Rozdzielanie - wyodrębnianie frakcji eluatu,

Transkrypt

1 Techniki i metody Sorpcji i Chromatografii WPROWADZENIE DO LC / HPLC / UPLC / TLC / SPE / PLC Techniki i metody rozdzielania -- cząsteczek cząsteczek(molekuł, w tym, produktów syntezy, polimerów, biopolimerów), -- cząstek (składników roztworów koloidalnych, a nawet zawiesin, np. lateksu, wirusów,bakterii) w układach dwufazowych : ciecz porowate ciało stałe, czasem ciecz ciecz na pow. f. st. Inne układy rozdzielcze : - gaz ciało stałe GSC, GS-A,, gaz ciecz GLC, GL-A, - płyn nadkrytyczny ciało stałe SFC,, płyn nadkrytyczny ciecz SFC Znaczenie rozdzielania: -- otrzymywanie czystych składników lub grup składników do zastosowań użytkowych, lub badań -- identyfikacja i oznaczanie składu mieszanin, -- przygotowanie wsadu / próbki -- badanie parametrów fizykochemicznych

2 Techniki sorpcji i chromatografii - L-SA (np. SPE) / LC, - G-SA / GC, - SFE / SFC -- kolumnowe (np. CLC, HPLC, CGC), --cienkowarstwowe (planarne, np. TLC) - okresowe, - pół-ciągłe, - ciągłe -- elucyjne -- czołowe -- rugowania (displacement)

3 Warunek konieczny rozdzielenia Konkurencja oddziaływań sorpcyjnych ( adsorpcyjnych, absorpcyjnych, podziałowych, jonowymiennych wykluczania jonowego, powinowactwa, wymiany ligandów ) o porównywalnych energiach, w układzie: substancje rozdzielane / składniki fazy ruchomej - faza stacjonarna

4 Zastosowania technik Adsorpcji i Chromatografii Rozdzielanie - wyodrębnianie frakcji eluatu, izolacja składników / grup składników mieszanin, oczyszczanie, oznaczanie składu, przygotowanie wsadu, próbki,. -- składniki głównych / ubocznych produktów syntezy, -- płynów fizjologicznych, komórek -- monitoring środowiska, -- kontrola jakości produktów, -- kontrola procesów technologicznych, -- badanie polidyspersyjności polimerów,..., ale także: -- rozdzielanie grupowe, przygotowanie wsadów / próbek -- określanie parametrów fizykochemicznych,...

5 historia Michaił Cwiet ( ) 1919) Odkrywca techniki kolumnowej elucyjnej chromatografii cieczowej Like light rays in the spectrum, the different components of a pigment mixture, obeying a law, are resolved on the calcium carbonate column and then can be qualitatively and quantitatively determined. I call such a preparation a chromatogram and the corresponding method the chromatographic method.

6

7 Klasyczna elucyjna technika kolumnowa (LC) Problemy umiejętność wypełniania kolumny, dozowania wąskiego i płaskiego pasma, opisu zjawisk w kolumnie podczas dozowania i elucji, detekcja, sterowanie

8 Widok pasm kilku składników ekstraktu acetonowego trawy przez szklaną ścianę kolumny HPLC typu CN, eluent heksan MTBE - THF; kolejność pasm - od dołu: produkt rozkładu chlorofilu, chlorofil A, carotenoidy-i, chlorofil B, carotenoidy-ii kierunek przepływu eluentu Nowoczesna technika HPLC (NP-HPLC) Warunki rozdzielania Kolumna 150x3mm, Separon CN 5 um,eluent: heksan:mtbe:thf=55:8:6,4 (v/v/v), próbka 30 ul ekstraktu acetonowego z trawy, temperatura pokojowa Natężenie przepływu eluentu w=0.8 ml/min II II B I A Pr. rozkł.

9 Przykład chromatogramu RP-HPLC mieszaniny wzorców WWA (PAH) 16 wg WHO Kolumna:.. Eluent i program elucji:.. Natężenie przepływu:.. Detektor i warunki detekcji:. Próbka:.., rozpuszczalnik próbki.. Objętość dozowania,. Piki: 1 -., 2 -., 3 -., 4 -., 5-.., 6 -., 7 -., 8 -.., 9 -.., , , , 13 -., 14 -., , 16 - Chromatogram powinien być poprawnie i w pełni opisany

10 Fragment chromatogramu detektora UV-VIS/DAD VIS/DAD w odwzorowaniu poziomicowym oraz chromatogramy dla wybranych długości fali i widma dla kilu pików rozdzielanych z rozdzielania ekstraktu izolowanego z trawy za pomocą acetonu. Warunki rozdzielania: Kolumna Eurospher CN, 7um; eluent heksan:mtbe:thf=55:8:6,4 (v/v/v)

11 Dla opisu hydrodynamiki, kinetyki, dyspersji masy w kolumnach i warstwach chromatograficznych, opanowania technologii wypełniania i kondycjonowania kolumn, efektywnego stosowania technik chromatografii w - analityce, przygotowaniu próbek i preparatyce oraz dla uzyskania umiejętności projektowania optymalnych warunków rozdzielania i otrzymywania substancji z wykorzystaniem technik i metod adsorpcji i chromatografii, adsorpcji i chromatografii, należy znać podstawowe pojęcia fizykochemii sorpcji i opisu operacji jednostkowych inżynierii chemicznej i procesowej w zakresie: --- hydrodynamiki, w tym, w tym, oporów przepływu w przewodach i warstwach porowatych, filtracji, sedymentacji, dekantacji, elutriacji --- dyfuzji i dyspersji, w tym, w tym, kinetyki transportu, wymiany, dyspersji masy w warstwach porowatych i warstewkach cieczy, kapilarach a także w zakresie fizykochemii: --- adsorpcji desorpcji, wymiany jonów, oddziaływań polarnych, dyspersyjnych, hydrofobowych, jonowych, elektrokinetycznych

