(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/EP02/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/EP02/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO02/97072 (13) B1 (51) Int.Cl. C12N 7/04 ( ) A61K 39/145 ( ) A61P 31/12 ( ) Opis patentowy przedrukowano ze względu na zauważone błędy (54) Preparat inaktywowanego wirusa grypy, szczepionka przeciw grypie, sposób wytwarzania stabilnego antygenu hemaglutyniny, zastosowanie preparatu wirusa grypy i zastosowanie bursztynianu α-tokoferolu (30) Pierwszeństwo: , GB, , GB, (73) Uprawniony z patentu: SAECHSISCHES SERUMWERK DRESDEN BRANCH OF SMITHKLINE BEECHAM PHARMA GMBH & CO.KG, Dresden, DE (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 03/05 (72) Twórca(y) wynalazku: UWE EICHHORN, Dresden, DE (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 08/10 (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Agnieszka Marszałek PL B1

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku są preparat inaktywowanego wirusa grypy, szczepionka przeciw grypie, sposób wytwarzania stabilnego antygenu hemaglutyniny, zastosowanie preparatu wirusa grypy i zastosowanie bursztynianu α-tokoferolu. W szczególności wynalazek dotyczy szczepionek zawierających inaktywowanego wirusa grypy, które są szczepionkami zawierającymi raczej fragmenty niż całego wirusa grypy i które są stabilne przy braku substancji konserwujących będących organicznymi związkami rtęci. Dodatkowo szczepionki te zawierają hemaglutyninę, która według znanych testów jest stabilna. Szczepionki te mogą być podawane dowolną drogą odpowiednią do podawania takich szczepionek, taką jak domięśniowa, podskórna, śródskórna lub śluzówkowa, np. donosowa. Wirus grypy jest jednym z najbardziej rozpowszechnionych wirusów na świecie, atakujący zarówno ludzi, jak i żywy inwentarz. Grypa w istotny sposób wpływa na gospodarkę. Wirus grypy jest wirusem RNA mającym otoczkę; średnica jego cząstki wynosi około 125 nm. Składa się głównie z wewnętrznego nukleokapsydu lub rdzenia zbudowanego z kwasu rybonukleinowego (RNA) związanego z nukleoproteiną, otoczonego otoczką wirusową zbudowaną z dwuwarstwowej błony lipidowej i zewnętrznych glikoprotein. Warstwa wewnętrzna otoczki wirusowej jest zbudowana przeważnie z białek macierzy, a warstwa zewnętrzna głównie z pochodzącego od gospodarza materiału lipidowego. Glikoproteiny powierzchniowe: neuraminidaza (NA) i hemaglutynina (HA) wyglądają jak kolce, o długości nm, na powierzchni cząsteczki. Te białka powierzchniowe, a w szczególności hemaglutynina, określają swoistość antygenową podtypów wirusa grypy. Obecnie dostępne szczepionki zawierają albo inaktywowanego albo żywego atenuowanego wirusa grypy. Inaktywowane szczepionki przeciw grypie zawierają jedną z trzech możliwych postaci preparatu antygenu: całego inaktywowanego wirusa, sub-wiriony, w których oczyszczone cząstki wirusa są fragmentowane za pomocą detergentów lub innych reagentów rozpuszczających osłonkę lipidową (tak zwane szczepionki rozszczepione") albo oczyszczoną HA i NA (szczepionki podjednostkowe). Takie inaktywowane szczepionki podawane są domięśniowo (i.m.) lub donosowo (i.n.). Żywe atenuowane szczepionki nie są dostępne w sprzedaży. Wszystkie rodzaje szczepionek przeciw grypie są zwykle szczepionkami trójwalentnymi. Przeważnie zawierają antygeny pochodzące z dwóch szczepów wirusa grypy A i jednego szczepu wirusa grypy B. W większości przypadków typowa 0,5 ml dawka do wstrzyknięcia zawiera 15 μg antygenu hemaglutyniny z każdego szczepu, na podstawie pomiarów metodą pojedynczej immunodyfuzji promieniowej (single radial immunodiffusion, SRD) (J.M. Wood i wsp.: An improved single radial immunodiffusion technique for the assay of influenza haemagglutinin antigen: adaptation for potency determination of inactivated whole virus and subunit vaccines. J. Biol. Stand. 5 (1977) ; J.M. Wood i wsp., International collaborative study of single radial diffusion and immunoelectrophoresis techniques for the assay of haemagglutinin antigen of influenza virus. J. Biol. Stand. 9 (1981) ). Światowa Organizacja Zdrowia we współpracy z krajowymi władzami ds. zdrowia i producentami szczepionek decyduje, które szczepy wirusa grypy zostaną włączone do szczepionki w każdym sezonie. Typowe epidemie grypy powodują wzrost zapadalności na zapalenie płuc i choroby dolnych dróg oddechowych, co objawia się wzrostem wskaźnika hospitalizacji i umieralności. U osób starszych oraz chorujących na choroby przewlekłe częściej obserwuje się takie powikłania. Małe dzieci również mogą przechodzić ciężką postać grypy. Z tego powodu te grupy w szczególności potrzebują ochrony. Obecne wysiłki mające na celu kontrolowanie zapadalności na grypę i umieralności, związanych z corocznymi epidemiami grypy, opierają się na domięśniowym podawaniu szczepionek zawierających inaktywowanego wirusa grypy. Skuteczność takich szczepionek w zapobieganiu chorobom układu oddechowego i powikłaniom grypy waha się od 75% u zdrowych dorosłych do poniżej 50% u osób starszych. Dla pomiaru skuteczności szczepionek przeciw grypie stosuje się międzynarodowe normy. Oficjalne kryteria Unii Europejskiej dotyczące skuteczności szczepionki przeciw grypie przedstawiono w tabeli poniżej. Teoretycznie, aby spełniać wymagania Unii Europejskiej, szczepionka przeciw grypie musi spełnić tylko jedno z kryteriów podanych w tabeli, dla wszystkich szczepów wirusa grypy zawartych w szczepionce. Jednakże w praktyce konieczne jest spełnienie co najmniej dwóch a nawet wszystkich trzech kryteriów przez wszystkie szczepy, szczególnie w przypadku nowych szczepionek, takich jak nowe szczepionki do podawania inną drogą. W pewnych przypadkach spełnienie dwóch

