Enzymy i koenzymy ROZDZIAŁ 8. Elżbieta Kotrys-Puchalska. Wojciech Garczorz. Agnieszka Kłych

Transkrypt

1 ROZDZIAŁ 8 Enzymy i koenzymy Elżbieta Kotrys-Puchalska Wojciech Garczorz Agnieszka Kłych Ogólne właściwości enzymów Enzymy są katalizatorami, które zwiększają szybkość przemiany substratów w produkty, a ich budowa po reakcji nie ulega zmianie. Działanie enzymów pozwala na obniżenie energii aktywacji. Energia aktywacji jest to najmniejsza ilość energii, którą należy dostarczyć dla jednego mola substratu, aby każda z cząsteczek stała się reaktywna. Enzymy wykazują zdolność przyspieszenia tylko takiej reakcji chemicznej, która jest termodynamicznie możliwa. W ich obecności reakcja może zachodzić razy szybciej. Enzymy to białka, chociaż znane są reakcje katalizowane przez cząsteczki RNA - rybozymy. Część białkowa enzymu, tzw. apoenzym, wpływa na specyficzność substratową (jaki substrat ulega przemianie w produkt), decyduje również o kierunku reakcji (ten sam substrat może dawać różne produkty). Specyficzność enzymu zależy od różnic w budowie centrum aktywnego i zdolności konformacyjnego przystosowania się do substratu. Specyficzność wobec substratów jest bardzo znaczna lub czasem absolutna np. reakcja hydrolizy katalizowana przez trombinę (hydroliza wiązania peptydowego pomiędzy resztą argininy i glicyny). Czasami enzymy mogą katalizować różne typy reakcji chemicznych np. trypsyna hydrolizuje wiązanie peptydowe, ale również wiązanie estrowe. 79

2 Miejsce gdzie dochodzi do połączenia enzymu z substratem w kompleks ES to tzw. centrum katalityczne. W jego obszarze ma miejsce zarówno wiązanie substratu (miejsce określające swoistość) oraz zachodzi reakcja. Enzymy allosteryczne posiadają również odrębne miejsce wiążące efektor centrum allosteryczne. Grupy funkcyjne aminokwasów biorące udział w katalizie enzymatycznej sąsiadują ze sobą w przestrzeni, ale zazwyczaj oddalone są od siebie w łańcuchu polipeptydowym. Aminokwasy biorące bezpośredni udział w katalizie znajdują się w odległości 0,2 nm od substratu. Najczęściej do nich należą: cysteina, seryna, lizyna, histydyna, kwas glutaminowy, kwas asparaginowy. Dla katalizy enzymatycznej ważne są również aminokwasy pomocnicze (nie stykają się z substratem, ale biorą udział w katalizie) oraz aminokwasy stabilizujące strukturę przestrzenną. Dla przebiegu wielu reakcji biochemicznych oprócz apoenzymu, konieczny jest udział niskocząsteczkowego niebiałkowego składnika. Te niebiałkowe kofaktory w zależności od swoich właściwości określane są jako koenzymy lub grupy prostetyczne. Mogą nimi być: nukleotydy, pochodne witamin, związki hemu, jony metali lub pochodne cukrów. koenzym holoenzym = apoenzym + lub grupa prostetyczna Mechanizm działania koenzymu i grupy prostetycznej polega na tym, że wiążą się one stechiometrycznie z białkiem enzymatycznym oraz z substratem za pośrednictwem określonej jego grupy. Następnie w obrębie wszystkich trzech połączonych składników, dokonuje się odpowiednie przegrupowanie, umożliwiające określoną przemianę substratu. Koenzym i grupa prostetyczna enzymu decydują najczęściej o rodzaju katalizowanej przez ten enzym reakcji. Różnice między grupą prostetyczną a koenzymem dotyczą: A. Siły wiązania z apoenzymem. Grupy prostetyczne są niebiałkowymi składnikami enzymu związanymi stosunkowo trwale i tworzącymi z białkiem pozornie niedysocjujące połączenia. Ich oddzielenie i ponowne złączenie z białkiem nie zawsze prowadzi do odtworzenia katalitycznie czynnego enzymu. Przykładami grup prostetycznych są: Pochodne flawinowe FAD, FMN. Występują one w enzymach: dehydrogenaza bursztynianowa, oksydaza ksantynowa, oksydaza aminokwasowa, dehydrogenaza acylo-coa, dehydrogenaza aldehydowa, dehydrogenaza kwasu liponowego. 80

3 Żelazoporfiryny, które spotykamy w enzymach: oksydaza ksantynowa, katalaza, peroksydaza. Koenzymy są składnikami łatwo odszczepialnymi, tworzącymi raczej luźne połączenia z białkiem enzymatycznym. Po oddzieleniu koenzymu od apoenzymu stanowią one jednostki nieczynne katalitycznie, które po połączeniu z białkiem enzymu dają ponownie aktywny enzym czyli holoenzym. Przykładem takich koenzymów są koenzymy nikotynamidowe (NAD +, NADP + ) występujące głównie w dehydrogenazach (np. NAD + NADP + - glukozo-6-fosforanowej). - mleczanowej, alkoholowej, jabłczanowej itd.; B. Sposobu regeneracji w reakcji enzymatycznej Koenzym i grupa prostetyczna biorą udział w reakcji katalitycznej, ulegając przy tym przekształceniu. Ich stan pierwotny zostaje odtworzony dopiero w reakcji wtórnej, która przebiega w odmienny sposób w przypadku tych obu niebiałkowych kofaktorów. W przypadku koenzymu, który jest luźno związany z białkiem enzymu, regeneracja może zachodzić w reakcjach z różnymi apoenzymami. Koenzym można tu nazwać kosubstratem, ponieważ jego katalityczne działanie występuje w wyniku sprzężenia koenzymu z dwoma enzymami w jeden układ enzymatyczny. Przedstawiają to dwa poniższe przykłady. Przykład I LDH mleczan + NAD + pirogronian + NADH + H + W reakcji utleniania mleczanu przez dehydrogenazę mleczanową (LDH) przy udziale NAD + powstaje pirogronian oraz NADH. Regeneracja z formy zredukowanej, czyli NADH może zachodzić w reakcji katalizowanej na przykład przez dehydrogenazę 3-hydroksymaślanową lub reduktazę cystynową, które to enzymy redukują swoiste substraty wykorzystując NADH. dehydrogenaza 3-hydroksymaślanowa acetooctan + NADH + H + 3-hydroksymaślan + NAD + lub L-cystyna + NADH + H + Przykład II reduktaza cystynowa 2 L-cysteina + NAD + glukoza + ATP heksokinaza glukozo-6-fosforan + ADP fosfoenolopirogronian + ADP kinaza pirogronianowa pirogronian + ATP 81

