(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 12/04 EP B1 (13) (1) T3 Int.Cl. A61K 39/00 (06.01) A61K 39/12 (06.01) A61K 39/14 (06.01) (4) Tytuł wynalazku: Kompozycja immunogenna zawierająca adiuwant () Pierwszeństwo: GB GB GB GB (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 08/3 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 12/06 (73) Uprawniony z patentu: GlaxoSmithKline Biologicals S.A., Rixensart, BE (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 PIERRE VANDEPAPELIERE, Rixensart, BE (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Agnieszka Marszałek SULIMA-GRABOWSKA-SIERZPUTOWSKA BIURO PATENTÓW I ZNAKÓW TOWAROWYCH SP.J. Skr. poczt Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 SGS-2236/VAL EP B1 Opis 1 2 DZIEDZINA TECHNIKI [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy ulepszonych kompozycji szczepionek, sposobów ich wytwarzania oraz ich zastosowania w medycynie. W szczególności wynalazek dotyczy adiuwantowanych kompozycji szczepionek, w których adiuwantem jest preparat liposomalny zawierający saponinę i lipopolisacharyd. Niniejszy wynalazek ponadto dotyczy preparatów szczepionek przeciw grypie oraz trybów szczepienia w celu immunizacji przeciw grypie. TŁO TECHNICZNE [0002] Nowe kompozycje lub szczepionki o ulepszonej immunogenności są zawsze potrzebne. W jednej ze strategii adiuwanty były stosowane do wypróbowania oraz ulepszenia odpowiedzi immunologicznej wywołanej przeciw dowolnemu danemu antygenowi. [0003] Lipopolisacharydy (LPS) są głównymi cząsteczkami powierzchniowymi i występują wyłącznie w zewnętrznej warstwie błony zewnętrznej bakterii Gram ujemnych. LPS zaburzają niszczenie bakterii przez dopełniacze surowicy i komórki fagocytujące oraz uczestniczą w przyleganiu podczas kolonizacji. LPS stanowią grupę strukturalnie pokrewnych złoŝonych cząsteczek o wielkości około 000 Daltonów oraz zawierających trzy regiony połączone kowalencyjnie: (i) O-specyficzny łańcuch polisacharydowy (antygen O) w regionie zewnętrznym (ii) centralny region w postaci oligosacharydu rdzeniowego (iii) lipid A najbardziej wewnętrzny region, który słuŝy jako hydrofobowa kotwica, zawiera on jednostki disacharydu glukozaminy, które niosą długołańcuchowe kwasy tłuszczowe. [0004] Wykazano, Ŝe aktywności biologiczne LPS, takie jak śmiertelna toksyczność, pirogenność oraz działanie adiuwantowe są związane z ugrupowaniem lipidu A. W odróŝnieniu od tego, immunogenność jest związana z O-specyficznym składnikiem polisacharydowym (antygen O). Zarówno LPS i lipid A były długo znane ze względu na ich silne działanie adiuwantowe, ale wysoka toksyczność tych cząsteczek uniemoŝliwiała ich stosowanie w preparatach szczepionek. Zatem czyniono znaczące wysiłki w celu obniŝenia toksyczności LPS lub lipidu A przy zachowaniu ich działania adiuwantowego. [000] Mutanta R9 Salmonella minnesota wyizolowano w 1966 roku z hodowli wyjściowego szczepu (gładki) (Luderitz i in Ann. N. Y. Acad. Sci. 133: ). Wyse-

3 lekcjonowane kolonie przeszukano pod względem ich podatności na lizę przez zestaw fagów, a do dalszego badania wyselekcjonowano tylko te kolonie, które wykazywały wąski zakres wraŝliwości (podatność na tylko jednego lub dwa fagi). Wysiłki te doprowadziły do wyizolowania szczepu mutanta głęboko szorstkiego z defektem biosyntezy LPS, którego nazwano S. minnesota R9. [0006] W porównaniu z innymi LPS te wytwarzane przez mutanta S. minnesota R9 mają względnie prostą strukturę. (i) nie zawierają one regionu O-specyficznego która to cecha jest odpowiedzialna za przesunięcie z fenotypu gładkiego typu dzikiego do fenotypu mutanta szorstkiego oraz powoduje utratę wirulencji (ii) region rdzeniowy jest bardzo krótki cecha ta zwiększa podatność szczepu na wiele środków chemicznych (iii) ugrupowanie lipidu A jest wysoce acylowane, nawet 7 kwasami tłuszczowymi. [0007] 4 -monofosforylo-lipid A (MPL), który moŝna uzyskać przez kwasową hydrolizę LPS, wyekstrahowanego ze szczepu mutanta głęboko szorstkiego bakterii Gram ujemnych, zachowuje właściwości adiuwantowe LPS jednocześnie wykazując toksyczność, która jest obniŝona o czynnik ponad 00 (co zmierzono na podstawie dawki śmiertelnej w jajkach z zarodkami kurzymi) (Johnson i in Rev. Infect. Dis. 9 Supl:S12-S16). LPS zazwyczaj ogrzewa się w warunkach powrotu skroplin w rozworach kwasu mineralnego o średniej mocy (np. 0,1M HCl) przez okres około minut. Proces ten powoduje jego defosforylację w 1 pozycji oraz dekarboksylację w pozycji 6, z uzyskaniem MPL. [0008] 3-O-Deacylowany monofosforylo-lipid A (3D-MPL), który uzyskuje się przez hydrolizę MPL w łagodnych warunkach zasadowych, wykazuje ponadto obniŝoną toksyczność ponownie przy zachowaniu działania adiuwantowego, patrz US49194 (Ribi Immunochemicals). Hydrolizę zasadową zazwyczaj prowadzi się w rozpuszczalniku organicznym, takim jak mieszanina chloroform/metanol, przez wysycenie wodnym roztworem słabej zasady, takim jak 0,M węglan sodu przy ph,. [0009] Dalsze informacje odnośnie wytwarzania 3D-MPL są dostępne przykładowo w US49194 i WO02/ (Corixa Corporation). [00] Saponiny Quillaja stanowią mieszaninę glikozydów triterpenowych wyekstrahowanych z kory drzewa Quillaja saponaria. Surowe saponiny szeroko stosowano jako adiuwanty weterynaryjne. Quil A jest częściowo oczyszczonym wodnym ekstraktem materiału saponin Quillaja. QS21 stanowi oczyszczoną metodą HPLC nietoksyczną frakcję Quil A, a sposób jego wytwarzania ujawniono (jako QA21) w opisie patentowym US nr [0011] Przykładowo szczepionki przeciw grypie oraz szczepionki przeciw ludzkiemu wi-

4 rusowi brodawczaka (HPV) opracowano z adiuwantami. [0012] Wirusy grypy są jednymi z najbardziej powszechnych wirusów obecnych na świecie, które dotykają zarówno ludzi, jak i Ŝywy inwentarz. Grypa powoduje istotne obciąŝenie ekonomiczne, zachorowalność, a nawet śmiertelność. [0013] Wirus grypy jest otoczkowym wirusem RNA o wielkości cząstek o średnicy około 12 nm. Zawiera on zasadniczo wewnętrzny nukleokapsyd, czyli rdzeń kwasu nukleinowego (RNA) związany z nukleoproteiną, otoczony przez otoczkę wirusa o strukturze dwuwarstwy lipidowej oraz z zewnętrznymi glikoproteinami. Wewnętrzna warstwa otoczki wirusa jest złoŝona głównie z białek macierzowych oraz warstwy zewnętrznej złoŝonej głównie z materiału lipidowego pochodzącego od gospodarza. Wirus grypy zawiera dwa antygeny powierzchniowe, glikoproteiny, które stanowi neuraminidaza (NA) i hemaglutynina (HA), które przypominają kolce o długości do 12 nm na powierzchni cząstek. To te białka powierzchniowe, a w szczególności hemaglutynina, determinują specyficzność antygenową podtypów grypy. [0014] Te antygeny powierzchniowe postępująco, czasami szybko, przechodzą pewne zmiany prowadzące do zmienności antygenowej grypy. Te zmiany antygenowe, nazywane dryfem lub przesunięciami są nieprzewidywalne oraz mogą wywierać znaczny wpływ z immunologicznego punktu widzenia poniewaŝ ostatecznie prowadzą do pojawienia się nowych szczepów grypy, które umoŝliwiają ucieczkę wirusa przed układem immunologicznym, powodując dobrze znane, prawie coroczne epidemie. [001] Szczepy wirusa grypy, które mają być wprowadzone do szczepionki przeciw grypie w kaŝdym sezonie, są określane przez Światową Organizację Zdrowia we współpracy z narodowymi władzami słuŝby zdrowia oraz producentami szczepionek. [0016] HA jest najwaŝniejszym antygenem przy określaniu specyficzności serologicznej róŝnych szczepów grypy. To białko o 7-80 kd zawiera wiele determinant antygenowych, z których kilka występuje w regionach podlegających zmianom sekwencji w róŝnych szczepach (determinanty specyficzne dla szczepu), a inne w regionach wspólnych dla wielu cząsteczek HA (wspólne dla determinant). [0017] Wirusy grypy wywołują epidemie prawie kaŝdej zimy, przy czym częstość zakaŝeń dla wirusów typu A lub B sięga 40% w okresie sześciu tygodni. ZakaŜenie grypą powoduje róŝne stany chorobowe, od zakaŝenia podklinicznego, przez łagodne zakaŝenie górnych dróg oddechowych do powaŝnego wirusowego zapalenia płuc. Typowa epidemia grypy powoduje wzrost częstości występowania zapalenia płuc i choroby dolnych dróg oddechowych, o czym świadczy zwiększona częstość hospitalizacji lub śmiertelność. CięŜkość choroby jest determinowana głównie przez wiek gospodarza, jego status immunologiczny

5 oraz miejsce zakaŝenia. [0018] Szczególnie podatni są ludzie starsi, w wieku 6 i starsi, i wśród nich występuje 80-90% wszystkich zgodnów związanych z grypą w krajach rozwiniętych. Osobnicy z przewlekłymi chorobami zasadniczymi takŝe z największym prawdopodobieństwem będą doświadczać takich powikłań. Małe dzieci mogą takŝe przechodzić cięŝką postać choroby. Zatem grupy te w szczególności muszą być chronione. Oprócz tych grup ryzyka władze słuŝby zdrowia takŝe zalecają szczepienia zdrowym osobom dorosłym, które mają kontakt z osobami starszymi. [0019] Szczepienie odgrywa krytyczną rolę w zwalczaniu corocznych epidemii grypy. Obecnie dostępne szczepionki przeciw grypie są szczepionkami inaktywowanymi albo szczepionkami z Ŝywym atenuowanym wirusem grypy. Inaktywowane szczepionki przeciw grypie składają się z trzech moŝliwych postaci preparatu antygenu: inaktywowanego całego wirusa, subwirionów, gdzie oczyszczone cząstki wirusa są zniszczone z uŝyciem detergentów lub innych odczynników w celu solubilizacji otoczki lipidowej (tak zwana szczepionka typu split ) lub oczyszczonych HA i NA (szczepionka podjednostkowa). Te inaktywowane szczepionki są podawane domięśniowo (i.m.) lub donosowo (i.n.). [00] Szczepionki przeciw grypie, wszystkich rodzajów, są zazwyczaj szczepionkami trójwaŝnymi. Ogólnie zawierają one antygeny pochodzące z dwóch szczepów wirusa grypy A oraz jednego szczepu wirusa grypy B. Standardowa dawka do wstrzykiwań 0, ml w większości przypadków zawiera 1 µg hemaglutyniny jako składnika antygenowego z kaŝdego ze szczepów, co mierzy się metodą pojedynczej immunodyfuzji radialnej (SRD) (J.M. Wood i in.: An improved single radial immunodiffusion technique for the assay of influenza haemagglutinin antigen: adaptation for potency determination of inactivated whole virus and subunit vaccines. J. Biol. Stand. (1977) ; J. M. Wood i in., International collaborative study of single radial diffusion and immunoelectrophoresis techniques for the assay of haemagglutinin antigen of influenza virus. J. Biol. Stand. 9 (1981) 317-3). [0021] Obecnie dostępne szczepionki przeciw grypie uwaŝa się za bezpieczne we wszystkich grupach wiekowych (De Donato i in. 1999, Vaccine, 17, 94-31). JednakŜe istnieje niewiele dowodów, Ŝe obecnie dostępne szczepionki przeciw grypie działają u małych dzieci w wieku poniŝej dwóch lat. Ponadto opisane wskaźniki skuteczności szczepionki w zapobieganiu potwierdzonej chorobie stanowiącej typową grypę wynosi 23-72% u osób starszych, co jest istotnie niŝsze od 60-90% wskaźników skuteczności opisywanych u młodszych osób dorosłych (Govaert, 1994, J. Am. Med. Assoc., 21, ; Gross, 199, Ann Intern. Med. 123, 23-27). Wykazano, Ŝe skuteczność szczepionki przeciw

6 1 2 3 grypie koreluje z surowiczymi mianami przeciwciał hamujących hemaglutynację (HI) dla danego szczepu wirusa oraz kilka badań wykazało, Ŝe starsze osoby dorosłe wykazują niŝsze miana HI po immunizacji przeciw grypie niŝ młodsze osoby dorosłe (Murasko, 02, Experimental gerontology, 37, ). [0022] Zatem nadal potrzebne są nowe szczepionki o ulepszonej immunogenności. Formułowanie antygenu szczepionkowego z silnymi adiuwantami jest moŝliwym podejściem do wzmacniania odpowiedzi immunologicznych na antygeny subwirionowe. [0023] Podjednostkowa szczepionka przeciw grypie adiuwantowana adiuwantem MF9, w postaci emulsji olej-w-wodzie jest dostępna w handlu i wykazano jej zdolność do wywoływania wyŝszego miana przeciwciał niŝ to uzyskiwane dla nieadiuwantowanych szczepionek podjednostkowych (De Donato i in. 1999, Vaccine, 17, 94-31). JednakŜe w późniejszej publikacji taka sama szczepionka nie wykazała ulepszonego profilu w porównaniu z nieadiuwantowaną szczepionką typu split (Puig-Barbera i in., 04, Vaccine 23, ). [0024] Zasadniczo podczas okresów między pandemiami krąŝą wirusy grypy spokrewnione z tymi z poprzedniej epidemii. Wirusy te rozprzestrzeniają się wśród ludzi z róŝnymi poziomami oporności wynikającymi z zakaŝeń na wcześniejszym etapie Ŝycia. Takie krą- Ŝenie przez okres zazwyczaj 2-3 lat sprzyja selekcji nowych szczepów, które uległy wystarczającej zmianie do wywołania ponownej epidemii w ogólnej populacji; proces ten jest nazywany dryfem antygenowym. Warianty powstałe w wyniku dryfu mogą mieć róŝny wpływ w róŝnych społecznościach, regionach, krajach lub kontynentach kaŝdego roku, jednakŝe przez kilka lat ich ogólny wpływ jest często podobny. Innymi słowy, pandemie grypy występują gdy pojawi się nowy wirus grypy przeciw któremu populacja ludzka nie ma odporności. Typowa epidemia grypy powoduje wzrost częstości występowania zapalenia płuc i choroby dolnych dróg oddechowych, o czym świadczy zwiększona częstość hospitalizacji lub śmiertelność. Osoby starsze lub te z przewlekłymi chorobami zasadniczymi z największym prawdopodobieństwem doświadczą tych powikłań, ale małe dzieci mogą takŝe przechodzić cięŝką postać choroby. [002] W nieprzewidywalnych odstępach czasowych pojawiają się nowe wirusy grypy z kluczowym antygenem powierzchniowym, hemaglutyniną, całkowicie innego podtypu w porównaniu ze szczepami krąŝącymi w poprzedzającym sezonie. Tutaj powstałe antygeny mogą róŝnić się od % do 0% od odpowiednich białek ze szczepów, które poprzednio krąŝyły u ludzi. MoŜe to spowodować, Ŝe wirus ucieknie zbiorowej odporności oraz rozpocznie pandemię. Fenomen ten jest nazywany przesunięciem antygenowym. UwaŜa się, Ŝe co najmniej w przeszłości pandemie występowały gdy wirus grypy z róŝnych gatunków,

7 tak jak wirus grypy ptasiej lub świńskiej, przekraczał barierę gatunkową. JeŜeli takie wirusy mają moŝliwość przenoszenia się z jednej osoby na drugą, mogą one rozprzestrzenić się na całym świecie w przeciągu kilku miesięcy do roku, wywołując pandemię. Przykładowo w 197 (pandemia grypy azjatyckiej) wirusy podtypu H2N2 zastąpiły wirusy H1N1 krąŝące w populacji ludzkiej od co najmniej 1918, gdy wirus ten został wyizolowany po raz pierwszy. HA H2 i NA N2 podlegały dryfowi antygenowemu między rokiem 197 i 1968 do czasu gdy HA został zastąpiony w 1968 (pandemia grypy Hong-Kong) przez pojawienie się podtypu wirusa grypy H3N2, po czym NA N2 dalej podlegała dryfowi razem z HA H3 (Nakajima i in., 1991, Epidemiol. Infect. 6, ). [0026] Cechy szczepu wirusa grypy, które nadają mu potencjał wywołania wybuchu pandemii stanowi: to, Ŝe zawiera on nową hemaglutyninę w porównaniu z hemaglutyniną w obecnie krąŝących szczepach, czemu moŝe, ale nie musi towarzyszyć zmiana podtypu neuraminidazy; to, Ŝe jest on zdolny do poziomego przenoszenia się w populacji ludzkiej; oraz to, Ŝe jest on patogenny dla ludzi. Nową hemaglutyniną moŝe być taka, która nie była widoczna w populacji ludzkiej przez przedłuŝony okres czasu, prawdopodobnie kilka dekad, taka jak H2. Ewentualnie moŝe być to hemaglutynina, która nie krąŝyła wcześniej w populacji ludzkiej, przykładowo H, H9, H7 lub H6, które występują u ptaków. W kaŝdym z przypadków większość lub co najmniej duŝa część lub nawet cała populacja wcześniej nie spotkała się z tym antygenem i jest względem niego immunologicznie naiwna. [0027] Wirusy brodawczaka są małymi onkogennymi wirusami DNA, które są wysoce specyficzne względem gatunku. Jak dotychczas opisano ponad 0 poszczególnych genotypów ludzkiego wirusa brodawczaka (HPV). HPV są ogólnie specyficzne względem skóry (np. HPV-1 i -2) lub powierzchni błony śluzowej (np. HPV-6 i -11) oraz zazwyczaj wywołują łagodne guzy (brodawki), które utrzymują się przez kilka miesięcy lub lat. Takie łagodne guzy mogą być niepokojące dla danej osoby, ale nie zagraŝają one Ŝyciu z kilkoma wyjątkami. [0028] Niektóre HPV są takŝe związane z nowotworami. Najsilniejszym pozytywnym związkiem między HPV i nowotworami u ludzi jest związek między HPV-16 i HPV-18 oraz rakiem szyjki macicy. Rak szyjki macicy jest najpowszechniejszym stanem złośliwym w krajach rozwijających się, przy czym kaŝdego roku na świecie występuje około nowych przypadków. Obecnie technicznie moŝliwe jest zwalczanie pierwotnych zakaŝeń HPV-16, a nawet wykształconych raków zawierających HPV-16 z zastosowaniem szczepionek. Praca przeglądowa odnośnie perspektyw szczepień profilaktycznych i terapeutycznych przeciw HPV-16, patrz Cason J., Clin. Immunother. 1994; 1(4) i Hagenesee M.E., Infections in Medicine (7) -6,9-64.

8 [0029] Pomimo, Ŝe występuje niewielka zmienność wszystkie opisane genomy HPV zawierają co najmniej osiem genów wczesnych, E1 do E8, oraz dwa geny późne, L1 i L2. Ponadto górny region regulatorowy niesie sekwencje regulatorowe, które wydają się kontrolować większość zdarzeń transkrypcyjnych w genomie HPV. [00] Szczepionki na bazie L1 HPV ujawniono w WO94/0012, WO94/137, WO93/02184 i WO94/0792. Taka szczepionka moŝe zawierać antygen L1 w postaci monomeru, kapsomeru lub cząstki wirusopodobnej (VLP). Sposoby wytwarzania VLP są dobrze znane w dziedzinie wynalazku i obejmują rozwiązania rozkładania-składania VLP w celu zapewnienia zwiększonej jednorodności, przykładowo jak opisano w WO9916 i US Takie cząstki mogą dodatkowo zawierać białka L2. Opisano szczepionki na bazie L2, przykładowo w WO93/ Inne rozwiązania szczepionek HPV są oparte na wczesnych białkach, takich jak E7, lub białkach fuzyjnych, takich jak L2-E7. [0031] W WO ujawniono kompozycję szczepionki zawierającą immunologicznie czynną saponinę i sterol. [0032] Nadal istnieje zapotrzebowanie na ulepszone szczepionki, w szczególności w przypadku grypy, a zwłaszcza w przypadku pandemii grypy i dla populacji ludzi starszych, albo w przypadku szczepionek HPV. [0033] Adiuwanty zawierające połączenia lipopolisacharydu i saponin Quillaja zostały wcześniej ujawnione przykładowo w EP W tym opisie wykazano silny synergizm gdy lipopolisacharyd (3D-MPL) połączono z saponiną Quillaja (QS21). Obecnie stwierdzono, Ŝe dobre właściwości adiuwantowe moŝna uzyskać z uŝyciem połączeń lipopolisacharydu i saponiny Quillaja jako immunostymulantów w kompozycji adiuwantowej, nawet gdy immunostymulanty są obecne w niskich ilościach w dawce dla człowieka. STRESZCZENIE WYNALAZKU [0034] W pierwszym aspekcie niniejszego wynalazku dostarcza się kompozycję immunogenną w objętości odpowiedniej do dawki dla człowieka, zawierającą antygen lub preparat antygenowy w połączeniu z adiuwantem, który to adiuwant zawiera immunologicznie czynną frakcję saponiny pochodzącą z kory Quillaja Saponaria Molina obecną w postaci liposomu oraz lipopolisacharyd, przy czym zarówno ta frakcja saponiny, jak i ten lipopolisacharyd są obecne w tej dawce dla człowieka na poziomie między 1 µg i µg. [003] W drugim aspekcie niniejszego wynalazku dostarcza się kompozycję immunogenną zawierającą wirus grypy lub jego preparat antygenowy w połączeniu z adiuwantem saponinowym obecnym w postaci liposomu. W szczególnej postaci tego aspektu kompozycja immunogenna ponadto zawiera pochodną lipidu A, taką jak 3D-MPL. [0036] Dogodnie adiuwant saponinowy w postaci liposomu według wynalazku zawiera

9 czynną frakcję saponiny pochodzącej z kory Quillaja Saponaria Molina, taką jak QS21, i sterol, taki jak cholesterol, w stosunku saponina:sterol od 1:1 do 1:0 wag./wag.. [0037] W szczególności ta kompozycja immunogenna zawiera antygen z epitopem dla komórek T CD4. Alternatywnie ta kompozycja immunogenna zawiera antygen z epitopem dla komórek B. [0038] Wynalazek dotyczy takŝe zastosowania wirusa grypy lub jego preparatu antygenowego oraz adiuwanta zawierającego immunologicznie czynną frakcję saponiny pochodzącą z kory Quillaja Saponaria Molina obecną w postaci liposomu i lipopolisacharyd, do wytwarzania kompozycji immunogennej do profilaktyki zakaŝenia i/lub choroby wywołanej wirusem grypy. [0039] Wynalazek dotyczy takŝe zastosowania antygenu lub antygenów ludzkiego wirusa brodawczaka albo jego preparatu antygenowego oraz adiuwanta zawierającego immunologicznie czynną frakcję saponiny pochodzącą z kory Quillaja Saponaria Molina obecną w postaci liposomu i lipopolisacharyd, do wytwarzania kompozycji immunogennej do profilaktyki zakaŝenia i/lub choroby wywołanej ludzkim wirusem brodawczaka. [0040] Wynalazek dotyczy takŝe zastosowania antygenu lub antygenów wirusa cytomegalii albo jego preparatu antygenowego oraz adiuwanta zawierającego immunologicznie czynną frakcję saponiny pochodzącą z kory Quillaja Saponaria Molina obecną w postaci liposomu i lipopolisacharyd, do wytwarzania kompozycji immunogennej do profilaktyki zakaŝenia i/lub choroby wywołanej wirusem cytomegalii. [0041] Wynalazek dotyczy takŝe zastosowania antygenu lub antygenów Streptococcus pneumoanie lub ich preparatu antygenowego oraz adiuwanta zawierającego immunologicznie czynną frakcję saponiny pochodzącą z kory Quillaja Saponaria Molina obecną w postaci liposomu i lipopolisacharyd, do wytwarzania kompozycji immunogennej do profilaktyki zakaŝenia i/lub choroby wywołanej Streptococcus pneumoniae. [0042] Wynalazek dotyczy takŝe zastosowania antygenu lub antygenów Plasmodium falciparum albo ich preparatu antygenowego oraz adiuwanta zawierającego immunologicznie czynną frakcję saponiny pochodzącą z kory Quillaja Saponaria Molina obecną w postaci liposomu i lipopolisacharyd, do wytwarzania kompozycji immunogennej do profilaktyki zakaŝenia Plasmodium falciparum i/lub malarii. [0043] Wynalazek dotyczy takŝe zastosowania antygenu lub antygenów wirusa ospy wietrznej i półpaśca lub jego preparatu antygenowego oraz adiuwanta zawierającego immunologicznie czynną frakcję saponiny pochodzącą z kory Quillaja Saponaria Molina obecną w postaci liposomu i lipopolisacharyd, do wytwarzania kompozycji immunogennej do profilaktyki zakaŝenia i/lub choroby wywołanej wirusem ospy wietrznej i półpaśca.