12 Pojęcia podstawowe adsorpcji i chromatografii -- innych technik rozdzielania -- Układ : faza stacjonarna faza stacjonarna(z reguły stała powierzchnia sorpcyjna (rzadko ciekła inaczej niż w GC) faza ruchoma konkurencyjne oddziaływania na powierzchni sorpcyjnej między molekułami substancji rozdzielanych i molekułami eluentu, a także, oddziaływania w przestrzeni eluentu (w praktyce tylko w LC i SFC) Retencja (spowolnienie elucji względem prędkości przepływu eluentu u ); Selektywność (zróżnicowanie retencji); Sprawność (miara dyspersji stref); Prędkość u [mm/s] i natężenie przepływu eluentu w [ml/min] Retencja Selektywność Sprawność Prędkość Opór przepływu w kolumnie P [MPa] = u*lc*η/ dp 2 Kolumna o długości (Lc),, średnicy (dc),, kolumna z wypełnieniem ziarnistym (dp, d, A) / monolityczna (dm, d, A) Sorbent - pory wewnątrz-ziarnowe ziarnowe i między-ziarnowe, ziarnowe, porowatość (ε wz, ε mz, ε T ),, powierzchnia sorpcyjna (nawet do 750 m 2 /g) Molekuły próbki Oddziaływania Molekuły eluentu Powierzchnia sorpcyjna

13 Oddziaływania - GC / SFC / LC Faza stacjonarna Substancje rozdzielane GC Substancje rozdzielane Faza stacjonarna Składniki eluentu LC (HPLC, TLC) SFC

14 ELUENT ELUAT substancje rozdzielane / grupy subst. rozdziel. w eluencie

15 Chromatogram (warunki elucyjne, bez przeładowania) Wykres zależności stężenia substancji w eluacie wypływającym z kolumny w funkcji objętości elucji, a gdy natężenie przepływu eluentu jest stałe (w, u = const) w funkcji czasu Opis każdego chromatogramu powinien zawierać: - cel badania, dane o próbce, kolumnie, warunkach elucji (składniki i skład eluentu, albo składniki eluentu i program elucji), - zastosowany detektor i warunki detekcji, w tym program długości fali, - nazwy substancji odpowiadających pikom chromatograficznym

16 Chromatografia cienkowarstwowa (planarna) TLC FAZA RUCHOMA

17 k= ( 1/Rf ) - 1 c d c Rf = 3 d b a FAZA RUCHOMA Rf = 1 a d Rf = 2 b d

18 Mechanizmy fizykochemiczne GPC / SEC (wykluczania, żelowa ) - zróżnicowanie czasu dyfuzji RP hydrofobowość (głównie) NP polarność, polaryzacja, dyspersja, wiązania wodorowe; IC wymiana jonów Inne: HIC, LIHIC, LLC, LEC, AC, EC,...

19 Przedmiotem wykładu są tylko podstawy; Wiedza, a także zrozumienie - w prezentacjach szczegółowych oraz wskazanych pozycjach literatury. Zalecam usilnie - systematyczny udział w wykładach oraz samodzielne studia, zgodnie ze wskazówkami w prezentacjach wykładowych, wykonywane na bieżąco

20 Sorbent / Warstwa wypełnienia / Kolumna w Sorpcji i Chromatografii - Ziarnista, lub monolityczna warstwa porowata wewnątrz rury o bardzo gładkiej ściance, o średnicy (dc) dc),, wypełniona sorbentem o przeciętnej (średniej) wielkości ziaren (dp) i długości warstwy wypełnienia (Lc); -Wypełnienie ułożone równomiernie w przekroju poprzecznym warstwy porowatej złoża, zapewniające tzw. tłokowy profil przepływu (u f (dc)); - Ziarna ułożone w sposób stabilny, zapewniający brak osiadania złoża; W celu stabilizacji wypełnienia kolumny preparatywnej stosowane są : dynamiczna kompresja osiowa złoża (DAC), albo/i kompresja radialna (promieniowa).

21 Wypełnienia ziarniste kolumny LC/HPLC, porowata warstwa płytki TLC TRTR-

22

23 DYSPERSJA MASY (rozmycie stref) w KOLUMNIE Wiele zjawisk przyczynia się do dyspersji stref rozdzielanych substancji Wzrost dyspersji = spadek sprawności kolumny wzrasta H i spada N Im niższa wartość wysokości równoważnej półce teoretycznej (HETP, H), tym wyższa wartość liczby półek teoretycznych tym wyższa sprawność rozdzielania -także - kolumny

24

25

26 Dyspersja stref zjawisko niekorzystne, jednak, nieuniknione Zjawiska powodujące dyspersję - Dyfuzja wirowa (A); - Dyfuzja molekularna (B); - Opory przenoszenia masy (C) 1. w fazie ruchomej (Cm), 2. w fazie stacjonarnej (Cs) Równanie Van Deemter a, H = B/u + A + Cu C = (Cm + Cs) u albo bardziej adekwatne dla LC równania: Knox a: h = B /v + A v C v B=0.5; A=2 (1); C=0.1 (0.05) h = H/dp v=udp/dm