4 lub fosfokreatyna + ADP kinaza kreatynowa kreatyna + ATP W reakcji katalizowanej przez heksokinazę ATP pełni funkcję koenzymu przekształcając się w ADP, który może ponownie przekształcić się w ATP przejmując fosforan od wysokoenergetycznego związku (fosfoenolopirogronianu lub fosfokreatyny), w reakcji katalizowanej przez inny enzym (kinazę pirogronianową lub kinazę kreatynową). W przypadku grupy prostetycznej katalityczne działanie enzymu polega na reakcji kolejno z dwoma substratami. Grupa prostetyczna, która przekształca się stechiometrycznie w reakcji z pierwszym substratem, na tym samym białku enzymatycznym, powraca do stanu pierwotnego w wyniku reakcji z drugim substratem. Przedstawia to poniższy przykład, w którym aminokwas ulega utlenieniu przez oksydazę aminokwasową, a grupa prostetyczna (FAD) ulega redukcji. Regeneracja FAD z formy zredukowanej (FADH 2 ) zachodzi podczas redukcji tlenu cząsteczkowego (drugi substrat) katalizowanej również przez oksydazę aminokwasową. -aminokwas FAD H 2 O 2 -ketokwas FADH 2 O 2 oksydaza aminokwasowa Czynniki wpływające na szybkość reakcji enzymatycznych Kinetyka reakcji enzymatycznych określa szybkość i przebieg reakcji. Jest ważnym czynnikiem umożliwiającym zachowanie homeostazy przez dostosowanie szybkości reakcji enzymatycznych w organizmie do aktualnych warunków środowiska lub bodźców hormonalnych. Dla celów praktycznych ćwiczenia, omówione zostaną tylko te czynniki, które wpływają na aktywność enzymów in vitro. Ilość enzymu w układzie może być oznaczona przez pomiar szybkości reakcji, ponieważ w określonych warunkach szybkość ta jest proporcjonalna do ilości enzymu. Szybkość reakcji określa się przez zmianę stężenia reagentów (przyrost produktów lub ubytek substratów) w jednostce czasu. 82

5 v p t s t gdzie: v szybkość reakcji p - stężenie produktu s - stężenie substratu t - czas Mierząc szybkość reakcji enzymatycznej ocenia się aktywność w warunkach badania. Na szybkość reakcji wpływają: stężenie substratu, stężenie enzymu, temperatura, ph środowiska, obecność aktywatorów i inhibitorów. Warunki badania są zazwyczaj tak dobrane, aby aktywność była proporcjonalna do ilości enzymu. Obecnie, niektóre enzymy są oznaczane metodami immunologicznymi. Oceniana jest wówczas ilość a nie aktywność enzymu. Wyniki te nie muszą się pokrywać, gdyż na aktywność wpływają czynniki, które nie mają wpływu na reakcję z przeciwciałami. Aby można było porównać różne jednostki aktywności, można podać stosunek aktywności zmierzonej do górnej granicy przyjętej wartości referencyjnej. WPŁYW CZASU Szybkość reakcji enzymatycznej można przedstawić na krzywej zależności ilości przekształconego substratu lub powstałego produktu od czasu trwania reakcji krzywej progresji (rys. 8.1). Przy stałym stężeniu enzymu i wybranym początkowym stężeniu substratu (S=const.) szybkość reakcji enzymatycznej przebiega według zerowego rzędu reakcji i nazwana została szybkością początkową (v o ). W reakcjach zerowego rzędu szybkość reakcji nie zależy od stężenia substratu ponieważ jest ono tak duże, że cały dostępny enzym jest nim wysycony. W tej sytuacji określa ją inny czynnik np. stężenie enzymu. Reakcje zerowego rzędu przebiegają ze stałą szybkością i są niezależne od stężenia substratu. Szybkość początkowa stanowi podstawę do oceny aktywności enzymów oraz badania właściwości kinetycznych (podaje przyrost produktu jaki można uzyskać w dowolnym czasie, gdyby stężenie substratu nie ulegało zmianie). Szybkość reakcji jest stała i jest równa szybkości początkowej tylko wtedy, gdy czas jest odpowiednio krótki. Wraz z upływem czasu, szybkość reakcji enzymatycznej zmniejsza się, co jest spowodowane wyczerpaniem substratu, a w niektórych przypadkach występuje hamowanie aktywności enzymu przez produkty reakcji. W w badaniach enzymologicznych wymagane jest ustalenie zakresu czasu, w którym reakcja przebiega według kinetyki zerowego rzędu. 83

6 Ilość produktu v (szybkość reakcji) t 1 t (czas reakcji) t 1 t (czas reakcji) Rysunek 8.1. Zależność szybkości reakcji od czasu trwania reakcji. WPŁYW STĘŻENIA SUBSTRATU Enzym katalizuje reakcję przekształcenia substratu w produkt: S + E ES E + P ES E + P w reakcjach odwracalnych Wraz ze wzrostem stężenia substratu wzrasta szybkość reakcji enzymatycznej, aż do osiągnięcia całkowitego wysycenia enzymu substratem. Wówczas dalsze zwiększenie stężenia substratu nie zwiększa szybkości reakcji, a szybkość reakcji enzymatycznej zbliża się do maksymalnej. Aby osiągnąć szybkość maksymalną wszystkie cząsteczki enzymu muszą być połączone z substratem. W zależności od powinowactwa enzymu do substratu szybkość maksymalną można uzyskać przy mniejszym (gdy enzym ma duże powinowactwo do substratu) lub większym (gdy enzym ma małe powinowactwo do substratu) stężeniu substratu. Równanie opisujące zależność szybkości reakcji enzymatycznej od stężenia substratu to równanie Michaelisa-Menten: gdzie: v v max K m [S] v v K max m [ S] [ S] - szybkość reakcji - maksymalna szybkość reakcji - stała Michaelisa - stężenie substratu Wykresem tego równania jest hiperbola (rys. 8.2). Jeżeli stężenie substratu (S) jest równe stałej Michaelisa (K m ) wtedy szybkość reakcji jest równa połowie szybkości maksymalnej. 84

7 K m [S] czyli vmax S] v v 2[ S] 2 [ max W oznaczeniach posługujemy się pomiarami szybkości początkowej, w takim zakresie czasu, w którym szybkość zostaje niezmieniona czyli reakcja jest rzędu zerowego. Należy stosować dostatecznie duże stężenie substratu aby zapewnić całkowite wysycenie enzymu. Stężenie substratu (S), w którym szybkość reakcji równa jest połowie szybkości maksymalnej to tzw. stała Michaelisa (oznaczona symbolem K m ). Określa ona powinowactwo enzymu do substratu, czyli zdolność enzymu do wiązania substratu. Im większa jest wartość K m tym mniejsze jest powinowactwo enzymu do substratu, gdyż dopiero przy dużym stężeniu substratu reakcja osiąga szybkość maksymalną. Wartość K m danego enzymu zależy od rodzaju substratu oraz od niektórych warunków zewnętrznych jak ph, siła jonowa, temperatura, nie zależy natomiast od stężenia enzymu czyli nie zależy od jego szybkości maksymalnej. Dla większości enzymów wartości K m znajdują się w przedziale 10-1 do 10-7 mola/l (najczęściej 10-3 do 10-5 mola/l). v (szybkość) reakcji) v 1 max E 1 v 1 max 2 v 2 max E 2 v 2 max 2 K m S (stężenie substratu) Rysunek 8.2. Graficzne przedstawienie równania Michaelisa-Menten dla różnych stężeń tego samego enzymu (E 1 >E 2 ). 85