10 [0044] W innym aspekcie dostarcza się zastosowanie (a) antygenu lub jego preparatu antygenowego oraz (b) określonego tutaj powyŝej adiuwanta do wytwarzania kompozycji immunogennej do wywoływania u człowieka co najmniej jednego lub co najmniej dwóch albo wszystkich spośród poniŝszych efektów: (i) ulepszonej odpowiedzi immunologicznej komórek T CD4 przeciw temu antygenowi lub jego preparatowi antygenowemu, (ii) ulepszonej humoralnej odpowiedzi immunologicznej przeciw temu antygenowi lub jego preparatowi antygenowemu, (iii) ulepszonej odpowiedzi komórek B pamięci przeciw temu antygenowi lub jego preparatowi antygenowemu. [004] W szczególności tym antygenem jest antygen lub preparat antygenowy wirusa grypy, HPV, wirusa cytomegalii (CMV), wirusa ospy wietrznej i półpaśca (VZV), Streptococcus pneumoniae lub malarii, a tym człowiekiem jest osobnik lub populacja o obniŝonej odporności, tak jak osoba dorosła o wysokim ryzyku, osoba satrsza lub dziecko. W szczególnej postaci dostarcza się zastosowanie antygenu lub jego preparatu antygenowego oraz określonego tutaj adiuwanta do wytwarzania kompozycji immunogennej do szczepienia człowieka, w szczególności człowieka starszego, przeciw patogenowi z którego pochodzi antygen kompozycji immunogennej. W szczególności ten antygen jest antygenem lub preparatem antygenowym wirusa grypy, ludzkiego wirusa brodawczaka, wirusa cytomegalii, wirusa ospy wietrznej i półpaśca, Streptococcus pneumoniae, Plasmodium parasite. [0046] Dostarcza się takŝe sposób szczepienia obejmujący dostarczanie antygenu lub kompozycji antygenowej, w szczególności wirusa grypy lub HPV, wirusa cytomegalii, wirusa ospy wietrznej i półpaśca, Streptococcus pneumoniae, Plasmodium parasite, albo ich preparatu antygenowego oraz określonego tutaj powyŝej adiuwanta osobnikowi lub populacji potrzebującym tego. [0047] W szczególnej postaci kompozycja immunogenna jest zdolna do wywoływania ulepszonej odpowiedzi immunologicznej komórek T CD4 przeciw temu antygenowi lub jego preparatowi antygenowemu, a w szczególności jest ponadto zdolna do wywoływania humoralnej odpowiedzi immunologicznej lub ulepszonej odpowiedzi komórek B pamięci lub obydwu z nich, w porównaniu z odpowiedzią uzyskaną dla nieadiuwantowanego antygenu lub kompozycji antygenowej. W szczególności ta odpowiedź immunologiczna komórek T CD4 obejmuje wywołanie krzyŝowej odpowiedzi komórek T pomocniczych. W szczególności ta humoralna odpowiedź immunologiczna obejmuje wywołanie krzyŝowej humoralnej odpowiedzi immunologicznej. [0048] W kolejnej postaci dostarcza się sposób lub zastosowanie określone tutaj powyŝej do ochrony przed zakaŝeniem lub chorobą wywołaną przez patogen, który jest wariantem patogenu, z którego pochodzi antygen w kompozycji immunogennej. W innej postaci do-

11 1 2 3 starcza się sposób lub zastosowanie określone tutaj powyŝej do ochrony przed zakaŝeniami lub chorobami wywołanymi przez patogen, który zawiera antygen, który jest wariantem tego antygenu w kompozycji immunogennej. W szczególnej postaci dostarcza się zastosowanie antygenu, w szczególności grypy lub HPV, lub jego preparatu antygenowego do wytwarzania kompozycji immunogennej do ponownego szczepienia ludzi wcześniej szczepionych kompozycją immunogenną zawierającą antygen, w szczególności grypy lub HPV, lub jego preparat antygenowy, w połączeniu z opisanym tutaj adiuwantem. [0049] W szczególnej postaci kompozycja stosowana do ponownego szczepienia moŝe dodatkowo zawierać adiuwant. W innej szczególnej postaci kompozycja immunogenna do ponownego szczepienia zawiera antygen, który ma wspólne epitopy dla komórek T CD4 z antygenem lub kompozycją antygenową stosowanymi do wcześniejszego szczepienia. W szczególności kompozycja immunogenna do ponownego szczepienia zawiera wirus grypylub jego preparat antygenowy, który ma wspólne epitopy dla komórek T CD4 z wirusem grypy lub jego preparatem antygenowym, który zastosowano do pierwszego szczepienia. [000] W pierwszym aspekcie ponowne szczepienie wykonuje się u osobników, których szczepiono przeciw grypie w poprzednim sezonie. Zazwyczaj ponowne szczepienie wykonuje się co najmniej 6 miesięcy po pierwszym szczepieniu, korzystnie 8 do 14 miesięcy później, korzystniej około do 12 miesięcy później. W innym aspekcie ponowne szczepienie wykonuje się u osobników, których szczepiono kompozycją zawierającą wirus grypy lub jego preparat antygenowy, przy czym co najmniej jeden szczep jest związany z wybuchem pandemii lub wykazuje potencjał do tego, Ŝeby był związany z wybuchem pandemii. [001] W kolejnym aspekcie niniejszego wynalazku dostarcza się zastosowanie wirusa grypy lub jego preparatu antygenowego z pierwszego szczepu grypy do wytwarzania określonej tutaj kompozycji immunogennej do ochrony przed zakaŝeniami grypą wywołanymi wariantem szczepu grypy. [002] Wynalazek dotyczy takŝe sposobu szczepienia obejmującego dostarczanie wirusa grypy lub jego preparatu antygenowego oraz określonego tutaj adiuwanta. [003] W innym aspekcie dostarcza się sposób szczenienia osobnika będącego człowiekiem lub populacji ludzi o obniŝonej odporności, takich jak osoby dorosłe o wysokim ryzyku lub osoby starsze, obejmujący podawanie kompozycji immunogennej przeciw grypie zawierającej wirus grypy lub jego preparat antygenowy w połączeniu z określonym tutaj adiuwantem. [004] W jeszcze innej postaci wynalazek dostarcza sposób ponownego szczepienia ludzi wcześniej szczepionych kompozycją immunogenną przeciw grypie zawierającą antygen

12 grypy lub jego preparat antygenowy z co najmniej jednego szczepu wirusa grypy w połączeniu z określonym tutaj adiuwantem, który to sposób obejmuje podawanie temu człowiekowi kompozycji immunogennej zawierającej adiuwantowany albo nieadiuwantowany wirus grypy lub jego preparat antygenowy. [00] Wynalazek dotyczy takŝe sposobu wytwarzania kompozycji immunogennej obejmującego łączenie adiuwanta saponinowego w postaci liposomu z wirusem grypy lub jego preparatem antygenowym oraz ewentualnie z 3D-MPL. [006] Inne aspekty i zalety niniejszego wynalazku opisano szerzej w poniŝszym szczegółowym opisie jego korzystnych postaci. OPIS RYSUNKÓW [007] Figura 1 Schematyczne przedstawienie wytwarzania MPL. Figura 2 Odpowiedź humoralna przeciw róŝnym szczepom wirusa grypy po szczepieniu fretek eksperymentalnymi preparatami: Test hamowania hemaglutynacji (GMT +/- IC9) przed heterologicznym szczepieniem pierwotnym i po nim (H1N1 A/Stockholm/24/90), po immunizacji (H1N1 A/New Caledonia//99, H3N2 A/Panama /07/ 99 i B/Shangdong/7/97) oraz po heterologicznej prowokacji (H3N2 A/Wyoming /3/03). Figura 3 Badanie na fretkach: Mianowanie wirusa w popłuczynach z nosa po prowokacji (Dzień 42). Figura 4 Badanie na myszach: Odpowiedź humoralna przeciw trzem szczepom szczepionkowym wirusa grypy po immunizacji myszy eksperymentalnymi preparatami: Test hamowania hemaglutynacji (GMT +/- IC9) 21 dni po immunizacji (H1N1 A/New Caledonia//99, H3N2 A/Wyoming/3/03 i B/Jiangsu//03). Figura Badanie na myszach: Komórkowa odpowiedź immunologiczna: odpowiedzi komórek T CD4+ specyficznych względem grypy w Dniu 7 po immunizacji. Figura 6 Badanie na myszach: CMI dla CD4 Połączone szczepy (wszystkie podwójnie) - Dzień 0 i Dzień 21. Figura 7 GMT w dniach 0 i 21 dla przeciwciał HI. Figura 8: Występowanie miejscowych i ogólnych objawów u ludzi (całkowite oraz powiązane stopnia 3) odnotowane podczas 7-dniowego okresu obserwacji po immunizacji adiuwantowanymi preparatami wirusa grypy, porównanie adiuwantów zawierających dwa róŝne stęŝenia immunostymulantów. Figura 9: Odpowiedzi humoralne na L1HPV 16 i 18 u myszy po immunizacji adiuwantowanymi preparatami HPV, porównanie adiuwantów zawierających dwa róŝne stęŝe-

13 nia immunostymulantów. Figura : Komórkowe odpowiedzi immunologiczne u myszy: Wybarwienie wewnątrzkomórkowych cytokin Komórki T CD4+ VLP16 i 18 po immunizacji adiuwantowanymi preparatami HPV, porównanie adiuwantów zawierających dwa róŝne stęŝenia immunostymulantów. Figura 11: Wytwarzanie specyficznych komórek B pamięci po immunizacji adiuwantowanymi preparatami HPV, porównanie adiuwantów zawierających dwa róŝne stęŝenia immunostymulantów. Figura 12: Przedkliniczne porównanie adiuwantowanych szczepionek przeciw S. pneumoniae u myszy, porównanie adiuwantów zawierających dwa róŝne stęŝenia immunostymulantów. Figura 13: Miana anty-gb u świnki morskiej według ELISA po immunizacji adiuwantowaną szczepionką Gb, porównanie adiuwantów zawierających dwa róŝne stęŝenia immunostymulantów. Figura 14: Miana neutralizacji anty-cmv u świnki morskiej po immunizacji adiuwantowaną szczepionką Gb, porównanie adiuwantów zawierających dwa róŝne stęŝenia immunostymulantów. Figura 1: Miana anty-gb u myszy według ELISA po immunizacji adiuwantowaną szczepionką gb. Figura 16: Miana neutralizacji anty-cmv u myszy po immunizacji adiuwantowaną szczepionką gb. Figura 17: Badanie na myszach: Odporność komórkowa komórki CD4+ i CD8+ specyficzne względem CMV po ponownej stymulacji pulą peptydów gb (7 dni po drugiej immunizacji) Figura 18: Badanie na myszach: Odporność komórkowa komórki CD4+ specyficzne względem CMV po ponownej stymulacji dwiema róŝnymi dawkami puli peptydów gb (21 dni po drugiej immunizacji). Figura 19: Badanie na myszach: Odporność komórkowa komórki CD8+ specyficzne względem CMV po ponownej stymulacji dwiema róŝnymi dawkami puli peptydów gb (21 dni po drugiej immunizacji). Figura : Średnie geometryczne mian przeciwciał (GMT) przeciw białku circumsporozoite CSP po immunizacji adiuwantowaną szczepionką RTS,S u myszy; porównanie adiuwantów zawierających dwa róŝne stęŝenia immunostymulantów. Figura 21: Średnie geometryczne mian przeciwciał (GMT) przeciw antygenowi powierzchniowemu wirusa zapalenia wątroby typu B (HBs) po immunizacji adiuwanto-

14 waną szczepionką RTS,S u myszy; porównanie adiuwantów z immunostymulantami w dwóch róŝnych stęŝeniach. Figura 22: Ekspresja ex vivo IL-2 i/lub IFN gamma przez komórki T CD4 i CD8 specyficzne względem CSP po immunizacji adiuwantowaną kompozycją immunogenną RTS,S, porównanie adiuwantów z immunostymulantami w dwóch róŝnych stęŝeniach. Figura 23: Ekspresja ex vivo IL-2 i/lub IFN gamma przez komórki T CD4 i CD8 T specyficzne względem HBs po immunizacji adiuwantowaną kompozycją immunogenną RTS,S, porównanie adiuwantów z immunostymulantami w dwóch róŝnych stęŝeniach. Figura 24: Odpowiedzi humoralne u myszy po immunizacji adiuwantowaną trójwaŝną szczepionką przeciw grypie typu split (A/New Caledonia, A/Wyoming, B/Jiangsu), immunostymulanty w dwóch róŝnych stęŝeniach. Figura 2: Komórkowa odpowiedź immunologiczna u myszy po immunizacji adiuwantowaną trójwaŝną szczepionką przeciw grypie (A/New Caledonia, A/Wyoming, B/Jiangsu), immunostymulanty w dwóch róŝnych stęŝeniach. Figura 26: Wyniki przedkliniczne u myszy porównujące szczepionki VZV ge adiuwantowane AS01B lub AS01E. Figura 27: Miana wirusa w popłuczynach z nosa po szczepieniu pierwotnym i prowokacji antygenami wirusa grypy - immunizacja A/New Caledonia, A/Wyoming, B/Jiangsu w postaci zwykłej lub adiuwantowanej kompozycjami adiuwantowymi zawierającymi immunostymulanty w dwóch róŝnych stęŝeniach, u fretek. Figura 28: Monitorowanie temperatury ciała u fretek po szczepieniu pierwotnym i prowokacji antygenami grypy. Immunizacja A/New Caledonia, A/Wyoming, B/Jiangsu w postaci zwykłej lub adiuwantowanej kompozycjami adiuwantowymi zawierającymi immunostymulanty w dwóch róŝnych stęŝeniach. Figura 29: Miana anty-hi dla szczepów A w preparacie szczepionki trójwaŝnej po immunizacji i prowokacji preparatami antygenu wirusa grypy. Immunizacja A/New Caledonia, A/Wyoming, B/Jiangsu w postaci zwykłej lub adiuwantowanej kompozycjami adiuwantowymi zawierającymi immunostymulanty w dwóch róŝnych stęŝeniach. Figura : Miana anty-hi dla B/Jiangsu oraz szczepu powstałego w wyniku dryfu zastosowanego do prowokacji po immunizacji i prowokacji preparatami antygenu grypy. Immunizacja A/New Caledonia, A/Wyoming, B/Jiangsu w postaci zwykłej lub adiuwantowanej kompozycjami adiuwantowymi zawierającymi immunostymulanty w dwóch róŝnych stęŝeniach. SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU [008] Niniejsi wynalazcy odkryli, Ŝe kompozycja adiuwantowa zawierająca saponinę

15 obecną w postaci liposomu oraz lipopolisacharyd, w której kaŝdy immunostymulant jest obecny na poziomie między 1 i µg na dawkę dla człowieka moŝe polepszyć odpowiedzi immunologiczne na preparat antygenowy, przy czym równocześnie wykazuje niŝszą reaktogenność niŝ pewne preparaty ze stanu techniki, w których immunostymulanty były obecne na wyŝszych poziomach na dawkę dla człowieka. [009] Ponadto niniejsi wynalazcy odkryli, Ŝe preparat przeciw grypie zawierający wirus grypy lub jego preparat antygenowy razem z adiuwantem zawierającym saponinę obecną w postaci liposomu oraz ewentualnie dodatkowo pochodną lipidu A, taką jak 3D-MPL, był zdolny do polepszenia odpowiedzi immunologicznej komórek T CD4 przeciw temu antygenowi lub kompozycji antygenowej w porównaniu z odpowiedzią uzyskaną dla nieadiuwantowanego wirusa lub jego preparatu antygenowego. Preparaty adiuwantowane saponiną obecną w postaci liposomu są korzystnie stosowane do wywołania odpowiedzi komórek T CD4 przeciw grypie, które są zdolne do wykrycia epitopów grypy prezentowanych przez cząsteczki MHC klasy II. Niniejszy zgłaszający odkrył, Ŝe skuteczne jest skierowanie komórkowej odpowiedzi immunologicznej w celu zwiększenia odpowiedzi przeciw homologicznym i szczepom grypy powstałym w wyniku dryfu (po szczepieniu i zakaŝeniu). [0060] Szczególną postacią niniejszego wynalazku jest to, Ŝe kompozycje do stosowania w niniejszym wynalazku mogą być zdolne do zapewniania u ludzi lepszej seroprotekcji przeciw grypie po ponownym szczepieniu, co oceniono u kilku osobników będących ludźmi spełniających korelaty ochrony przed grypą. Ponadto inną szczególną postacią jest to, Ŝe ta kompozycja do stosowania w niniejszym wynalazku będzie takŝe zdolna do wywołania wyŝszej odpowiedzi komórek B pamięci po pierwszym szczepieniu osobnika będącego człowiekiem oraz wyŝszej odpowiedzi humoralnej po ponownym szczepieniu, w porównaniu z kompozycją nieadiuwantowaną. [0061] Adiuwantowane kompozycje przeciw grypie według wynalazku wykazują kilka zalet: 1) Ulepszoną immunogenność: pozwolą na przywrócenie słabej odpowiedzi immunologicznej u ludzi starszych (ponad 0 lat Ŝycia, zazwyczaj ponad 6 lat Ŝycia) do poziomów obserwowanych u młodych osób (odpowiedzi przeciwciał i/lub komórek T); 2) Ulepszony profil ochrony krzyŝowej: zwiększona ochrona krzyŝowa przed wariantowymi (powstałymi w wyniku dryfu) szczepami grypy; 3) UmoŜliwią one takŝe stosowanie obniŝonej dawki antygenu dla podobnej odpowiedzi, co zapewnia zwiększoną wydajność w sytuacjach kryzysowych (przykładowo przy pandemii). [0062] W innym aspekcie wynalazku wynalazcy odkryli, Ŝe określona tutaj kompozycja

16 adiuwantowa wykazuje wyniki immunogeności zarówno pod kątem wytwarzania przeciwciał, jak i częstości CD4 specyficznych względem grypy po szczepieniu, które odpowiadają lub czasami są wyŝsze niŝ te wytwarzane z uŝyciem szczepionki nieadiuwantowanej. Efekt ten jest szczególnie wartościowy dla populacji osób starszych i moŝna go uzyskać z uŝyciem określonego tutaj adiuwanta zawierającego niŝszą dawkę immunostymulantów. Ponadto zaobserwowano tendencję do częstszych objawów reaktogenności w grupie, która otrzymała szczepionkę adiuwantowaną najwyŝszym stęŝeniem immunostymulantów, w porównaniu z grupą, która otrzymała szczepionkę adiuwantowaną, w której immunostymulanty są w niŝszym stęŝeniu. [0063] Stwiedzenia te moŝna zastosować do innych postaci takich samych antygenów lub innych antygenów. Adiuwant saponinowy [0064] Kompozycja adiuwantowa według wynalazku zawiera adiuwant saponinowy obecny w postaci liposomu. [006] Szczególnie odpowiednią saponiną do stosowania w niniejszym wynalazku jest Quil A i jej pochodne. Quil A jest preparatem saponinowym wyizolowanym z południowoamerykańskiego drzewa Quillaja Saponaria Molina, a jego aktywność adiuwantowa została po raz pierwszy opisana przez Dalsgaarda i in. w 1974 ( Saponin adjuvants, Archlv. für die gesamte Virusforschung, tom 44, Springer Verlag, Berlin, str ). Metodą HPLC wyodrębniono oczyszczone fragmenty Quil A, które zachowują aktywność adiuwantową bez toksyczności związanej z Quil A (EP ), przykładowo QS7 i QS21 (znane takŝe jako QA7 i QA21). QS21 jest naturalną saponiną pochodzącą z kory Quillaja saponaria Molina, która indukuje cytotoksyczne komórki T CD8+ (CTL), komórki Th1 oraz odpowiedź przeciwciał zdominowaną przez IgG2a, i jest korzystną saponiną w kontekście niniejszego wynalazku. [0066] W odpowiedniej postaci niniejszego wynalazku adiuwant saponinowy w kompozycji immunogennej stanowi pochodna Quil A z Saponaria Molina, korzystnie immunologicznie czynna frakcja Quil A, taka jak QS17 lub QS21, dogodnie QS21. W jednej postaci kompozycje według wynalazku zawierają immunologicznie czynną frakcję saponiny w zasadniczo czystej postaci. Korzystnie kompozycje według wynalazku zawierają QS21 w zasadniczo czystej postaci, tj. QS21 jest czysta w co najmniej 90%, przykładowo czysta w co najmniej 9% lub czysta w co najmniej 98%. [0067] W szczególnej postaci QS21 dostarcza się w postaci jej mniej reaktogennej kompozycji, która jest wygaszona egzogennym sterolem, takim jak przykładowo cholesterol. Kilka konkretnych postaci mniej reaktogennych kompozycji, w których QS21 jest wygaszona

17 występującym egzogennym cholesterolem. W szczególnej postaci saponina/sterol są w postaci struktury liposomu (WO 96/33739, Przykład 1). W tej postaci liposomy dogodnie zawierają obojętny lipid, przykładowo fosfatydylocholinę, która jest dogodnie w postaci niekrystalicznej w temperaturze pokojowej, przykładowo fosfatydylocholinę z Ŝółtka jaja, dioleoilofosfatydylocholinę (DOPC) lub dilaurylofosfatydylocholinę. Liposomy mogą tak- Ŝe zawierać naładowany lipid, który zwiększa stabilność struktury lipsom-qs21 dla liposomów złoŝonych z nasyconych lipidów. W tych przypadkach ilość naładowanego lipidu wynosi dogodnie 1-% wag./wag., korzystnie -%. Stosunek sterolu do fosfolipidu wynosi 1-0% (mol./mol.), dogodnie -2%. [0068] Odpowiednie sterole obejmują β-sitosterol, stigmasterol, ergosterol, ergokalcyferol i cholesterol. W jednej konkretnej postaci kompozycja adiuwantowa jako sterol zawiera cholesterol. Sterole te są dobrze znane w dziedzinie wynalazku, przykładowo cholesterol ujawniono w Merck Index, wyd. 11, str. 341, jako występujący naturalnie sterol obecny w tłuszczu zwierzęcym. [0069] Kompozycje adiuwantowe według wynalazku zawierające QS21 i sterol, w szczególności cholesterol, wykazują obniŝoną reaktogenność w porównaniu z kompozycjami w których brak jest sterolu, przy czym działanie adiuwantowe jest utrzymywane. Badania reaktogenności moŝna prowadzić metodami ujawnionymi w WO 96/ Sterol zgodnie z wynalazkiem oznacza egzogenny sterol, tj. sterol, który nie jest endogenny dla organizmu, z którego pobrano preparat antygenowy, ale jest dodawany do preparatu antygenowego lub później w momencie formułowania. Zazwyczaj sterol moŝna dodawać podczas późniejszego formułowania preparatu antygenowego z adiuwantem saponinowym z zastosowaniem przykładowo saponiny w jej postaci wygaszonej sterolem. Dogodnie egzogenny sterol jest zasocjowany z adiuwantem saponinowym, jak opisano w WO 96/ [0070] Gdy czynną frakcję saponiny stanowi QS21, stosunek QS21:sterol będzie zazwyczaj rzędu 1:0 do 1:1 (wag./wag.), dogodnie w zakresie 1: do 1:1 (wag./wag.), a korzystnie 1: do 1:1 (wag./wag.). Dogodnie obecny jest nadmiar sterolu, przy czym stosunek QS21:sterol wynosi co najmniej 1:2 (wag./wag.). W jednej postaci stosunek QS21:sterol wynosi 1: (wag./wag.). Sterolem jest dogodnie cholesterol. [0071] Inne przydatne saponiny pochodzą z roślin Aesculus hippocastanum lub Gyophilla struthium. Inne saponiny, które opisano w literaturze obejmują escynę, którą opisano w Merck Index (wyd. 12: wpis 3737) jako mieszaninę saponin występujących w nasionach kasztanowca zwyczajnego, łac. Aesculus hippocastanum. Opisano jej wyodrębnianie przez chromatografię i oczyszczanie (Fiedler, Arzneimittel-Forsch. 4, 213 (193)) oraz z zastosowaniem Ŝywic jonowymiennych (Erbring i in., US ). Oczyszczono frakcje escy-