27 Zależności najprostsze, aktualne dla CGC w przypadku HPLC aktualne co do zasady H = A + min BC u opt = B C H = min A+ B C

28 Modification of the van Deemter Equation: the Giddings Equation Giddings realized that the eddy diffusion and resistance to mass transfer in the mobile phase must be treated dependently: 5 B H = Csu + Cmu + 1 i + 1 = 1 u A C u 1 H e

29 Zakres braku sorpcji Informacje niesione z chromatogramem -- podstawowe zależności dla sorpcji i chromatografii -- Rs -rozdzielczość pików -zależność teoretyczna R S = 1 4 α 1 α k2 k N 2 t R czas retencji t M czas martwy kolumny retencja substancji niesorbowanej, wnikającej do porów wypełnienia kolumny k współczynnik retencji k = t R t -współczynnik rozdzielenia k2 tr2 tm α = = k1 tr 1 tm N-liczba półek teoretycznych N - zależność obliczeniowa M t M t = 5,54 w R(Rs)=(t Rn+1 t Rn ) / ½(S n+1 + S n ) R h 2

30 k opt = (7.0)

31

32 Instrumentalizacja chromatografii aparatura chromatograficzna - Należy zapewnić: - Stałe (w, u = const), albo zmienne w funkcji czasu, zaprogramowane natężenie przepływu eluentu (u, w = f(t)),, o zaprogramowanej stałej (elucja izokratyczna),, albo zmiennej w funkcji czasu - zawartości poszczególnych składników eluentu (elucja gradientowa) oraz - stałą (T=const, warunki izotermiczne), albo zmienną, zaprogramowanąw w funkcji czasu temperaturę separacji (T=f(t) - warunki gradientu temperatury ) warunki gradientu temperatury ).

33 Instrumentalizacja chromatografii aparatura chromatograficzna - Należy także: - Zapewnić czułą, wystarczająco uniwersalną, albo wysoce specyficzną ( oraz, o ile to możliwe) liniową w szerokim zakresie stężeń detekcję obecności i zawartości rozdzielanych substancji w eluacie wypływającym z kolumny, - Celowe jest, dodatkowo,, stosowanie systemu przełączania kolumn i zapewnienie możliwości stosowania przepływu zwrotnego w kolumnie chromatograficznej

34

35 Schemat ideowy najprostszego aparatu HPLC elucja izokratyczna --

36 SCHEMAT CHROMATOGRAFU CIECZOWEGO Z ELUCJĄ GRADIENTOWĄ etapy: kondycjonowanie, dozowanie, rozdzielanie + detekcja, oznaczanie, kolekcja frakcj

37

38 Prototyp gradientowego aparatu 2D- HPLC, opracowanego w roku 2006 w PG przy współpracy z COBRABiD w Warszawie System przełączania kolumn i zawór przepływu zwrotnego

39 Chromatogram Wykres zależności stężenia substancji w eluacie wypływającym z kolumny w funkcji objętości elucji, a gdy natężenie przepływu eluentu jest stałe (w, u = const) w funkcji czasu Opis każdego chromatogramu powinien zawierać: - cel badania, dane o próbce, kolumnie, warunkach elucji (składniki i skład eluentu, albo składniki eluentu i program elucji), - zastosowany detektor i warunki detekcji, w tym program długości fali, - nazwy substancji odpowiadających pikom chromatograficznym

40 Detektor to przepływowy instrument pomiarowy nie powodujący rozmycia stref rozdzielanych substancji (znikoma objętość kuwety przepływowej) Detektory: stężeniowe / masowe Pojęcia związane z detekcją w chromatografii są te same, jak z w przypadku każdego instrumentu analitycznego: - poziom sygnału (S) szumów (Sz), - czułość (Cz ) - stosunek poziomu sygnału do poziomu szumów), - dryf, - dynamika (czas odpowiedzi - stała czasowa), - zakres liniowości, albo charakter funkcji odpowiedzi, - selektywność (bardzo rzadko - specyficzność)

41 Detekcja Detektory w HPLC / TLC Detektor chromatograficzny przepływowy instrument analityczny o znikomej objętości naczyńka pomiarowego; Nie istnieje dotychczas w pełni uniwersalny detektor w LC, stąd stosuje się wiele różnych; Znaczenie ma bardzo dobra dynamika oraz liniowość odpowiedzi; stosowane detektory i techniki detekcji: UV ( nm)/ UV-VIS VIS ( nm) i szczególne znaczenie detektora typu DAD (diode array detector) RID (refractive index detector) LLSD (laser light scattering detector) FLD (fluorescence detector) El-D (electrochemical detector, typ amperometryczny) CD (coductometric detector - supresja jonów eluentu) LC-MS, LC-MS-MS (mas - spectrometry) inne (FTIR, NMR, LC-FID, Radiometryczny, Polarymetryczny, Pomiaru momentu dipolowego,...) Techniki wizualizacji w przypadku TLC oraz technika derywatyzacji post-kolumnowej TCh - prof M. Kamński w przypadku HPLC