3 PL B1 3 kryteriów może być wystarczające. Przykładowo, mogłaby być zaakceptowana sytuacja, gdzie dwa kryteria będą spełnione przez wszystkie szczepy, podczas gdy trzecie kryterium będzie spełnione przez niektóre, ale nie przez wszystkie szczepy (np. dwa z trzech szczepów). Inne są wymagania dla populacji osób dorosłych (18-60 lat) i dla populacji osób starszych (> 60 lat) lat > 60 lat Odsetek serokonwersji* >40% >30% Wskaźnik konwersji** >2,5 >2,0 Odsetek ochrony*** >70% >60% * Odsetek serokonwersji jest definiowany jako odsetek osób zaszczepionych, u których po zaszczepieniu miano hamowania osoczowej hemaglutyniny (HI) dla każdego szczepu szczepionki wzrosło co najmniej 4-krotnie. ** Wskaźnik konwersji jest definiowany jako krotność wzrostu w osoczu średniej geometrycznej miana (GMT) HI po szczepieniu dla każdego szczepu szczepionki. ***Odsetek ochrony jest definiowany jako odsetek osób zaszczepionych, u których miano osoczowej HI jest równe lub większe od 1:40 po szczepieniu (dla każdego szczepu szczepionki) i normalnie jest uważany za wskaźnik ochrony. Aby nowa szczepionka przeciw grypie mogła zostać uznana za przydatną do sprzedaży, musi nie tylko spełniać powyższe normy, ale również musi być w praktyce co najmniej tak skuteczna jak obecnie dostępne szczepionki podawane drogą iniekcji. Musi również być ekonomicznie konkurencyjna pod względem wymaganej ilości antygenu i ilości podań. W sprzedaży dostępne są obecnie rozszczepione lub podjednostkowe szczepionki przeciw grypie do podawania drogą iniekcji. Szczepionki te wytwarza się poprzez fragmentację cząstki wirusa, głównie przy użyciu rozpuszczalnika organicznego lub detergentu, oraz rozdzielanie lub oczyszczanie białek wirusowych w różnym stopniu. Szczepionki rozszczepione wytwarza się poprzez fragmentację całego wirusa grypy, zakaźnego albo inaktywowanego, przy użyciu rozpuszczającego stężenia rozpuszczalników organicznych lub detergentów, a następnie usunięciu środka solubilizującego i części lub większości materiału lipidowego wirusa. Szczepionki rozszczepione przeważnie zawierają zanieczyszczenia w postaci białek macierzy i nukleoprotein oraz czasami lipidów, jak również białek błony osłonki. Szczepionki rozszczepione będą zwykle zawierały większość lub całość białek strukturalnych wirusa, jednakże nie koniecznie w takich samych proporcjach, w jakich występują one w całym wirusie. Z drugiej strony szczepionki podjednostkowe zawierają zasadniczo wysoko oczyszczone białka powierzchniowe wirusa, hemaglutyninę i neuraminidazę, będące białkami powierzchniowymi odpowiedzialnymi za pobudzanie produkcji pożądanych przeciwciał neutralizujących wirusa pod wpływem szczepienia. Wiele dostępnych obecnie szczepionek wymaga dodatku środków konserwujących, aby zapobiec psuciu się szczepionek. Często stosowanym środkiem konserwującym jest tiomersal, który jest związkiem zawierającym rtęć. Wyrażane są pewne obawy opinii publicznej dotyczące działania związków zawierających rtęć. Nie istnieje system kontrolny, który miałby na celu wykrywanie wpływu niskich do średnich dawek organicznych związków rtęci na rozwój układu nerwowego, a specjalne badania dzieci, które otrzymały wysokie dawki organicznych związków rtęci, zostaną zakończone za kilka lat. Niektórzy komentatorzy podkreślają, że nie należy wyolbrzymiać potencjalnych niebezpieczeństw związanych ze stosowaniem szczepionek zawierających tiomersal (Offit; P.A. JAMA tom 283; nr: 16). Jednakże znalezienie alternatywnych sposobów wytwarzania szczepionek, z zastępowaniem stosowania tiomersalu w procesie produkcji, byłoby niewątpliwie korzystne. Zatem istnieje zapotrzebowanie na opracowanie szczepionek, nie zawierających tiomersalu, w szczególności szczepionek takich jak szczepionki przeciw grypie, których stosowanie jest zalecane co roku, przynajmniej dla pewnych populacji pacjentów. Dotychczas typową praktyką było stosowanie środków konserwujących podczas procesu wytwarzania/oczyszczania i/lub w ostatecznej szczepionce w dostępnych w sprzedaży inaktywowanych szczepionkach przeciw grypie. Środek konserwujący jest wymagany dla zabezpieczenia szczepionki przed rozwojem mikroorganizmów w czasie różnych etapów oczyszczania. W przypadku szczepionek przeciw grypie opartych na jajach kurzych, tiomersal zazwyczaj dodaje się do surowego płynu omoczniowego, przy czym można go dodać drugi raz podczas obróbki wirusa. Zatem na koniec procesu będą obecne resztkowe ilości tiomersalu, które można dodatkowo zwiększyć do żądanego stężenia środka konserwującego w ostatecznej szczepionce, np. do stężenia około 100 μg/ml.

4 4 PL B1 Skutkiem ubocznym stosowania tiomersalu jako środka konserwującego w szczepionkach przeciw grypie jest działanie stabilizujące. Tiomersal występujący w dostępnych w sprzedaży szczepionkach przeciw grypie stabilizuje składnik HA szczepionki, w szczególności, ale nie wyłącznie, HA szczepu B wirusa grypy. Niektóre hemaglutyniny szczepu A np. H3 mogą również wymagać stabilizacji. Z tego względu, mimo iż pożądane może być rozważenie usunięcia tiomersalu ze szczepionek przeciw grypie, albo co najmniej zmniejszenia stężenia tiomersalu w ostatecznej szczepionce, istnieje problem do pokonania, gdyż bez tiomersalu HA nie będzie wystarczająco stabilna. W niniejszym wynalazku odkryto, że istnieje możliwość stabilizacji HA w inaktywowanych preparatach wirusa grypy przy użyciu alternatywnych odczynników nie zawierających organicznych związków rtęci. HA pozostaje stabilna, co oznacza, że jest wykrywana po pewnym czasie znanymi metodami ilościowymi, w szczególności SRD, w większym stopniu niż niestabilizowany preparat antygenu wytwarzany przy użyciu takiej samej metody, ale bez zastosowania stabilizującej substancji pomocniczej. Sposób SRD prowadzi się jak opisano powyżej. Co istotne, HA pozostaje trwała przez okres do 12 miesięcy co jest ogólnie obowiązującym wymaganiem stawianym ostatecznej szczepionce przeciw grypie. Zatem wynalazek dotyczy preparatu inaktywowanego wirusa grypy, zawierającego antygen hemaglutyniny stabilizowany bez użycia tiomersalu lub przy niskich poziomach tiomersalu, przy czym hemaglutynina jest wykrywana w próbie SRD, który charakteryzuje się tym, że zawiera bursztynian α-tokoferolu w ilości wystarczającej do stabilizacji hemaglutyniny. Korzystnie preparat inaktywowanego wirusa grypy według wynalazku zawiera bursztynian α-tokoferolu w stężeniu 1 μg/ml - 10 mg/ml, korzystniej w stężeniu μg/ml. Ponadto korzystnie w odniesieniu do preparatu inaktywowanego wirusa grypy według wynalazku preparat antygenu wirusa grypy jest wybrany z grupy obejmującej preparaty antygenu rozszczepionego wirusa, antygenów podjednostkowych oraz całego wirusa inaktywowanego chemicznie albo inaktywowanego promieniowaniem ultrafioletowym lub cieplnie, korzystniej preparat antygenu grypy stanowi preparat antygenu rozszczepionego i wirusa. Ponadto korzystnie preparat inaktywowanego wirusa grypy według wynalazku zawiera hemaglutyninę zarówno szczepu A, jak i B. Korzystniej preparat inaktywowanego wirusa grypy według wynalazku stanowi trójwalentny preparat wirusa grypy. Ponadto korzystnie preparat