8 Znacznie łatwiejszym sposobem wyznaczania wartości K m jest wykorzystanie równania Lineweavera-Burka, które powstało z przekształcenia (jest odwrotnością) równania Michaelisa-Menten. Wykresem jest prosta o nachyleniu względem osi odciętych równym K m /V max : 1 K v v m max 1 1 [ S] v max Punkt przecięcia prostej z osią y wyznaczony jest przez wartość 1/v max, natomiast w przedłużeniu tej prostej, w punkcie przecięcia z osią x, wyznaczona jest wartość 1/K m (rys. 8.3). Wartość K m jest pomocna przy opracowaniu metod oznaczania enzymów. Z definicji K m wynika, że szybkość reakcji przy stężeniu substratu równym K m wynosi 50% szybkości maksymalnej, przy stężeniu 10 K m wynosi 90%. Przy stężeniu powyżej 100 K m jest reakcją zerowego rzędu i szybkość w stosunkowo szerokim zakresie jest proporcjonalna do ilości enzymu. W metodach oznaczania aktywności enzymów zazwyczaj tak jest dobrane stężenie substratu, aby było ono około 100-krotnie większe od stałej Michaelisa. W niektórych przypadkach niedobór lub nadmiar substratu zmniejsza szybkość reakcji, dlatego musi być zachowane określone stężenie substratu. 1 v E 2 K m tg = v max E K m 1 v 1 max Rysunek 8.3. Graficzne przedstawienie równania Lineweavera - Burka dla różnych stężeń tego samego enzymu (E 1 >E 2 ). 1 v 2 max 1 S 86

9 W warunkach fizjologicznych większość enzymów nie jest wysycona substratem, a stosunek [S]/ K m znajduje się w granicach 0,01 do 1,0. WPŁYW STĘŻENIA ENZYMU Szybkość reakcji zależy od stężenia enzymu, gdy substratu jest w nadmiarze. Dopóki substratu w trakcie reakcji enzymatycznej będzie w nadmiarze, aktywność (wyrażona szybkością reakcji) będzie proporcjonalna do stężenia enzymu. Jest to podstawa do oznaczania ilości enzymów w płynach ustrojowych i w tkankach. WPŁYW ph Aktywność enzymu zależy od ph środowiska, które wpływa na stan jonizacji aminokwasów w cząsteczce enzymu oraz na stan dysocjacji substratu. Większość enzymów organizmu człowieka działa najlepiej w zakresie ph 6-8. Aby enzym osiągnął pełną aktywność, wymagana jest ściśle określona liczba dodatnich i ujemnych ładunków w jego cząsteczce. Zmiana ph może wpływać na aktywność enzymu przez zmianę ładunku w cząsteczce lub przez zmianę jego struktury. Przy tworzeniu kompleksu enzym-substrat czasem duże znaczenie ma ładunek substratu i enzymu. Przykładem może być pepsyna, dla której optymalne ph wynosi około 2. W miejscu aktywnym tego enzymu występują dwie reszty asparaginianu. Aby enzym był aktywny jedna z reszt asparaginianu musi być zjonizowana, a druga występować w postaci niezjonizowanej. Natomiast w tych przypadkach, gdy substraty są elektrycznie obojętne lub też ich ładunek nie jest istotny dla katalizy, krzywe zależności między ph a aktywnością mają często postać linii prostej, np.: esteraza cholinowa (w zakresie ph 7,0-10,5), -fruktofuranozydaza (w zakresie ph 3,0-7,5) (rys. 8.4). Optymalne ph dla danego enzymu można uzyskać stosując odpowiednie bufory, jest to szczególnie ważne przy oznaczaniu enzymów działających w bardzo wąskim zakresie ph, gdzie przesunięcie wartości ph może znacznie zmienić szybkość reakcji. W przypadkach gdy powstającym produktem jest kwas, może dochodzić do zmiany ph w trakcie reakcji, jeżeli pojemność buforowa jest zbyt mała. Zmiana ph środowiska o 0,1 jednostki może niekiedy dawać duże zmiany aktywności. Wiele buforów stanowi dobrą pożywkę dla mikroorganizmów. Rozwijająca się flora bakteryjna może zmieniać ph i pojemność buforu, zaburzając przebieg reakcji. 87

10 Aktywność względna pepsyna sacharaza trypsyna esteraza cholinowa arginaza ph Rysunek 8.4. Zależność szybkości reakcji enzymatycznych od ph. WPŁYW TEMPERATURY Utrzymanie stałej temperatury jest szczególnie istotne podczas inkubacji enzymatycznej. Podwyższenie temperatury zazwyczaj powoduje przyspieszenie szybkości reakcji, co związane jest ze zwiększeniem energii kinetycznej reagujących cząsteczek. Przy wzroście temperatury o 10 ºC (tzw. współczynnik temperatury - Q 10 ), szybkość wielu procesów biologicznych, w tym szybkość reakcji enzymatycznej, podwaja się czyli Q 10 =2. Gdy energia kinetyczna jest zbyt duża, może dochodzić do rozerwania wiązań utrzymujących strukturę drugo- i trzeciorzędową, co prowadzi do obniżenia aktywności (rys. 8.5). Zmiana temperatury inkubacji o 1 ºC może zmienić szybkość reakcji o około 5-10%. Dla przykładu aktywność amylazy oznaczana metodą kinetyczną w surowicy w temperaturze 25 ºC wynosi 40 U/l, natomiast w temperaturze 37 ºC 90 U/l. 88

11 Aktywność względna temp. (C) Rysunek 8.5. Zależność szybkości reakcji enzymatycznej od temperatury. WPŁYW AKTYWATORÓW I INHIBITORÓW Stosując optymalne warunki dla danej reakcji enzymatycznej należy pamiętać o aktywatorach np. jony magnezu w przypadku enzymów aktywowanych przez jony metali. Ustalenie optymalnych warunków działania enzymów musi uwzględniać obecność małocząsteczkowych związków. Jeżeli dodane do mieszaniny reakcyjnej związki małocząsteczkowe zmieniają powinowactwo enzymu do substratu, to zmienia się K m, natomiast szybkość maksymalna nie ulega zmianie. W przypadku, gdy dodany aktywator nie wpływa na powinowactwo enzymu do substratu, to zmienia się szybkość maksymalna, natomiast K m pozostaje bez zmian. Dla amylazy silnie aktywująco działają jony chlorkowe. Niektóre związki hamują reakcję enzymatyczną i dlatego trzeba je wyeliminować ze środowiska reakcji. Do nich należą między innymi jony metali ciężkich lub detergenty. RODZAJE INHIBICJI ENZYMATYCZNEJ Substancje zmniejszające aktywność enzymu to inhibitory. Mogą być nimi substancje endogenne, które w ten sposób regulują aktywność szlaku metabolicznego. Inhibitorami moga być rówież substancje egzogenne toksyny i leki modyfikujące aktywność enzymatyczną. W ramach inhibicji odwracalnej można wyróżnić typ kompetycyjny i niekompetycyjny. Inhibitor kompetycyjny to substancja o budowie podobnej do substratu, przez co współzawodniczy z substratem o dostęp do miejsca katalitycznego. Po przyłączeniu inhibitor nie może zostać przekształcony przez enzym, może tylko ulec odłączeniu od niego. Najczęściej inhibitor ma większe powinowactwo do miejsca katalitycznego, ale przy dużych stężeniach substratu inhibicja może zostać przełamana. Nie ulega zmianie szybkość 89