42 Detekcja detektory Najczęściej stosowane techniki detekcji i detektory Fotoabsorpcjometryczny (spektrofotometryczny) w zakresie UV-VIS, VIS, ostatnio coraz częściej typu DAD (UV-VIS/DAD); VIS/DAD); Refraktometryczny (różnicowy) (RID) uwaga tylko dla elucji izokratycznej; Fluorescencyjny (FLD); Rozproszenia światła (najczęściej laserowy LLSD) - uwaga tylko dla niskolotnych substancji; Konduktometryczny z supresją jonów w chromatografii jonowej; LC-MS i inne zdecydowanie mniej często

43 Nowoczesna detekcja i detektory fotoabsorpcjomeytryczne UV, UV-VIS, VIS, UV-VIS VIS/DAD, Pojęcie absorpcji światła, prawo absorpcji światła: [- lg(i/ (I/I o )]= lg(i o /I)=ABS=k * c * l Widmo, jakie informacje niesie widmo? Wnikliwa analiza przebiegu widma umożliwia identyfikację substancji o charakterystycznym przebiegu widma identyfikacja na podstawie retencji oraz cech widma -jedocześnie Chromatogram detektora UV-VIS/DAD VIS/DAD bardzo wiele chromatogramów jednocześnie; Najwygodniejsze - odwzorowanie poziomicowe; Problem widmo własne składników eluentu

44 Detektor UV-VIS typu DAD Chromatogram program dł. Fali Funkcja analizy ilościowej ABS-f(t) Widmo -piren Funkcja analizy jakościowej Chromatogram detektora UV-DAD odwzorowanie poziomicowe ABS=f(t, λ) ABS=f(λ)

45 Oznaczanie zawartości WWA chromatogram poziomicowego odwzorowania absorpcji światła Kolumna Lichrospher RP mmx4mm 5µm, CH3CN-H2O v/v, 1.5 ml/min, UV-DAD nm; piki: 1-(?), 2-benzen, 3- naftalen, 4-acenaften, 5-fenantren, 6-piren, 7-benzo (α) piren.

46 Analityka składu mieszanin w chromatografii - metody kalibracji - Metoda krzywej kalibracyjnej (external standard method) -Metoda wzorca wewnętrznego (internal standard method) - Metoda normalizacji (normalization method) -- uproszczona (simplified), -- ze współczynnikami kalibarcyjnymi (using correction factors) -Metoda dodatku wzorca (standard addition) - co najmniej dwa rozdzielania

47 Chromatografia cienkowarstwowa (planarna) (thin layer chromatography (TLC), odkryta jako bibułowa (PC) 1989

48 Chromataografia Cienkowarstwowa - TLC (Planarna) Najczęściej w ukladach faz normalnych (NP-TLC) / NP-HPTLC), lub oddziaływań hydrofilowych (HILIC-TLC, HILIC - HPTLC). Coraz częściej w układach faz odwróconych (RP-TLC, RP-HPTLC HPTLC. FAZA RUCHOMA - ELUENT Bardzo rzadko inne mechanizmy rozdzielania, nigdy GPC/SEC zbyt mała droga dyfuzji cząsteczek / cząstek

49 k= ( 1/Rf ) - 1 c d c Rf = 3 d b a FAZA RUCHOMA Rf = 1 a d Rf = 2 b d

50 Chromatografia wykluczania (żelowa) GPC/SEC mechanizm rozdzielania Technika rozdzielania pod względem wielkości cząsteczek / cząstek w warunkach eliminacji, albo co najmniej - minimalizacji sorpcji. O rozdzielaniu powinna decydować tylko różnica czasu dyfuzji molekuł / cząstek koloidalnych w przestrzeni porów wypełnienia kolumny. Idea niemożliwa do realizacji z zastosowaniem TLC wymaga długiej kolumny. Wykluczanie Częściowe wykluczanie Brak wykluczania Technika wykorzystywana dla substancji lipofilowych, (THF, CH2Cl2, ) albo hydrofilowych (bufory z dodatkiem EDTA, ). Nie wolno skokowo zmienić polarności!!!

51 Kalibracja w zakresie rozkładu masy molekular- nej i postępo- wanie w celu określenia polidysper syjności kopolime- ru o bimo- dalnej charakte- rystyce polidysper syjności

52 PCV i plastyfikatory PCV - oznaczanie rozkładu masy molekularnej oraz zawartości plastyfikatorów

53 Chromatografia sorpcyjna adsorpcyjna / podziałowa / mieszana Układy RP / HIC -- wprowadzenie -- Układy NP / HILIC / NP-w Układy jonowymienne / wykluczania jonowego Mechanizmy sorpcji i oddziaływania Należy brać pod uwagę dla : powierzchni sorpcyjnej / fazy stacjonarnej, cząsteczek rozdzielanych, składników eluentu: Polarność, hydrofobowość, kwasowość, zasadowość, zdolność dysocjacji elektrolit.,