inaktywowanego wirusa grypy według wynalazku zawiera stabilizowaną hemaglutyninę szczepu grypy B. Ponadto wynalazek dotyczy szczepionki przeciw grypie, która charakteryzuje się tym, że zawiera preparat wirusa grypy zdefiniowany powyżej. Korzystnie w szczepionce przeciw grypie według wynalazku stężenie antygenu hemaglutyniny dla każdego ze szczepów grypy wynosi μg/ml, oznaczone w próbie SRD. Korzystnie szczepionka przeciw grypie według wynalazku dodatkowo zawiera adiuwant. Ponadto wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania stabilnego antygenu hemaglutyniny, który charakteryzuje się tym, że oczyszcza się antygen w obecności α-tokoferolu lub jego pochodnej, takiej jak bursztynian α-tokoferolu. Ponadto wynalazek dotyczy zastosowania preparatu inaktywowanego wirusa grypy do wytwarzania szczepionki, zdefiniowanej powyżej, do profilaktyki zakażenia lub zachorowania na grypę u osobnika. Korzystnie w odniesieniu do powyższego zastosowania szczepionkę podaje się drogą śródskórna, donosową, domięśniową, doustną lub podskórną. Ponadto wynalazek dotyczy zastosowania bursztynianu α-tokoferolu jako stabilizatora hemaglutyniny do wytwarzania szczepionki przeciw grypie. Niskie poziomy tiomersalu stanowią takie poziomy, przy których stabilność HA pochodzącej z wirusa grypy B jest zmniejszona i w celu stabilizacji HA wymagane jest zastosowanie stabilizującej substancji pomocniczej. Niskie poziomy tiomersalu wynoszą zwykle 5 μg/ml lub mniej. Ogólnie, stabilizowana HA odnosi się do HA, która jest wykrywalna po pewnym czasie znanymi metodami ilościowymi, w szczególności SRD, w większym stopniu niż niestabilizowany preparat antygenu wytwarzany przy użyciu takiej samej metody, ale bez zastosowania stabilizującej substancji pomocniczej. Stabilizacja HA korzystnie pozwala na zachowanie aktywności HA na zasadniczo stałym poziomie przez okres jednego roku. Korzystnie, stabilizacja pozwala szczepionce zawierającej HA na

5 PL B1 5 zapewnienie akceptowalnej ochrony po 6 miesięcznym okresie przechowywania, korzystniej po okresie 1 roku. Odpowiednio, stabilizacja przeprowadzana jest z użyciem stabilizującej substancji pomocniczej, korzystnie substancji pomocniczej modyfikującej micele. Substancję pomocniczą modyfikującą micele ogólnie stanowi substancja pomocnicza, którą można wprowadzić do miceli utworzonych przez detergenty stosowane lub odpowiednie do solubilizacji błonowego białka HA, takie jak stosowane indywidualnie, bądź w połączeniu detergenty Tween 80, Triton X100 i dezoksycholan. Nie chcąc być ograniczonym przez teorię, uważa się, że substancje pomocnicze stabilizują HA poprzez interakcję z lipidami, detergentami i/lub białkami w ostatecznym preparacie. Mogą powstawać mieszane micele substancji pomocniczej z białkami i lipidami, takie jak micele Tween i dezoksycholanu z resztkami lipidów i/lub Triton X100. Uważa się, że białka powierzchniowe są utrzymywane w stanie solubilizowanym przez te złożone micele. Korzystnie, agregacja białek jest ograniczana poprzez odpychanie się ładunków miceli zawierających odpowiednie substancje pomocnicze, takich jak micele zawierające ujemnie naładowane detergenty. Przykładowymi odpowiednimi substancjami pomocniczymi modyfikującymi micele są: dodatnio, ujemnie lub dwubiegunowo naładowane amfifilowe cząsteczki, takie jak alkilosiarczany lub alkiloarylosiarczany; niejonowe cząsteczki amfifilowe, takie jak alkilopoliglikozydy lub ich pochodne, takie jak Plantacare (dostępne z Henkel KGaA) lub polialkilenowe etery alkoholi alkilowych lub ich pochodne, takie jak Laureth-9. Do korzystnych substancji pomocniczych należy α-tokoferol lub pochodne α-tokoferolu, takie jak bursztynian α-tokoferolu. Innymi przykładowymi pochodnymi tokoferolu są D-α tokoferol, D-δ tokoferol, D-γ tokoferol i DL-α tokoferol. Do odpowiednich pochodnych tokoferolu, które można zastosować, należą octany, bursztyniany, estry kwasu fosforowego, mrówczany, propioniany, maślany, siarczany i glukoniany. Bursztynian α-tokoferolu jest stosowany w niniejszym wynalazku. α-tokoferol lub jego pochodna są obecne w ilości wystarczającej do stabilizacji hemaglutyniny. Inne odpowiednie substancje pomocnicze można zidentyfikować znanymi metodami i zbadać je, np. w próbie SRD oznaczania stabilności, jak to tutaj opisano. W korzystnym aspekcie wynalazek dostarcza preparat antygenu wirusa grypy zawierający co najmniej jeden trwały antygen hemaglutyniny szczepu B wirusa grypy. Szczepionki stanowiące preparaty antygenu tutaj opisane znajdują zastosowanie w sposobie profilaktyki zakażenia lub zachorowania na grypę u osobnika, który to sposób polega na podawaniu temu osobnikowi szczepionki według wynalazku. Szczepionkę można podawać jakąkolwiek odpowiednią drogą, to znaczy śródskórnie, dośluzówkowo np. donosowo, doustnie, domięśniowo lub podskórnie. Inne drogi podawania są dobrze znane. Korzystne jest podawanie śródskórne. Jakikolwiek odpowiedni przyrząd może być używany do podawania śródskórnego, np. przyrząd z krótką igłą, taki jak te opisane w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki: US , US , US , US , US , US , US , US Szczepionki można również podawać śródskórnie przy użyciu przyrządów, które ograniczają zasięg skutecznej penetracji igły wewnątrz skóry, takich jak te opisane w WO 99/34850 i EP , oraz ich odpowiedników równoważnych pod względem działania. Przyrządy typu strzykawka bezigłowa ( jet injector") są również przydatne. Dostarczają one płynne szczepionki do skóry właściwej z użyciem strzykawki bezigłowej podającej płyn lub za pomocą igły, która penetruje przez warstwę rogową i wytwarza strumień, który dostaje się do skóry właściwej. Strzykawki bezigłowe opisane są np. w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki: US , US , US , US , US , US , US , US , US , US 5,466,220, US , US , US , US , US , US , US , US , US , WO 97/37705 i WO 97/ Przydatne są również balistyczne przyrządy do dostarczania proszków/cząstek, w których używa się sprężonego gazu do przyspieszenia przedostawania się szczepionki w postaci proszku przez zewnętrzne warstwy skóry do skóry właściwej. Dodatkowo, można stosować zwykłe strzykawki do klasycznego podawania śródskórnego metodą mantoux. Jednakże, zastosowanie zwykłe strzykawek wymaga wysoko wykwalifikowanego personelu, dlatego korzystne są przyrządy, które umożliwiają dokładne podanie leku nie tylko przez wysoko wykwalifikowany personel.

