiedy bez dodatku do eluentu innych substancji dysocjujących elektrolitycznie niż woda np. w przypadku rozdzielania cukrów, glikoli, amin z zastosowaniem NH2, lub CN, lub Si2 itp. sorbentów

80

81 Jak to działa?

82

83

84

85

86

87 ZIC HILIC

88

89 Chromatografia jonowa (IC) Eluenty o małej sile jonowej: 0,1 1 mm Żywice rozdzielające o małej pojemności jonowej Konieczne tłumienie tła: supresja jonów eluentu, lub elektroniczna korekta tła dla bardzo małej siły jonowej eluentu! Uniwersalna detekcja konduktometryczna po supresji jonów eluentu Próg detekcji (LD) ogranicza poziom przewodnictwa oznaczanych jonów Detektory przydatne w szczególnych przypadkach: UV-VIS (np. azotany - 5 i -3, siarczki), RID (wyższe stężenia), ELD (reduktory)

90 Żywice kationo-wymienne w postaci pierwotnej, grupy kwasowe odszczepiające proton - H + wymienialny na inne kationy Grupy funkcyjne związane na powierzchni sorpcyjnej: -Sulfonowe: -S 3 H mocny -Karboksylowe: -CH średnio mocny, albo słaby -Amino-di-octanowe: -N(CH 2 CH) 2 słaby -Fenolowe: -C 6 H 4 H bardzo słaby -Fosfonowe: -P 3 H 2 mocny -Fosfinowe: -P 2 H słaby

91 Żywice aniono-wymienne grupy funkcyjne o charakterze zasadowym związane na powierzchni sorpcyjnej: -czwartorzędowe grupy amoniowe: -NR 3+, - N + (CH 3 ) 2 C 2 H 4 H mocny -Aminy, amidy, protonowane aminy II i III rzędowe: -NH 2, =NH, -NR 2 H +, -NRH 2+ NH 3+ - średni, słaby, b. słaby -dialkilosulfoniowe: -SR słaby do b. słaby

92 Przykłady rozdzielań IC elucja izokratyczna

93 Chromatografia jonowa w warunkach elucji gradientowej - detektor konduktometryczny z tzw. auto-supresorem mikro-membranowym

94

95 2D-HPLC / UPLC

96

97 Rozdzielanie grupowe TR-TCh - prof M. Kamński ważny obszar zastosowań chromatografii cieczowej - realizowane zazwyczaj dotychczas techniką kolumnową z klasyczną preparatywną kolumną szklaną, z elucją stopniową i oznaczaniem grawimetrycznym, - coraz częściej warunkach wysokosprawnej chromatografii kolumnowej w skali semi-preparatywnej (P-HPLC) z przepływem zwrotnym eluentu w kolumnie, albo z systemem kliku kolumn z elucją izokratyczną i z przepływem zwrotnym eluentu w kolumnie - niekiedy, z wykorzystaniem do rozdzielania wielokolumnowego układu kolumn i różnych sorbentów w każdej z kolumn, w tym, wypełnień do chromatografii jonowymiennej, ze związanym - dodatkowo jonem metalu, np,. Ag+ (możliwość rozdzielania izomerów cis/trans); -- w normalnych układach faz (NP), oraz detekcją RID, lub LLSD, lub z elucją gradientową i detektorem LLSD, albo oznaczeniem grawimetrycznym - do rozdzielania grupowego stosowana też bywa technika planarna (TLC), albo technika TLC-FID.

98 Rozdzielanie grupowe benzyn z przepływem zwrotnym eluentu Low volatile petroleum fractions and products - vacuum distillates and their reffining products, vacuum resudue and vacuum residue extracts - new grouop - type separation and group type determination procedures UV 260 nm RID TR-TCh - prof M. Kamński

99 RID TR-TCh - prof M. Kamński

100 Styren UV-VIS / DAD TR-TCh - prof M. Kamński

101 N RID EN the column is to selective for Grupe-Type Sep. EN the column has optimal selectivity for G-T S ep. Chromatogramy oleju napędowego: A zastosowano kolumnę Spherisorb S5 NH2 spełniającą wymagania normy, ale o niekorzystnej selektywności, i w konsekwencji nie przydatną do wykonywania oznaczeń składu grupowego, B zastosowano kolumnę spełniającą wymagania normy i o poprawnej selektywności grupowej (Spherisorb S3 NH2 szarża produkcyjna sprzed kilku lat). Warunki rozdzielania i detekcji zgodne z normą IP-391-EN-12916; BF czas przełączania zaworu elucji wstecznej wyznaczony zgodnie z formułą podaną w normie. TR-TCh - prof M. Kamński

102 olephines pirenes N 150 N UV-VIS DD chrysenes N 500 TR-TCh - prof M. Kamński

103 Przykład chromatogramu rozdzielania grupowego i identyfikacji grup składników oleju bazopwego z zastosowaniem detektora UV-VIS/DAD Setki, a nawet tysiące substancji w każdej grupie TR-TCh - prof M. Kamński

104 Chromatograms of group-type separation of base oil SAE 10 use of multicolumn arrangement no 1: CN+NH2+Cu(NH3)2 columns, reverse eluent flow, UV 265 nm and RI detector TR-TCh - prof M. Kamński

105 PWTÓRZENIE NAJWAŻNIEJSZE UKŁADY RZDZIELCZE GPC / SEC RP / HIC NP, NP-w, HILIC IExC C_exch, A_exch RZDZIELANIE - oznaczanie składu / przygotowanie wsadu, próbki / oczyszczanie / otrzymywanie czystych składników mieszanin - Skala analityczna / modelowa semi-preparatywna / preparatywna / procesowa

106 Mechanizmy rozdzielania Warunki wykluczania (chromatografii żelowej) zróżnicowanie dróg i czasu dyfuzji składników próbki Warunki RP hydrofobowość Warunki NP polarność, polaryzacja, dyspersja, wiązania wodorowe; Warunki IExC wymiana jonów Inne: HIC,HILIC,NP-w,LEC,AC,EC,...

107 ddziaływania - GC / SFC / LC Faza stacjonarna Substancje rozdzielane GC Substancje rozdzielane Składniki eluentu LC (HPLC, TLC) Faza stacjonarna SFC

108 Informacje niesione z chromatogramem i podstawowe zależności Rs -rozdzielczość pików -zależność teoretyczna R S k2 k 1 2 N 2 t R czas retencji t M czas martwy kolumny retencja substancji niesorbowanej, wnikającej do porów wypełnienia kolumny k współczynnik retencji k t R t -współczynnik rozdzielenia k2 tr2 tm k1 tr 1 tm N-liczba półek teoretycznych t N 5,54 w Rs=(t Rn+1 t Rn ) / ½(S n+1 + S n ) - zależność obliczeniowa M t M R h 2

109 k= ( 1/Rf ) - 1 c d c Rf 3 d b a FAZA RUCHMA Rf 1 a d Rf 2 b d

110 Chromatografia adsorpcyjna Chromatografia podziałowa Chromatografia jonowymienna Chromatografia wykluczania

111