54 o- m- p- O H N + O H O N + OH O N + OH N H NH 2 NH 2

55 OH OH C H 3 O O H 3 C O O etylowy propylowy

56 Układy faz odwróconych RP-HPLC, RP-TLC, RP- HPTLC (ale nie HIC) warunki te mają miejsce gdy: Nisko polarna (hydrofobowa) faza stacjonarna, względnie polarny eluent, składający się z wody i dodatku / dodatków organicznych; - Ze wzrostem zawartości organicznego składnika eluentu rośnie siła elucyjna, im dodatek bardziej hydrofobowy, tym bardziej wzrasta siła elucyjna; - Zmiana jednego składnika organicznego eluentu na inny wpływa na retencję i może wpływać na selektywność rozdzielania; - Dla przewidywania retencji i selektywności rozdzielania ma znaczenie przede wszystkim hydrofobowość substancji rozdzielanych oraz hydrofobowość powierzchni sorpcyjnej, ale także w znacznie mniejszym stopniu - elektrodonorowość i elektroakceptorowość, polarność i polaryzowalność, wiązania wodorowe między cząsteczkami substancji chromatografowanych i cząsteczkami eluentu, a także oddziaływania tego typu częścią polarną powierzchni sorpcyjnej; Fazy stacjonarne dla RP-HPLC: typu C18, C8, PHENYL, CN (wypełnienie typu CN może być też używane w układach faz normalnych, zarówno w warunkach adsorpcyjnych, jak i HILIC)

57 OH ORP CH 3 O O O Si Si C H 3 OH O CH 3 O O O Si Si CH 3 CH 3 O H 2 H 2 O OH O C H 3 O Si CH 3 O O Si O O Si CH 3 faza stacjonarna: SiO 2 /Cx faza ruchoma: MeOH/ H 2 O, 1:1 O CH 3

58 Kolejność elucji substancji w RP-HPLC HPLC: Jony, woda, polarne substancje organiczne, o niskiej, średniej, wysokiej hydrofobowości; Różne grupy funkcyjne o różnej hydrofobowości powodują zróżnicowanie retencji, dlatego rozdzielanie grupowe nie jest możliwe. Orientacyjna kolejność elucji: sole i kwasy nieorganiczne, alkanoloaminy (brak sorpcji),, cukry, aminy, aminokwasy, kwasy karboksylowe, aldehydy, alkohole, etery cykliczne, estry, etery di-alkilowe, tioetery, węglowodory aromatyczne, węglowodory alifatyczne, węglowodory alicykliczne, węglowodory alifatyczne, fluoroalkany

59 RP - warunki izo-elucyjne

60 Otrzymywanie faz stacjonarnych związanych chemicznie z żelem krzemionkowym

61 Układy faz normalnych NP-HPLC, NP-TLC gdy: Względnie polarna faza stacjonarna, względnie nisko polarny eluent warunki bezwodne; Polarna faza stacjonarna, eluent zawiera wodę w stężeniu bliskim nasycenia; Silne zmiany retencji ze zmianą zawartości wody w eluencie Polarna, lub względnie polarna faza stacjonarna i eluent zawierający wodę i rozpuszczalne w wodzie składniki organiczne. Siła elucji rośnie / spada z : - Ze wzrostem polarności eluentu rośnie jego siła elucyjna. - Zmiana jednego składnika organicznego eluentu na inny może wpływać na selektywność rozdzielania - Dla przewidywania retencji i selektywności ma znaczenie elektrodonorowość i elektroakceptorowość, polarność i polaryzowalność oraz wiązania wodorowe Fazy stacjonarne dla NP-HPLC: - Naturalne sorbenty SiO2, Al2O3, MgSiO3, Hydroksy- apatyt, ZrO2, TiO2, - Związane chemicznie fazy stacjonarne: CN, DIOL, NH2, Amid, SCX, SAX, Ag+,

62 Si O O NP Si O O Si Si O O Si O O Si Si O O Si O O Si Si O O Si OH OH OH OH OH OH OH C H 3 faza stacjonarna: SiO 2 CH3 faza ruchoma: Heksan- C 6 H 14

63 Si O O NP Si O O Si Si O O Si O O Si Si O O Si O O Si Si O O Si OH OH OH OH OH OH OH C H 3 faza stacjonarna: SiO 2 CH3 faza ruchoma: C 6 H 14 : C 4 H 8 O 2 heksan: dioksan 8:2 v/v

64 NP-HPLC - kolejność wzrostu siły elucji (energii oddziaływań adsorpcyjnych): Fluoroalkany, izoalkany, n-alkany, węglowodory aromatyczne, etery, chloroalkany, estry, etery cykliczne, ketony, acetonitryl, kwas octowy, alkohole alifatyczne, aminy alifatyczne,., woda

65

66 Widok pasm kilku składników ekstraktu acetonowego trawy przez szklaną ścianę kolumny HPLC typu CN, eluent heksan MTBE - THF; kolejność pasm - od dołu: produkt rozkładu chlorofilu, chlorofil A, carotenoidy-i, chlorofil B, carotenoidy-ii І Ι Ι ν ν kierunek przepływu eluentu od góry do dołu Warunki rozdzielania Kolumna 150x3mm, Separon CN 5 um,eluent: heksan:mtbe:thf=55:8:6,4 (v/v/v), próbka 30 ul ekstraktu acetonowego z trawy, temperatura pokojowa Natężenie przepływu eluentu w=0.8 ml/min

67 NP warunki izoelucyjne

68 Problem zmian zawartości wody w eluencie w warunkach układów faz normalnych szczególnie w przypadku stosowania naturalnych adsorbentów w postaci fazy stacjonarnej

69 Zestawienie chromatogramów rozdzielania w war NP / RP tych samych grup substancji NP NP RP a. Glikozydy NP-w b. Nitroaniliny NP c. Estry RP d. Estry NP e,f. Nitroaniliny RP RP Kolejność elucji w RP/NP(HILIC)

70 Zestawienie chromatogramów rozdzielania w war NP / RP tych samych grup substancji NP NP RP a. Glikozydy NP-w b. Nitroaniliny NP c. Estry RP d. Estry NP e,f. Nitroaniliny RP RP Kolejność elucji w RP/NP(HILIC)

71 HILIC Chromatografia oddziaływań hydrofilowych Hydrophilicic Interaction Chromatography lub Hydrophilic Interaction Lipophilic Interaction Chromatography - Faza stacjonarna polarna, typu NP, lub jonowym. - Faza ruchoma polarna, z dużą zawartością rozpuszczalnika organicznego (AcCN AcCN, MeOH, ), często : + kwas, lub zasada org., albo sól. Ze wzrostem zawartości wody w eluencie rośnie siła elucyjna!!!