6 6 PL B1 Wynalazek znajduje zastosowanie w sposobie profilaktyki zakażenia lub zachorowania na grypę u osobnika, zgodnie z którym temu osobnikowi podaje się śródskórnie szczepionkę przeciw grypie według wynalazku. Wynalazek również obejmuje przyrządy do podawania śródskórnego w połączeniu ze szczepionką według wynalazku, w szczególności np. przyrządy ujawnione w WO 99/34850 lub EP Wynalazek ma zastosowanie w szczególności, lecz nie wyłącznie, do stabilizacji hemaglutyniny szczepu B wirusa grypy. Korzystnie stabilizowana HA według wynalazku zachowuje trwałość przez okres 6 miesięcy, korzystniej przez okres 12 miesięcy. α-tokoferol jest w postaci bursztynianu. Korzystne stężenie α-tokoferolu lub pochodnej wynosi 1 μg/ml - 10 mg/ml, korzystniej μg/ml. Szczepionka według wynalazku ogólnie zawiera antygeny zarówno szczepu A, jak i B wirusa grypy, typowo w trójwalentnej kompozycji dwóch szczepów A i jednego szczepu B. Jednakże, dwuwalentne i monowalentne szczepionki nie są wykluczone. Monowalentne szczepionki mogą być korzystne np. w przypadku pandemii, gdzie ważne jest wyprodukowanie i podanie szczepionki tak szybko jak to tylko możliwe. Nieżywotne preparaty antygenu grypy nadające się do zastosowania w wynalazku można wybrać z grupy obejmującej preparaty antygenów rozszczepionego wirusa, antygenów podjednostkowych (zarówno wyrażanych rekombinacyjnie, jak i otrzymanych z całej cząstki wirusa), inaktywowanego całego wirusa, który może być inaktywowany chemicznie przy użyciu np. formaldehydu, β-propiolaktonu lub inaktywowane w inny sposób, np. promieniowaniem ultrafioletowym lub cieplnie. Korzystnie preparat antygenu jest preparatem rozszczepionego wirusa lub podjednostkowym preparatem otrzymywanym z całego wirusa, zwłaszcza przez rozszczepianie, a następnie oczyszczanie antygenu powierzchniowego. Najkorzystniejsze są preparaty rozszczepionego wirusa. Korzystnie stężenie antygenu hemaglutyniny dla preparatu każdego szczepu wirusa grypy, oznaczane w próbie SRD, wynosi μg/ml, korzystniej μg/ml, a najkorzystniej około 30 μg/ml. Szczepionka według wynalazku może dodatkowo zawierać adiuwant lub immunostymulator, taki jak, ale nie wyłącznie, pozbawiony toksyczności lipid A pochodzący z jakiegokolwiek źródła lub nietoksyczne pochodne lipidu A, saponiny i inne odczynniki zdolne do pobudzenia odpowiedzi typu TH1. Od dawna było wiadomo, że enterobakteryjny lipopolisacharyd (LPS) jest silnym stymulatorem układu odpornościowego, chociaż jego zastosowanie jako adiuwantów jest ograniczone przez jego działanie toksyczne. Nietoksyczna pochodna LPS, monofosforylolipid A (MPL) otrzymany przez usunięcie grupy węglowodanowej rdzenia i fosforanu z redukującego końca glukozaminy, została opisana przez Ribi i wsp (1986, Immunology and Immunopharmacology of bacterial endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY, str ), i ma następujący wzór:

7 PL B1 7 Kolejna pozbawiona toksyczności odmiana MPL otrzymywana jest poprzez usunięcie łańcucha acylowego z pozycji 3 szkieletu disacharydowego, i jest określana jako 3-O-deacylowany monofosforylolipid A (3D-MPL). Można go oczyścić i wytwarzać sposobami opisanymi w GB B, który dotyczy także wytwarzania difosforylolipidu A i jego 3-O-deacylowanych odmian. Korzystną postacią 3D-MPL jest postać emulsji zawierającej małe cząstki, o średnicy mniejszej niż 0,2 μm. Sposób jej wytwarzania jest ujawniony w WO 94/ Wodne preparaty zawierające monofosforylolipid A i środek powierzchniowo czynny opisano w WO A2. Adiuwanty, będące pochodnymi bakteryjnego lipopolisacharydu, do formułowania w środkach według wynalazku mogą stanowić adiuwanty oczyszczone i przetworzone ze źródeł bakteryjnych lub alternatywnie adiuwanty mogą być syntetyczne. Przykładowo, oczyszczony monofosforylolipid A został opisany przez Ribi i wsp (patrz wyżej), 3-O-deacylowany monofosforylo- lub difosforylolipid A otrzymywany z Salmonella sp. opisano w GB i US Opisano również inne oczyszczone i syntetyczne lipopolisacharydy (Hilgers i in., 1986, Int. Arch. Allergy. Immunol., 79 (4): 392-6; Hilgers i in., 1987, Immunology, 60(1):141-6 oraz EP B1). Szczególnie korzystnym bakteryjnym lipopolisacharydowym adiuwantem jest 3D-MPL. W związku z tym pochodne LPS, które mogą być stosowane zgodnie z wynalazkiem, stanowią te immunostymulatory, które mają podobną budowę do LPS, MPL lub 3D-MPL. W kolejnym aspekcie wynalazku pochodne LPS mogą być acylowanymi monosacharydami, które stanowią część opisanej powyżej struktury MPL. Saponiny opisano w: Lacaille-Dubois M. i Wagner H. (1996. A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine tom 2 str ). Saponiny są steroidowymi lub triterpenowymi glikozydami, szeroko rozpowszechnionymi w świecie roślin i zwierząt morskich. Saponiny są znane z tworzenia roztworów koloidalnych w wodzie, które tworzą pianę podczas wstrząsania, oraz z wytrącania cholesterolu. Kiedy saponiny znajdą się blisko błony komórkowej, tworzą w niej struktury budową zbliżone do porów, które powodują rozerwanie błony komórkowej. Przykładem tego zjawiska jest hemoliza erytrocytów, co jest właściwością niektórych, ale nie wszystkich, saponin. Saponiny są stosowane jako adiuwanty w szczepionkach przeznaczonych do podawania układowego. Aktywność adiuwantowa i aktywność hemolityczna poszczególnych saponin została szeroko zbadana w literaturze fachowej (Lacaille-Dubios i Wagner, patrz wyżej). Przykładowo, Quil A (pochodzący z kory południowoamerykańskiego drzewa Quillaja Saponaria Molina) i jego frakcje są opisane w US i w Saponins as vaccine adjuvants", Kensil C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2):1-55; oraz w EP B1. Struktury w postaci cząstek, określane jako Kompleksy Immunostymulujące (ISCOMS), zawierające frakcje Quil A, mają działanie hemolityczne i zostały zastosowane w wytwarzaniu szczepionek (Morein B., EP B1; WO 96/11711; WO 96/33739). Hemolityczne saponiny QS21 i QS17 (oczyszczone metodą HPLC frakcje Quil A) opisano jako silne adiuwanty układowe, a sposób ich wytwarzania ujawniono w opisie patentowym US nr i EP B1. Do innych saponin, które zastosowano w badaniach nad szczepionkami do podawania układowego, należą saponiny pochodzące z innych gatunków roślin, jak