12 maksymalna (v max ) enzymu, ale obecność inhibitora kompetycyjnego pozornie zmniejsza powinowactwo substratu do enzymu, dlatego rośnie K m (rys. 8.6). 1 v E + I E 1 v max K m K m (inh) Rysunek 8.6. Graficzne przedstawienie równania Lineweavera - Burka dla inhibicji kompetycyjnej. E enzym; I inhibitor. 1 S 1 v E+ I E 1 - K m 1 v max 1 v max (inh) Rysunek 8.7. Graficzne przedstawienie równania Lineweavera Burka dla inhibicji niekompetycyjnej. E enzym; I inhibitor. 1 S Inhibitor niekompetycyjny zwykle ma budowę zupełnie odmienną od substratu i wiąże się z enzymem w innym miejscu niż centrum katalityczne. Powoduje to zmianę konformacji przestrzennej enzymu i prowadzi do obniżenia aktywności katalitycznej. Wzrost stężenia 90

13 substratu nie ma wpływu na inhibicję, ponieważ enzym może wiązać obie substancje jednocześnie, wobec tego nie zmienia się powinowactwo substratu do enzymu oraz K m. Zmniejszeniu ulega wartość v max (rys. 8.7). Dla inhibitorów definiuje się IC 50 to takie stężenie inhibitora, które zmniejsza aktywność enzymu o połowę w stosunku do aktywności maksymalnej enzymu. JEDNOSTKI AKTYWNOŚCI ENZYMATYCZNEJ Miarą aktywności enzymu jest szybkość reakcji enzymatycznej, wyrażona jako ubytek substratu lub przyrost produktu w jednostce czasu. W 1961 roku Komisja Enzymowa zaproponowała definicję jednostki enzymatycznej: międzynarodową jednostką standardową enzymu (U lub IU) jest to jego ilość, która katalizuje przemianę 1 mikromola substratu (lub 1 mikromola odpowiednich grup chemicznych) w ciągu 1 minuty, w temperaturze 30 C, w optymalnych warunkach reakcji przy stężeniu substratu gwarantującym pełne wysycenie enzymu. Mianem jednostki standardowej enzymu jest mol/min. W przypadku, gdy substratem jest białko, wielocukier lub inny związek, w którym więcej niż jedno wiązanie podlega reakcji, określenie 1 mol substratu zastępuje się wyrażeniem 1 mol odpowiednich grup chemicznych, za miarę szybkości reakcji przyjmuje się liczbę rozłożonych wiązań, nie zaś liczbę całkowicie rozłożonych cząsteczek. Gdy reakcja enzymatyczna przebiega pomiędzy dwoma identycznymi cząsteczkami związku, za podstawę oznaczeń przyjmuje się 2 mole tego związku. Przy oznaczeniu aktywności enzymu w płynach biologicznych wyniki przelicza się na 1000 cm 3 roztworu (stężenie aktywności enzymatycznej w roztworze). Aktywność właściwa określa stopień czystości preparatów enzymatycznych i jest to liczba jednostek standardowych przypadająca na 1 miligram białka (IU/mg). Aktywność molekularna określa reaktywność enzymu jest to liczba cząsteczek substratu przekształconych w produkty, w czasie 1 minuty przez 1 cząsteczkę enzymu, w optymalnych warunkach. W przypadku enzymów, które zawierają kilka centrów katalitycznych, używa się określenia aktywność centrum katalitycznego k cat, która równa się aktywności molekularnej podzielonej przez liczbę centrów aktywnych w enzymie. Katal jest jednostką aktywności enzymatycznej w układzie SI jest to aktywność, która przekształca 1 mol substratów w czasie 1 sekundy w optymalnych warunkach reakcji przy stężeniu substratu gwarantującym pełne wysycenie enzymu. Mianem katala jest mol/s. 91

14 Ponieważ aktywność enzymatyczna wyrażona w katalach przybiera bardzo małe wartości, praktycznie stosuje się: mikrokatale (kat = 10-6 kat), nanokatale (nkat = 10-9 kat), pikokatale (pkat = kat). 1 kat = 1 mol/s = 60 mol/min = mol/min = IU 1 IU = 1 mol/min = 1/60 mol/s = 1/60 kat = 1, kat Zmianie ulegają również wielkości pochodne: stężenie aktywności enzymatycznej w roztworze wyraża się w mikrokatalach w litrze (kat/l), aktywność właściwa - w mikrokatalach na kilogram białka (kat/kg), aktywność molarna (odpowiednik dawnej aktywności molekularnej) w katalach na mol enzymu (kat/mol). Aktywność enzymów wyrażoną w tzw. jednostkach umownych ustaloną przez autorów dla poszczególnych metod można czasami przeliczyć na jednostki międzynarodowe, aby umożliwić porównanie wyników. Czasem używa się definicji jednostki umownej jak np. dla oznaczania aktywności amylazy metodą Caraway a. Jednostka aktywności amylazy w metodzie Caraway'a, to taka aktywność enzymu, która hydrolizuje 10 mg skrobi w ciągu 30 min. do stopnia, w którym zanika reakcja z jodem. Aktywność wyraża się w jednostkach w odniesieniu do 100 ml materiału badanego. Aktywność amylazy w danym materiale wynosi 1 j./100 ml, jeżeli enzym zawarty w 100 ml zhydrolizuje 10 mg skrobi w ciągu 30 min. W celu ujednolicenia warunków reakcji przyjęto zasadę, że absorbancja próby badanej nie może być mniejsza (mierzymy ubytek substratu) niż 50% absorbancji próby kontrolnej (co daje aktywność 400 j.c./100 ml). Jeżeli aktywność amylazy jest większa, to badany materiał należy rozcieńczyć, a wynik pomnożyć przez rozcieńczenie. Zapewnia to większą powtarzalność wyników o małej i dużej aktywności enzymu. Pobieranie i przechowywanie materiału do oznaczania aktywności enzymów Aktywność enzymów oznaczanych w surowicy jest często znacznie niższa (nawet do kilku tysięcy razy) od aktywności tych enzymów oznaczanych w komórkach. Dlatego uszkodzenie nawet małych fragmentów tkanki powoduje zauważalny wzrost aktywności w osoczu. Należy pamiętać o tym, że zazwyczaj hemoliza znacznie zwiększa aktywność wielu enzymów w surowicy, między innymi dehydrogenazy mleczanowej, aminotransferazy asparaginianowej i alaninowej, fosfatazy kwaśnej. W niektórych przypadkach, np. podczas oznaczania 92