72

73

74 Jak to działa?

75

76

77

78 Porównanie układów sorpcyjnych RP / NP / HILIC Możliwość wykorzystania mechanizmów mieszanych w rozdzielaniu

79 Zestawienie chromatogramów rozdzielania w war NP / RP tych samych grup substancji a. Glikozydy NP-w b. Nitroaniliny NP c. Estry RP d. Estry NP e,f. Nitroaniliny RP Kolejność elucji w RP/NP(HILIC)

80 NP-w NP RP NP RP Porównanie różnych warunków rozdzielania w układach RP i NP bez przeładowania i z przeładowaniem kolumny 2013 (sorbentu)

81 Niektóre sorbenty, np. CN mogą być wykorzystywane w warunkach RP, lub NP, a także w warunkach HILIC

82 Wymiana jonowa / wysokosprawna chromatografia jonowymienna SCX / SA // SAX / SB -- chromatografia jonowa (IC) wysokosprawna chromatografia jonowa (HPIC) wysokosprawne kolumny rozdzielające z ograniczoną pojemnością jonowa, z zastosowaniem często - detekcji konduktometrycznej po supresji jonów eluentu, ale także - detekcji refraktometrycznej, UV-VIS, VIS, potencjometrycznej technika wprowadzona w 1975 r. (Small, Stevens, Bauman)

83 Typowe przykłady rozdzielania z zastosowaniem nowoczesnej chromatografii jonowej (IC)

84 Sorpcja i Chromatografia jako technika przygotowania próbki do analizy / wsadu do rozdzielania - Technika SPE (RP, NP, SCX, SAX, Affinity) - Technika SPME - Technika chromatografii wykluczania (żelowej) - Technika elucyjna w skali semi-prepratywnej lub preparatywnej

85 Skala preparatywna / procesowa chromatografii kolumnowej PLC P-HPLC // cienkowarstwowej P-TLC Możliwość otrzymywania użytkowych ilości czystych substancji / grup substancji, szczególnie, z roztworów skomplikowanych mieszanin składników aminokwasy, peptydy, białka, enzymy, metabolity roślinne, grzybowe glikozydy i aglikony, alkaloidy, metale rzadkie i inne,.

86 Chromatografia preparatywna / procesowa technika otrzymywania czystych substancji Skala semi-preparatywna / preparatywna stosowanie okazjonalne (cel: badania strukturalne, kalibracja, mikrosyntezy, właściwości fizykochemiczne ); Skala procesowa stosowanie do produkcji leków, wzorców analitycznych, nukleotydów o określonej sekwencji, metali ziem rzadkich,

87 Różne rodzaje izoterm sorpcji - kształt pików w warunkach przeładowania stężeniowego (masowego) TR-

88 Problem zapewnienia tłokowego profilu przepływu w kolumnie

89 Zestawienie chromatogramów NP / RP w warunkach różnego typu przeładowania a. Glikozydy NP_w b. Nitroaniliny NP c. Estry RP d. Estry NP e. Nitroaniliny RP a, b, c przeładowanie stężeniowe g. przeładowanie objętościowe

90 Rozdzielanie Grupowe Postępowanie separacyjne w celu otrzymania chromatogramu składającego się z pików zawierających wiele substancji o podobnej strukturze molekularnej, a czasem, o podobnych innych właściwościach, takich, jak polarność, hydrofobowość, te same pierwiastki w cząsteczce (S, V, Ni, itp.)

91 Rozdzielanie grupowe - ważny obszar zastosowań chromatografii cieczowej - realizowane zazwyczaj dotychczas techniką kolumnową z klasyczną preparatywną kolumną szklaną, z elucją stopniową i oznaczaniem grawimetrycznym, - coraz częściej warunkach wysokosprawnej chromatografii kolumnowej w skali semi-preparatywnej (P-HPLC HPLC) z przepływem zwrotnym eluentu w kolumnie, albo z systemem kliku kolumn z elucją izokratyczną i z przepływem zwrotnym eluentu w kolumnie - niekiedy, z wykorzystaniem do rozdzielania wielokolumnowego układu kolumn i różnych sorbentów w każdej z kolumn, w tym, wypełnień do chromatografii jonowymiennej, ze związanym - dodatkowo jonem metalu, np,. Ag+ (możliwość rozdzielania izomerów cis/trans); -- w normalnych układach faz (NP), oraz detekcją RID, lub LLSD, lub z elucją gradientową i detektorem LLSD, albo oznaczeniem grawimetrycznym - do rozdzielania grupowego stosowana też bywa technika planarna (TLC), albo technika TLC-FID.