Gypsophilia i Saponaria (Bomford i wsp., Vaccine, 10 (9): , 1992). Układ wzmacniający zawiera połączenie pochodnej nietoksycznego lipidu A i pochodnej saponin, zwłaszcza połączenie QS21 i 3D-MPL, co zostało ujawnione w WO 94/00153, lub mniej reaktogenne połączenie, w którym QS21 jest przytłumiony przez cholesterol, co ujawniono w WO 96/ Szczególnie silną kompozycję adiuwantową stanowi preparat zawierający QS21 i 3D-MPL w emulsji typu olej w wodzie, opisanej w WO 95/17210 i jest kompozycją korzystną. Zatem w jednej postaci, wynalazek dostarcza szczepionkę zawierającą preparat antygenu grypy według wynalazku z adiuwantem, którym jest pozbawiony toksyczności lipid A lub nietoksyczna pochodna lipidu A, korzystniej z adiuwantem, który stanowi monofosforylolipid A lub jego pochodna. Korzystnie szczepionka dodatkowo zawiera saponinę, korzystniej QS21. Korzystnie kompozycja dodatkowo zawiera emulsję typu olej w wodzie. Kompozycję szczepionkową wytwarza się sposobem polegającym na zmieszaniu preparatu antygenu według wynalazku z farmaceutycznie dopuszczalną substancją pomocniczą, taką jak 3D-MPL. Szczepionki według wynalazku mogą ponadto zawierać co najmniej jeden środek powierzchniowo czynny, którym może być zwłaszcza niejonowy środek powierzchniowo czynny. Odpowiedni niejonowy środek powierzchniowo czynny jest wybrany z grupy obejmującej oktylo- lub nonylofenoksypolioksyetanole (np. dostępna w handlu seria Triton ), estry polioksyetylenosorbitanu (serie Tween ) oraz etery lub estry polioksyetylenowe o ogólnym wzorze (I):

8 8 PL B1 (I) HO(CH 2 CH 2 O) n -A-R gdzie n oznacza 1-50, A oznacza wiązanie lub -C(O)-, R oznacza C 1-50 alkil lub fenylo-c alkil; albo połączenia dwóch lub większej liczby powyższych środków. Korzystnymi środkami powierzchniowo czynnymi o wzorze (I) są cząsteczki, w których n oznacza 4-24, korzystniej 6-12, a najkorzystniej 9; składnik R stanowi C 1-50, korzystniej C 4 -C 20 alkil, a najkorzystniej C 12 alkil. Oktylofenoksypolioksyetanole i estry polioksyetylenosorbitanu opisano w Surfactant systems", red.: Attwood and Florence (1983, Chapman and Hall). Oktylofenoksypolioksyetanole (oktoksynole), w tym t-oktylofenoksypolietoksyetanol (Triton X-100 ) są również opisane w Merck Index, pozycja 6858 (strona 1162, wydanie 12, Merck & Co. Inc., Whitehouse Station, N.J., USA; ISBN ). Estry polioksyetylenosorbitanu, w tym monooleinian polioksyetylenosorbitanu (Tween 80 ) opisano w Merck Index, pozycja 7742 (str. 1308, wydanie 12, Merck & Co. Inc., Whitehouse Station, N.J., USA; ISBN ). Obydwa związki można wytworzyć opisanym tam sposobem, lub nabyć z handlowych źródeł, takich jak Sigma Inc. Do szczególnie korzystnych niejonowych środków powierzchniowo czynnych należą Triton X-45, t-oktylofenoksypolietoksyetanol (Triton X-100), Triton X-102, Triton X-114, Triton X-165, Triton X-205, Triton X-305, Triton N-57, Triton N-101, Triton N-128, Breij 35, eter polioksyetyleno-9-laurylowy (laureth 9) i eter polioksyetyleno-9-stearylowy (steareth 9). Szczególnie korzystne są Triton X-100 i laureth 9. Również szczególnie korzystny jest ester polioksyetylenosorbitanu, monooleinian polioksyetylenosorbitanu (Tween 80 ). Kolejne odpowiednie etery polioksyetylenu o ogólnym wzorze (I) są wybrane z następującej grupy: eter polioksyetyleno-8-stearylowy, eter polioksyetyleno-4-laurylowy, eter polioksyetyleno-35- -laurylowy i eter polioksyetyleno-23-laurylowy. Alternatywne określenia lub nazwy eteru polioksyetyleno-laurylowego są zawarte w rejestrze CAS. Numerem eteru polioksyetyleno-9-laurylowego w rejestrze CAS jest Etery polioksyetylenowe, takie jak eter polioksyetylenolaurylowy są opisane w Merck Index (wyd. 12: pozycja 7717, Merck & Co. Inc., Whitehouse Station, N.J., USA; ISBN ). Laureth 9 wytwarza się drogą reakcji tlenku etylenu z alkoholem dodecylowym, i zawiera średnio dziewięć jednostek tlenku etylenu. W opisanym preparacie szczepionkowym mogą być obecne dwa lub większa liczba niejonowych środków powierzchniowo czynnych spośród różnych opisanych grup środków powierzchniowo czynnych. W szczególności korzystne jest połączenie estru polioksyetylenosorbitanu, takiego jak monooleinian polioksyetylenosorbitanu (Tween 80 ) i oktoksynolu, takiego jak t-oktylofenoksypolietoksyetanol (Triton X-100 ). Inne szczególnie korzystne połączenie niejonowych środków powierzchniowo czynnych obejmuje laureth 9 oraz ester polioksyetylenosorbitanu i/lub oktoksynol. Niejonowe środki powierzchniowo czynne, takie jak te omówione powyżej, korzystnie występują w następujących stężeniach w ostatecznej kompozycji szczepionkowej: estry polioksyetylenosorbitanu, takie jak Tween 80 : 0,01-1%, najkorzystniej około 0,1% (wag./obj.); oktylo- lub nonylofenoksypolioksyetanole, takie jak Triton X-100 lub inne detergenty z grupy Triton: 0,001-0,1%, najkorzystniej 0,005-0,02% (wag./obj.); etery polioksyetylenu o ogólnym wzorze (I), takie jak laureth 9: 0,1-20%, korzystnie 0,1-10%, a najkorzystniej 0,1-1% lub około 0,5% (wag./obj.). W przypadku pewnych preparatów szczepionkowych, inne składniki szczepionki mogą znaleźć się w preparacie. I tak kompozycje według wynalazku mogą również zawierać kwasy żółciowe lub ich pochodne, w szczególności w postaci soli. Należą do nich pochodne kwasu cholowego i ich sole, w szczególności sole sodowe kwasu cholowego lub pochodnych kwasu cholowego. Do przykładowych kwasów żółciowych i ich pochodnych należy kwas cholowy, kwas dezoksycholowy, kwas chenodezoksycholowy, kwas litocholowy, kwas ursodezoksycholowy, kwas hiodezoksycholowy, oraz pochodne, takie jak gliko-, tauro-, amidopropylo-1-propanosulfonowe, amidopropylo-2-hydroksy-1-propanosulfonowe pochodne wspomnianych powyżej kwasów żółciowych lub N,N-bis(3-D-glukonoamidopropylo)dezoksycholoamid. Szczególnie korzystnym przykładem jest dezoksycholan sodu (Na- DOC), który może być obecny w ostatecznej dawce szczepionki. Wynalazek dostarcza także zestawy farmaceutyczne zawierające przyrząd do podawania szczepionki napełniony szczepionką według wynalazku. Takie przyrządy do podawania obejmują, ale nie wyłącznie, przyrządy igłowe, podające płyn przyrządy bezigłowe, przyrządy proszkowe i przyrządy aerozolowe (do podawania donosowego).