15 aktywności acylotransferazy lecytyna:cholesterol (LCAT), hemoliza powoduje częściowe zahamowanie aktywności enzymu. W oznaczeniach rutynowych krew do badań aktywności enzymów należy pobierać od pacjentów będących na czczo w godzinach porannych. SUROWICA Sposób przechowywania surowicy do oznaczeń aktywności enzymów wymaga znajomości właściwości badanego enzymu. Niewłaściwe przechowywanie prowadzi często do obniżenia aktywności enzymów. Stabilność enzymów jest różna i zależy od rodzaju enzymu i temperatury przechowywania. Bardzo mało stabilnym enzymem jest fosfataza kwaśna, gdyż już po 5 godz. przechowywania w temperaturze pokojowej enzym ten traci około 50% wyjściowej aktywności. Fosfataza kwaśna jest niestabilna nawet podczas przechowywania w lodówce lub zamrażarce. Spadek aktywności można zahamować, dodając do surowicy 20% kwasu octowego lub cytrynowego w ilości 0,01 ml na 1 ml surowicy. Aktywność fosfatazy kwaśnej częściej oznacza się w osoczu heparynizowanym niż w surowicy, gdyż podczas krzepnięcia krwi może dochodzić do uwolnienia enzymu zawartego w płytkach. W lodówce (temp. 4 ºC) surowica może być przechowywana: od 1 do kilku dni do oznaczania aktywności dehydrogenazy mleczanowej, fosfatazy zasadowej, aminotransferazy asparaginianowej, do 1 tygodnia do oznaczania aktywności aminotransferazy alaninowej, gammaglutamylotranspeptydazy (GGTP), do 5 miesięcy do oznaczania aktywności amylazy. Pozostawienie surowicy w zamrażarce zazwyczaj przedłuża możliwość przechowywania materiału do oznaczenia aktywności enzymów (np. aktywność fosfatazy zasadowej można oznaczać do kilku miesięcy), chociaż niektóre enzymy, jak np. aminotransferaza alaninowa po zamrożeniu traci stabilność. OSOCZE Znacznie rzadziej oznacza się aktywność enzymów w osoczu. Aby otrzymać osocze należy do krwi dodać antykoagulant, który hamuje procesy krzepnięcia krwi. Werseniany ze względu na chelatujące właściwości nie mogą być stosowane do oznaczania np. ceruloplazminy i metaloenzymów. Również heparyna hamuje aktywność niektórych enzymów, między innymi enzymów restrykcyjnych. Czasami wstępne przygotowanie materiału do oznaczania aktywności enzymów musi być przeprowadzone zgodnie z daną procedurą np. oznaczanie aktywności acylotransferazy 93

16 lecytyna:cholesterol (LCAT) wymaga natychmiastowego obniżenia temperatury pobranej krwi w celu zahamowania reakcji, gdyż do oznaczenia aktywności enzymu wykorzystywany jest substrat endogenny, występujący w surowicy cholesterol wolny. MOCZ Mocz przeznaczony do badania enzymów powinien być zbierany bez środków konserwujących. Należy go oziębić lub zamrozić. METODY OZNACZANIA AKTYWNOŚCI ENZYMÓW Badając aktywność enzymów oznaczamy ilość zużytego substratu lub wytworzonego produktu podczas inkubacji w ściśle określonych standardowych warunkach. Ilość przereagowanego substratu zależy od ilości enzymu. Dlatego bezwzględnie należy przestrzegać warunków danej metody. Jest to szczególnie ważne w metodach dwupunktowych, gdzie bezpośrednio nie śledzimy reakcji enzymatycznej. METODY STATYCZNE (DWUPUNKTOWE) Metody oparte na porównaniu ilości substratu lub produktu w dwóch punktach czasowych zaliczamy do metod dwupunktowych, czyli metod punktu końcowego. Czas zero, to zmieszanie enzymu z substratem, natomiast po określonym czasie, w zależności od metody, przerywa się reakcję i oznacza stężenie substratu lub produktu. Czas zero jest to tzw. próba kontrolna. W metodach dwupunktowych tak ustala się warunki reakcji, aby zapewnić stałą szybkość reakcji podczas całego czasu trwania inkubacji. Tylko tzw. szybkość początkowa reakcji (reakcja zerowego rzędu), niezależna od stężenia substratu, jest proporcjonalna do ilości enzymu. METODY KINETYCZNE Metody kinetyczne oznaczania aktywności enzymów oparte są na wielokrotnym pomiarze w czasie (co 15, 30 lub 60 sekund) ubytku substratu lub przyrostu produktu. W metodach tych szczególnie dogodne są badania pomiaru zmian absorbcji światła zredukowanej lub utlenionej formy dinukleotydów nikotynamidoadeninowych. Pomiar ten zwany testem optycznym Warburga stosuje się nie tylko do oznaczania aktywności dehydrogenaz, których koenzymem jest NAD + lub NADP +, ale także do oznaczania aktywności enzymów katalizujących reakcje sprzężone z dehydrogenazami, gdzie w końcowym etapie zachodzi redukcja lub utlenianie koenzymów nikotynamidoadeninowych (rys. 8.8). W teście optycznym Warburga wykorzystuje się zmiany właściwości optycznych koenzymu, gdy przechodzi on z formy zredukowanej w utlenioną lub odwrotne. W zredukowanej 94

17 cząsteczce NADH + H + (NADPH + H + ) zanika aromatyczny charakter pierścienia pirymidynowego i zmienia się pochłanianie światła. Powstały układ dihydropirydyny odpowiedzialny jest za pojawienie dodatkowego maksimum absorbcji przy długości fali 340 nm. Szybkość tworzenia się NAD + (NADP + ) można więc mierzyć śledząc zmniejszanie się absorbancji przy 340 nm, natomiast szybkość tworzenia się NADH + H + (NADPH + H + ) mierząc przyrost absorbancji w tym paśmie. Te zmiany absorbancji w jednostce czasu są miarą szybkości reakcji, która w określonych warunkach jest proporcjonalna do aktywności enzymu. Wykorzystywane są również inne reakcje, jeżeli możliwy jest pomiar w trakcie przebiegającej reakcji. Przykładem może być oznaczanie aktywności gamma-glutamylotranspeptydazy (GGTP), gdzie substratem jest gamma-glutamylo-4-nitroanilid. W wyniku reakcji reszta gammaglutamylowa przeniesiona zostaje na akceptor. Z substratu powstaje 4-nitroanilina o żółtym zabarwieniu. Ilość uwolnionej 4-nitroaniliny zależy od aktywności enzymu. 1.0 A B S O R B A N C J A NADH+H + NAD długość fali [nm] Rysunek 8.8. Widma absorbancji NAD + i NADH + H +. NADP + i NADPH + H + mają widma analogiczne. Metody optyczne wykorzystano także w śledzeniu przebiegu procesu redukcji flawoprotein. Flawoproteiny wykazują maksimum absorbcji światła przy długości 450 nm. Po całkowitym 95