18 ny i wykazano, Ŝe są one biologicznie czynne (Yoshikawa M, i in. (Chem Pharm Bull (Tokyo) sierpień 1996;44(8): )). Przykładowo opisano takŝe sapoalbin z Gypsophilla struthium (R. Vochten i in., 1968, J. Pharm.Belg., 42, ) w powiązaniu z wytwarzaniem ISCOM. [0072] Kluczowym aspektem niniejszego wynalazku jest fakt, Ŝe immunologicznie czynną saponinę, którą korzystnie stanowi QS21, moŝna stosować w mniejszych ilościach niŝ te, które wcześniej uwaŝano za przydatne, dogodnie między 1 i µg na dawkę kompozycji immunogennej dla człowieka. [0073] Zatem wynalazek dostarcza dawkę kompozycji immunogennej dla człowieka zawierającą immunologicznie czynną saponinę, korzystnie QS21, na poziomie 1 - µg. [0074] W jednej postaci kompozycja immunogenna w objętości, która jest odpowiednia do dawki dla człowieka, która to dawka kompozycji immunogennej dla człowieka zawiera QS21 na poziomie około 2 µg, przykładowo między - µg, dogodnie między µg lub między 22 i 28 µg lub między 23 i 27 µg lub między 24 i 26 µg lub 2 µg. W innej postaci dawka kompozycji immunogennej dla człowieka zawiera QS21 na poziomie około µg, przykładowo między i 1 µg, dogodnie między 6 i 14 µg, przykładowo między 7 i 13 µg lub między 8 i 12 µg lub między 9 i 11 µg lub µg. [007] W kolejnej postaci dawka kompozycji immunogennej dla człowieka zawiera QS21 na poziomie około µg, przykładowo między 1 i 9 µg lub między 2 i 8 µg lub dogodnie między 3 i 7 µg lub 4 i 6 µg lub µg. [0076] Odpowiednią ilością QS21 jest przykładowo dowolna ilość spośród 1, 2, 3, 4,, 6, 7, 8, 9,, 11, 12, 13, 14, 1, 16, 17, 18, 19,, 21, 22, 23, 24, 2, 26, 27, 28, 29, µg (wag./obj.) na dawkę kompozycji immunogennej dla człowieka. [0077] Określenie dawka dla człowieka oznacza dawkę, która ma objętość odpowiednią do stosowania u człowieka. Ogólnie wynosi ona między 0,3 i 1, ml. W jednej postaci dawka dla człowieka wynosi 0, ml. W kolejnej postaci dawka dla człowieka jest większa niŝ 0, ml, przykładowo wynosi 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 lub 1 ml. W kolejnej postaci dawka dla człowieka wynosi między 1 ml i 1, ml. Wynalazek charakteryzuje się tym, Ŝe kaŝda dawka dla człowieka zawiera między 1 i µg QS21. [0078] Wynalazek ponadto dostarcza kompozycję adiuwantową zawierającą między 1 i µg QS21. Zazwyczaj taka kompozycja adiuwantowa będzie mieć objętość odpowiednią do dawki dla człowieka. Gdy adiuwant jest w postaci ciekłej do połączenia z ciekłą postacią kompozycji antygenowej, kompozycja adiuwantowa będzie mieć objętość odpowiednią do dawki dla człowieka, która wynosi w przybliŝeniu połowę zamierzonej objętości końcowej dawki dla człowieka, przykładowo objętość 360 µl dla zamierzonej dawki dla człowieka

19 ,7 ml lub objętość µl dla zamierzonej dawki dla człowieka 0, ml. Kompozycję adiuwantową rozcieńcza się gdy łączy się ją z kompozycją antygenową, z dostarczeniem końcowej dawki szczepionki dla człowieka. Końcowa objętość takiej dawki będzie się oczywiście zmieniać zaleŝnie od początkowej objętości kompozycji adiuwantowej i objętości kompozycji antygenowej dodanej do kompozycji adiuwantowej. W alternatywnej postaci ciekły adiuwant stosuje się do roztwarzania liofilizowanej kompozycji antygenowej. W tej postaci objętość odpowiednia do dawki kompozycji adiuwantowej dla człowieka jest w przybliŝeniu równa końcowej objętości dawki dla człowieka. Ciekłą kompozycję adiuwantową dodaje się do fiolki zawierającej liofilizowaną kompozycję antygenową. Końcowa dawka dla człowieka moŝe się zmieniać między 0, i 1, ml. W konkretnej postaci dawka dla człowieka wynosi 0, ml i w tej postaci kompozycja szczepionki według wynalazku będzie zawierać QS21 na poziomie między 1 i µg na 0, ml dawki dla człowieka, ponadto w tej postaci kompozycja adiuwantowa według wynalazku będzie zawierać QS21 na poziomie między 1 i µg na µl kompozycji adiuwantowej lub na 00 µl kompozycji adiuwantowej zaleŝnie od tego czy kompozycja adiuwantowa jest przeznaczona do połączenia odpowiednio z ciekłą czy z liofilizowaną kompozycją antygenową. [0079] W szczególności w przypadku łączenia z antygenem grypy stosowana ilość QS21 moŝe stanowić przykładowo ilość 1 do 0 µg (wag./obj.) na dawkę kompozycji, korzystnie ilość do 0 µg (wag./obj.) na dawkę kompozycji. Odpowiednią ilością QS21 jest przykładowo dowolna ilość spośród 1, 2, 3, 4,, 6, 7, 8, 9,, 11, 12, 13, 14, 1, 16, 17, 18, 19,, 21, 22, 23, 24, 2, 26, 27, 28, 29,, 31, 32, 33, 34, 3, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 4, 46, 47, 48, 49 lub 0 µg (wag./obj.) na dawkę kompozycji. Korzystniej ilość QS21 jest w zakresie 2 do 7 µg (wag./obj.) na dawkę kompozycji. Zazwyczaj dawka kompozycji będzie w zakresie od około 0, ml do około 1 ml. Typowa dawka szczepionki wynosi 0, ml, 0,6 ml, 0,7 ml, 0,8 ml, 0,9 ml lub 1 ml. W korzystnej postaci końcowe stę- Ŝenie zawartej QS21 wynosi 0 µg na ml kompozycji szczepionki lub 2 µg na 0, ml dawkę szczepionki. W innych korzystnych postaciach końcowe stęŝenie zawartej QS21 wynosi 3,7 µg lub 71,4 µg na ml kompozycji szczepionki. W szczególności objętość 0, ml dawki szczepionki zawiera 2 µg lub 0 µg QS21 na dawkę. [0080] Dawka QS21 jest dogodnie zdolna do zwiększenia odpowiedzi immunologicznej na antygen u człowieka. W szczególności odpowiednią ilością QS21 jest taka ilość, która polepsza potencjał immunologiczny kompozycji w porównaniu z kompozycją nieadiuwantowaną lub w porównaniu z kompozycją adiuwantowaną inną ilością QS21, podczas gdy jest ona dopuszczalna pod względem profilu reaktogenności. Adiuwant 3D-MPL

20 [0081] Kompozycja ponadto zawiera dodatkowy adiuwant, który stanowi lipopolisacharyd, dogodnie nietoksyczna pochodną lipidu A, w szczególności monofosforylo-lipid A lub w szczególności 3-deacylowany monofosforylo-lipid A (3D - MPL). [0082] 3D-MPL jest sprzedawany pod nazwą MPL przez GlaxoSmithKline Biologicals N.A. oraz jest nazywany w niniejszym dokumencie MPL lub 3D-MPL. Patrz przykładowo opisy patentowe US nr ; ; i D-MPL głównie wywołuje odpowiedzi komórek T CD4+ o fenotypie IFN-g (Th1). 3D-MPL moŝna wytwarzać sposobami ujawnionymi w GB A. Pod względem chemicznym jest on mieszaniną 3-deacylowanego monofosforylo-lipidu A z 3, 4, lub 6 acylowanymi łańcuchami. Korzystnie w kompozycjach według niniejszego wynalazku stosuje się 3D-MPL o małych cząstkach. 3D-MPL o małych cząstkach ma taką wielkość cząstek, Ŝe moŝe być jałowiony drogą filtracji przez filtr 0,22 µm. Takie preparaty opisano w WO 94/ [0083] Kluczowym aspektem niniejszego wynalazku jest fakt, Ŝe lipopolisacharyd, który korzystnie stanowi 3D-MPL, moŝe być stosowany w mniejszych ilościach niŝ wcześniej uwaŝano za przydatne, dogodnie między 1 i µg na dawkę kompozycji immunogennej dla człowieka. [0084] Zatem wynalazek dostarcza dawkę kompozycji immunogennej dla człowieka zawierającą lipopolisacharyd, korzystnie 3D-MPL, na poziomie między 1 i µg. [008] W jednej postaci dawka kompozycji immunogennej dla człowieka zawiera 3D- MPL na poziomie około 2 µg, przykładowo między - µg, dogodnie między µg lub między 22 i 28 µg lub między 23 i 27 µg lub między 24 i 26 µg lub 2 µg. [0086] W innej postaci dawka kompozycji immunogennej dla człowieka zawiera 3D-MPL na poziomie około µg, przykładowo między i 1 µg, dogodnie między 6 i 14 µg, przykładowo między 7 i 13 µg lub między 8 i 12 µg lub między 9 i 11 µg lub µg. W kolejnej postaci dawka kompozycji immunogennej dla człowieka zawiera 3D-MPL na poziomie około µg, przykładowo między 1 i 9 µg lub między 2 i 8 µg lub dogodnie między 3 i 7 µg lub 4 i 6 µg lub µg. Odpowiednią ilością -MPL jest przykładowo dowolna ilość spośród 1, 2, 3, 4,, 6, 7, 8, 9,, 11, 12, 13, 14, 1, 16, 17, 18, 19,, 21, 22, 23, 24, 2, 26, 27, 28, 29, µg (wag./obj.) na dawkę kompozycji immunogennej dla człowieka. [0087] W jednej postaci objętość dawki dla człowieka wynosi 0, ml. W kolejnej postaci kompozycja immunogenna ma objętość odpowiednią do dawki dla człowieka, która to objętość jest większa od 0, ml, przykładowo wynosi 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 lub 1 ml. W kolejnej postaci dawka dla człowieka wynosi między 1 ml i 1, ml. Wynalazek ponadto charakteryzuje się tym, Ŝe kaŝda dawka dla człowieka zawiera między 1 i µg 3D-MPL.

21 1 2 3 [0088] Wynalazek ponadto dostarcza kompozycję adiuwantową zawierającą między 1 i µg 3D-MPL. Zazwyczaj taka kompozycja adiuwantowa będzie mieć objętość odpowiednią do dawki dla człowieka. Gdy adiuwant jest w postaci ciekłej do połączenia z ciekłą postacią kompozycji antygenowej, kompozycja adiuwantowa będzie mieć objętość odpowiednią do dawki dla człowieka, która wynosi w przybliŝeniu połowę zamierzonej objętości końcowej dawki dla człowieka, przykładowo objętość 360 µl dla zamierzonej dawki dla człowieka 0,7 ml lub objętość µl dla zamierzonej dawki dla człowieka 0, ml. Kompozycję adiuwantową rozcieńcza się gdy łączy się ją z kompozycją antygenową, z dostarczeniem końcowej dawki kompozycji immunogennej dla człowieka. Końcowa objętość takiej dawki będzie się oczywiście róŝnić zaleŝnie od początkowej objętości kompozycji adiuwantowej oraz objętości kompozycji antygenowej dodanej do kompozycji adiuwantowej. W alternatywnej postaci ciekłą kompozycję adiuwantową stosuje się do roztwarzania liofilizowanej kompozycji antygenowej. W tej postaci objętość kompozycji adiuwantowej odpowiednia do dawki dla człowieka jest w przybliŝeniu równa końcowej objętości dawki dla człowieka. Ciekłą kompozycję adiuwantową dodaje się do fiolki zawierającej liofilizowaną kompozycję antygenową. Końcowa dawka dla człowieka moŝe się zmieniać między 0, i 1, ml. W konkretnej postaci dawka dla człowieka wynosi 0, ml, w postaci tej kompozycja szczepionki według wynalazku będzie zawierać 3D-MPL na poziomie między 1 i µg, na 0, ml dawki dla człowieka, ponadto w postaci tej kompozycja adiuwantowa według wynalazku będzie zawierać 3D-MPL na poziomie między 1 i µg na µl kompozycji adiuwantowej lub na 00 µl kompozycji adiuwantowej zaleŝnie od tego czy kompozycja adiuwantowa jest przeznaczona do połączenia odpowiednio z ciekłą lub liofilizowaną kompozycją antygenową. [0089] Gdy kompozycja immunogenna zawiera wirus grypy lub jego preparat antygenowy, kompozycja adiuwantowa, która zawiera saponinę w postaci liposomu, ewentualnie dodatkowo zawiera pochodną lipidu A, w szczególności monofosforylo-lipid A lub konkretniej 3D-MPL. W tej postaci 3D-MPL moŝna stosować przykładowo w ilości 1 do 0 µg (wag./obj.) na dawkę kompozycji, korzystnie w ilości do 0 µg (wag./obj.) na dawkę kompozycji. Odpowiednią ilością 3D-MPL jest przykładowo dowolna ilość spośród 1, 2, 3, 4,, 6, 7, 8, 9,, 11, 12, 13, 14, 1, 16, 17, 18, 19,, 21, 22, 23, 24, 2, 26, 27, 28, 29,, 31, 32, 33, 34, 3, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 4, 46, 47, 48, 49 lub 0 µg (wag./obj.) na dawkę kompozycji. Korzystniej ilość 3D-MPL jest w zakresie od 2 do 7 µg (wag./obj.) na dawkę kompozycji. Zazwyczaj dawka kompozycji będzie w zakresie od około 0, ml do około 1 ml. Typowymi dawkami szczepionki są 0, ml, 0,6 ml, 0,7 ml, 0,8 ml, 0,9 ml lub 1 ml. W jednej postaci końcowe stęŝenie zawartego 3D-MPL wynosi 0 µg

22 na ml kompozycji szczepionki lub 2 µg na 0, ml dawki szczepionki. W innej postaci końcowe stęŝenie zawartego 3D-MPL wynosi 3,7 µg lub 71,4 µg na ml kompozycji szczepionki. W szczególności objętość 0, ml dawki szczepionki zawiera 2 µg lub 0 µg 3D-MPL na dawkę. [0090] Dawka 3D-MPL jest dogodnie zdolna do zwiększenia odpowiedzi immunologicznej na antygen u człowieka. W szczególności odpowiednią ilością 3D-MPL jest taka ilość, która polepsza potencjał immunologiczny kompozycji w porównaniu z kompozycją nie adiuwantowaną lub w porównaniu z kompozycją adiuwantowaną inną ilością MPL, podczas gdy jest ona dopuszczalna pod względem profilu reaktogenności. [0091] Odpowiednimi kompozycjami według wynalazku są takie, w których liposomy są wytwarzane początkowo bez MPL (jak opisano w WO 96/33739), a MPL jest dodawany później, dogodnie w postaci małych cząstek poniŝej 0 nm lub cząstek, które są odpowiednie do jałowienia drogą filtracji przez membranę 0,22 µm. Zatem MPL nie jest zawarty wewnątrz błony pęcherzyka (co jest znane jako MPL out). Kompozycje, w których MPL jest zawarty wewnątrz błony pęcherzyka (znane jako MPL in) takŝe stanowią aspekt wynalazku. Antygen moŝe być zawarty wewnątrz błony pęcherzyka lub zawarty na zewnątrz błony pęcherzyka. Dogodnie rozpuszczalne antygeny znajdują się na zewnątrz, a antygeny hydrofobowe lub lipidowane znajdują się wewnątrz lub na zewnątrz błony. [0092] W jednej postaci kompozycja adiuwantowa według wynalazku zawiera zarówno lipopolisacharyd, jak i immunologicznie czynną saponinę. W szczególnej postaci wynalazku lipopolisacharyd stanowi 3D-MPL, a immunologicznie aktywną saponinę stanowi QS21. W kolejnej postaci wynalazku kompozycja adiuwantowa składa się zasadniczo z lipopolisacharydu i immunologicznie czynnej saponiny w preparacie liposomalnym. Dogodnie w jednej formie tej postaci kompozycja adiuwantowa składa się z 3D-MPL i QS21, ewentualnie ze sterolem, który korzystnie stanowi cholesterol. [0093] W kolejnej postaci wynalazku kompozycja adiuwantowa zawiera w preparacie liposomalnym lipopolisacharyd i immunologicznie czynną saponinę w połączeniu z jednym lub większą liczbą kolejnych immunostymulantów lub adiuwantów. Dogodnie w jednej formie tej postaci lipopolisacharyd stanowi 3D-MPL, a immunologicznie czynną saponinę stanowi QS21. [0094] W szczególnej postaci QS21 i 3D-MPL są obecne w takim samym końcowym stę- Ŝeniu na dawkę kompozycji immunogennej dla człowieka. W jednym aspekcie tej postaci dawka kompozycji immunogennej dla człowieka zawiera 3D-MPL na końcowym poziomie 2 µg i QS21 na końcowym poziomie 2 µg. W kolejnej postaci dawka kompozycji immunogennej dla człowieka zawiera kaŝdy z MPL i QS21 na końcowym poziomie µg.

23 W kolejnej szczególnej postaci dostarcza się kompozycję adiuwantową o objętości µl, zawierająca 3D-MPL na poziomie 2 µg i QS21 na poziomie 2 µg lub µg kaŝdego z MPL i QS21. [009] Antygeny, które moŝna stosować z kompozycjami adiuwantowymi według niniejszego wynalazku obejmują antygeny wirusowe, pasoŝytnicze, bakteryjne lub związane z nowotworami, przykładowo: Wirus grypy lub jego preparat antygenowy do stosowania zgodnie z niniejszym wynalazkiem, którym moŝe być rozszczepiony wirus grypy lub preparat antygenowy tego rozszczepionego wirusa. W alternatywnej postaci preparat wirusa grypy moŝe zawierać inny typ inaktywowanego antygenu grypy, taki jak inaktywowany cały wirus lub oczyszczone HA i NA - (szczepionka podjednostkowa) lub wirosom grypy. W jeszcze innej postaci wirus grypy moŝe być preparatem Ŝywego atenuowanego wirusa. [0096] Rozszczepiony wirus grypy lub preparat antygenowy tego rozszczepionego wirusa do stosowania zgodnie z niniejszym wynalazkiem stanowi dogodnie preparat inaktywowanego wirusa, w którym cząstki wirusa są rozerwane z uŝyciem detergentów lub innych odczynników, które rozpuszczają lipidową otoczkę. Rozszczepiony wirus lub preparaty antygenowe tego rozszczepionego wirusa dogodnie wytwarza się przez fragmentację całego wirusa grypy, zakaźnego albo inaktywowanego, przez solubilizujące stęŝenia rozpuszczalników organicznych lub detergentów, a następnie usunięcie całości lub większości solubilizatora oraz części lub większości materiału lipidowego wirusa. Preparat antygenowy tego rozszczepionego wirusa oznacza preparat rozszczepionego wirusa, który moŝe być poddany w pewnym stopniu oczyszczaniu w porównaniu z rozszczepionym wirusem, przy czym zachowuje on większość właściwości antygenowych składników rozszczepionego wirusa. Przykładowo, gdy jest on wytwarzany w jajach, rozszczepiony wirus moŝe zostać pozbawiony zanieczyszczających białek jaja albo gdy jest wytwarzany w hodowli komórkowej rozszczepiony wirus moŝe zostać pozbawiony zanieczyszczeń z komórki gospodarza. Preparat antygenowy rozszczepionego wirusa moŝe zawierać składniki antygenowe rozszczepionego wirusa pochodzące z więcej niŝ jednego szczepu wirusa. Szczepionki zawierające rozszczepionego wirusa (nazywane szczepionką przeciw grypie typu split ) lub preparaty antygenowe rozszczepionego wirusa na ogół zawierają pozostałe białko macierzowe oraz nukleoproteinę oraz czasami lipid, a takŝe białka błony otoczkowej. Takie szczepionki przeciwwirusowe typu split zazwyczaj będą zawierać większość lub wszystkie białka strukturalne wirusa, jakkolwiek nie koniecznie w takich samych stosunkach w jakich występują one w całym wirusie. [0097] Alternatywnie wirus grypy moŝe być w postaci szczepionki z całym wirusem: moŝe

24 to okazać się korzystne względem szczepionki przeciwwirusowej typu split w sytuacji pandemii, gdyŝ pozwala to uniknąć niepewności czy szczepionka przeciwwirusowa typu split moŝe zostać skutecznie wytworzona dla nowego szczepu wirusa grypy. Dla niektórych szczepów standardowe detergenty stosowane do wytwarzania rozszczepionego wirusa mogą uszkodzić wirusa i sprawić, Ŝe nie da się go zastosować. Pomimo, Ŝe zawsze istnieje moŝliwość zastosowania innych detergentów i/lub opracowania innego sposobu wytwarzania szczepionki typu split, zajęłoby to czas, który moŝe nie być dostępny w sytuacji pandemii. Oprócz większego stopnia pewności w przypadku rozwiązania z całym wirusem, istnieje takŝe większa wydajność wytwarzania szczepionki niŝ dla rozszczepionego wirusa, gdyŝ znaczne ilości antygenu są tracone podczas dodatkowych etapów oczyszczania wymaganych do wytwarzania odpowiedniej szczepionki typu split. [0098] W innej postaci preparat wirusa grypy jest w postaci oczyszczonej szczepionki podjednostkowej przeciw grypie. Szczepionki podjednostkowe przeciw grypie zawierają zazwyczaj dwa główne białka otoczki, HA i NA oraz mogą wykazywać dodatkową zaletę względem szczepionek opartych na całym wirionie gdyŝ są mniej reaktogenne, w szczególności u młodych szczepionych osób. Szczepionki podjednostkowe mogą być wytwarzane rekombinacyjnie lub oczyszczane z rozerwanych cząstek wirusa. [0099] W innej postaci preparat wirusa grypy jest w postaci wirosomu. Wirosomy są sferycznymi, jednobłonowymi pęcherzykami, które zachowują funkcjonalne glikoproteiny HA i NA otoczki wirusowej w autentycznej konformacji wstawione do dwuwarstwowej błony fosfolipidowej wirosomów. [00] Ten wirus grypy lub jego preparat antygenowy moŝe być uzyskany z jaja lub uzyskany z hodowli komórkowej. [01] Przykładowo antygen wirusa grypy lub jego preparaty antygenowe według wynalazku moŝna uzyskać z zastosowaniem standardowej metody z uŝyciem jaj z zarodkami, przez hodowanie wirusa grypy w jajach i oczyszczanie zebranego płynu omoczniowego. Jaja moŝna gromadzić w duŝej liczbie w krótkim czasie. Alternatywnie mogą być one uzyskane z zastosowaniem dowolnej z nowych metod wytwarzania z zastosowaniem komórki lub hodowli komórkowej do hodowli wirusa lub ekspresji rekombinowanych antygenów powierzchniowych wirusa grypy. Odpowiednie substraty komórkowe do hodowania wirusa obejmuj, przykładowo, komórki nerki psa, takie jak MDCK lub komórki z klonu MDCK, komórki MDCK-podobne, komórki nerki małpy, takie jak komórki AGMK, włącznie z komórkami Vero, odpowiednie linie komórek świni lub dowolny inny typ komórek ssaczych odpowiednich do wytwarzania wirusa grypy do celów szczepionkowych. Odpowiednie substraty komórkowe obejmują takŝe komórki ludzkie, np. komórki MRC-.