9 PL B1 9 Preparaty antygenu wirusa grypy według wynalazku mogą być uzyskiwane zwykłym sposobem opartym na zawierających zarodki jajach, lub mogą być uzyskiwane jakimkolwiek sposobem nowej generacji, w których stosuje się hodowle tkankowe do namnażania wirusa lub ekspresji zrekombinowanych antygenów powierzchniowych wirusa grypy. Do odpowiednich substratów komórkowych do namnażania wirusa należą np. komórki nerki psiej, takie jak MDCK lub komórki z klonów MDCK, komórki MDCK-podobne, komórki nerek małpich, takie jak AGMK, do których należą komórki Vero, odpowiednie linie komórek świńskich lub dowolny inny typ komórek ssaków, które są odpowiednie do wytwarzania wirusa grypy dla celów szczepionki. Do odpowiednich substratów komórkowych należą również komórki ludzkie np. komórki MRC-5. Odpowiednie substraty komórkowe nie są ograniczone do linii komórkowych; np. należą do nich również komórki pierwotne, takie jak fibroblasty zarodków kurzych. Preparat antygenu wirusa grypy może być produkowany w jakimkolwiek z odpowiednich procesów, dostępnych w handlu, np. w procesie rozszczepiania wirusa grypy, opisanym w opisie patentowym nr DD i DD Tradycyjnie rozszczepiony wirus grypy był wytwarzany z użyciem rozpuszczalników/detergentów, takich jak fosforan tri-n-butylu lub eter dietylowy w połączeniu z Tween (proces znany jako rozszczepianie Tween-eter"). Ten proces jest ciągle stosowany w pewnych zakładach produkcyjnych. Do innych środków rozszczepiających, stosowanych obecnie, należą detergenty lub enzymy proteolityczne albo sole żółciowe, np. dezoksycholan sodu, co zostało opisane w opisie patentowym nr DD Do detergentów, które mogą być stosowane jako środki rozszczepiające, należą detergenty kationowe, np. bromek cetylotrimetyloamoniowy (CTAB), inne jonowe detergenty np. laurylosiarczan, taurodezoksycholan lub niejonowe detergenty, takie jak te opisane powyżej, do których należą Triton X-100 (np. w sposobie opisanym przez Lina i wsp, 2000, Biologicals 28, ) i Triton N-101, albo połączenie jakichkolwiek dwóch lub większej liczby detergentów. Sposób wytwarzania szczepionki rozszczepionej będzie obejmował liczne różne etapy filtracji i/lub inne etapy rozdzielania, takie jak ultrawirowanie, ultrafiltracja, wirowanie strefowe i chromatografia (np. wymiana jonowa), w różnych zestawieniach, i ewentualnie etap inaktywacji np. cieplnej, z użyciem formaldehydu lub β-propiolaktonu, albo promieni ultrafioletowych, które można zastosować przed lub po rozszczepieniu. Proces rozszczepiania może być przeprowadzany w sposób periodyczny, ciągły lub półciągły. Korzystne preparaty antygenu wirusa gryp w rozszczepionej szczepionce według wynalazku zawierają resztkowe ilości Tween 80 i/lub Triton X-100 pozostałe po procesie wytwarzania, chociaż można je również dodawać lub ich stężenie można dopasować po wytworzeniu rozszczepionego antygenu. Korzystnie obecne są zarówno Tween 80, jak i Triton X-100. Korzystne ostateczne zakresy stężeń tych niejonowych środków powierzchniowo czynnych w dawce szczepionki wynoszą: Tween 80: 0,01-1%, korzystniej około 0,1% (obj./obj.) Triton X-100: 0,001-0,1% (wag./obj.), korzystniej 0,005-0,02% (wag./obj.). Alternatywnie preparaty antygenu wirusa grypy według wynalazku mogą pochodzić ze źródła innego niż żywy wirus grypy, np. antygen hemaglutyniny można wytwarzać na drodze rekombinacji. Wynalazek zostanie poniżej opisany dodatkowo w następujących, nie ograniczających przykładach. P r z y k ł a d y P r z y k ł a d 1. Wytwarzanie preparatu antygenu wirusa grypy z użyciem bursztynianu α-tokoferolu jako stabilizatora w szczepionce bez środków konserwujących (ze zmniejszoną zawartością tiomersalu). Monowalentną rozszczepioną szczepionkę wytworzono według następującej procedury. Wytwarzanie wirusowego materiału inokulacyjnego W dniu inokulacji zawierających zarodek jaj, przygotowywuje się świeży materiał inokulacyjny przez zmieszanie roboczej hodowli zaszczepiającej z buforowaną fosforanem solą fizjologiczną, zawierającą siarczan gentamycyny w stężeniu 0,5 mg/ml oraz hydrokortyzon w stężeniu 25 μg/ml. (w zależności od szczepu wirusa). Materiał inokulacyjny wirusa przechowuje się w temperaturze 2-8 C. Inokulacja jaj zawierających zarodki Do replikacji wirusa stosuje się 9-11-dniowe jaja zawierające zarodki. Skorupy odkaża się. Jaja poddaje się inokulacji za pomocą 0,2 ml wirusowego materiału inokulacyjnego. Jaja poddane inokulacji inkubuje się w odpowiedniej temperaturze (w zależności od szczepu wirusa) przez godzin. Pod koniec okresu inkubacji zarodki są zabijane przez ochłodzenie, a jaja są przechowywane przez godzin w temperaturze 2-8 C.

10 10 PL B1 Zbieranie Zbierany jest płyn omoczniowy ze schłodzonych jaj mających zarodki. Zazwyczaj z jednego jaja uzyskiwane jest 8-10 ml surowego płynu omoczniowego. Zagęszczenie i izolacja całych cząstek wirusa z płynu omoczniowego 1. Klarowanie płynu Uzyskany płyn omoczniowy poddaje się klarowaniu przez wirowanie z umiarkowaną szybkością (w zakresie g) 2. Etap adsorpcji Aby otrzymać żel CaHPO 4 w klarownym zbiorze wirusa, dodaje się 0,5 mola/l Na 2 HPO 4 i 0,5 mola/l roztworu CaCl 2, tak żeby otrzymać ostateczne stężenie CaHPO 4 wynoszące 1,5 g - 3,5 g CaHPO 4 /l, w zależności od szczepu wirusa. Po sedymentacji trwającej co najmniej 8 godzin, supernatant usuwa się, a osad zawierający wirusa grypy ponownie solubilizuje się przez dodanie roztworu 0,26 mola/l EDTA-Na 2, w zależności od ilości użytego CaHPO Filtracja Ponownie przeprowadzony w stan zawiesiny osad sączy się przez 6 μm membranę filtracyjną. 