92 The schema of arrangement of the simplest group type NP- HPLC apparatus for an analysis of fractions and products up to 360 o C TBP EN or ASTM D-6476 using one eluent (n-heptane or n-hexan) and with application of the reverse flow of the eluent in HPLC column RID and UV-DAD

93 Rozdzielanie grupowe benzyn i przepływ zwrotny w kolumnie Low volatile petroleum fractions and products - vacuum distillates and their reffining products, vacuum resudue and vacuum residue extracts - new grouop - type separation and group type determination procedures UV 260 nm RID

94 RID

95 Styren UV-VIS / DAD

96 Petroleum including reformate RID badanie pochodzenia i sfałszowania benzyn Petroleum including CCR Petroleum including pirocondensate (dienes and styren)

97 ON RID EN the column is to selective for Grupe-Type Sep. EN the column has optimal selectivity for G-T S ep. Chromatogramy oleju napędowego: A zastosowano kolumnę Spherisorb S5 NH2 spełniającą wymagania normy, ale o niekorzystnej selektywności, i w konsekwencji nie przydatną do wykonywania oznaczeń składu grupowego, B zastosowano kolumnę spełniającą wymagania normy i o poprawnej selektywności grupowej (Spherisorb S3 NH2 szarża produkcyjna sprzed kilku lat). Warunki rozdzielania i detekcji zgodne z normą IP-391-EN-12916; BF czas przełączania zaworu elucji wstecznej wyznaczony zgodnie z formułą podaną w normie.

98 olephines pirenes ON 150 ON UV-VIS DD chrysenes ON 500

99 Multi-column separation column separation arrangement 1

100 Multi-column separation arrangement 2

101 Chromatogramy otrzymane w wyniku rozdzielenia grupowego oleju bazowego SAE 10 (A,C) oraz frakcji A (B,D) z wykorzystaniem układu wielokolumnowego. Układ kolumn: (A,B A,B) Lichrospher CN oraz dwie połączone w szereg kolumny Lichrospher NH2-KH2PO4 oraz (C,D) Lichrospher CN oraz dwie połączone w szereg kolumny SiO2-Cu(NH3)2. Eluent: n-heksan, przepływ: 1 ml/min, temperatura: 20 o C, detektor: refraktometryczny. Zakres elucji: O olefiny, ma węglowodory monoaromatyczne, da węglowodory diaromatyczne, pa węglowodory poliaromatyczne; Detektor UV_VIS/DASD

102 Przykład chromatogramu rozdzielania grupowego i identyfikacji grup składników oleju bazopwego z zastosowaniem detektora UV-VIS/DAD VIS/DAD Setki, a nawet tysiące substancji w każdej grupie

103 Opis warunków rozdzielania i detekcji rozdzielanie wielowymiarowe olejów bazowych Opis chromatogramu z rozdzielania wielokolumnowego Chromatogram typu poziomicowego UV-DAD, otrzymany w wyniku rozdzielenia oleju bazowego SAE 10 z wykorzystaniem układu wielokolumnowego na grupy: P/N/mA/dA/ A/pA. Układ kolumn: Lichrospher CN, dwie połączone szeregowo kolumny Lichrospher SiO2-Cu(NH Cu(NH3)2 oraz dwie połączone szeregowo kolumny Lichrogel PS1; Eluent: n-heksan, przepływ: 1 ml/min, temperatura: 20 o C; Objętość dozowana: 20 µl; stężenie próbki 50 mg/ml. Przełączanie kolumn: CN odłączanie w 6 min, SiO2- Cu(NH3)2 odłączanie w 8.1 min elucja frakcji PNO z kolumny PS1, SiO2-Cu(NH Cu(NH3)2 elucja węglowodorów aromatycznych od 32 min. chromatogram (B): CN odłączanie w 6 min, SiO2-Cu(NH Cu(NH3)2 odłączanie w 7.28 min elucja frakcji PNO z kolumny PS1, SiO2-Cu(NH Cu(NH3)2 elucja węglowodorów mono- i di-aromatycznych od 27 min, elucja wsteczna węglowodorów poli-aromatycznych od 40 min. Piki: O olefiny, ma węglowodory monoaromatyczne, da węglowodory di-aromatyczne, pa węglowodory poli-aromatyczne.

104 Chromatograms of g grroupup-type separation of base oil SAE 10 use of multicolumn arrangement no 1: CN+NH2+Cu(NH3)2 columns, reverse eluent flow flow,, UV 265 nm and RI detector TRTR-

105 Wnioski (przykład wniosków) Opracowano kilka alternatywnych procedur analitycznych, stosowania wysokosprawnej chromatografii cieczowe w układzie faz normalnych (NP- HPLC) do rozdzielania i oznaczania składu grupowego odasfaltowanych (deasphalted) / bezasfaltenowych frakcji i produktów z ropy naftowej o dowolnym zakresie lotności w konwencji: P / ΣA / R oraz (ip+np+n) / O / A1 / A2 / A3+ / ΣR,, jednak grupa asfaltenów musi zostać wydzielona techniką precypitacji i zawartość oznaczona grawimetrycznie; Opracowano nowe procedury stosowania wysokosprawnej chromatografii w układzie faz normalnych NP-HPLC do rozdzielania i oznaczania składu grupowego różnych frakcji i produktów naftowych o różnych zakresach lotności, w tym, z zastosowaniem kolumn HPLC o modyfikowanej na nowe sposoby powierzchni sorpcyjnej, np. SiO2 Cu(NH3)x2+, SCX-Ag+, NH2-KH2PO4, Pd(R3)+ i innych; Stwierdzono szczególne zalety wykorzystania przepływu zwrotnego w kolumnie, zwłaszcza w przypadku zastosowania HPLC do rozdzielania grupowego materiałów złożonych z bardzo wielu komponentów oraz celowość stosowania wielowymiarowej separacji w przypadku oznaczania składu grupowego frakcji, albo produktów naftowych o niskiej lotności, klas lipidów, grup detergentów i temu podobnych materiałów