18 zredukowaniu absorbcja światła o długości fali 450 nm całkowicie zanika. W ten sposób można mierzyć aktywność dehydrogenaz zawierających jako grupy prostetyczne FAD i FMN. Wyróżnia się następujące odmiany testu optycznego Warburga: prosty, z reakcją wskaźnikową, z reakcją pomocniczą i wskaźnikową. Test optyczny prosty służy do oznaczania aktywności dehydrogenaz zależnych od NAD + lub NADP +. Przykładem jest oznaczanie aktywności dehydrogenazy mleczanowej (LDH) w reakcji utleniania mleczanu przy udziale NAD +. LDH mleczan + NAD + pirogronian + NADH + H + Redukcja NAD + monitorowana jest poprzez pomiar przyrostu absorbancji przy długości fali 340 nm, proporcjonalnej do aktywności enzymu. Test optyczny z reakcją wskaźnikową może być wykorzystywany do oznaczania aktywności aminotransferazy alaninowej (AlAT) i asparaginianowej (AspAT). Test ten obejmuje dodatkowe reakcje wskaźnikowe katalizowane przez odpowiednio: dehydrogenazę mleczanową (LDH) i dehydrogenazę jabłczanową (MDH). L-alanina + -ketoglutaran AlAT pirogronian + L-glutaminian LDH pirogronian + NADH + H + mleczan + NAD + Szybkość obniżania się absorbancji przy długości fali 340 nm spowodowanej utlenianiem NADH w reakcji wskaźnikowej jest proporcjonalna do szybkości powstawania pirogronianu i stąd do aktywności AlAT. L-asparaginian + -ketoglutaran AspAT szczawiooctan + L-glutaminian szczawiooctan + NADH + H + MDH jabłczan + NAD + Szybkość obniżania absorbancji przy 340 nm spowodowanego powstawaniem NAD + w reakcji wskaźnikowej jest proporcjonalna do szybkości tworzenia szczawiooctanu i stąd do aktywności AspAT. 96

19 Test optyczny z reakcją pomocniczą i wskaźnikową może służyć do oznaczania aktywności kinazy kreatynowej (CK). Przykład 1 CK fosfokreatyna + ADP kreatyna + ATP ATP + glukoza heksokinaza ADP + glukozo 6 fosforan dehydrogenaza glukozo 6 fosforanowa glukozo 6 fosforan + NADP + 6 fosfoglukonian + NADPH + H + Przykład 2 CK kreatyna + ATP fosfokreatyna + ADP ADP + fosfoenolopirogronian kinaza pirogronianowa LDH pirogronian + NADH + H + mleczan + NAD + pirogronian + ATP W podanych wyżej przykładach reakcjami pomocniczymi są: reakcja z heksokinazą, reakcja z kinazą pirogronianową. Natomiast do reakcji wskaźnikowych należą : reakcja z dehydrogenazą glukozo-6-fosforanową, reakcja z dehydrogenazą mleczanową. Przyrost absorbancji przy długości fali 340 nm spowodowany powstawaniem NADPH + H + (przykład I) oraz spadek absorbancji przy tej długości fali z powodu utleniania NADH + H + (przykład II) jest proporcjonalny do aktywności kinazy kreatynowej. W każdym z powyższych oznaczeń mieszanina reakcyjna zawiera oprócz nadmiaru substratów wszystkie konieczne enzymy z wyjątkiem oznaczanego, który pochodzi wyłącznie z badanego materiału biologicznego. 97

20 CZĘŚĆ PRAKTYCZNA ĆWICZENIE 1 WPŁYW TEMPERATURY NA AKTYWNOŚĆ ENZYMU ZASADA METODY Amylaza hydrolizuje skrobię do produktu nie dającego reakcji barwnej z jodem. Zmniejszenie natężenia zabarwienia z jodem jest proporcjonalne do aktywności enzymu. MATERIAŁ BADANY Mocz ODCZYNNIKI Buforowany substrat skrobiowy 0,01 M roztwór jodu WYKONANIE Przygotować i opisać 4 probówki. Do każdej dodać 1 ml substratu skrobiowego. Probówki inkubować przez 5 minut w: 1) wodzie z lodem, 2) temperaturze pokojowej, 3) łaźni o temperaturze 37 C, 4) we wrzącej łaźni wodnej (probówkę nakryć folią). Po tym czasie do każdej probówki dodać 0,02 ml moczu, inkubować dokładnie 7 minut i 30 sekund w tej samej temperaturze co poprzednio. Schłodzić. Następnie dodać 1 ml roztworu jodu, 8 ml wody destylowanej i dokładnie wymieszać. Przygotować próbkę kontrolną, która zawiera: 1 ml substratu skrobiowego, 1 ml roztworu jodu i 8 ml wody destylowanej. Pomiaru absorbancji próby badanej A(B) i kontrolnej A(K) dokonać wobec wody destylowanej przy długości fali 660 nm. OBLICZENIE WYNIKÓW ( ) ( ) ( ) gdzie: A(K) - absorbancja próby kontrolnej A(B) - absorbancja próby badanej 98

21 ĆWICZENIE 2 WPŁYW STĘŻENIA ENZYMU NA SZYBKOŚĆ REAKCJI ENZYMATYCZNEJ ZASADA METODY Jak w ćwiczeniu 1. MATERIAŁ BADANY Mocz Mocz zagotowany ODCZYNNIKI Buforowany substrat skrobiowy 0,01 M roztwór jodu WYKONANIE Rozcieńczyć mocz w dodatkowych probówkach: dwukrotnie (np. 100 µl nie zagotowanego µl zagotowanego) i pięciokrotnie (np. 100 µl nie zagotowanego µl zagotowanego). Przygotować 3 probówki (B 1, B 2 i B 3 ), do każdej dodać po 1 ml substratu skrobiowego i wstawić do łaźni wodnej o temperaturze 37 C na okres 5 minut. Po tym czasie do probówek kolejno dodać po 0,02 ml moczu 1/ nie rozcieńczonego, 2/ rozcieńczonego dwukrotnie, 3/ rozcieńczonego pięciokrotnie. Inkubować w temp. 37 C przez 7 minut i 30 sekund. Natychmiast po tym czasie dodać 1 ml roztworu jodu, 8 ml wody destylowanej i dokładnie wymieszać. Przygotować próbkę kontrolną, która zawiera: 1 ml substratu skrobiowego, 1 ml roztworu jodu i 8 ml wody destylowanej. Pomiaru absorbancji próby badanej A(B) i kontrolnej A(K) dokonać wobec wody destylowanej przy długości fali 660 nm. OBLICZENIE WYNIKÓW ( ) ( ) ( ) 99