4. Wirowanie w gradiencie sacharozy Wirus grypy zatęża się w procesie izopiknicznego wirowania w liniowym gradiencie sacharozy (0,55% (wag./obj.)), zawierającym 100 μg/ml Tiomersalu. Szybkość przepływu wynosi 8-15 l/godzinę. Po zakończeniu wirowania cztery różne frakcje odzyskuje się z wirnika (sacharozę mierzy się w refraktometrze): - frakcja % sacharozy - frakcja 2 około 52-38% sacharozy - frakcja % sacharozy* - frakcja % sacharozy * w zależności od szczepu wirusa: frakcję 3 można obniżyć do 15% sacharozy. Do dalszego wytwarzania szczepionki używa się tylko frakcji 2 i 3. Frakcję 3 przemywa się w procesie diafiltracji buforem fosforanowym, aby zmniejszyć zawartość sacharozy do poniżej około 6%. Wirus grypy obecny w tej rozcieńczonej frakcji odwirowuje się celem usunięcia rozpuszczalnych zanieczyszczeń. Osad ponownie przeprowadza się w stan zawiesiny i dokładnie miesza dla otrzymania jednorodnej zawiesiny. Frakcję 2 oraz ponownie przeprowadzoną w stan zawiesiny frakcję 3 łączy się i dodaje się buforu fosforanowego dla otrzymania objętości około 40 litrów. Ten produkt jest monowalentnym koncentratem całego wirusa. 5. Wirowanie w gradiencie sacharozy z dezoksycholanem sodu Monowalentny koncentrat całego wirusa grypy umieszcza się w ultrawirówce ENI-Mark II. Wirnik K3 zawiera liniowy gradient sacharozy (0,55% (wag./obj.)), na który nakładany jest dodatkowy gradient dezoksycholanu sodu. W czasie rozszczepiania obecny jest Tween 80 w stężeniu do 0,1 (wag./obj.), a w przypadku wirusów szczepu B w stężeniach do 0,5 mm dodaje się bursztynianu tokoferolu. Maksymalne stężenie dezoksycholanu sodu wynosi 0,7-1,5% (wag./obj.) i jest zależne od szczepu. Natężenie przepływu wynosi 8-15 l/godzinę. Po zakończeniu wirowania, zawartość wirnika odzyskuje się w trzech różnych frakcjach (sacharozę mierzy się w refraktometrze). Frakcję 2 stosuje się do dalszego przetwarzania. Granice zawartości sacharozy (47-18%) różnią się w zależności od szczepu i są ustalane po wykonaniu oceny. 6. Filtracja w warunkach jałowych Frakcję rozszczepionego wirusa filtruje się przez membrany filtracyjne kończące się membraną 0,2 μm. Do rozcieńczania stosuje się roztwór zawierający bufor fosforanowy, Tween 80 w stężeniu 0,025% (wag./obj.) i (w przypadku szczepów B wirusa) bursztynian tokoferolu w stężeniu 0,5 mm. Ostateczna objętość przefiltrowanej frakcji jest 2-5 krotnie większa od wyjściowej objętości frakcji. 7. Inaktywacja Przefiltrowany materiał monowalentny inkubuje się w temperaturze 22 ± 2 C przez co najwyżej 84 godziny (w zależności od szczepu wirusa, czas inkubacji można skrócić). Następnie dodaje się buforu fosforanowego zawierającego Tween 80 w stężeniu 0,025% (wag./obj.), aby zmniejszyć całkowitą zawartość białka do maksymalnie 250 μg/ml. W przypadku wirusów szczepu B do rozcieńczenia i zmniejszenia całkowitej zawartości białka do 250 μg/ml stosuje się buforowaną fosforanem sól fizjo-

11 PL B1 11 logiczną, zawierającą 0,025% (wag./obj.) Tween 80 i 0,25 mm bursztynianu tokoferolu. Dodaje się formaldehydu, do osiągnięcia ostatecznego stężenia 50 μg/ml i inaktywację prowadzi się w temperaturze 20 ± 2 C przez co najmniej 72 godziny. 8. Ultrafiltracja Inaktywowany rozszczepiony materiał wirusowy zatęża się co najmniej dwukrotnie w jednostce ultrafiltracyjnej, wyposażonej w membrany z octanu celulozy z MWCO 20 kda. Materiał następnie przemywa się buforem fosforanowym zawierającym 0,025% (wag./obj.) Tween 80, a potem buforowaną fosforanem solą fizjologiczną zawierającą 0,01% (wag./obj.) Tween. W przypadku wirusa szczepu B do przemywania stosuje się buforowaną fosforanem sól fizjologiczną, zawierającą 0,01% (wag./obj.) Tween 80 i 0,1 mm bursztynian tokoferolu. 9. Ostateczna filtracja w warunkach jałowych Materiał po ultrafiltracji filtruje się przez membrany kończące się membraną 0,2 μm. Membrany filtracyjne przepłukuje się, a materiał rozcieńcza się, jeśli jest to potrzebne, tak aby stężenie białka nie przekraczało 500 μg/ml, z użyciem buforowanej fosforanem soli fizjologicznej, zawierającej 0,01% (wag./obj.) Tween 80 oraz (w przypadku szczepów B wirusów) 0,1 mm bursztynian tokoferolu. 10. Przechowywanie Ostateczną monowalentną partię przechowuje się w temperaturze 2-8 C maksymalnie przez 18 miesięcy. Stabilność T a b e l a 1. Porównanie zmian zawartości HA (μg/ml) w czasie, wykrywalnych w próbie SRD w ostatecznych monowalentnych partiach Szczep B/Yamanashi/ 166/98 B/Yamanashi/ 166/98 B/Yamanashi/ 166/98 B/Johannesburg/ 5/99 B/Johannesburg/ 5/99 B/Johannesburg/ 5/99 B/Johannesburg/ 5/99* B/Johannesburg/ 5/99** Stabilizator Bursztynian tokoferolu (resztkowa rtęć 3 μg/ml) Po wytworzeniu 4 tygodnie w 30 C 6 miesięcy w 2-8 C (82%) 172 (>100%) NB 12 miesięcy w 2-8 C Tiomersal (108 μg/ml) (83%) 186 (97%) 178 (93%) Brak (resztkowa rtęć 3 μg/ml) Bursztynian tokoferolu (resztkowa rtęć 4 μg/ml) Bursztynian tokoferolu (resztkowa rtęć 4 μg/ml) Bursztynian tokoferolu (resztkowa rtęć 3 μg/ml) (60%) 175 (92%) 154 (81%) (>100%) 158 (95%) 179 (>100%) (>100%) 158 (95%) 178 (>100%) (>100%) 130 (90%) 145 (>100%) Tiomersal 159 NB 172 (>100%) 154 (97%) Brak (63%) 153 (90%) WB * wytwarzany zgodnie z licencją na FLUARIX, ** wytwarzany zgodnie z przykładem 1, bez bursztynianu tokoferolu, WB: w trakcie badań, NB: nie badano. P r z y k ł a d 2. Wytwarzanie szczepionki przeciw grypie z użyciem bursztynianu α-tokoferolu jako stabilizatora w szczepionce ze zmniejszoną zawartością tiomersalu Ostateczne monowalentne partie trzech szczepów, A/New Caledonia/20/99 (H1N1) IVR-116, A/Panama/2007/99 (H3N2) Resvir-17 i B/Yamanashi/166/98, wytworzono sposobem opisanym w przykładzie 1. Łączenie Odpowiednie ilości monowalentnych ostatecznych partii połączono tak, aby osiągnąć ostateczne stężenie 30 μg/ml odpowiednio A/New Caledonia/20/99 (H1N1) IVR-116 oraz A/Panama/2007/99 (H3N2) Resvir-17 i stężenie 39 μg/ml B/Yamanashi/166/98. Stężenia Tween 80 i Triton X ustalono na poziomie odpowiednio 580 μg/ml i 90 μg/ml. Ostateczną objętość uzupełniono do 3 litrów buforowaną fosforanem solą fizjologiczną. Trójwalentny zbiór przefiltrowano przez zestaw zakończony