25 Odpowiednie substraty komórkowe nie są ograniczone do linii komórkowych; przykładowo włączone są fibroblasty zarodków kurzych oraz linie komórek ptasich. [02] Antygen wirusa grypy lub jego preparat antygenowy mogą być wytwarzane z zastosowaniem dowolnego z wielu sposobów mających zastosowanie handlowe, przykładowo sposobu rozszczepiania wirusa grypy opisanego w opisach patentowych nr DD 0833 i DD Tradycyjnie rozszczepiony wirus grypy wytwarzano z zastosowaniem obróbki rozpuszczalnikiem/detergentem, takim jak fosforan tri-n-butylu lub eter dietylowy w połączeniu z Tween (która jest znana jako rozszczepianie Tween-eter ) oraz ten sposób jest nadal stosowany w niektórych urządzeniach produkcyjnych. Inne obecnie stosowane środki rozszczepiające obejmują detergenty lub enzymy proteolityczne lub sole kwasów Ŝółciowych, przykładowo deoksycholan sodu, jak opisano w opisie patentowym nr DD Detergenty, które mogą być stosowane jako środki rozszczepiające obejmują detergenty kationowe, np. bromek cetylotrimetyloamoniowy (CTAB), inne detergenty jonowe, np. laurylosiarczan, taurodeoksycholan lub detergenty niejonowe, takie jak te opisane powyŝej, włącznie z Triton X-0 (przykładowo w sposobie opisanym w Lina i in., 00, Biologicals 28, 9-3) i Triton N-1 lub połączenia dowolnych dwóch lub większej liczby detergentów. [03] Proces wytwarzania szczepionki typu split moŝe obejmować kilka róŝnych etapów filtracji i/lub inne etapy rozdzielania, takie jak etapy ultrawirowania, ultrafiltracji, wirowania strefowego i chromatografii (np. jonowymiennej) w róŝnych połączeniach oraz ewentualnie etap inaktywacji, np. termicznej, z uŝyciem formaldehydu lub β-propiolaktonu lub UV, które moŝna prowadzić przed lub po rozszczepieniu. Proces rozszczepiania moŝna prowadzić jako proces okresowy, ciągły lub półciągły. Korzystny sposób rozszczepiania i oczyszczania dla kompozycji immunogennej typu split opisano w WO 02/ [04] Korzystne preparaty antygenowe do szczepionki przeciw grypie typu split według wynalazku zawierają resztkowe ilości Tween 80 i/lub Triton X-0 pozostające po procesie wytwarzania, jakkolwiek mogą być one dodane lub ich stęŝenia mogą być dostosowane po wytworzeniu rozszczepionego antygenu. Korzystnie obecne są zarówno Tween 80, jak i Triton X-0. Korzystne zakresy końcowych stęŝeń tych nie jonowych środków powierzchniowo czynnych w dawce szczepionki wynoszą: Tween 80: 0,01 do 1%, korzystniej około 0,1% (obj./obj.) *Triton X-0: 0,001 do 0,1 (% wag./obj.), korzystniej 0,00 do 0,02% (wag./obj.). [0] W szczególnej postaci końcowe stęŝenie Tween 80 jest w zakresie 0,02%-0,09% wag./obj. W innej szczególnej postaci antygen dostarcza się jako 2-krotnie stęŝoną mieszaninę, która zawiera Tween 80 w stęŝeniu w zakresie 0,02%-0,2% (wag./obj.) i musi

26 być dwukrotnie rozcieńczona podczas ostatecznego formułowania z adiuwantem (lub buforem w preparacie kontrolnym). [06] W innej szczególnej postaci końcowe stęŝenie Triton X-0 jest w zakresie od 0,004%-0,017% wag./obj. W innej szczególnej postaci antygen dostarcza się jako 2-krotnie stęŝoną mieszaninę, która zawiera Triton X-0 w stęŝeniu w zakresie od 0,00%-0,034% (wag./obj.) i musi być dwukrotnie rozcieńczona podczas ostatecznego formułowania z adiuwantem (lub buforem w preparacie kontrolnym). [07] Korzystnie preparat wirusa grypy wytwarza się w obecności tiomersalu na niskim poziomie lub korzystnie bez tiomersalu. Korzystnie powstały preparat wirusa grypy jest trwały bez środków konserwujących w postaci organicznych związków rtęci, w szczególności preparat nie zawiera resztkowego tiomersalu. W szczególności preparat wirusa grypy zawiera antygen hemaglutyniny stabilizowany bez tiomersalu lub przy niskim poziomie tiomersal (ogólnie µg/ml lub mniej). Konkretnie stabilizację szczepu wirusa grypy B realizuje się z zastosowaniem pochodnej alfa tokoferolu, takiej jak bursztynian alfatokoferolu (znany takŝe jako bursztynian witaminy E, tj. VES). Takie preparaty i sposoby ich wytwarzania ujawniono w WO 02/ [08] Korzystna kompozycja zawiera antygeny trzech inaktywowanych, rozszczepionych wirionów wytworzone ze szczepów rekomendowanych przez WHO odpowiedniego sezonu grypowego. [09] Korzystnie wirus grypy lub jego preparat antygenowy oraz adiuwant według wynalazku są zawarte w tym samym pojemniku. Nazywa się to podejściem jednofiolkowym. Korzystnie fiolkę stanowi wstępnie wypełniona strzykawka. W alternatywnej postaci wirus grypy lub jego preparat antygenowy oraz adiuwant według wynalazku są zawarte w osobnych pojemnikach lub fiokach i mieszane krótko przed lub podczas podawania osobnikowi. Nazywa się to podejściem dwufiolkowym. Przykładowo, gdy szczepionka jest szczepionką 2-składnikową do uzyskania całkowitej objętości dawki 0,7 ml, stęŝone antygeny (przykładowo stęŝone trójwaŝne antygeny inaktywowanego rozszczepionego wirionu) są obecne w jednej fiolce (33 µl) (pojemnik z antygenem) oraz wstępnie wypełniona strzykawka zawiera adiuwant (360 µl) (pojemnik z adiuwantem). W momencie wstrzykiwania zawartość fiolki zawierającej stęŝone trójwaŝne antygeny inaktywowanego rozszczepionego wirionu jest usuwana z fiolki z zastosowaniem strzykawki zawierającej adiuwant po czym prowadzi się delikatne mieszanie zawartości strzykawki. Przed wstrzyknięciem zuŝytą igłę zastępuje się igłą do zastrzyków domięśniowych i objętość doprowadza się do µl. W przykładzie tym jedna dawka roztworzonego kandydata na adiuwantowaną szczepionkę przeciw grypie odpowiada µl.

27 [01] W jednym aspekcie wynalazku gdy kompozycja jest wielowaŝna, to wtedy co najmniej jeden szczep wirusa grypy w tej określonej tutaj wielowaŝnej kompozycji immunogennej jest związany z wybuchem pandemii lub wykazuje potencjał do tego Ŝeby był związany z wybuchem pandemii. Taki szczep moŝe być takŝe nazywany w tekście poniŝej szczepem pandemicznym. W szczególności, gdy szczepionka jest szczepionką wielowaŝną, taką jak szczepionka dwuwaŝna, trójwaŝna lub czterowaŝna, co najmniej jeden szczep jest związany z wybuchem pandemii lub wykazuje potencjał do tego Ŝeby był związany z wybuchem pandemii. Odpowiednimi szczepami są, ale nie tylko: HN1, H9N2, H7N7 i H2N2. [0111] Ten wirus grypy lub jego preparat antygenowy jest dogodnie wielowaŝny, tak jak dwuwaŝny, trójwaŝny lub czterowaŝny. Korzystnie wirus grypy lub jego preparat antygenowy jest trójwaŝny lub czterowaŝny i zawiera antygen spośród trzech róŝnych szczepów wirusa grypy, przy czym co najmniej jeden szczep jest związany z wybuchem pandemii lub wykazuje potencjał do tego Ŝeby był związany z wybuchem pandemii. [0112] Cechy szczepu wirusa grypy, które nadają mu potencjał wywołania wybuchu pandemii stanowi: to, Ŝe zawiera on nową hemaglutyninę w porównaniu z hemaglutyniną w obecnie krąŝących szczepach; to, Ŝe jest on zdolny do poziomego przenoszenia się w populacji ludzkiej; oraz to, Ŝe jest on patogenny dla ludzi. Nową hemaglutyniną moŝe być taka, która nie była widoczna w populacji ludzkiej przez przedłuŝony okres czasu, prawdopodobnie kilka dekad, taka jak H2. Ewentualnie moŝe być to hemaglutynina, która nie krąŝyła wcześniej w populacji ludzkiej, przykładowo H, H9, H7 lub H6, które występują u ptaków. W kaŝdym z przypadków większość lub co najmniej duŝa część lub nawet cała populacja wcześniej nie zetknęła się z tym antygenem i jest względem niego immunologicznie naiwna. [0113] W pewnych grupach ogólnie występuje zwiększone ryzyko zakaŝenia grypą w sytuacji pandemii. Osoby starsze, przewlekle chore oraz małe dzieci są szczególnie podatne, ale u wielu młodych i pozornie zdrowych osób takŝe występuje ryzyko. W przypadku grypy H2 zwiększone ryzyko występuje w części populacji urodzonej po 1968 roku. Dla tych grup istotne jest aby były skutecznie chronione tak szybko jak to tylko moŝliwe oraz w prosty sposób. [0114] Inną grupą ludzi, u których występuje zwiększone ryzyko są osoby podróŝujące. Obecnie ludzie podróŝują więcej niŝ kiedykolwiek wcześniej, a regiony w których powstaje najwięcej nowych wirusów, takich jak Chiny i Azja Południowo-Wschodnia, stały się popularnymi celami podróŝny w ostatnich latach. Ta zmiana we wzorcach podróŝowania umoŝliwia rozprzestrzenienie się nowych wirusów na świecie w przeciągu tygodni, a nie

28 miesięcy lub lat. [011] Zatem w przypadku tych grup ludzi istnieje szczególna potrzeba szczepienia w celu ochrony przed grypą w sytuacji pandemii lub w potencjalnej sytuacji pandemii. Odpowiednie szczepy obejmują, ale nie tylko: HN1, H9N2, H7N7 i H2N2. [0116] Ewentualnie kompozycja moŝe stanowić kompozycję więcej niŝ trójwaŝną, przykładowo zawierającą trzy szczepy nie pandemiczne i jeden szczep pandemiczny. Alternatywnie kompozycja moŝe zawierać trzy szczepy pandemiczne. Korzystnie kompozycja zawiera trzy szczepy pandemiczne. [0117] Ponadto przykładami antygenów dla kompozycji immunogennej według wynalazku są antygeny paciorkowców, takie jak z paciorkowców z grupy A lub paciorkowców z grupy B, ale najkorzystniej ze Streptococcus pneumoniae. Najkorzystniej stosowane jest co najmniej jedno białko i/lub co najmniej jeden antygen sacharydowy. Co najmniej jeden antygen białkowy Streptococcus pneumoniae jest najkorzystniej wybrany z grupy obejmującej: pneumolizynę, PspA lub jego warianty z delecją w regionie transbłonowym, PspC lub jego warianty z delecją w regionie transbłonowym, PsaA lub jego warianty z delecją w regionie transbłonowym, dehydrogenazę gliceraldehydo-3-fosforanową, CbpA lub jego warianty z delecją w regionie transbłonowym, PhtA, PhtD, PhtB, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, Sp12, Sp1, Sp128, Sp1 i Sp133 lub ich immunologicznie funkcjonalny odpowiednik (przykładowo fuzje domen powyŝszych białek, przykładowo białka fuzyjne Pht- DE opisane w WO 01/98334 i WO 03/4007). [0118] Pewne kompozycje opisano w WO 00/639 i WO 02/22167 oraz WO 02/ [0119] Antygen moŝe zawierać antygeny sacharydu otoczkowego (korzystnie sprzęŝone z białkiem nośnikowym), przy czym sacharydy (najkorzystniej polisacharydy) pochodzą z co najmniej czterech serotypów pneumokoków. W jednej postaci te cztery serotypy obejmują 6B, 14, 19F i 23F. W kolejnej postaci do kompozycji jest włączonych co najmniej 7 serotypów, przykładowo te pochodzące z serotypów 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F i 23F. W kolejnej postaci do kompozycji jest włączonych co najmniej serotypów, przykładowo kompozycja w jednej postaci zawiera sacharydy otoczkowe pochodzące z serotypów 1, 4,, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F i 23F (korzystnie sprzęŝone z białkiem nośnikowym). W innej postaci kompozycja immunogenna zawiera sacharydy otoczkowe pochodzące z serotypów 1, 3, 4,, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F i 23F. W korzystnej postaci wynalazku włączonych jest co najmniej 13 antygenów sacharydowych (korzystnie sprzęŝonych z białkiem nośnikowym), jednakŝe kolejne antygeny sacharydowe, przykładowo 23-waŜne (takie jak serotypów 1, 2, 3, 4,, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, A, 11A, 12F, 14, 1B, 17F, 18C, 19A, 19F,, 22F, 23F i 33F) są takŝe rozwaŝane przez wynalazek.

29 [01] Pomimo, Ŝe powyŝsze sacharydy są korzystnie w swojej postaci natywnego polisacharydu pełnej długości naleŝy rozumieć, Ŝe moŝna takŝe zastosować polisacharydy o zmniejszonej wielkości, które są nadal immunogenne (patrz przykładowo EP i 4972), gdy jest to konieczne sprzęŝone z nośnikiem w postaci białka. [0121] W celu przeciwdziałania/polepszenia przebiegu zapalenia płuc w populacji osób starszych (+ lat) oraz zapalenia ucha środkowego u niemowląt (do 18 miesiąca Ŝycia) i małych dzieci (zazwyczaj od 18 miesięcy do lat), korzystną postacią wynalazku jest łączenie opisanego tutaj wielowaŝnego sacharydu Streptococcus pneumonia z białkiem Streptococcus pneumoniae korzystnie wybranym z grupy wymienionych powyŝej białek. Korzystnie moŝna stosować połączenie białek pneumokokowych, jak opisano poniŝej. Białka pneumokokowe [0122] Antygeny Streptococcus pneumoniae są korzystnie wybrane z grupy obejmującej: białko z rodziny białek z triadą polihistydynową (Pht), białko z rodziny Lyt, białko wiąŝące cholinę, białka zawierające motyw LPXTG (gdzie X oznacza dowolny aminokwas), białka zawierające motyw sekwencji sygnałowej typu II LXXC (gdzie X oznacza dowolny aminokwas) i białka zawierające motyw sekwencji sygnałowej typu I. Korzystnymi przykładami w tych kategoriach (lub motywach) są poniŝsze białka (lub ich skrócone lub immunologicznie funkcjonalne równowaŝniki): Rodzina Pht (rodzina białek z triadą polihistydynową) zawiera białka PhtA, PhtB, PhtD i PhtE. Rodzina ta charakteryzuje się sekwencją lipidacji, dwoma domenami rozdzielonymi przez region bogaty w prolinę i kilkoma triadami histydynowymi, prawdopodobnie uczestniczącymi w wiązaniu metalu lub nukleozydu albo aktywności enzymatycznej, regionami typu (3-) coiled-coil, konserwatywnym N-końcem i heterogennym C- końcem. Jest ona obecna we wszystkich zbadanych szczepach pneumokoków. Homologiczne białka znaleziono takŝe w innych paciorkowcach i Neisseria. Korzystnymi członkami tej rodziny są PhtA, PhtB i PhtD. Korzystniej obejmuje to PhtA lub PhtD. NaleŜy jednak zrozumieć, Ŝe określenia Pht A, B, D i E dotyczą białek o sekwencjach ujawnionych w poniŝszych pozycjach literaturowych, a takŝe ich naturalnie występujących (i wytworzonych przez człowieka) wariantów, które wykazują homologię sekwencji, która wykazuje co najmniej 90% identyczności z tymi białkami. Korzystnie jest ono w co najmniej 9% identyczne, a najkorzystniej jest w 97% identyczne. [0123] W odniesieniu do białek Pht, PhtA ujawniono w WO 98/189 i jest ono takŝe nazywane Sp36. Jak wskazano powyŝej białko to naleŝy do rodziny białek z triadą polihistydynową i zawiera motyw sygnałowy typu II LXXC.

30 [0124] PhtD ujawniono w WO 00/37 i jest ono takŝe nazywane Sp036D. Jak wskazano powyŝej jest ono takŝe białkiem z rodziny białek z triadą polihistydynową i zawiera motyw sygnałowy typu II LXXC. PhtB ujawniono w WO 00/37 i jest ono takŝe nazywane Sp036B. Innym członkiem rodziny PhtB jest polipeptyd C3-degradujący, jak ujawniono w WO 00/ Białko to takŝe naleŝy do rodziny białek z triadą polihistydynową i zawiera motyw sygnałowy typu II LXXC. Korzystnym immunologicznie funkcjonalnym odpowiednikiem jest białko Sp42 ujawnione w WO 98/189. Skróconą postać PhtB (w przybliŝeniu 79 kd) ujawniono w WO 99/167, którą takŝe uznaje się za członka rodziny PhtX. PhtE ujawniono w WO 00/299 i jest ono takŝe nazywane BVH-3. SpsA jest białkiem wiąŝącym cholinę (Cbp) ujawnionym w WO 98/3940. [012] Rodzina Lyt obejmuje białka związane z błoną uczestniczące w lizie komórek. Domena N-końcowa zawiera domenę(-y) wiąŝącą(-e) cholinę, jednakŝe rodzina Lyt nie wykazuje wszystkich cech występujących w rodzinie białek wiąŝących cholinę (Cbp) wskazanych poniŝej, a zatem w niniejszym wynalazku rodzinę Lyt uznaje się za odrebną od rodziny Cbp. W odróŝnieniu od rodziny Cbp C-końcowa domena zawiera domenę katalityczną rodziny białek Lyt. Rodzina ta obejmuje LytA, B i C. W odniesieniu do rodziny Lyt, LytA ujawniono w Ronda i in., Eur J Biochem, 164: (1987). LytB ujawniono w WO 98/189 i jest takŝe nazywane Sp46. LytC ujawniono takŝe w WO 98/189 i jest takŝe nazywane Sp91. Korzystnym członkiem tej rodziny jest LytC. Inną korzystną postacią są skrócone postacie białek z rodziny Lyt (w szczególności LytA), przy czym określenie Lyt zdefiniowano powyŝej, a określenie skrócone postacie dotyczy białek w których brak jest 0% lub większej części regionu wiąŝącego cholinę. Korzystnie w takich białkach brak jest całego regionu wiąŝącego cholinę. Sp12 jest przykładem pneumokokowego białka powierzchniowego z motywem zakotwiczania w ścianie komórkowej LPXTG (gdzie X oznacza dowolny aminokwas). Stwierdzono, Ŝe kaŝde białko w tej klasie pneumokokowych białek powierzchniowych z tym motywem jest przydatne w kontekście tego wynalazku, a zatem jest uznane za kolejne białko według wynalazku. Samo Sp12 ujawniono w WO 98/189 i jest ono takŝe znane jako ZmpB metaloproteinza cynkowa. Sp1 ujawniono w WO 98/06734 (gdzie ma ono numer odniesienia y8993). Charakteryzuje się ono sekwencją sygnałową typu I. Sp133 ujawniono w WO 98/06734 (gdzie ma ono numer odniesienia y8992). Charakteryzuje się ono sekwencją sygnałową typu I. Sp128 i Sp1 ujawniono w WO 00/7640.