22 ĆWICZENIE 3 WPŁYW CZASU INKUBACJI NA SZYBKOŚĆ REAKCJI ENZYMATYCZNEJ ZASADA METODY Jak w ćwiczeniu 1. MATERIAŁ BADANY Mocz ODCZYNNIKI Buforowany substrat skrobiowy 0,01 M roztwór jodu WYKONANIE Do 4 opisanych probówek dodać po 1 ml substratu skrobiowego i wstawić do łaźni wodnej o temperaturze 37 C na okres 5 minut. Po tym czasie do wszystkich probówek dodać po 0,02 ml moczu pozostawiając probówki w łaźni. Kolejno do probówek dodać 1 ml roztworu jodu i ochłodzić pod bieżącą wodą dokładnie po 5, 10, 15 i 30 minutach (próby B 1 B 4 ). Następnie dodać 8 ml wody destylowanej i dokładnie wymieszać. Przygotować próbkę kontrolną, która zawiera: 1 ml substratu skrobiowego, 1 ml roztworu jodu i 8 ml wody destylowanej. Pomiaru absorbancji próby badanej A(B) i kontrolnej A(K) dokonać wobec wody destylowanej przy długości fali 660 nm. OBLICZENIE WYNIKÓW Wykreślić krzywą progresji (zależność ilości substratu od czasu reakcji). Wykreślić krzywą zależności szybkości reakcji od czasu reakcji. 100

23 OBLICZENIE WYNIKÓW DO KRZYWEJ PROGRESJI: ( ) ( ) (20 = 0,4 mg skrobi x 50 - w przeliczeniu na 1 ml moczu) Obliczenie szybkości reakcji - dla każdej próby badanej obliczyć ubytek substratu, a następnie szybkość reakcji. ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ĆWICZENIE 4 WYKRYWANIE KATALAZY WE KRWI ZASADA METODY Katalaza (EC ) jest hemoproteiną. Katalizuje reakcję dysproporcjonowania nadtlenku wodoru : Peroksydaza 2 H 2 O 2 2 H 2 O + O 2 Katalaza jest bardzo aktywnym enzymem, w ciągu sekundy cząsteczka katalazy rozkłada około cząsteczek nadtlenku wodoru. Jest aktywna w szerokim zakresie ph (5-10,5). W tkankach ssaków katalaza występuje głównie w wątrobie, erytrocytach i w nerkach, nie występuje w surowicy krwi. MATERIAŁ BADANY Krew ODCZYNNIKI 3% roztwór H 2 O 2 101

24 WYKONANIE Do dwóch probówek odmierzyć po 2 ml wody destylowanej i dodać po kropli krwi. Jedną probówkę wstawić na 5 min. do wrzącej łaźni wodnej, wyjąć i oziębić. Do obydwu probówek dodać po około 10 kropli 3% roztworu H 2 O 2. Zaobserwować zachodzącą reakcję. ĆWICZENIE 5 WYKRYWANIE PEROKSYDAZY ZASADA METODY Peroksydazy to enzymy, które redukują nadtlenek wodoru do wody, utleniając różne związki: substrat zredukowany + H 2 O 2 Peroksydaza substrat utleniony + H 2 O Peroksydazy mogą katalizować utlenianie wielu metabolitów, np. NADH + H +, NADPH+ H +, tryptofanu, cytochromu c, fenoli, glutationu. Peroksydazy powszechne są w tkankach roślinnych i podobnie jak katalaza są hemoproteinami, np. peroksydaza chrzanowa, szeroko wykorzystywana w analityce. Hemoproteinowe peroksydazy występują również w niektórych komórkach zwierzęcych. Najlepiej zbadana jest peroksydaza glutationowa (oksydoreduktaza glutation: nadtlenek wodoru; EC ), która nie jest hemoproteiną. W centrum katalitycznym zawiera selen w Peroksydaza 2 H 2 O 2 2 H 2 O + O 2 postaci selenocysteiny. Peroksydaza ta redukuje nadtlenek wodoru lub nadtlenki organiczne utleniając glutation. W wyniku reakcji powstaje utleniona forma glutationu czyli disulfid glutationu (GSSG). Wraz z peroksydazą glutationową współdziała reduktaza glutationowa (EC ), która odtwarza zredukowy glutation przez utlenianie NADPH. W celu wykazania obecności peroksydazy w materiale biologicznym można wykorzystać benzydynę, która pod wpływem H 2 O 2 w obecności peroksydazy utlenia się do błękitu benzydynowego. -2H H 2 N NH 2 HN NH benzydyna błękit benzydynowy 102

25 MATERIAŁ BADANY Sok z ziemniaka ODCZYNNIKI 3% roztwór H 2 O 2 Nasycony roztwór benzydyny WYKONANIE Do probówki nalać około 1 ml soku z ziemniaka, dodać kilka kropli roztworu benzydyny i kilka kropli 3% roztworu H 2 O 2. Zaobserwować reakcję. ĆWICZENIE 6 REAKCJA PSEUDOPEROKSYDAZOWA HEMOGLOBINY ZASADA METODY Dodatnią próbę benzydynową prócz peroksydazy dają również porfiryny wolne lub związane z białkiem. Aby wykazać obecność krwi próbą benzydynową, należy wykluczyć obecność peroksydazy, inaktywując ją przez denaturację termiczną. MATERIAŁ BADANY Krew ODCZYNNIKI 3% roztwór H 2 O 2 Nasycony roztwór benzydyny WYKONANIE Do dwóch probówek wlać po około 1 ml wody destylowanej, dodać po 1 kropli krwi. Jedną probówkę wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 5 minut. Po ochłodzeniu do obu probówek dodać po kilka kropli roztworu benzydyny i kilka kropli 3% roztworu H 2 O 2. Porównać wyniki reakcji. 103

26 ĆWICZENIE 7 WYKRYWANIE OKSYDAZY KSANTYNOWEJ W MLEKU ZASADA METODY Oksydaza ksantynowa (EC ) odznacza się małą swoistością, katalizuje utlenianie aldehydów alifatycznych i aromatycznych oraz zasad purynowych (łącznie z ksantyną i hipoksantyną) z wytworzeniem kwasu moczowego. Akceptorem wodoru jest tlen cząsteczkowy, który zostaje zredukowany do H 2 O 2 lub łatwo redukujący się barwnik np. błękit metylenowy. Oksydaza ksantynowa jest flawoproteiną, zawiera molibden oraz żelazo. MATERIAŁ BADANY Mleko H 2 C OH OH uwodnioniona forma aldehydu mrówkowego +BM oksydaza ksantynowa HCOOH + BM-H 2 błękit metylenowy kwas mrówkowy zredukowany błękit metylenowy ODCZYNNIKI 0,02% roztwór błękitu metylenowego 0,5% roztwór aldehydu mrówkowego Parafina płynna WYKONANIE Do dwóch probówek odmierzyć po 2,5 ml mleka. Jedną probówkę wstawić na 5 min do wrzącej łaźni wodnej, następnie wyjąć i ochłodzić. Do obu probówek dodać po 0,5 ml błękitu metylenowego i 0,5 ml 0,5% roztworu aldehydu mrówkowego. Dokładnie wymieszać, nawarstwić kilka kropli płynnej parafiny (zabezpieczenie przed działaniem tlenu z powietrza), pozostawić na min i porównać obydwie próby. 104