12 12 PL B1 0,8 μm membraną z octanu celulozy i uzyskano ostateczną trójwalentną partię. Trójwalentną ostateczną partię umieszczano w strzykawkach, w każdej w ilości co najmniej 0,5 ml. T a b e l a 2. Porównanie zmian zawartości HA w czasie, wykrywanych w próbie SRD, w ostatecznych trójwalentnych partiach, które uzyskano ze strzykawek Preparat szczepionkowy Szczep Miesiąc 0 Miesiąc 2 Miesiąc 4 Miesiąc 6 Szczepionka przeciw grypie bez stabilizatora Szczepionka przeciw grypie zawierająca bursztynian α-tokoferolu A/NCal/20/99 33 (32-34) 32 (31-33) 36 (34-38) 31 (30-32) A/Pan/2007/99 29 (27-31) 31 (28-34) 34 (32-36) 32 (31-33) B/Yam/166/98 36 (34-38) 33 (32-34) 32 (30-34) 31 (29-33) A/NCal/20/99 31 (30-32) 32 (31-33) 36 (34-38) 32 (31-33) A/Pan/2007/99 33 (30-36) 33 (30-36) 36 (35-37) 33 (31-35) B/Yam/166/98 37 (35-39) 36 (34-38) 38 (35-41) 36 (33-39) P r z y k ł a d 3. Próba SRD stosowana do pomiaru zawartości hemaglutyniny Płytki szklane (12,4-10,0 cm) powleka się żelem agarowym, zawierającym w zalecanym przez NIBSC stężeniu surowicę przeciw-grypowej HA. Po zastygnięciu żelu w agarze wykrawa się 72 studzienki na próbki (3 mm Ø). W studzienkach umieszcza się po 10 μl odpowiednio rozcieńczonego wzorca i próbki. Płytki inkubuje się przez 24 godziny w temperaturze pokojowej (20-25 C) w wilgotnej komorze. Następnie płytki przez noc nasącza się roztworem NaCl i krótko przemywa wodą destylowaną. Żel następnie ściska się i suszy. Gdy płytki całkowicie wyschną, barwi się je roztworem Coomassie Brilliant Blue przez 10 minut i odbarwia się je dwukrotnie w mieszaninie metanolu i kwasu octowego do momentu, gdy pojawią się wyraźnie zaznaczone zabarwione obszary. Po wysuszeniu płytek mierzy się średnicę zabarwionych obszarów wokół studzienek z antygenami, w dwóch kierunkach krzyżujących się pod kątem prostym. Alternatywnie można zastosować aparat do pomiaru powierzchni. Wyznacza się krzywe dawka-odpowiedź rozcieńczeń antygenu względem powierzchni, a wyniki oblicza się z użyciem znanych metod wyznaczania nachylenia-stosunku (Finney D.J (1952). Statistical Methods in Biological Assay. Londyn: Griffin, cytowane w Wood JM i wsp. (1977). J. Biol. Standard. 5, ). P r z y k ł a d 4. Kliniczne badania stabilizowanej α-tokoferolem szczepionki przeciw grypie (o zmniejszonej zawartości tiomersalu) Strzykawki otrzymane zgodnie z opisem w przykładzie 2, są stosowane w badaniu klinicznym H3N2: A/Panama/2007/99 RESVIR-17 H1N1: A/New Caledonia/20/99 (H1N1) IVR-116 B: B/Yamanashi/166/98 Dorośli w wieku lat T a b e l a 3 Zmniejszony-tio Plus-tio H3N2 H1N1 B H3N2 H1N1 B przed szczep. GMT Miano < 10 [%] 10,3% 13,8% 1,7% 5,3% 12,3% 8,8% Miano 40, SPR [%] 60,3% 55,2% 75,9% 70,2% 52,6% 75,4% po szczep. Odsetek serokonwersji [%] 10,3% 13,8% 1,7% 5,3% 12,3% 8,8% Znaczny wzrost miana przeciwciał [%] 58,6% 74,1% 58,6% 63,2% 73,7% 52,6%

13 PL B1 13 cd. tabeli Serokonwersje [%] 58,6% 74,1% 58,6% 63,2% 73,7% 52,6% GMT Krotność GMT 7,3 13,0 6,9 5,9 9,8 5,9 Miano 40, SPR [%] 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% Nie wykonano = PU (przedział ufności) dla proporcji p=n/n nie został określony, ponieważ p*(1-p)*n<9 n/n = odpowiadający (n) jako odsetek ilości osobników (sub)populacji (N), tzn. serokonwersje lub znaczne wzrosty, patrz także CPMAP/BWP/214/96, 12 marca 1997 r., str.17 i następne GMT = średnia geometryczna miana, odwrotne 95% PU = 95% przedział ufności SPR = Odsetek seroprotekcji: udział osobników z ochronnym mianem przed lub po szczepieniu 40 miano = miano przeciwciał HI Odsetek serokonwersji = udział osobników, u których miano przeciwciał wzrosło z <10 przed wszczepieniem do 40 po szczepieniu Krotność GMT = krotność wzrostu GMT Znaczący wzrost = udział osobników, z mianem przeciwciał 10 przed szczepieniem i 4-krotnym wzrostem miana przeciwciał po szczepieniu (dwuetapowe miano) Wym. = wymagania UE Serokonwersje = ujemne do dodatnich lub 4-krotny wzrost (ujemne: miano <10, dodatni: miano 40) = udział osobników albo z serokonwersją (<10 do 40) albo ze znaczącym wzrostem. Wyniki pokazują, że szczepionka może zapewniać taką samą ochronę, jak szczepionki zawierające tiomersal jako środek konserwujący. P r z y k ł a d 5a. Wytwarzanie preparatu antygenu wirusa grypy z użyciem bursztynianu α-tokoferolu jako stabilizatora w szczepionce nie zawierającej tiomersalu Monowalentną rozszczepioną szczepionkę wytwarza się zgodnie z następującą procedurą. Wytwarzanie wirusowego materiału inokulacyjnego W dniu inokulacji zawierających zarodek jaj, wytwarza się świeży materiał inokulacyjny przez zmieszanie roboczej hodowli zaszczepiającej z buforowaną fosforanem solą fizjologiczną, zawierającą siarczan gentamycyny w stężeniu 0,5 mg/ml oraz hydrokortyzon w stężeniu 25 μg/ml. (w zależności od szczepu wirusa). Materiał inokulacyjny wirusa przechowuje się w temperaturze 2-8 C. Inokulacja jaj zawierających zarodki Do replikacji wirusa stosuje się 9-11-dniowe jaja zawierające zarodki. Skorupy są odkażane. Jaja są poddawane inokulacji za pomocą 0,2 ml wirusowego materiału inokulacyjnego inokulowanych jaj poddane inokulacji inkubuje się w odpowiedniej temperaturze (w zależności od szczepu wirusa) przez godzin. Pod koniec okresu inkubacji zarodki są zabijane przez ochłodzenie, a jaja są przechowywane przez godzin w temperaturze 2-8 C. Zbieranie Zbierany jest płyn omoczniowy ze schłodzonych jaj mających zarodki. Zazwyczaj z jednego jaja uzyskiwane jest 8-10 ml surowego płynu omoczniowego. Zagęszczenie i izolacja całych cząstek wirusa z płynu omoczniowego Klarowanie płynu Uzyskany płyn omoczniowy poddaje się klarowaniu przez wirowanie z umiarkowaną szybkością (w zakresie g) Etap strącania Do klarownego zbioru wirusa, dodaje się nasyconego roztworu siarczanu amonu, tak żeby otrzymać ostateczne stężenie siarczanu amonu wynoszące 0,5 mola/l. Po sedymentacji trwającej co najmniej 1 godzinę, osad usuwa się drogą filtracji przez głębokie filtry (typowo 0,5 μm). Filtracja Wyklarowaną partię całych cząstek wirusa filtruje się przez membrany filtracyjne kończące się certyfikowaną jałową membraną (typowo 0,2 μm). Ultrafiltracja Jałowy przefiltrowany surowy zasób monowalentnych całych cząstek wirusa zatęża się co najmniej 6-krotnie w kasetach z membraną BIOMAX 1000 kda MWCO. Stężony retentat przemywa się buforowaną fosforanem solą fizjologiczną co najmniej 1,8 razy.