31 1 2 3 Białka stosowane w niniejszym wynalazku są korzystnie wybrane z grupy PhtD, PhtA i PhtE lub stanowią połączenia 2 lub wszystkich 3 z tych białek (tj. PhtA+D, A+E, D+E lub A+D+E). Kolejne antygeny w postaci białek pneumokokowych, które moŝna dodać stanowią jedno lub większą liczbę białek z grupy obejmującej: pneumolizynę (takŝe nazywaną Ply; korzystnie detoksykowaną przez obróbkę chemiczną lub mutację) [WO 96/089, WO 90/0691, WO 99/03884], PsaA i jego warianty z delecją w regionie transbłonowym (Berry i Paton, Infect Immun, grudzień 1996;64(12):2-62), PspA i jego warianty z delecją w regionie transbłonowym (US , WO 92/14488, WO 99/3940), PspC i jego warianty z delecją w regionie transbłonowym (WO 97/09994, WO 99/3940), członka rodziny białek wiąŝących cholinę (Cbp) [np. CbpA i jego warianty z delecją w regionie transbłonowym (WO 97/4111; WO 99/1266)], dehydrogenazę gliceraldehydo-3-fosforanową (Infect. Immun :344), HSP70 (WO 96/40928), PcpA (Sanchez-Beato i in. FEMS Microbiol Lett 1998, 164:7-14), białko M-podobne (zgłoszenie patentowe SB nr EP 08371) oraz adhezynę (zgłoszenie patentowe SB nr EP ). Niniejszy wynalazek takŝe obejmuje immunologicznie funkcjonalne odpowiedniki lub skrócone postacie takich białek (jak określono powyŝej). W odniesieniu do rodziny białek wiąŝących cholinę członków tej rodziny początkowo zidentyfikowano jako białka pneumokokowe, które mogą być oczyszczone z zastosowaniem chromatografii powinowactwa do choliny. Wszystkie białka wiąŝące cholinę są nie kowalencyjnie związane z ugrupowaniami fosforylocholinowymi kwasu teichowego ściany komórkowej oraz związanego z błoną kwasu lipoteichowego. Pod względem struktury zawierają one kilka regionów wspólnych dla całej rodziny, jednakŝe dokładna natura tych białek (sekwencja aminokwasowa, długość itd.) moŝe się róŝnić. Ogólnie białka wiąŝące cholinę zawierają region N-końcowy (N), konserwatywne regiony powtórzeń (R1 i/lub R2), region bogaty w prolinę (P) oraz konserwatywny region wiąŝący cholinę (C), złoŝony z wielu powtórzeń, który obejmuje w przybliŝeniu połowę białka. Stosowane w tym zgłoszeniu określenie rodzina białek wiąŝących cholinę (Cbp) odnosi się do grupy obejmującej białka wiąŝące cholinę, jak określono w WO 97/4111, PbcA, SpsA, PspC, CbpA, CbpD i CbpG. CbpA ujawniono w WO 97/4111. CbpD i CbpG ujawniono w WO 00/ PspC ujawniono w WO 97/ PbcA ujawniono w WO 98/ Korzystnie białka wiąŝące cholinę są wybrane z grupy obejmującej CbpA, PbcA, SpsA i PspC. JeŜeli Cbp jest kolejnym stosowanym białkiem moŝe być to skrócona postać Cbp, gdzie określenie Cbp zdefiniowano powyŝej, a określenie skrócona postać dotyczy białek w których brak jest 0% lub większej części regionu wiąŝącego cholinę (C). Korzystnie w

32 takich białkach brak jest całego regionu wiąŝącego cholinę. Korzystniej w takich skróconych postaciach białek brak jest (i) regionu wiąŝącego cholinę, a takŝe (ii) części N- końcowej połowy białka, jednakŝe zachowany jest co najmniej jeden region powtarzalny (R1 lub R2). Jeszcze korzystniej skrócona postać zawiera 2 regiony powtórzeń (R1 i R2). Przykładami takich korzystnych postaci są NR1xR2, R1xR2, NR1xR2P i R1xR2P, jak zilustrowano w WO 99/1266 lub WO 99/1188, jednakŝe inne białka wiąŝące cholinę w których brak jest podobnego regionu wiąŝącego cholinę są rozwaŝane w zakresie tego wynalazku. Białka chimeryczne (lub fuzje) skrócona postać Cbp-skrócona postać Lyt mogą być takŝe stosowane w kompozycji według wynalazku. Korzystnie obejmuje to NR1xR2 (lub R1xR2 lub NR1xR2P lub R1xR2P) Cbp oraz część C-końcową (C-koniec, tj. bez domen wiąŝących cholinę) Lyt (np. C-koniec LytC lub C-koniec Sp91). Korzystnie Cbp jest wybrane z grupy obejmującej CbpA, PbcA, SpsA i PspC. Jeszcze korzystniej jest to CbpA. Korzystnie Lyt stanowi LytC (takŝe nazywane Sp91). MoŜna takŝe stosować skrócone postacie PspA lub PsaA bez domeny wiąŝącej cholinę (C) i eksprymowane jako białko fuzyjne z Lyt. Korzystnie Lyt stanowi LytC. W kompozycji penumokokowej moŝliwe jest połączenie róŝnych białek penumokokowych według wynalazku. Korzystnie łączone białka według wynalazku są wybrane spośród 2 lub większej liczby (3 lub 4) róŝnych kategorii, takich jak białka zawierające motyw sekwencji sygnałowej typu II LXXC (gdzie X oznacza dowolny aminokwas, np. z rodziny białek z triadą polihistydynową (Pht)), białka wiąŝące cholinę (Cbp), białka zawierające motyw sekwencji sygnałowej typu I (np., Sp1), białka zawierające motyw LPXTG (gdzie X oznacza dowolny aminokwas, np. Sp128, Sp1), toksyny (np. Ply) itd. Korzystnymi przykładami wśród tych kategorii (lub motywów) są białka wspomniane powyŝej lub ich immunologicznie funkcjonalne odpowiedniki. Korzystne połączenia kategorii stanowią toksyna + Pht, toksyna + Cbp, Pht + Cbp i toksyna + Pht + Cbp. Preferowane korzystne połączenia obejmują, ale nie tylko, PhtD + NR1xR2, PhtD + białka chimeryczne lub fuzyjne NR1xR2 - C-koniec Sp91, PhtD + Ply, PhtD + Sp128, PhtD + PsaA, PhtD + PspA, PhtA + NR1xR2, PhtA + białka chimeryczne lub fuzyjne NR1xR2 - C-koniec Sp91, PhtA + Ply, PhtA + Sp128, PhtA + PsaA, PhtA + PspA, NR1xR2 + LytC, NR1xR2 + PspA, NR1xR2 + PsaA, NR1xR2 + Sp128, R1xR2 + LytC, R1xR2 + PspA, R1xR2 + PsaA, R1xR2 + Sp128, R1xR2 + PhtD, R1xR2 + PhtA. Korzystnie NR1xR2 (lub R1xR2) pochodzi z CbpA lub PspC. Jeszcze korzystniej pochodzi on z CbpA. Szczególnie korzystne połączenie białek pneumokokowych zawiera Ply (lub jego skróconą postać lub immunologicznie funkcjonalny odpowiednik) + PhtD (lub jego skróconą postać

33 lub immunologicznie funkcjonalny odpowiednik), ewentualnie z NR1xR2 (lub R1xR2 lub NR1xR2P lub R1xR2P). Korzystnie NR1xR2 (lub R1xR2 lub NR1xR2P lub R1xR2P) pochodzi z CbpA lub PspC. Jeszcze korzystniej pochodzi ono z CbpA. [0126] Antygenem moŝe być koniugat pneumokokowego sacharydu zawierający antygeny polisacharydowe pochodzące z co najmniej czterech serotypów, korzystnie z co najmniej siedmiu serotypów, korzystnie z co najmniej dziesięciu serotypów oraz z co najmniej z jednego, ale korzystnie 2, 3 lub 4 białek Streptococcus pneumoniae korzystnie wybranych z grupy białek opisanych powyŝej. Korzystnie jednym z białek jest PhtD (lub jego immunologicznie funkcjonalny odpowiednik) i/lub Ply (lub jego immunologicznie funkcjonalny odpowiednik). [0127] Problemem związanym z zastosowaniem polisacharydów do szczepienia jest fakt, Ŝe polisacharydy same z siebie są słabymi immunogenami. Aby to przezwycięŝyć sacharydy moŝna sprzęgać z nośnikami w postaci białka, które dostarczają przypadkową pomoc komórek T (ang. bystander T-cell help). Zatem korzystne jest aby sacharydy stosowane w wynalazku były sprzęŝone z takim nośnikiem w postaci białka. Przykłady takich nośników, które są obecnie powszechnie stosowane do wytwarzania immunogenów sacharydowych obejmują anatoksyny błoniczą i tęŝcową (odpowiednio DT, DT CRM197 i TT), hemocyjaninę Megathura crenulata (KLH), OMPC z N. meningitidis oraz oczyszczoną pochodną białkową tuberkuliny (PPD). Korzystnym nośnikiem dla kompozycji immunogennych (lub szczepionek) opartych na sacharydzie pneumokokowym jest białko D z Haemophilus influenzae (EP 946-B) lub jego fragmenty. Fragmenty odpowiednie do stosowania obejmują fragmenty zawierające epitopy dla komórek T pomocniczych. W szczególności fragment białka D będzie korzystnie zawierać N-końcową 1/3 białka. Nośnik w postaci białka D jest przydatny jako nośnik w kompozycjach, w których sprzęŝonych jest wiele pneumokokowych antygenów sacharydowych. Na białku D moŝna korzystnie sprzęgać jeden lub większą liczbę połączonych sacharydów pneumokokowych. Kolejnym korzystnym nośnikiem dla sacharydu pneumokokowego jest samo białko pneumokokowe (jak określono powyŝej w części białka pneumokokowe według wynalazku ). Sacharyd moŝe być sprzęŝony z białkiem nośnikowym dowolną znaną metodą (przykładowo według Likhite, opis patentowy US , oraz Armor i in., opis patentowy US ). Korzystnie prowadzi się sprzęganie CDAP (WO 9/08348). Korzystnie stosunek białko:sacharyd (wagowo:wagowy) w koniugatach wynosi 0,3:1 do 1:1, korzystniej 0,6:1 do 0,8:1 oraz najkorzystniej około 0,7:1.

34 Szczególnie korzystne kompozycje według wynalazku zawierają jeden lub większą liczbę sprzęŝonych sacharydów pneumokokowych oraz jedno lub większą liczbę białek pneumokokowych według wynalazku. Ponadto sacharydy i białka pneumokokowe moŝna stabilnie przechowywać jako składniki preparatu zaabsorbowane na fosforanie glinu w postaci ciekłej. [0128] W innym aspekcie wynalazku kompozycja szczepionki moŝe zawierać antygen ludzkiego wirusa cytomegalii (HCMV). HCMV jest ludzkim wirusem DNA naleŝącym do rodziny wirusów opryszczki i stanowi główną przyczynę wad wrodzonych u noworodków, a takŝe wywołuje powaŝne stany medyczne u pacjentów z obniŝoną odpornością. Choroba kliniczna wywołuje róŝne objawy włącznie z gorączką, zapaleniem wątroby, zapaleniem płuc i zakaźną mononukleozą. [0129] W jednej postaci antygenem HCMV jest chimeryczne białko fuzyjne lub jego immunogenna pochodna, zawierające część glikoproteiny HCMV w fuzji z częścią glikoproteiny HSV. Glikoproteiną HCMV jest zazwyczaj gb oraz glikoproteiną HSV jest zazwyczaj gd, w szczególności gd HSV typu 2 (gd2). Fuzję zazwyczaj wytwarza się między aminokwasem w N-końcowej części białka gb HCMV oraz aminokwasem w C-końcowej części białka gd HSV. W obydwu składnikach białka fuzyjnego gb HCMV i gd HSV moŝe być brak domeny zakotwiczającej w błonie. [01] Część białka gb HCMV moŝe zawierać nierozszczepialną postać gb HCMV. Dogodnie uzyskuje się to przez zmianę jednego lub większej liczby aminokwasów w miejscu rozszczepiania białka, przykładowo przez wymianę Arg48 i Arg49 odpowiednio na Glu i Thr. Część białka HSV moŝe zawierać sekwencję sygnałową gd2 (aminokwasy 1 do 2) i ewentualnie aminokwasy 26 do 2 gd2 i/lub sekwencję z gd2, którą stanowi PEDSAL- LEDPED lub jej funkcjonalne odpowiedniki, które mogą być krótsze lub dłuŝsze. Kolejne sekwencje z gd HSV moŝna dodawać do białka fuzyjnego, przykładowo na C-końcu białka gb HCMV. [0131] W jednej postaci białko fuzyjne zawiera aminokwasy 1 do 2 białka gd2 HSV w fuzji z resztami 28 do 68 białka gb HCMV. Takie białko fuzyjne oznaczono gb68* HCMV. W kolejnej postaci sekwencja aminokwasowa PEDSALLEDPED, pochodząca ze wewnętznej sekwencji gd2, moŝe być włączona na C-końcu białka gb68* HCMV w celu wytworzenia białka oznaczonego gb68** HCMV. Te specyficzne białka fuzyjne opisano bardziej szczegółowo w WO 9/31. [0132] Innym immunogenem odpowiednim do stosowania jako szczepionka HCMV jest pp6, białko macierzowe HCMV opisane w WO 94/00 (City of Hope).

35 [0133] W kolejnej postaci niniejszego wynalazku kompozycje immunogenne zawierają antygen lub preparat antygenowy uzyskany z ludzkiego wirusa brodawczaka (HPV) uznawanego za czynnik odpowiedzialny za brodawki płciowe (HPV 6 lub HPV 11 i inne) i/lub wirusów HPV odpowiedzialnych za raka szyjki macicy (HPV16, HPV18 i inne). [0134] W jednej postaci, postacie kompozycji profilaktycznych lub terapeutycznych do leczenia brodawek płciowych zawierają cząstki lub kapsomery L1 oraz białka fuzyjne zawierające jeden lub większą liczbę antygenów wypranych spośród białek HPV E1, E2, E E6, E7, L1 i L2. [013] W jednej postaci, postaciami białek fuzyjnych są: L2E7 ujawnione w WO 96/26277 i białko D(1/3)-E7 ujawnione w GB (PCT/EP98/028). [0136] Korzystna kompozycja profilaktyczna lub terapeutyczna do leczenia zakaŝenia szyjki macicy HPV lub raka moŝe zawierać antygeny HPV 16 lub 18. Przykładowo monomery antygenów L1 lub L2 lub antygeny L1 lub L2 obecne razem w postaci cząstki wiruso-podobnej (VLP) lub samo białko L1 obecne w VLP lub strukturze kapsomeru. Takie antygeny, cząstki wiruso-podobne oraz kapsomery jako takie są znane. Patrz przykładowo WO94/0012, WO94/137, WO94/0792 i WO93/ [0137] Dodatkowe wczesne białka, które moŝna włączyć samodzielnie lub w postaci białek fuzyjnych obejmują przykładowo E7, E2 lub korzystnie E; ich szczególnie korzystne postacie obejmują VLP zawierające białka fuzyjne L1 E7 (WO 96/11272). [0138] W jednej postaci antygeny HPV 16 zawierają wczesne białka E6 lub E7 w fuzji z nośnikiem w postaci białka D lub z wytworzeniem fuzji białko D - E6 lub E7 z HPV 16 lub ich połączenia; lub połączenia E6 lub E7 z L2 (WO 96/26277). [0139] Alternatywnie wczesne białka E6 i E7 HPV 16 lub 18 mogą być obecne w pojedynczej cząsteczce, korzystnie w fuzji białko D - E6/E7. Taka kompozycja moŝe ewentualnie zawierać którekolwiek lub obydwa białka E6 i E7 z HPV 18, korzystnie w postaci białka fuzyjnego białko D - E6 lub białko D - E7 lub białka fuzyjnego białko D - E6/E7. [0140] Kompozycja według niniejszego wynalazku moŝe dodatkowo zawierać antygeny z innych typów HPV, korzystnie z HPV 31 lub 33. Onkogenne typy HPV obejmują HPV 31, 33, 3, 39, 4, 1, 2, 6, 8, 9, 66 i 68. Zatem kompozycja według niniejszego wynalazku moŝe zawierać antygeny z jednego lub większej liczby tych typów HPV, oprócz HPV 16 i/lub HPV 18. [0141] VLP lub kapsomery L1 HPV przydatne w wynalazku mogą zawierać lub składać się z L1 pełnej długości lub immunogennego fragmentu L1. Gdy VLP lub kapsomer zawiera lub składa się z immunogennego fragmentu L1 wtedy odpowiednie immunogenne fragmenty L1 HPV obejmują postacie skrócone, mutanty delecyjne, substytucyjne lub in-

36 3 1 2 sercyjne L1. Takie immunogenne fragmenty są dogodnie zdolne do wywołania odpowiedzi immunologicznej, która to odpowiedź immunologiczna jest w stanie rozpoznać białko L1 tak jak cząstkę wiruso-podobną z typu HPV z którego pochodzi to białko L1. Odpowiednie immunogenne fragmenty L1 obejmują skrócone białka L1. W jednym aspekcie skrócenie usuwa sygnał lokalizacji jądrowej. W innym aspekcie skrócenie stanowi skrócenie C-końcowe. W kolejnym aspekcie skrócenie C-końcowe usuwa mniej niŝ 0 aminokwasów, tak jak mniej niŝ 40 aminokwasów. Gdy L1 pochodzi z HPV 16, wtedy w innym aspekcie skrócenie C-końcowe usuwa 34 aminokwasy z L1 HPV 16. Gdy L1 pochodzi z HPV 18, wtedy w innym aspekcie skrócenie C-końcowe usuwa 3 aminokwasów z L1 HPV 18. [0142] Odpowiednie skrócone sekwencje L1 HPV 16 i 18 podano w WO 06/ Sekwencją HPV 16 moŝe być takŝe odpowiednio skrócona sekwencja ujawniona przykładowo w WO lub US Odpowiednimi skróconymi postaciami są postaci skrócone w pozycji równowaŝnej do tej omówionej powyŝej, co określa się przez porównanie sekwencji. Alternatywną sekwencję HPV 18 ujawniono w WO , która moŝe być dogodnie skrócona. Odpowiednimi skróconymi postaciami są postaci skrócone w pozycji równowaŝnej do tej omówionej powyŝej, co określa się przez porównanie sekwencji. Inne sekwencje HPV 16 i HPV 18 są dobrze znane w dziedzinie wynalazku oraz mogą być one dogodne do stosowania w niniejszym wynalazku. Gdy białko L1 pochodzi z innego typu HPV wtedy moŝna zastosować C-końcowe skrócenia odpowiadające tym wytwarzanym dla HPV 16 i HPV 18, w oparciu o zastawienia sekwencji DNA lub białka. Odpowiednie skrócenia L1 HPV 31 i 4 podano w WO 06/ MoŜna takŝe wytworzyć odpowiednie skrócenia białek HPV 31, 33, 3, 39, 4, 1, 2, 6, 8, 9, 66 i 68, a w jednym aspekcie usuwa się C-końcowe części białka L1 równowaŝne z tymi opisanymi powyŝej, co określa się przez zestawienie sekwencji. Białko L1 lub immunogenny fragment według wynalazku moŝe ewentualnie być w postaci białka fuzyjnego, takiego jak białko fuzyjne L1 z L2 lub białkiem wczesnym. Białko L1 HPV jest dogodnie w postaci kapsomeru lub cząstki wiruso-podobnej (VLP). W jednym aspekcie w niniejszym wynalazku mogą być stosowane VLP HPV. VLP HPV oraz sposoby wytwarzania VLP są dobrze znane w dziedzinie. VLP zazwyczaj konstruuje się z białek strukturalnych wirusa, L1 oraz ewentualnie L2, patrz przykładowo WO94137, US986, W , US69908B1, US B1, EP 993. W niniejszym wy-

37 nalazku moŝna stosować dowolne odpowiednie VLP HPV zapewniające ochronę krzyŝową, takie jak VLP L1 lub L1 + L2. Dogodnie VLP stanowi VLP wyłącznie z L1. Kompozycja według wynalazku moŝe zawierać połączenie VLP L1 HPV 16 i VLP L1 HPV 18 lub połączenie VLP L1 HPV z HPV 16, 18, 31 i 4 lub większe połączenia i zawiera VLP L1 HPV 16 i 18 lub HPV 16, 18, 31 i 4 lub większe połączenia, gdzie L1 jest ewentualnie skrócone, jak tutaj opisano. W konkretnej postaci wynalazku z antygenami HPV 16 i/lub 18 stosuje się jeden lub większą liczbę antygenów z typów HPV wywołujących nowotwory, przy czym antygeny te są wybrane z poniŝszych typów HPV: HPV 31, 4, 33, 8 i 2. Jak tutaj opisano antygenem moŝe być w kaŝdym przypadku L1, przykładowo w postaci VLP lub kapsomerów L1. Zatem antygeny HPV do stosowania w opisanych tutaj kompozycjach, sposobach oraz zastosowaniach mogą obejmować lub zawierać VLP lub kapsomery L1 z HPV 16, 18, 31, 4, 33, 8 i 2. VLP L1 mogą być VLP wyłącznie z L1 lub w połączeniu z innym antygenem, takim jak L2 w VLP L1 + L2. Białko L1 moŝe dogodnie być skrócone, jak tutaj opisano. [0143] Wytworzenie VLP moŝna analizować standardowymi technikami, takimi jak przykładowo mikroskopia elektronowa lub dynamiczne rozpraszanie światła laserowego. VLP moŝe zawierać białko L1 pełnej długości. W jednym aspekcie białko L1 stosowane do wytworzenia VLP jest skróconym białkiem L1, jak tutaj opisano. VLP mogą być obecne w dowolnym odpowiednim substracie komórkowym, takim jak komórki droŝdŝowe lub komórki owadzie, np. w bakulowirusowym układzie ekspresyjnym, a techniki wytwarzania VLP są dobrze znane w dziedzinie, tak jak opisane w WO9916, US B1, US B1 i US62468 oraz zacytowanych tam pozycjach literaturowych. VLP moŝna wytwarzać technikami rozkładania i ponownego składania, które dostarczają bardziej stabilne i/lub jednorodne VLP wirusa brodawczaka. Przykładowo McCarthy i in., 1998 Quantitative Disassembly and Reassembly of Human Papillomavirus Type 11 Virus like Particles in Vitro J. Virology 72(1):33-41 opisuje rozkładanie i ponowne składanie rekombinowanych VLP L1 HPV 11 oczyszczonych z komórek owadzich w celu uzyskania jednorodnego preparatu VLP. WO9916 i US62468 takŝe opisują proces rozkładania/ponownego składania do wytwarzania VLP HPV. W jednym aspekcie VLP HPV wytwarza się w sposób opisany w WO9916 lub US62468.

38 [0144] Kompozycje według niniejszego wynalazku mogą zawierać antygeny lub preparaty antygenowe uzyskane z pasoŝytów wywołujących malarię, takich jak Plasmodium falciparum lub Plasmodium vivax. Przykładowo moŝliwe antygeny pochodzące z Plasmodium falciparum obejmują białko circumsporozoite (białko CS), RTS,S MSP1, MSP3, LSA1, LSA3, AMA1 i TRAP. RTS jest białkiem hybrydowym zawierającym zasadniczo całą C- końcową część białka circumsporozoite (CS) P. falciparum sprzęŝoną przez cztery aminokwasy części pres2 antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B z antygenem powierzchniowym (S) wirusa zapalenia wątroby typu B. Jego pełną strukturę ujawniono w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym nr PCT/EP92/0291, opublikowanym pod numerem WO 93/12 zastrzegającym pierwszeństwo z brytyjskiego zgłoszenia patentowego nr Gdy jest eksprymowane w droŝdŝach RTS jest wytwarzane jako cząstka lipoproteinowa i gdy jest koeksprymowane z antygenem S z HBV wytwarzane są mieszane cząstki znane jako RTS,S. Antygeny TRAP opisano w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym nr PCT/GB89/0089, opublikowanym pod numerem WO 90/ Korzystną postacią niniejszego wynalazku jest szczepionka przeciwko malarii, w której preparat antygenowy zawiera połączenie antygenów RTS,S i TRAP. Innymi antygenami zarodźcowymi, które są prawdopodobnymi kandydatami na szczepionkę przeciwko wielu stadiom malarii są MSP1, AMA1, MSP3, EBA, GLURP, RAP1, RAP2, sekwestryna, PfEMP1, Pf332, LSA1, LSA3, STARP, SALSA, PfEXP1, Pfs2, Pfs28, PFS27/2, Pfs16, Pfs48/4, Pfs2 P. faciparum oraz ich analogi z Plasmodium spp. Jedną postacią niniejszego wynalazku jest kompozycja zawierająca RTS,S lub białko CS lub jego fragment taki jak część CS RTS,S w połączeniu z jednym lub większą liczbą kolejnych antygenów malarii, które mogą być wybrane z grupy obejmującej MSP1, MSP3, AMA1, LSA1 lub LSA3. MoŜliwe antygeny z P. vivax obejmują białko circumsporozoite (białko CS) oraz białko wiąŝące antygen Duffy lub jego fragmenty, takie jak PvRII (patrz np. WO02/12292). [014] Inne moŝliwe antygeny, które mogą być stosowane w kompozycjach immunogennych według niniejszego wynalazku obejmują: Antygeny paciorkowców takie jak z paciorkowców z grupy A lub paciorkowców z grupy B, antygeny dogodnie pochodzą z HIV-1 (tak jak antygen F4 lub jego fragmenty lub gag lub jego fragmenty, takie jak p24, tat, nef, gp1 lub gp160 lub fragmenty któregokolwiek z nich), ludzkich wirusów opryszczki, tak jak gd lub jego pochodne lub białko najwcześniejsze, takie jak ICP27 z HSV1 lub HSV2, wirusa cytomegalii (w szczególności ludzkiego) (tak jak gb lub jego pochodne), rotawirusa (włącznie z Ŝywymi atenuowanymi wirusami), wirusa Epsteina-Barr (tak jak gp lub jego pochodne), wirusa ospy wietrznej i półpaśca (tak jak gpi, II i IE63) lub z wirusa zapalenia wątroby, takiego