106 Wnioski cd. Opracowane procedury można zastosować w skali preparatywnej, zapewniając otrzymanie odpowiednich frakcji w ilościach przydatnych do badań składu, parametrów fizykochemicznych oraz właściwości użytkowych innymi technikami analitycznymi; Powinny zastąpić takie, mało powtarzalne i niedokładne metody oznaczania składu grupowego, jak: FIA, ASTM D-2007, ASTM D i in., zapewniając otrzymywanie w krótszym czasie dokładne i powtarzalne wyniki, co ma znaczenie nie tylko w analityce procesowej frakcji, albo produktów naftowych, dla kontroli jakości produktów naftowych, a także w monitoringu zanieczyszczeń środowiska i miejsca awarii w instalacjach rafineryjno petrochemicznych; Opracowano także skuteczne procedury wykorzystania wielowymiarowej wysokosprawnej chromatografii cieczowej w układzie faz normalnych do oznaczania składu grupowego ropy naftowej i z ich zastosowaniem scharakteryzowano skład grupowy kilku rodzajów ropy naftowej, uzyskując wiarygodne rezultaty

107 Rozdzielanie grupowe klas lipidów z zastosowaniem elucji gradientowej -- detektor LC-FID, albo LLSD -- A. Stołyhwo - Rozprawa habilitacyjna

108 Chromatografia dwuwymiarowa (najłatwiej: IC-RP dlaczego?)

109 Ostatnie trendy rozwojowe Preparation of MIPs Moleculary Imprinted Polymers Based on the preparation of a highly cross-linked polymer around a template (the analyte) in the presence of a suitable monomer The template and monomer(s) are first mixed to form a stable prepolymerization complex in a selected solvent Molecular Imprinted Porous Polymeric Stationary Phases

110 Preparation of MIPs (cont.) Next, the polymerization is initiated in the presence of a suitable cross- linker After polymerization (usually bulk), the polymer is ground and sieved to an appropriate particle size The template is then removed, leaving cavities complementary in shape, size and functionality

111

112

113 Monomers Used in the Preparation of MIPS

114 Applications of MIPs Solid-phase extraction material Stationary phases for HPLC Sensor components Artificial antibodies for drug screening and delivery Synthetic mediators

115

116 TRTR-

117

118 Powtórzenie LC (HPLC / TLC) RP - odwróconych układów faz NP - normalnych układów faz HILI C - oddziaływan hydrofilowych IExC (IC) - wymiany jonowej GPC / SEC w w warunkach wykluczania Otrzymywanie czystych substancji/grup, oznaczanie składu mieszanin, przygot. wsadów / próbki do badań, w skali analitycznej, semi- preparatywnej, preparatywnej, procesowej

119 Oddziaływania LC / GC / SFC Faza stacjonarna Substancje rozdzielane GC Substancje rozdzielane Składniki eluentu LC (HPLC, TLC) Faza stacjonarna SFC

120 Zakres braku sorpcji Informacje niesione z chromatogramem -- podstawowe zależności dla sorpcji i chromatografii -- Rs -rozdzielczość pików -zależność teoretyczna R S = 1 4 α 1 α k2 k N 2 t R czas retencji t M czas martwy kolumny retencja substancji niesorbowanej, wnikającej do porów wypełnienia kolumny k współczynnik retencji k = t R t -współczynnik rozdzielenia k2 tr2 tm α = = k1 tr 1 tm N-liczba półek teoretycznych N - zależność obliczeniowa M t M t = 5,54 w R(Rs)=(t Rn+1 t Rn ) / ½(S n+1 + S n ) R h 2

121 TLC k= ( 1/Rf ) - 1 c d c Rf = 3 d b a FAZA RUCHOMA Rf = 1 a d Rf = 2 b d

122 Zależności podstawowe

123 Inne chromatograficzne techniki rozdzielania Elektroforeza żelowa (GE), bibułowa (PE), kapilarna (CE); Elektrochromatografia (EC); Chromatografia micellarna (MC); Chromatografia membranowa ( poli poli-membranowa ); ale także Chromatografia powinowactwa (AC); Chromatografia wykluczania jonowego (IEC); Rozdzielanie w polu sił (FFF); Przeciwprądowa chromatografia kroplowa (CCC); Inne, niekonwencjonalne techniki rozdzielania z sorpcją

124 Prezentacje, rozdziały podręczników, które warto uzupełniająco przestudiować - Hydrodynamika, operacje hydrodynamiczne, filtracja, - Kinetyka i dynamika wymiany masy w operacjach dyfuzji i konwekcji - GPC/SEC, RP-HPLC, HIC, NP-HPLC, IEC-IC IC, IPC, - Techniki ekstrakcji ługowania w przygotowaniu wsadu / próbki do rozdzielania, - GC, - SFE / SFC, - PLC, - Ekstrakcja współ- i przeciwprądowa / CCC, - Wirowanie / FFF