27 ĆWICZENIE 8 OZNACZANIE AKTYWNOŚCI DEHYDROGENAZY MLECZANOWEJ (LDH) W SUROWICY TEST OPTYCZNY PROSTY ZASADA METODY Procedura oznaczania opiera się na utlenianiu mleczanu do pirogronianu. Reakcji tej towarzyszy redukcja NAD + do NADH monitorowana przez pomiar szybkości przyrostu absorbancji przy długości fali 340 nm, która jest proporcjonalna do aktywności dehydrogenazy mleczanowej w surowicy. LDH mleczan + NAD + pirogronian + NADH + H + MATERIAŁ BADANY Surowica ODCZYNNIKI Odczynnik A - zawierający: L-mleczan, NAD +, bufor o ph 9.0. WYKONANIE 1. Do kuwety odmierzyć 1 ml odczynnika A i ogrzewać do temperatury 37 C przez 5 min. 2. Dodać 100 l surowicy, wymieszać i inkubować w temp 37 C przez 1 min. 3. Dokładnie po minucie odczytać wartość absorbancji przy długości fali 340 nm (A 340 ) w czasie zero (t = 0). Dokonać kolejnych pomiarów absorbancji przy długości fali 340 nm (A 340 ), w odstępach 1-minutowych przez następne 3 min. 4. Obliczyć średnią zmianę absorbancji na minutę (abs/min). 5. abs/min pomnożona przez współczynnik 1768 daje wynik aktywności dehydrogenazy mleczanowej w jednostkach międzynarodowych, tj. IU/l. 105

28 OBLICZENIE WYNIKÓW Sposób wyliczania aktywności LDH: abs / min 1, IU / l abs / min ,22 0,1 gdzie: 1.1 objętość całkowita mieszaniny reakcyjnej (w ml) 1000 przeliczenie IU/ml na IU/l 6.22 współczynnik absorbancji milimolowej NADH 0.1 objętość surowicy (w ml) 1 długość drogi optycznej (1 cm) UWAGI Aktywność LDH powinna być oznaczana w surowicy wolnej od hemolizy. Stabilność LDH w surowicy wynosi 2-3 dni w temperaturze pokojowej. Próbek nie wolno zamrażać ani poddawać działaniu podwyższonej temperatury. ĆWICZENIE 9 OZNACZANIE AKTYWNOŚCI AMINOTRANSFERAZY ALANINOWEJ (ALAT) W SUROWICY TEST OPTYCZNY Z REAKCJĄ WSKAŹNIKOWĄ ZASADA METODY Aminotransferaza alaninowa (AlAT) katalizuje reakcję przeniesienia grupy -aminowej z L- alaniny na -ketoglutaran. Produktami tej reakcji są pirogronian i L-glutaminian. Następnie, w wyniku reakcji enzymatycznej katalizowanej przez dehydrogenazę mleczanową (LDH), następuje redukcja pirogronianu do mleczanu z jednoczesnym utlenieniem NADH do NAD +. Spadek absorbancji przy długości fali 340 nm, towarzyszący utlenieniu NADH, jest proporcjonalny do aktywności aminotransferazy alaninowej w surowicy. L-alanina + -ketoglutaran AlAT LDH pirogronian + L-glutaminian pirogronian + NADH + H + mleczan + NAD + MATERIAŁ BADANY Surowica 106

29 ODCZYNNIKI Odczynnik B - zawierający: L-alaninę, -ketoglutaran, NADH, LDH, bufor o ph 7.5. WYKONANIE 1. Do kuwety odmierzyć 1 ml odczynnika B i ogrzewać przez 5 min. w temp. 37 C. 2. Dodać 50 l surowicy, wymieszać i inkubować w temp 37 C przez 1 min. 3. Dokładnie po minucie odczytać wartość absorbancji przy długości fali 340 nm (A 340 ) w czasie zero (t = 0). Dokonać kolejnych pomiarów absorbancji przy długości fali 340 nm (A 340 ) w odstępach 1-minutowych przez następne 3 min. 4. Obliczyć średnią zmianę absorbancji na minutę ( abs/min). 5. abs/min pomnożona przez współczynnik 3376, daje wynik aktywności AlAT w jednostkach międzynarodowych tj. IU/l. OBLICZENIE WYNIKÓW Sposób wyliczania aktywności AlAT: abs / min 1, IU / l abs / min ,22 0,05 gdzie: 1.05 objętość całkowita mieszaniny reakcyjnej (w ml) 1000 przeliczenie IU/ml na IU/l 6.22 współczynnik absorbancji milimolowej NADH 0.05 objętość surowicy (w ml) 1 długość drogi optycznej (1 cm) ĆWICZENIE 10 OZNACZANIE AKTYWNOŚCI KINAZY KREATYNOWEJ (CK) W SUROWICY TEST OPTYCZNY Z REAKCJĄ POMOCNICZĄ I WSKAŹNIKOWĄ ZASADA METODY Kinaza kreatynowa przenosi grupę fosforanową z fosforanu kreatyny na ADP. W reakcji tej powstaje cząsteczka ATP. Pod wpływem heksokinazy (HK) ATP fosforyluje glukozę do glukozo-6-fosforanu. Następnie glukozo-6-fosforan ulega odwodorowaniu w reakcji, którą katalizuje dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa (G6P-DH). Produktami tej reakcji są 6-fosfoglukonian i NADPH. 107

30 CK fosfokreatyna + ADP kreatyna + ATP ATP + glukoza heksokinaza ADP + glukozo 6 fosforan dehydrogenaza glukozo 6 fosforanowa glukozo 6 fosforan + NADP + 6 fosfoglukonian + NADPH + H + MATERIAŁ BADANY Surowica ODCZYNNIKI Odczynnik C - zawierający: fosforan kreatyny, glukozę, ADP, NADP, heksokinazę, G6P-DH, bufor o ph 6.7. WYKONANIE 1. Do kuwety odmierzyć 1 ml odczynnika C. 2. Dodać 50 l surowicy, wymieszać i inkubować w temp. 37 C przez 1 min. 3. Dokładnie po minucie odczytać wartość absorbancji przy długości fali 340 nm (A 340 ) w czasie zero (t = 0). Dokonać kolejnych pomiarów absorbancji w odstępach 1- minutowych przez następne 3 min. 4. Obliczyć średnią zmianę absorbancji na minutę (abs/min). 5. abs/min pomnożona przez współczynnik 3376 daje wynik aktywności CK w jednostkach międzynarodowych, tj. IU/l. OBLICZENIA WYNIKÓW Sposób wyliczania aktywności CK: abs / min 1, IU / l abs / min ,22 0,05 gdzie: 1.05 objętość całkowita mieszaniny reakcyjnej (w ml) 1000 przeliczenie IU/ml na IU/l 6.22 współczynnik absorbancji milimolowej NADPH 0.05 objętość surowicy (w ml) 1 długość drogi optycznej (1 cm) 108