39 jak wirus zapalenia wątroby typu B (przykładowo antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B lub jego pochodna), wirus zapalenia wątroby typu A, wirus zapalenia wątroby typu C i wirus zapalenia wątroby typu E lub z innych patogenów wirusowych, takich jak paramyksowirusy: wirus syncytium nabłonka oddechowego (tak jak białka F, N i G lub ich pochodne), wirus parainfluency, wirus odry, wirus świnki, ludzki wirus brodawczaka (przykładowo HPV 6, 11, 16, 18,), flawiwirusy (np. wirus Ŝółtej gorączki, wirus Dengi, wirus odkleszczowego zapalenia mózgu, wirus japońskiego zapalenia mózgu) lub wirus grypy (cały Ŝywy lub inaktywowany wirus, rozszczepiony wirus grypy, hodowany w jajach lub komórkach MDCK lub całe wirosomy grypy (jak opisano w R. Gluck, Vaccine, 1992,, 91-9) lub jego oczyszczone lub rekombinowane białka, takie jak białka HA, NP, NA lub M lub ich połączenia) lub pochodzą z patogenów bakteryjnych, takich jak Neisseria spp., włącznie z N. gonorrhea i N. meningitidis (przykładowo sacharydy otoczkowe oraz ich koniugaty, białka wiąŝące transferynę, białka wiąŝące laktoferynę, PilC, adhezyny); S. pyogenes (przykładowo białka M lub ich fragmenty, proteaza CA, kwasy lipoteichowe), S. agalactiae, S. mutans; H. ducreyi; Moraxella spp., włącznie z M. catarrhalis, znana takŝe jako Branhamella catarrhalis (przykładowo adhezyny i inwazyny o wysokiej i niskiej masie cząsteczkowej); Bordetella spp., włącznie z B. pertussis (przykładowo pertaktyna, toksyna krztuścowa lub jej pochodne, hemaglutynina włókienkowa, cyklaza adenylanowa, strzępki), B. parapertussis i B. bronchiseptica; Mycobacterium spp., włącznie z M. tuberculosis (przykładowo ESAT6, antygen 8A, -B lub -C), M. bovis, M. leprae, M. avium, M. paratuberculosis, M. smegmatis; Legionella spp., włącznie z L. pneumophila; Escherichia spp., włącznie z enterotoksyczną E. coli (przykładowo czynniki kolonizacji, toksyna termolabilna lub jej pochodne, toksyna termostabilna lub jej pochodne), enterokrwotoczną E. coli, enteropatogenną E. coli (przykładowo toksyna podobna do toksyny Shiga lub jej pochodne); Vibrio spp., włącznie z V. cholera (przykładowo toksyna cholery lub jej pochodne); Shigella spp., włącznie z S. sonnei, S. dysenteriae, S. flexnerii; Yersinia spp., włącznie z Y. enterocolitica (przykładowo białko Yop), Y. pestis, Y. pseudotuberculosis; Campylobacter spp., włącznie z C. jejuni (przykładowo toksyny, adhezyny i inwazyny) oraz C. coli; Salmonella spp, włącznie z S. typhi, S. paratyphi, S. choleraesuis, S. enteritidis; Listeria spp., włącznie z L. monocytogenes; Helicobacter spp, włącznie z H. pylori (przykładowo ureaza, katalaza, toksyna wakuolizująca); Pseudomonas spp., włącznie z P. aeruginosa; Staphylococcus spp., włącznie z S. aureus, S. epidermidis; Enterococcus spp., włącznie z E. faecalis, E. faecium; Clostridium spp., włącznie z C. tetani (przykładowo toksyna tęŝcowa oraz jej pochodna), C. botulinum (przykładowo toksyna

40 botulinowa oraz jej pochodna), C. difficile (przykładowo toksyny Clostridium A lub B oraz ich pochodne); Bacillus spp., włącznie z B. anthracis (przykładowo toksyna botulinowa oraz jej pochodne); Corynebacterium spp., włącznie z C. diphtheriae (przykładowo toksyna błonicza oraz jej pochodne); Borrelia spp., włącznie z B. burgdorferi (przykładowo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. garinii (przykładowo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. afzelii (przykładowo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. andersonii (przykładowo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. hermsii; Ehrlichia spp., włącznie z E. equi oraz czynnikiem ludzkiej erlichiozy granulocytarnej; Rickettsia spp., włącznie z R. rickettsii; Chlamydia spp., włącznie z C. trachomatis (przykładowo MOMP, białka wiąŝące heparynę), C. pneumoniae (przykładowo MOMP, białka wiąŝące heparynę), C. psittaci; Leptospira spp., włącznie z L. interrogans; Treponema spp., włącznie z T. pallidum (przykładowo rzadkie białka błony zewnętrznej), T. denticola, T. hyodysenteriae; lub pochodzące z pasoŝytów takich jak Plasmodium spp., włącznie z P. falciparum; Toxoplasma spp., włącznie z T. gondii (przykładowo SAG2, SAG3, Tg34); Entamoeba spp., włącznie z E. histolytica; Babesia spp., włącznie z B. microti; Trypanosoma spp., włącznie z T. cruzi; Giardia spp., włącznie z G. lamblia; Leshmania spp., włącznie z L. major; Pneumocystis spp., włącznie z P. carinii; Trichomonas spp., włącznie z T. vaginalis; Schisostoma spp., włącznie z S. mansoni lub pochodzace z droŝdŝy, takich jak Candida spp., włącznie z C. albicans; Cryptococcus spp., włącznie z C. neoformans. [0146] Innymi korzystnymi specyficznymi antygenami M. tuberculosis są przykładowo Tb Ra12, Tb H9, Tb Ra3, Tb38-1, Erd 14, DPV, MTI, MSL, mttc2 i htcc1 (WO 99/1748), Mtb72F oraz M72. Białka M. tuberculosis obejmują takŝe białka fuzyjne i ich warianty, w których co najmniej dwa, korzystnie trzy polipeptydy M. tuberculosis są połączone w większe białko. Korzystne fuzje obejmują Ra12-TbH9-Ra3, Erd14-DPV-MTI, DPV-MTI-MSL, Erd14-DPV-MTI-MSL-mTCC2, Erd14-DPV-MTI-MSL, DPV-MTI- MSL-mTCC2, TbH9-DPV-MTI (WO 99/1748). Konkretna sekwencja Ra12-Tbh9-Ra3, o której moŝna wspomnieć, jest określona przez SEQ ID NO: 6 w WO06/ razem z wariantami, w których Ser 704 w tej sekwencji jest zmutowana do innego aminokwasu niŝ seryna, np. do Ala, oraz jej pochodne zawierające N-końcowy znacznik His odpowiedniej długości (np. SEQ ID NO: 2 lub 4 w WO06/117240). Przykładowe antygeny Chlamydia sp., np. C trachomatis są wybrane spośród CT88, CT 089, CT87, MOMP, CT622, PmpD, PmpG oraz ich fragmentów, SWIB oraz immunogennych fragmentów któregokolwiek z nich (takich jak PmpDpd i PmpGpd) i ich połączeń. Korzystne połączenia antygenów obejmują CT88, CT089 i CT87. Specyficzne sekwencje i połączenia, które moŝna stosować opisano w WO06/4890. Korzystne

41 kompozycje bakteryjne zawierają antygeny pochodzące z Haemophilus spp., włącznie z H. influenzae typu B (przykładowo PRP oraz jego koniugaty), nietypowalnych H. influenzae, przykładowo OMP26, adhezyny o wysokiej masie cząsteczkowej, P, P6, białko D i lipoproteinę D oraz fimbrynę i peptydy pochodzące z fimbryny (US ) lub warianty o wielu kopiach lub ich białka fuzyjne. Pochodne antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B są dobrze znane w dziedzinie wynalazku i obejmują między innymi antygeny PreS1, PreS2 S przedstawione w europejskich zgłoszeniach patentowych EP-A ; EP-A-0478 i EP W jednym korzystnym aspekcie preparat szczepionki według wynalazku zawiera antygen HIV-1, gp1, w szczególności eksprymowany w komórkach CHO. W kolejnej postaci kompozycja według wynalazku zawiera gd2t, jak określono tutaj powyŝej. [0147] Kompozycje mogą takŝe zawierać antygen przeciwnowotworowy i mogą być przydatne do immunoterapeutycznego leczenia raków. Przykładowo antygenem moŝe być antygen odrzucenia nowotworu, taki jak antygeny raka gruczołu krokowego, sutka, jelita grubego, płuca, trzustki, nerki lub czerniaka. Przykładowe antygeny obejmują MAGE 1, 3 i MAGE 4 lub inne antygeny MAGE, takie jak te ujawnione w WO99/40188, PRAME, BAGE, Lage (takŝe znany jako NY Eos 1) SAGE i HAGE (WO 99/61) lub GAGE (Robbins i Kawakami, 1996, Current Opinions in Immunology 8, str ; Van den Eynde i in., International Journal of Clinical & Laboratory Research (wysłana 1997); Correale i in. (1997), Journal of the National Cancer Institute 89, str W rzeczywistości antygeny te są eksprymowane w szerokim zakresie typów nowotworów, takich jak czerniak, rak płuca, mięsak i rak pęcherza. Antygeny MAGE do stosowania w niniejszym wynalazku moŝna eksprymować jako białko fuzyjne ze wzmacniaczem ekspresji lub jako immunologiczny partner fuzyjny. W szczególności białko MAGE moŝna łączyć z białkiem D z Heamophilus infuenzae B lub jego lipidowaną pochodną. W szczególności partner fuzyjny moŝe zawierać pierwszą 1/3 białka D. Takie konstrukty ujawniono w WO99/ Inne antygeny specyficzne dla nowotworu obejmują, ale nie tylko, KSA (GA733), gangliozydy specyficzne dla nowotworu, takie jak GM 2 i GM3 lub ich koniugaty z białkami nośnikowymi; lub ten antygen moŝe być własnym hormonem peptydowym, takim jak pełnej długości hormon uwalniający gonadotropinę (GnRH, WO 9/600), krótkim peptydem długości aminokwasów, przydatnym w leczeniu wielu nowotworów lub w kastracji immunologicznej. W korzystnej postaci wykorzystuje się antygeny gruczołu krokowego, takie jak antygen specyficzny dla gruczołu krokowego (PSA), PAP, PSCA (PNAS 9(4) ),

42 PSMA lub antygen znany jako prostaza. Prostaza jest specyficzną dla gruczołu krokowego proteazą serynową (trypsyno-podobną) o długości 24 aminokwasów z konserwatywną katalityczną triadą proteazy serynowej H- D-S i N-końcową sekwencją prepropeptydu, wskazującą na potencjalną funkcję wydzielniczą (P. Nelson, Lu Gan, C. Ferguson, P. Moss, R. Gelinas, L. Hood i K. Wand, Molecular cloning and characterisation of prostase, an androgen regulated serine protease with prostate restricted expression, w Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) 96, ). Opisano domniemane miejsce glikozylacji. Przewidywana struktura jest bardzo podobna do innych znanych proteaz serynowych, co wskazuje, Ŝe dojrzały polipeptyd zwija się w pojedynczą domenę. Dojrzałe białko ma długość 224 aminokwasów, z jednym epitopem A2, co do którego wykazano, Ŝe ulega naturalnej obróbce. Sekwencję nukleotydową prostazy i wydedukowaną sekwencję peptydową oraz homologi ujawniono w Ferguson i in. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96, ) oraz międzynarodowych zgłoszeniach patentowych nr WO 98/122 (a takŝe w odpowiadającym udzielonym patencie US 96), WO 98/117 (a takŝe w odpowiadających udzielonych patach US i ) (kallikreina specyficzna dla gruczołu krokowego) i WO 00/04149 (P703P). Niniejszy wynalazek dostarcza kompozycje zawierające fuzję białka prostazy opartą na białku prostazy oraz jego fragmentach lub homologach ( pochodnych ). Takie pochodne są odpowiednie do stosowania w preparatach szczepionek terapeutycznych, które są odpowiednie do leczenia nowotworów gruczołu krokowego. Zazwyczaj fragment będzie zawierać co najmniej, korzystnie 0, a korzystniej 0 sąsiadujących aminokwasów, jak ujawniono w powyŝej cytowanych opisach patentowych i zgłoszeniach patentowych. Kolejny korzystny antygen gruczołu krokowego jest znany jako P01S, sekwencja ID NO: 113 w WO98/ Jego immunogenne fragmenty i części zawierające co najmniej, korzystnie 0, korzystniej 0 sąsiadujących aminokwasów ujawniono w wyŝej wymienionym zgłoszeniu patentowym. Patrz, przykładowo, PS8 (WO 98/067). Inne antygeny specyficzne dla gruczołu krokowego są znane z WO 98/37418 i WO/ Innym jest STEAP, PNAS 96, , Inne antygeny związane z nowotworami, uŝyteczne w kontekście niniejszego wynalazku, obejmują: Plu-1 - J. Biol. Chem., 274 (22) , 1999; HASH-1, HasH-2, Cripto (Salomon i in., Bioessays 199, , opis patentowy US 64140); Criptin - opis patentowy US Dodatkowo, antygeny szczególnie odpowiednie do szczepionek w leczeniu raka takŝe obejmują tyrozynazę i surwiwinę. Peptydy pochodzące z mucyny, takie jak Muc1, patrz przykładowo US , US

43 , WO 88004, US W szczególności rozwaŝa się peptydy pochodzące z Muc1, które zawierają co najmniej jedną jednostkę powtarzalną peptydu Muc1, korzystnie co najmniej dwa takie powtórzenia i które są rozpoznawane przez przeciwciało SM3 (US ). Inne peptydy pochodzące z mucyny obejmują peptyd z Muc. Antygenem według wynalazku mogą być takŝe antygeny raka sutka, takie jak her 2/Neu, mammaglobina (opis patentowy US ) lub te ujawnione w WO/00216, WO99/33869, WO99/19479, WO 98/4328. Antygeny her 2/Neu ujawniono między innymi w opisie patentowym US 800. Korzystnie her 2/Neu zawiera całą domenę zewnątrzkomórkową (zawierającą w przybliŝeniu aminokwasy 1-64) lub jej fragmenty oraz co najmniej immunogenną część całej domeny wewnątrzkomórkowej, obejmującej w przybliŝeniu 80 C-końcowych aminokwasów. W szczególności wewnątrzkomórkowa część powinna zawierać domenę fosforylacji lub jej fragmenty. Takie konstrukty ujawniono w WO 00/ Szczególnie korzystny konstrukt jest znany jako ECD PD, a drugi jest znany jako ECD PD, patrz WO 00/ Zastosowany tutaj her 2/Neu moŝe pochodzić od szczura, myszy lub człowieka. Kompozycje mogą zawierać antygeny związane z mechanizmami podtrzymywania nowotworu (np. angiogeneza, naciekanie nowotworu), przykładowo tie 2, VEGF. Przewiduje się, Ŝe w kompozycjach według niniejszego wynalazku moŝna stosować antygeny pochodzące z Borrelia spp. Przykładowo antygeny mogą obejmować kwas nukleinowy, antygen lub preparaty antygenowe pochodzące z patogenu, białka lub peptydy wytwarzane metodami rekombinacji oraz chimeryczne białka fuzyjne. W szczególności antygenem jest OspA. OspA moŝe być całym dojrzałym białkiem w postaci zlipidowanej za pośrednictwem komórki gospodarza (E. coli) nazywanej (Lipo-OspA) albo nielipidowaną pochodną. Takie nielipidowane pochodne obejmują nielipidowane białko fuzyjne NS1- OspA, które zawiera pierwsze 81 N-końcowych aminokwasów białka niestrukturalnego (NS1) wirusa grypy oraz kompletne białko OspA, a inne, MDP-OspA jest nielipidowaną postacią OspA zawierającą 3 dodatkowe N-końcowe aminokwasy. Kompozycje według niniejszego wynalazku mogą być stosowane w profilaktyce lub terapii alergii. Takie szczepionki będą zawierały antygeny specyficzne dla alergenu (przykładowo Der p1) i niespecyficzne dla alergenu (przykładowo peptydy pochodzące z ludzkiej IgE, łącznie z, ale nie tylko, dekapeptydem Stanworth (EP B1)). Kompozycje według niniejszego wynalazku mogą być równieŝ przydatne do profilaktyki lub terapii przewlekłych chorób innych niŝ choroby alergiczne, nowotworowe i zakaźne. Takimi przewlekłymi zaburzeniami są choroby takie, jak miaŝdŝyca tętnic i choroba Alzheimera.

44 Kompozycje według niniejszego wynalazku są szczególnie odpowiednie do immunoterapi chorób, takich jak stany przewlekłe i nowotwory, ale takŝe do terapii uporczywych zaka- Ŝeń. Zgodnie z tym kompozycje według niniejszego wynalazku są szczególnie odpowiednie do immunoterapii chorób zakaźnych, takich jak gruźlica (TB), AIDS i zakaŝenia wirusem zapalenia wątroby typu B (HepB). Ponadto w kontekście AIDS dostarcza się sposób leczenia osobnika podatnego lub cierpiącego na AIDS. Sposób ten obejmuje podawanie osobnikowi szczepionki według niniejszego wynalazku, przez co zmniejsza się spadek liczby komórek T CD4+ wywołany przez późniejsze zakaŝenie HIV lub spowalnia lub zatrzymuje spadek komórek T CD4+ u osobnika juŝ zakaŝonego HIV. [0148] Inne antygeny obejmują sacharydy bakteryjne (korzystnie otoczkowe) inne niŝ (lub dodatkowe oprócz) antygenów pneumokokowych opisanych powyŝej. Antygeny polisacharydowe są dogodnie przechowywane w postaci ciekłego preparatu zaadsorbowanego na fosforanie glinu zatem proste jest wytworzenie kompozycji szczepionek według wynalazku przez zmieszanie tego ciekłego preparatu z adiuwantem według wynalazku bezpośrednio przed uŝyciem. Korzystnie inne sacharydy bakteryjne są wybrane z grupy obejmującej: sacharyd otoczkowy N. meningitidis z grupy serologicznej A (MenA), sacharyd otoczkowy N. meningitidis z grupy serologicznej C (MenC), sacharyd otoczkowy N. meningitidis z grupy serologicznej Y (MenY), sacharyd otoczkowy N. meningitidis z grupy serologicznej W-13 (MenW), sacharyd otoczkowy z grupy I paciorkowca z grupy B, sacharyd otoczkowy z grupy II paciorkowca z grupy B, sacharyd otoczkowy z grupy III paciorkowca z grupy B, sacharyd otoczkowy z grupy IV paciorkowca z grupy B, sacharyd otoczkowy z grupy V paciorkowca z grupy B, sacharyd otoczkowy Staphylococcus aureus typu, sacharyd otoczkowy Staphylococcus aureus typu 8, sacharyd Vi z Salmonella typhi, LPS N. meningitidis, LPS M. catarrhalis i LPS H. influenzae. LPS oznacza natywny lipopolisacharyd (lub lipooligosacharyd) lub lipopolisacharyd, w którym część lipidu A jest detoksykowana dowolną z kilku znanych metod (patrz przykładowo WO 97/18837 lub WO 98/33923) lub dowolną cząsteczkę zawierającą O-polisacharyd pochodzący z tego LPS. LPS N. meningitidis oznacza jeden lub większą liczbę z 12 znanych immunotypów (L1, L2, L3, L4, L, L6, L7, L8, L9, L, L11 lub L12). Szczególnie korzystnymi połączeniami są kompozycje zawierające: 1) sprzęŝony Hib, sprzęŝony MenA i sprzęŝony MenC; 2) sprzęŝony Hib, sprzęŝony MenY i sprzęŝony MenC; 3) sprzęŝony Hib i sprzęŝony MenC; oraz 4) sprzęŝony MenA, sprzęŝony MenC, sprzęŝony MenY i sprzęŝony MenW-13. Ilość PS w kaŝdym z powyŝszych koniugatów

45 moŝe wynosić lub g na kaŝde 0, ml dawki dla człowieka. Korzystnie Hib, MenA, MenC, MenW-13 i MenY są sprzęŝone z TT. Problemem związanym z zastosowaniem polisacharydu do szczepienia jest fakt, Ŝe polisacharydy same z siebie są słabymi immunogenami. Aby to przezwycięŝyć sacharydy według wynalazku moŝna sprzęgać z nośnikami w postaci białka, które dostarczają przypadkową pomoc komórek T. Zatem korzystne jest aby sacharydy stosowane w wynalazku były sprzęŝone z takim nośnikiem w postaci białka. Przykłady takich nośników, które są obecnie powszechnie stosowane do wytwarzania immunogenów sacharydowych obejmują anatoksyny błoniczą i tęŝcową (odpowiednio DT, DT CRM197 i TT), hemocyjaninę Megathura crenulata (KLH), OMPC z N. meningitidis oraz oczyszczoną pochodną białkową tuberkuliny (PPD). Sacharyd moŝe być sprzęŝony z białkiem nośnikowym dowolną znaną metodą (przykładowo według Likhite, opis patentowy US , oraz Armor i in., opis patentowy U.S ). Korzystnie prowadzi się sprzęganie CDAP (WO 9/08348). Korzystnie stosunek białko:sacharyd (wagowo:wagowy) w koniugatach wynosi 0,3:1 do 1:1, korzystniej 0,6:1 do 0,8:1, a najkorzystniej około 0,7:1. [0149] Połączenia antygenów zapewniające ochronę przed pneumokokami i innym patogenem są objęte niniejszym wynalazkiem. Wiele szczepionek pediatrycznych jest obecnie podawanych jako szczepionki skojarzone, aby w ten sposób ograniczyć liczbę wstrzyknięć, które muszą otrzymać dzieci. Zatem w szczepionkach pediatrycznych inne antygeny z innych patogenów mogą być sformułowane ze szczepionkami przeciw pneumokokom według wynalazku. Przykładowo szczepionki według wynalazku mogą być sformułowane z (lub podawane osobno, ale w tym samym czasie) dobrze znaną trójwaŝną sprzęŝoną szczepionką zawierającą anatoksynę błoniczą (DT), anatoksynę tęŝcową (TT) i składniki krztuścowe [zazwyczaj detoksykowaną anatoksynę krztuścową (PT) i hemaglutyninę włókienkową (FHA), ewentualnie z pertaktyną (PRN) i/lub aglutyniną 1+2], przykładowo dostępną w handlu szczepionką INFANRIX-DTPa (SmithKlineBeecham Biologicals), zawierającą antygeny DT, TT, PT, FHA i PRN, lub z pełnokomórkowymi składnikami krztuścowymi, przykładowo preparat wytwarzany przez SmithKlineBeecham Biologicals s.a., taki jak Tritarix. Szczepionka skojarzona moŝe takŝe zawierać inny antygen, taki jak powierzchniowy antygen wirusa zapalenia wątroby typu B (HbsAg), antygeny wirusa Polio (przykładowo inaktywowana trójwaŝna szczepionka przeciw wirusowi Polio - IPV), białka błony zewnętrznej Moraxella catarrhalis, białka nietypowalnej Haemophilus influenzae, białka błony zewnętrznej N. meningitidis B.

46 Przykłady korzystnych antygenów białkowych Moraxella catarrhalis, które mogą być włączone do szczepionki skojarzonej (w szczególności do profilaktyki zapalenia ucha środkowego) obejmują: OMP6 [WO 97/41731 (Antex) i WO 96/34960 (PMC)]; OMP21; LbpA i/lub LbpB [WO 98/606 (PMC)]; TbpA i/lub TbpB [WO 97/1378 i WO 97/32980 (PMC)]; CopB [Helminen ME, i in. (1993) Infect. Immun. 61:03-]; UspA1 i/lub UspA2 [WO 93/03761 (University of Texas)]; OmpCD; HasR (PCT/EP99/03824); PilQ (PCT/EP99/03823); OMP8 (PCT/EP00/01468); lipo06 (GB ,2); lipo (GB 99188,1); lipo11 (GB 99182,2); lipo18 (GB ,2); P6 (PCT/EP99/038); D1 (PCT/EP99/03822); OmplA1 (PCT/EP99/06781); Hly3 (PCT/EP99/0327); i OmpE. Przykłady antygenów nietypowalnej Haemophilus influenzae, które mogą być włączone do szczepionki sprzęŝonej (w szczególności do profilaktyki zapalenia ucha środkowego) obejmują: białko fimbrynę [(US Ohio State Research Foundation)] oraz fuzje zawierające pochodzące z niego peptydy [np. fuzje peptydowe LB1 (f); US (OSU) lub WO 99/64067]; OMP26 [WO 97/01638 (Cortecs)]; P6 [EP (State University of New York)]; TbpA i/lub TbpB; Hia; Hsf; Hin47; Hif; Hmw1; Hmw2; Hmw3; Hmw4; Hap; D1 (WO 94/12641); białko D (EP 946); P2; oraz P (WO 94/264). Inne rozwaŝane połączenia obejmują sacharyd pneumokokowy i białko według wynalazku w połączeniu z antygenami wirusowymi, przykładowo grypy (w postaci atenuowanej, typu split lub podjednostkowej [np. powierzchniowe glikoproteiny neuraminidaza (NA) i hemaglutynina (HA). Patrz np. Chaloupka I. i in., Eur. Journal Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1996, 1: ]), RSV (np. antygeny F i G lub fuzje F/G, patrz np. Schmidt A. C. i in., J Virol, maj 01, str ), PIV3 (np. białka HN i F, patrz Schmidt i in., jak wyŝej), ospy wietrznej (np. w postaci atenuowanej, glikoprotein I-V itd.) oraz dowolnym(-i) (lub wszystkimi) składnikiem(-ami) MMR (odra, świnka, róŝyczka). Korzystna pediatryczna szczepionka skojarzona rozwaŝana w niniejszym wynalazku do ogólnego leczenia lub profilaktyki zapalenia ucha środkowego zawiera: jeden lub większą liczbę antygenów sacharydowych Streptococcus pneumoniae (korzystnie sprzęŝonych z białkiem D), jedno lub większą liczbę białek pneumokokowych (korzystnie te opisane powyŝej) oraz jeden lub większą liczbę eksponowanych na powierzchni antygenów z Moraxella catarrhalis i/lub nietypowalnej Haemophilus influenzae. Białko D moŝna korzystnie stosować jako nośnik w postaci białka dla sacharydów pneumokokowych (jak wspomniano powyŝej) oraz ze względu na to, Ŝe jest ono samo z siebie immunogenem zdolnym do wytworzenia ochrony za pośrednictwem komórek B przeciw nietypowalnej H. influenzae (nthi). Antygeny Moraxella catarrhalis lub nietypowalnej Haemophilus influenzae

47 moŝna włączyć do szczepionki w postaci podjednostkowej lub moŝna je dodać jako antygeny obecne na powierzchni pęcherzyków (uwypukleń) błony zewnętrznej wytwarzanych przez bakterie. Właściwości immunogenne kompozycji immunogennej stosowanej do szczepienia według niniejszego wynalazku [0] W niniejszym wynalazku kompozycja immunogenna jest korzystnie zdolna do wywołania ulepszonej odpowiedzi immunologicznej komórek T CD4 przeciw co najmniej jednemu składnikowi(-om) antygenowemu(-ym) lub przeciw kompozycji antygenowej w porównaniu z odpowiedzią immunologiczną komórek T CD4 uzyskaną z odpowiednią kompozycją, która jest nieadiuwantowana, tj. nie zawiera Ŝadnego egzogennego adiuwanta (nazywana tutaj równieŝ zwykłą kompozycją ). W szczególnej postaci, gdy kompozycją immunogenną jest kompozycja przeciw grypie i gdy preparat szczepionki przeciw grypie składa się z kilku szczepów grypy, z których jeden jest szczepem pandemicznym, ta ulepszona odpowiedź immunologiczna komórek T CD4 jest skierowana przeciw pandemicznemu szczepowi grypy. [011] Określenie ulepszona odpowiedź immunologiczna komórek T CD4 oznacza, Ŝe wyŝsza odpowiedź CD4 jest uzyskiwana u ssaka po podaniu adiuwantowanej kompozycji immunogennej w porównaniu z tą uzyskaną po podaniu takiej samej kompozycji bez adiuwanta. Przykładowo wyŝszą odpowiedź komórek T CD4 uzyskuje się u pacjenta będącego człowiekiem po podaniu kompozycji immunogennej zawierającej wirus grypy lub jego preparat antygenowy razem z adiuwantem według wynalazku, w porównaniu z odpowiedzią wywołaną po podaniu kompozycji immunogennej zawierającej wirus grypy lub jego preparat antygenowy, które są nieadiuwantowane. Taki preparat będzie korzystnie stosowany do wywołania przeciwgrypowej odpowiedzi komórek T CD4, które są zdolne wykryć epitopy grypy prezentowane przez cząsteczki MHC klasy II. [012] W szczególności, ale nie tylko, tę ulepszoną odpowiedź immunologiczną komórek T CD4 uzyskuje się u pacjenta immunologicznie nieszczepionego pierwotnie, tj. pacjenta, który jest seronegatywny względem tego wirusa lub antygenu grypy. Ta seronegatywność moŝe wynikać z faktu, Ŝe ten pacjent nigdy nie napotkał takiego wirusa lub antygenu (tak zwany pacjent naiwny ) lub alternatywnie nie odpowiedział na ten antygen po jego napotkaniu. W specyficznym aspekcie ta odpowiedź komórek T CD4 jest uzyskiwana u pacjenta z obniŝoną odpornością, takiego jak osoba starsza, zazwyczaj w wieku 6 lub więcej lub osoba dorosła młodsza niŝ 6 z wysokim ryzykiem wystąpienia stanu medycznego (osoba dorosła z wysokim ryzykiem ) lub dziecko w wieku poniŝej dwóch lat. [013] Ulepszoną odpowiedź immunologiczną komórek T CD4 moŝna ocenić przez po-

48 miar liczby komórek wytwarzających którekolwiek z poniŝszych cytokin: komórek wytwarzających co najmniej dwie róŝne cytokiny (CD40L, IL-2, IFNγ, TNFα) komórek wytwarzających co najmniej CD40L i inną cytokinę (IL-2, TNFα, IFNγ) komórek wytwarzających co najmniej IL-2 i inną cytokinę (CD40L, TNFα, IFNγ) komórek wytwarzających co najmniej IFNγ i inną cytokinę (IL-2, TNFα, CD40L) komórek wytwarzających co najmniej TNFα i inną cytokinę (IL-2, CD40L, IFNγ) [014] Ulepszona odpowiedź immunologiczna komórek T CD4 wystąpi, gdy komórki wytwarzające którekolwiek z powyŝszych cytokin będą w wyŝszej ilości po podaniu kompozycji adiuwantowanej w porównaniu z podaniem kompozycji nieadiuwantowanej. Zazwyczaj będzie spełniony jeden, korzystnie dwa z pięciu wspomnianych powyŝej warunków. W konkretnej postaci komórki wytwarzające wszystkie cztery cytokiny będą obecne w większej ilości w grupie kompozycji adiuwantowanej w porównaniu z grupą kompozycji nieadiwuantowanej. [01] Ulepszoną odpowiedź immunologiczną komórek T CD4 nadawaną przez adiuwantowaną kompozycję przeciw grypie według niniejszego wynalazku moŝna w idealnej sytuacji uzyskać po pojedynczym podaniu. Podejście z pojedynczą dawką będzie wyjątkowo istotne przykładowo w szybko rozwijającej się sytuacji wybuchu epidemii. W pewnych okolicznościach, w szczególności w populacji osób starszych lub w przypadku małych dzieci (poniŝej 9 roku Ŝycia), które szczepi się przeciw grypie po raz pierwszy lub w przypadku pandemii, korzystne moŝe być podanie dwóch dawek takiej samej kompozycji w danym sezonie. Drugą dawkę tej takiej samej kompozycji (nadal uznawanej za kompozycję do pierwszego szczepienia ) moŝna podawać podczas trwającej pierwotnej odpowiedzi immunologicznej i jest ona odpowiednio oddzielona w czasie. Zazwyczaj drugą dawkę kompozycji podaje się kilka tygodni lub około miesiąc, np. 2 tygodnie, 3 tygodnie, 4 tygodnie, tygodni lub 6 tygodni po pierwszej dawce aby wspomóc w pierwotnym pobudzeniu układu immunologicznego u osobników nie odpowiadających lub słabo odpowiadających. [016] W innej postaci podawanie tej kompozycji immunogennej wywołuje ulepszoną odpowiedź komórek B pamięci u pacjentów, którym podano adiuwantowaną kompozycję immunogenną w porównaniu z odpowiedzią komórek B pamięci u osobników immunizowanych kompozycją nieadiuwantowaną. Określenie ulepszona odpowiedź komórek B pamięci z zamierzenia oznacza zwiększoną częstość limfocytów B w krwi obwodowej zdolnych do róŝnicowania się w komórki plazmatyczne wydzielające przeciwciała po napotkaniu antygenu, co mierzy się przez stymulację róŝnicowania in vitro. [017] W innej postaci podawanie tej kompozycji immunogennej wywołuje ulepszoną odpowiedź humoralną u pacjentów, którym podano adiuwantowaną kompozycję immuno-

49 genną w porównaniu z odpowiedzią humoralną wywołaną u osobników immunizowanych kompozycją nieadiuwantowaną. Tę humoralną odpowiedź immunologiczną moŝna mierzyć według procedury wyszczególnionej w Przykładzie I, a w szczególności w częściach I.1 (I.1.1), I.2 (I.2.1) i I.3 (I.3..2). Gdy kompozycja immunogenna jest kompozycją przeciw grypie w szczególności ta odpowiedź humoralna jest uzyskiwana przeciw szczepom homologicznym i heterologicznym. W szczególności ta heterologiczna humoralna odpowiedź immunologiczna oznacza odpowiedź humoralną między szczepami i jest nazywana krzyŝową odpowiedzią humoralną. Ta krzyŝowa humoralna odpowiedź immunologiczna obejmuje wywołanie odpowiedzi przeciw szczepowi grypy, który jest wariantem (powstałym w wyniku dryfu) szczepu grypy zastosowanego do szczepienia. Przykład takiej odpowiedzi zilustrowano w Przykładzie III.3.1 i na Figurze 2. [018] W szczególnej postaci podawanie tej adiuwantowanej kompozycji immunogennej wywołuje co najmniej dwie z poniŝszych odpowiedzi: (i) ulepszoną odpowiedź immunologiczną komórek T CD4, (ii) ulepszoną odpowiedź immunologiczną komórek B pamięci, (iii) ulepszoną odpowiedź humoralną przeciw co najmniej jednemu składnikowi w postaci antygenu(-ów) lub kompozycji antygenowej w porównaniu z odpowiedzią immunologiczną uzyskaną z odpowiednią kompozycją, która jest nieadiuwantowana, tj. która nie zawiera Ŝadnego egzogennego adiuwanta (nazywana tutaj równieŝ zwykłą kompozycją ). [019] W kolejnej szczególnej postaci szczepienie kompozycją do pierwszego szczepienia, adiuwantowaną, nie wywiera mierzalnego wpływu na odpowiedź CD8. [0160] Specyficzną postacią według wynalazku jest to, Ŝe kompozycja zawierająca wirus grypy lub jego preparat antygenowy sformułowany z adiuwantem saponinowym obecnym w postaci liposomu, w szczególności saponiną QS21 w swojej postaci wygaszonej cholesterolem, jest skuteczna w wywoływaniu odpowiedzi komórek T w populacji ludzi z obni- Ŝoną odpornością. W jednej postaci ten adiuwant ponadto zawiera 3D-MPL. W szczególności podanie pojedynczej dawki opisanej w wynalazku kompozycji immunogennej do pierwszego szczepienia jest w stanie zapewnić lepszą seroprotekcję, co ocenia się przez korelaty ochrony dla szczepionek przeciwko grypie, po ponownym szczepieniu przeciw grypie w populacji ludzi starszych, niŝ szczepienie nieadiuwantowaną szczepionką przeciw grypie. Zastrzegany adiuwantowany preparat był takŝe w stanie wywołać ulepszoną odpowiedź immunologiczną komórek T CD4 przeciw wirusowi grypy w porównaniu z tą uzyskaną dla preparatu nieadiuwantowanego. Odkrycie to moŝe być powiązane ze zwiększoną odpowiedzią po szczepieniu lub zakaŝeniu przy naraŝeniu na antygeny grypy. Ponadto moŝe być to związane z odpowiedzią krzyŝową, tj. wyŝszą zdolnością do odpowiadania na warianty szczepów grypy. Ta ulepszona odpowiedź moŝe być szczególnie korzystna w

50 przypadku populacji ludzi o obniŝonej odporności, takiej jak populacja ludzi starszych (w wieku 6 lub więcej), a w szczególności w populacji ludzi starszych ze zwiększonym ryzykiem. MoŜe to spowodować obniŝenie ogólnych wskaźników zachorowalności i śmiertelności oraz przeciwdziałać przyjmowaniu do szpitala w nagłych przypadkach w wyniku zapalenia płuc lub innej choroby podobnej do grypy. MoŜe to być takŝe korzystne w populacji dzieci (poniŝej roku Ŝycia, korzystnie poniŝej 2 lat Ŝycia). Ponadto moŝe to umoŝliwić wywołanie odpowiedzi komórek T CD4, która utrzymuje się dłuŝej w czasie, np. będzie nadal obecna po roku od pierwszego szczepienia, w porównaniu z odpowiedzią wywoływaną preparatem nieadiuwantowanym. [0161] W szczególnym aspekcie odpowiedź immunologiczna komórek T CD4, taka jak ulepszona odpowiedź komórek T CD4, uzyskana u nieszczepionego pierwotnie osobnika, obejmuje wywołanie krzyŝowej odpowiedzi komórek T CD4 pomocniczych. W szczególności ilość reagujących krzyŝowo komórek T CD4 jest zwiększona. Określenie krzyŝowa odpowiedź CD4 oznacza, Ŝe komórki T CD4 są skierowane na wspólne epitopy dla szczepów grypy. [0162] Zazwyczaj dostępne szczepionki przeciw grypie są skuteczne tylko przeciw zakaŝającym szczepom wirusa grypy, które zawierają hemaglutyninę o podobnych cechach antygenowych. Gdy zakaŝający (krąŝący) wirus grypy ulegnie niewielkim zmianom (takim jak przykładowo mutacja punktowa lub nagromadzenie mutacji punktowych powodujące zmiany aminokwasowe) w glikoproteinach powierzchniowych, w szczególności w hemaglutyninie (wariant szczepu wirusa powstały w wyniku dryfu antygenowego) szczepionka moŝe nadal zapewniać pewną ochronę, jednakŝe moŝe ona dostarczyć tylko ograniczoną ochronę poniewaŝ nowo utworzone warianty mogą uciec przed odpornością wywołaną przez wcześniejsze zakaŝenie grypą lub szczepienie. Dryf antygenowy jest odpowiedzialny za coroczne epidemie, które występują podczas okresów między pandemiami (Wiley i Skehel, 1987, Ann. Rev. Biochem. 6, ). Wywołanie krzyŝowych odpowiedzi komórek T CD4 stanowi dodatkową zaletę kompozycji według wynalazku pod tym względem, Ŝe moŝe ona takŝe zapewnić krzyŝową ochronę, innymi słowy ochronę przed zakaŝeniami heterologicznymi, tj. zakaŝeniami wywołanymi przez krąŝący szczep grypy, który jest wariantem (np. powstałym w wyniku dryfu) szczepu wirusa grypy zawartego w kompozycji immunogennej. MoŜe być to korzystne, gdy krąŝący szczep jest trudny do namna- Ŝania w jajach lub do wytworzenia w hodowli komórkowej, co czyni stosowanie szczepu powstałego w wyniku dryfu przydatną alternatywą. MoŜe być to takŝe korzystne, gdy osobnik otrzymuje pierwsze i drugie szczepienie rozdzielone w czasie o kilka miesięcy lub rok oraz szczep grypy w kompozycji immunogennej zastosowany do drugiej immunizacji

51 0 1 2 jest wariantem szczepu powstałym w wyniku dryfu wobec szczepu uŝytego w kompozycji zastosowanej do pierwszego szczepienia. [0163] Zatem określona tutaj adiuwantowana kompozycja immunogenna przeciw grypie wykazuje większą zdolność do indukcji seroprotekcji i reagujących krzyŝowo komórek T CD4 u szczepionych osób starszych. Cecha ta moŝe być związana z większą zdolnością do odpowiadania przeciw wariantowi szczepu względem szczepu obecnego w kompozycji immunogennej. MoŜe to okazać się istotną zaletą w sytuacji pandemii. Przykładowo wielowaŝna kompozycja immunogenna przeciw grypie zawierająca którykolwiek szczep lub kilka szczepów H, H2, H9, H7 lub H6 moŝe zapewnić wyŝszą zdolność do odpowiadania przeciw wariantowi pandemicznemu, tj. szczepowi powstałemu w wyniku dryfu z tego/tych szczepu(-ów) pandemicznego(-ych), po następującym później szczepieniu lub po zakaŝeniu tym szczepem. Wykrywanie reagujących krzyŝowo komórek T CD4 po szczepieniu szczepionką przeciw grypie [0164] Komórki T CD4, które są w stanie rozpoznawać zarówno homologiczne szczepy wirusa grypy, jak i szczepy, które powstały w wyniku dryfu, nazwano w niniejszym dokumencie reagującymi krzyŝowo. Opisane tutaj adiuwantowane kompozycje przeciw grypie były w stanie wykazać reaktywność krzyŝową wobec odmiennych podtypów poniewaŝ obserwuje się reaktywność krzyŝową przeciw szczepom wirusa grypy, które powstały w wyniku dryfu. Jak wspomniano powyŝej, zdolność pandemicznego preparatu szczepionki do tego aby był skuteczny przeciw szczepom pandemicznym, które powstały w wyniku dryfu, moŝe okazać się istotną cechą w przypadku pandemii. [016] Zgodnie z powyŝszymi obserwacjami u ludzi zidentyfikowano epitopy dla komórek T CD4 wspólne dla róŝnych szczepów wirusa grypy (Gelder C i in. 1998, Int Immunol. (2):211-22; Gelder CM i in J Virol. 70(7): ; Gelder CM i in. 199 J Virol (12): ). [0166] W szczególnej postaci adiuwantowana kompozycja moŝe zaoferować dodatkową korzyść taką, Ŝe dostarcza lepszą ochronę przed krąŝącymi szczepami, które uległy znacznej zmianie (takiej jak przykładowo, rekombinacja genetyczna między dwoma róŝnymi gatunkami) w hemaglutyninie (przesunięcie antygenowe) względem których obecnie dostępne szczepionki są nieskuteczne. Ponowne szczepienie oraz kompozycja stosowana do ponownego szczepienia (kompozycja przypominająca)

52 [0167] W jednej postaci wynalazek dostarcza zastosowanie wirusa grypy lub jego preparatu antygenowego do wytwarzania kompozycji immunogennej do ponownego szczepienia ludzi wcześniej szczepionych zastrzeganą tutaj kompozycją immunogenną. [0168] W jednym aspekcie niniejszego wynalazku dostarcza się zastosowanie wirusa grypy lub jego preparatu antygenowego z pierwszego pandemicznego szczepu grypy do wytwarzania określonej tutaj adiuwantowanej kompozycji immunogennej do ochrony przeciw zakaŝeniom wirusem grypy wywołanym szczepem grypy, który jest wariantem tego pierwszego szczepu grypy. [0169] W innym aspekcie wynalazek dostarcza zastosowanie wirusa grypy lub jego preparatu antygenowego do wytwarzania kompozycji immunogennej przeciw grypie do ponownego szczepienia ludzi wcześniej szczepionych zastrzeganą tutaj adiuwantowaną kompozycją przeciw grypie lub adiuwantowaną kompozycją przeciw grypie zawierającą wariant szczepu grypy, przy czym adiuwant jest taki jak tutaj określono. [0170] W innym aspekcie niniejszy wynalazek dostarcza sposób szczepienia populacji ludzi lub osobnika przeciw jednemu szczepowi wirusa grypy, po czym wykonuje się ponowne szczepienie tego człowieka lub populacji przeciw wariantowi szczepu wirusa grypy, przy czym ten sposób obejmuje podawanie temu człowiekowi (i) pierwszej kompozycji zawierającej wirus grypy lub jego preparat antygenowy z pierwszego szczepu wirusa grypy oraz określony tutaj adiuwant oraz (ii) drugiej kompozycji zawierającej wariant wirusa grypy tego pierwszego szczepu wirusa grypy. W szczególnej postaci ten pierwszy szczep jest związany z wybuchem pandemii lub wykazuje potencjał do bycia związanym z wybuchem pandemii. W innej szczególnej postaci ten wariant szczepu jest związany z wybuchem pandemii lub wykazuje potencjał do bycia związanym z wybuchem pandemii. W szczególności ponowne szczepienie wykonuje się z uŝyciem kompozycji przeciw grypie zawierającej co najmniej jeden szczep, który jest krąŝącym szczepem pandemicznym. Zarówno kompozycja do szczepienia pierwotnego, jak i kompozycja przypominająca mogą być wielowaŝne, tj. mogą zawierać co najmniej dwa szczepy wirusa grypy. Gdy kompozycja(-e) jest/są wielowaŝna(-e) co najmniej jeden szczep jest związany z wybuchem pandemii lub wykazuje potencjał do bycia związanym z wybuchem pandemii. [0171] Zazwyczaj ponowne szczepienie wykonuje się co najmniej 6 miesięcy po pierwszym(-ych) szczepieniu(-ach), korzystnie 8 do 14 miesięcy później, korzystniej około do 12 miesięcy później. [0172] Kompozycja immunogenna do ponownego szczepienia (kompozycja przypominająca) moŝe zawierać dowolny typ preparatu antygenowego, inaktywowany lub Ŝywy atenuowany. MoŜe ona zawierać taki sam typ preparatu antygenowego, np. szczepionkę z

53 rozszczepionym wirusem grypy lub jego preparatem antygenowym, całym wirionem lub oczyszczonymi HA i NA (podjednostkową), co kompozycja immunogenna zastosowana do pierwszego szczepienia. Alternatywnie kompozycja przypominająca moŝe zawierać inny typ antygenu grypy niŝ ten, który zastosowano do pierwszego szczepienia. Korzystnie stosuje się rozszczepionego wirusa. Kompozycja przypominająca moŝe być adiuwantowana lub nieadiuwantowana. Nieadiuwantowaną kompozycją przypominającą moŝe być Fluarix /α-rix /Influsplit podawana domięśniowo. Preparat ten zawiera trzy inaktywowane antygeny rozszczepionego wirionu przygotowane z rekomendowanych przez WHO szczepów z odpowiedniego sezonu grypy. [0173] Kompozycja przypominająca moŝe być adiuwantowana lub nieadiuwantowana. W szczególnej postaci kompozycja przypominająca zawiera określony tutaj adiuwant saponinowy. [0174] W szczególnej postaci kompozycja immunogenna do ponownego szczepienia (nazywana tutaj poniŝej takŝe kompozycją przypominającą ) zawiera wirus grypy lub jego preparat antygenowy, który ma wspólne epitopy dla komórek T CD4 z wirusem grypy lub jego preparatem antygenowym zastosowanym do pierwszego szczepienia. Wspólny epitop dla komórek T CD4 z zamierzenia oznacza peptydy/sekwencje/epitopy z róŝnych antygenów, które mogą być rozpoznawane przez tą samą komórkę CD4 (patrz przykłady opisanych epitopów w: Gelder C i in. 1998, Int Immunol. (2):211-22; Gelder CM i in J Virol. 70(7): ; Gelder CM i in. 199 J Virol (12): ). [017] W jednej postaci według wynalazku kompozycja przypominająca jest jednowaŝną kompozycją przeciw grypie zawierającą szczep wirusa grypy, który jest związany z wybuchem pandemii lub wykazuje potencjał do bycia związanym z wybuchem pandemii. W szczególności ten szczep w kompozycji przypominającej jest krąŝącym szczepem pandemicznym. Odpowiednimi szczepami są, ale nie tylko: HN1, H9N2, H7N7 oraz H2N2. Ten szczep moŝe być taki sam jak obecny, lub moŝe być jednym ze szczepów obecnych w kompozycji zastosowanej do pierwszego szczepienia. W alternatywnej postaci ten szczep moŝe być wariantem szczepu, tj. szczepem powstałym w wyniku dryfu, wobec szczepu obecnego w kompozycji zastosowanej do pierwszego szczepienia. [0176] W innej szczególnej postaci kompozycja przypominająca jest wielowaŝną szczepionka przeciw grypie. W szczególności, gdy kompozycja przypominająca jest szczepionką wielowaŝną, taką jak szczepionka dwuwaŝna, trójwaŝna lub czterowaŝna, co najmniej jeden szczep jest związany z wybuchem pandemii lub wykazuje potencjał do tego Ŝeby był związany z wybuchem pandemii. W szczególnej postaci dwa lub więcej szczepów w kompozycji przypominającej są szczepami pandemicznymi. W innej szczególnej postaci co

54 najmniej jeden szczep pandemiczny w kompozycji przypominającej jest tego samego typu co ten obecny, lub jeden z tych obecnych w kompozycji zastosowanej do pierwszego szczepienia. W alternatywnej postaci co najmniej jeden szczep moŝe być wariantem szczepu, tj. szczepem powstałym w wyniku dryfu, wobec co najmniej jednego szczepu pandemicznego obecnego w kompozycji zastosowanej do pierwszego szczepienia. W szczególności co najmniej jeden szczep w kompozycji przypominającej jest krąŝącym szczepem pandemicznym. Kompozycja przypominająca moŝe być adiwuantowana lub nie. [0177] Zazwyczaj kompozycja przypominająca, gdy jest stosowana, jest podawana w kolejnym sezonie grypowym, np. w przybliŝeniu po roku od podania pierwszej kompozycji immunogennej. Kompozycja przypominająca moŝe być takŝe podana kaŝdego kolejnego roku (trzecie, czwarte, piąte szczepienie itd.). Kompozycja przypominająca moŝe być taka sama jak kompozycja stosowana do pierwszego szczepienia. Dogodnie kompozycja przypominająca zawiera wirus grypy lub jego preparat antygenowy, który jest wariantem szczepu wirusa grypy zastosowanego do pierwszego szczepienia. W szczególności szczepy wirusa grypy lub ich preparat antygenowy są wybrane zgodnie z materiałem odniesienia rozprowadzanym przez Światową Organizację Zdrowia, tak Ŝe są one dostosowane do szczepu grypy, który krąŝy w roku ponownego szczepienia. [0178] Antygen lub kompozycja antygenowa wirusa grypy stosowane do ponownego szczepienia korzystnie zawierają adiuwant, korzystnie taki jak opisano powyŝej. Adiuwantem moŝe być saponina obecna w postaci liposomu, jak opisano tutaj powyŝej, co jest korzystne, ewentualnie zawierająca dodatkowy adiuwant taki jak 3D-MPL. [0179] W jednym aspekcie ponowne szczepienie wywołuje którykolwiek z, korzystnie dwa lub wszystkie z poniŝszych efektów: (i) ulepszoną odpowiedź CD4 przeciw wirusowi grypy lub jego preparatowi antygenowemu, lub (ii) ulepszoną odpowiedź komórek B pamięci, lub (iii) ulepszoną odpowiedź humoralną w porównaniu z równowaŝną odpowiedzią wywołaną po pierwszym szczepieniu nieadiuwantowanym wirusem grypy lub jego preparatem antygenowym. Korzystnie odpowiedź(-dzi) wywołana(-e) po ponownym szczepieniu określonym tutaj adiuwantowanym wirusem grypy lub jego preparatem antygenowy jest (są) wyŝsza(-e) niŝ odpowiednia odpowiedź wywołana po ponownym szczepieniu kompozycją nieadiuwantowaną. Korzystnie odpowiedzi immunologiczne wywołane po ponownym szczepieniu nieadiuwantowanym, korzystnie rozszczepionym, wirusem grypy są wyŝsze w populacji wcześniej szczepionej adiuwantowaną kompozycją przeciw grypie, korzystnie typu split, niŝ odpowiednia odpowiedź w populacji wcześniej szczepionej nieadiuwantowaną kompozycją przeciw grypie, korzystnie typu split. [0180] W szczególnej postaci, ponowne szczepienie pacjentów kompozycją przypominają-

55 cą zawierającą wirus grypy oraz adiuwant saponinowy w postaci liposomu, jak określono tutaj powyŝej, wykazuje wyŝsze miana przeciwciał niŝ odpowiednie wartości w grupie osób wcześniej szczepionych kompozycją nieadiuwantowaną, którym podano dawkę przypominającą kompozycji nieadiuwantowanej. Wpływ adiuwanta polegający na zwiększeniu odpowiedzi przeciwciał na ponowne szczepienie jest szczególnie waŝny w populacji osób starszych, o której wiadomo, Ŝe wykazuje niską odpowiedź na szczepienie lub zakaŝenie wirusem grypy. Korzyści związane z kompozycją adiuwantowaną takŝe były znaczne w zakresie polepszenia odpowiedzi komórek T CD4 po ponownym szczepieniu. [0181] W szczególności kompozycja adiuwantowana według wynalazku jest zdolna do wywołania lepszej odpowiedzi krzyŝowej względem szczepu powstałego w wyniku dryfu (szczepu grypy z kolejnego sezonu grypowego) w porównaniu z ochroną nadawaną przez szczepionkę kontrolną. Wykazano, Ŝe ta odpowiedź krzyŝowa utrzymuje się dłuŝej w porównaniu z tą uzyskana dla preparatu nieadiuwantowanego. Działanie adiuwantu we wzmacnianiu odpowiedzi krzyŝowej względem szczepu powstałego w wyniku dryfu jest istotne w sytuacji pandemii. [0182] W kolejnej postaci wynalazek dotyczy trybu szczepienia, w którym pierwsze szczepienie wykonuje się z uŝyciem kompozycji przeciw grypie, korzystnie kompozycji przeciw grypie typu split, zawierającej co najmniej jeden szczep wirusa grypy, który moŝe potencjalnie wywołać wybuch pandemii, a ponowne szczepienie wykonuje się z uŝyciem krąŝącego szczepu, szczepu pandemicznego lub szczepu klasycznego. Epitop dla CD4 w HA [0183] Dryf antygenowy występuje głównie w regionach epitopowych białek powierzchniowych wirusa, hemaglutyniny (HA) i neuraminidazy (NA). Wiadomo, Ŝe jakakolwiek róŝnica w epitopach dla komórek CD4 i B między róŝnymi szczepami wirusa grypy, która jest wykorzystywana przez wirusa do ominięcia odpowiedzi adaptacyjnej układu immunologicznego gospodarza, będzie odgrywać istotną rolę w szczepieniu przeciw grypie. [0184] U człowieka zidentyfikowano epitopy dla komórek T CD4 wspólne dla róŝnych szczepów wirusa grypy (patrz przykładowo: Gelder C i in. 1998, Int Immunol. (2):211-22; Gelder CM i in J Virol. 70(7): ; i Gelder CM i in. 199 J Virol (12): ). [018] W szczególnej postaci ponowne szczepienie wykonuje się z uŝyciem kompozycji przypominającej zawierającej wirus grypy lub jego preparat antygenowy, który ma wspólne epitopy dla komórek T CD4 z antygenem wirusa grypy lub jego preparatem antygenowym zastosowanym do pierwszego szczepienia. Zatem wynalazek dotyczy zastosowania kompozycji immunogennej zawierającej pandemiczny wirus grypy lub jego preparat anty-

56 1 2 3 genowy oraz saponinę w postaci liposomu, w szczególności QS21 w jej postaci detoksykowanej cholesterolem, ewentualnie z 3D-MPL, do wytwarzania składnika do pierwszego szczepienia szczepionki wielodawkowej, przy czym szczepionka wielodawkowa jako dawkę przypominającą ponadto zawiera wirus grypy lub jego preparat antygenowy, który ma wspólne epitopy dla komórek T CD4 z pandemicznym antygenem wirusa grypy lub jego preparatem antygenowym z dawki podanej w pierwszym szczepieniu. Sposoby szczepienia [0186] Kompozycje immunogenne według wynalazku moŝna podawać dowolną odpowiednią drogą dostarczania, tak jak śródskórnie, dośluzówkowo, np. donosowo, doustnie, domięśniowo lub podskórnie. Inne drogi dostarczania są dobrze znane w dziedzinie. [0187] Dla adiuwantowanej kompozycji immunogennej korzystna jest domięśniowa droga dostarczania. [0188] Inną odpowiednią drogą jest dostarczanie śródskórne. Do dostarczania śródskórnego moŝna zastosować dowolne odpowiednie urządzenie, przykładowo urządzenia z krótkimi igłami, takie jak te opisane w US , US 19021, US , US 27288, US , US 0123, US , US Szczepionki śródskórne moŝna równieŝ podawać przy uŝyciu urządzeń, które ograniczają skuteczne przeniknięcie całej długości igły do skóry, takich jak te opisane w WO99/3480 i EP92444, które są tutaj włączone jako pozycje literaturowe, oraz ich funkcjonalne odpowiedniki. Odpowiednie są równieŝ urządzenia do wstrzykiwania przezskórnego strumieniem roztworu pod wysokim ciśnieniem, które dostarczają ciekłe szczepionki do skóry właściwej z zastosowaniem wtryskiwacza do wstrzyknięć cieczy lub przez igłę, która przebija warstwę rogową naskórka i wytwarza strumień, który dociera do skóry właściwej. Urządzenia do wstrzykiwania przezskórnego strumieniem roztworu pod wysokim ciśnieniem opisano przykładowo w US , US 992, US , US , US , US 69189, US , US 38381, US , US 4662, US , US 31233, US 03627, US , US 639, US 4966, US , US , US , WO 97/3770 i WO 97/1337. Odpowiednie są takŝe urządzenia typu pistoletu do dostarczania proszku/cząstek, które wykorzystują spręŝony gaz do przyspieszenia szczepionki w postaci proszku przez zewnętrzne warstwy skóry do skóry właściwej. Ponadto moŝna stosować standardowe strzykawki w klasycznej metodzie podawania śródskórnego Mantoux. [0189] Inną odpowiednią drogą podawania jest droga podskórna. Do dostarczania podskórnego moŝna stosować dowolne odpowiednie urządzenie przykładowo klasyczną igłę. Korzystnie stosuje się wstrzykiwacz bezigłowy, tak jak opublikowano w WO 01/043,

57 WO 01/042, WO 01/041, WO 01/32243, WO 01/41840, WO 01/41839, WO 01/478, WO 01/6637, WO 01/812, WO 01/64269, WO 01/788, WO 01/9183, WO 01/97884, WO 02/09796, WO 02/ Korzystniej to urządzenie jest wstępnie wypełnione ciekłym preparatem szczepionki. [0190] Alternatywnie szczepionkę podaje się donosowo. Zazwyczaj szczepionkę podaje się miejscowo do obszaru nosowo-gardłowego, korzystnie bez wdychania jej do płuc. Po- Ŝądane jest zastosowanie donosowego urządzenia do dostarczania, które dostarcza preparat szczepionki do obszaru nosowo-gardłowego bez lub zasadniczo bez jego dostawania się do płuc. [0191] Korzystnymi urządzeniami do podawania donosowego szczepionek według wynalazku są urządzenia rozpylające. Odpowiednie dostępne w handlu urządzenia rozpylające do nosa obejmują Accuspray (Becton Dickinson). Nebulizatory wytwarzają bardzo drobny aerozol, który moŝe być łatwo wdychany do płuc, a zatem nie dociera skutecznie do błony śluzowej nosa. Zatem nebulizatory nie są korzystne. [0192] Korzystne urządzenia rozpylające do stosowania donosowego są urządzeniami, w przypadku których wydajność urządzenia nie jest zaleŝna od ciśnienia przyłoŝonego przez uŝytkownika. Urządzenia te znane są jako urządzenia uruchamiane przy wartości progowej nacisku. Ciecz jest uwalniana z dyszy tylko wtedy, gdy przykłada się nacisk o wartości progowej. Urządzenia te ułatwiają uzyskanie aerozolu o regularnej wielkości kropli. Urządzenia uruchamiane przy wartości progowej nacisku odpowiednie do stosowania zgodnie z niniejszym wynalazkiem są znane w dziedzinie wynalazku oraz przykładowo opisane w WO 91/13281 i EP B i EP Takie urządzenia są dostępne w handlu z Pfeiffer GmbH i są takŝe opisane w Bommer, R. Pharmaceutical Technology Europe, wrzesień [0193] Korzystne urządzenia donosowe wytwarzają kropelki (mierzone z zastosowaniem wody jako cieczy) w zakresie od 1 do 0 µm, korzystnie do 1 µm. PoniŜej µm istnieje ryzyko wdychania, dlatego wskazane jest, aby nie więcej niŝ około % kropelek było mniejszych niŝ µm. Kropelki większe niŝ 1 µm nie rozprzestrzeniają tak dobrze jak mniejsze kropelki, a zatem wskazane jest, aby nie więcej niŝ około % kropelek przekraczało 1 µm. [0194] Dostarczanie dwudawkowe jest kolejną korzystną cechą układu do dostarczania donosowego do stosowania ze szczepionkami według wynalazku. Urządzenia dwudawkowe zawierają dwie subdawki pojedynczej dawki szczepionki, po jednej z subdawek do podawania do kaŝdego nozdrza. Ogólnie, dwie subdawki są obecne w jednej komorze, a konstrukcja urządzenia pozwala na sprawne dostarczanie jednej z subdawek na raz. Alter-

58 7 1 2 natywnie do podawania szczepionek według wynalazku moŝna stosować urządzenie jednodawkowe. [019] Alternatywnie w niniejszym wynalazku rozwaŝa się naskórkową lub przezskórną drogę szczepienia. [0196] W szczególnym aspekcie niniejszego wynalazku, adiuwantowaną kompozycję immunogenną do pierwszego podania moŝna podać domięśniowo, a kompozycję przypominającą, adiuwantowaną lub nie, moŝna podać inną drogą, przykładowo śródskórnie, podskórnie lub donosowo. W innej szczególnej postaci kompozycja immunogenna zawierająca konkretnie antygen wirusa grypy lub jego preparat antygenowy do pierwszego podania moŝe zawierać standardową ilość HA 1 µg na szczep wirusa grypy, a kompozycja przypominająca wirusa grypy moŝe zawierać niską dawkę HA, tj. poniŝej 1 µg, i w zaleŝności od drogi podawania moŝe być podana w mniejszej objętości. Populacje do szczepienia [0197] Populacją docelową do szczepienia mogą być ludzie o obniŝonej odporności. Ludzie o obniŝonej odporności ogólnie są mniej zdolni do odpowiedzi na antygen, a w szczególności na antygen grypy, w porównaniu ze zdrowymi osobami dorosłymi. [0198] Korzystnie populację docelową stanowi populacja nieszczepiona pierwotnie przeciw grypie, osób naiwnych (np. względem szczepu pandemicznego) lub osób, które nie zareagowały wcześniej na zakaŝenie lub szczepienie wirusem grypy. Korzystnie populację docelową stanowią osoby starsze, odpowiednio w wieku 6 lat i więcej, młodsze osoby dorosłe z wysokim ryzykiem (tj. między 18 a 64 rokiem Ŝycia), takie jak osoby pracujące w instytucjach słuŝby zdrowia lub młode osoby dorosłe z czynnikiem ryzyka, takim jak choroba układu sercowo-naczyniowego i płuc lub cukrzyca. Kolejną populację docelową stanowią wszystkie dzieci w wieku 6 miesięcy i powyŝej, a zwłaszcza dzieci w wieku 6-23 miesięcy, które doświadczają względnie wysokiej częstości hospitalizacji związanych z grypą. Korzystnie populację docelową stanowią osoby starsze w wieku powyŝej 6 lat. Tryby szczepienia, dawkowanie i dodatkowe kryteria skuteczności [0199] Dogodnie kompozycje immunogenne według niniejszego wynalazku w większości przypadków są w standardowej dawce do wstrzykiwań 0, ml i gdy jest to kompozycja przeciw grypie, zawierają 1 µg hemaglutyniny jako składnika antygenowego z jednego lub kaŝdego szczepu grypy, co mierzy się metodą pojedynczej immunodyfuzji radialnej (SRD) (J.M. Wood i in.: J. Biol. Stand. (1977) ; J. M. Wood i in., J. Biol. Stand. 9 (1981) 317-3). Dogodnie objętość dawki szczepionki będzie wynosić między 0, ml i 1 ml, w szczególności standardową objętość dawki szczepionki 0, ml lub 0,7 ml. Dla

59 8 1 2 szczepionek przeciw grypie, niewielkie dostosowanie objętości dawki będzie rutynowo wykonywane zaleŝnie od stęŝenia HA w wyjściowej próbce preparatu. [00] Dogodnie ta kompozycja immunogenna zawiera niską dawkę antygenu HA np. dowolną dawkę spośród 1, 2, 3, 4,, 6, 7, 8, 9,, 11, 12, 13 lub 14 µg HA na szczep grypy. [01] Korzystnie dawka szczepionki według wynalazku, w szczególności szczepionki o niskiej dawce, moŝe być dostarczona w mniejszej objętości niŝ objętość standardowych szczepionek przeciw grypie typu split do wstrzykiwań, która na ogół wynosi około 0,, 0,7 lub 1 ml na dawkę. Dawki o niskiej objętości według wynalazku korzystnie wynoszą poni- Ŝej 00 µl, korzystniej poniŝej 0 µl, a najkorzystniej nie więcej niŝ około 0 µl lub mniej na dawkę. [02] Zatem zgodnie z jednym aspektem wynalazku korzystną dawką szczepionki o niskiej objętości jest dawka z niską dawką antygenu w małej objętości, np. około 1 µg lub około 7, µg HA lub około 3,0 µg HA (na szczep) w objętości około 0 µl. [03] Lek przeciw grypie według wynalazku korzystnie spełnia pewne międzynarodowe kryteria dla szczepionek. [04] Na arenie międzynarodowej stosuje się standardy pomiaru skuteczności szczepionek przeciwko grypie. Oficjalne kryteria Unii Europejskiej dla skutecznej szczepionki przeciwko grypie są określone w Tabeli 1 poniŝej. Teoretycznie, w celu spełnienia wymogów Unii Europejskiej szczepionka przeciw grypie musi spełniać tylko jedno z kryteriów w Tabeli, dla wszystkich szczepów wirusa grypy zawartych w szczepionce. Kompozycje według niniejszego wynalazku dogodnie spełniają co najmniej jedno takie kryterium. [0] JednakŜe w praktyce, co najmniej dwa lub wszystkie trzy kryteria będą musiały być spełnione dla wszystkich szczepów, zwłaszcza w przypadku nowej szczepionki, takiej jak nowa szczepionka do podawania inną drogą. W pewnych okolicznościach dwa kryteria mogą być wystarczające. Przykładowo dopuszczalne moŝe być spełnienie dwóch z trzech kryteriów przez wszystkie szczepy, podczas gdy trzecie kryterium jest spełnione przez niektóre, ale nie wszystkie szczepy (np. dwa z trzech szczepów). Wymagania te róŝnią się dla populacji osób dorosłych (18-60 lat) i osób starszych (> 60 lat).

60 9 Tabela lat > 60 lat Wskaźnik serokonwersji* >40% >% Współczynnik konwersji** >2, >2,0 Wskaźnik ochrony*** >70% >60% * Wskaźnik serokonwersji definiuje się jako procent szczepionych osób, u których stwierdzono co najmniej 4-krotny wzrost surowiczych mian hamowania hemaglutyniny (HI) po szczepieniu, dla kaŝdego szczepu szczepionkowego. ** Współczynnik konwersji definiuje się jako krotność wzrostu geometrycznych średnich surowiczych mian (GMT) HI po szczepieniu, dla kaŝdego szczepu szczepionkowego. *** Wskaźnik ochrony definiuje się jako procent szczepionych osób z surowiczym mianem HI równym lub wyŝszym niŝ 1:40 po szczepieniu (dla kaŝdego szczepu szczepionkowego), które normalnie przyjmuje się jako oznaczające ochronę. 1 [06] W kolejnym aspekcie wynalazek dostarcza sposób projektowania szczepionki przeciw chorobom, które są znane z tego, Ŝe są wyleczalne lub leczone przez aktywację komórek T CD4+, obejmujący 1) selekcję antygenu zawierającego epitopy dla komórek CD4+, oraz 2) łączenie tego antygenu z określonym powyŝej adiuwantem saponinowym w postaci liposomu, przy czym ta szczepionka po podaniu temu ssakowi jest zdolna do wywołania zwiększonej odpowiedzi komórek T CD4 u tego ssaka. [07] Dla uniknięcia wątpliwości zamieszczone tutaj określenia zawierający, zawierać i zawiera z zamierzenia przez autorów wynalazku mogą zostać w kaŝdym przypadku ewentualnie zastąpione określeniami odpowiednio składający się z, składać się z oraz składa się z. [08] Wynalazek zostanie poniŝej opisany przez odniesienie do poniŝszych przykładów, które nie ograniczają jego zakresu: Przykład I opisuje immunologiczne metody odczytu zastosowane w badaniach na myszach, fretkach i ludziach. Przykład II opisuje wytwarzanie adiuwanta liposomalnego MPL/QS21 Przykład III opisuje ocenę przedkliniczną adiuwantowanych i nieadiuwantowanych szczepionek przeciw grypie u fretek. Przykład IV przedstawia ocenę przedkliniczną adiuwantowanych i nieadiuwantowanych szczepionek przeciw grypie u naiwnych i szczepionych pierwotnie myszy C7BI/6.

61 Przykład V opisuje porównanie adiuwantowanej szczepionki przeciw grypie z 3D-MPL w dwóch róŝnych stęŝeniach u myszy. Przykład VI opisuje porównanie adiuwantowanej szczepionki przeciw grypie z 3D-MPL w dwóch róŝnych stęŝeniach u starszych ludzi. Przykład VII opisuje ocenę przedkliniczną adiuwantowanych szczepionek przeciw HPV u myszy. Przykład VIII opisuje ocenę przedkliniczną adiuwantowanych i nieadiuwantowanych kompozycji immunogennych przeciw wirusowi cytomegalii. Przykład IX opisuje ocenę przedkliniczną adiuwantowanej kompozycji szczepionki RTS,S z 3D-MPL w dwóch róŝnych stęŝeniach. Przykład X opisuje ocenę kliniczną adiuwantowanej szczepionki RTS,S z 3D-MPL w dwóch róŝnych stęŝeniach Przykład I - Immunologiczne metody odczytu I.1. Metody stosowane dla myszy I.1.1. Test hamowania hemaglutynacji Procedura badawcza [09] Miana przeciwciał przeciw hemaglutyninie względem trzech szczepów wirusa grypy określono z zastosowaniem testu hamowania hemaglutynacji (HI). Zasada testu HI jest oparta na zdolności specyficznych przeciwciał przeciw grypie do hamowania hemaglutynacji czerwonych krwinek (RBC) kurczęcia przez hemaglutyninę (HA) wirusa grypy. Surowice inaktywowane termicznie wcześniej potraktowano kaolinem i RBC kurczęcia w celu usunięcia niespecyficznych inhibitorów. Po wstępnej obróbce dwukrotne rozcieńczenia surowic inkubowano z 4 jednostkami hemaglutynacji kaŝdego szczepu wirusa grypy. Następnie dodano czerwone krwinki kurczęcia i oceniano hamowanie aglutynacji. Miana wyraŝono jako odwrotność najwyŝszego rozcieńczenia surowicy, które całkowicie hamowało hemaglutynację. PoniewaŜ pierwsze rozcieńczenie surowicy wynosiło 1:, niewykrywalny poziom oznaczono jako miano wynoszące. Analiza statystyczna [02] Analizę statystyczną przeprowadzono na mianach HI po szczepieniu z zastosowaniem UNISTAT. Protokół zastosowany do analizy wariancji moŝna w skrócie opisać w następujący sposób: Logarytmiczne przekształcenie danych Test Shapiro-Wilka na kaŝdej populacji (grupie) w celu potwierdzenia normalności rozkładu w grupach Test Cochrana w celu potwierdzenia jednorodności wariancji między róŝnymi popu-

62 lacjami (grupami) Dwuczynnikowa analiza wariancji przeprowadzona na grupach Test porównań wielokrotnych Tukeya HSD I.1.2. Wybarwianie wewnątrzkomórkowych cytokin [0211] Technika ta pozwala na ilościowe oznaczenie specyficznych względem antygenu limfocytów T na podstawie wytwarzania cytokin: komórki efektorowe T i/lub komórki efektorowe T pamięci wytwarzają IFN-γ i/lub centralne komórki T wytwarzają IL-2. PBMC zbiera się w 7 dniu po immunizacji. [0212] Komórki limfoidalne ponownie stymuluje się in vitro w obecności inhibitora wydzielania (Brefeldine): Następnie komórki te poddaje się obróbce z zastosowaniem standardowej procedury stosowanej do immunofluorescencji z uŝyciem przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie (CD4, CD8, IFN-γ i IL-2). Wyniki wyraŝono jako częstość komórek pozytywnych względem cytokiny pośród komórek T CD4/CD8. Wybarwianie wewnątrzkomórkowych cytokin w komórkach T przeprowadzono na PBMC 7 dni po drugiej immunizacji. Krew zebrano od myszy i połączono w heparynizowanej poŝywce RPMI + Add. Dla próbek krwi zawiesiny PBL w RPMI + Add naniesiono na gradient Lympholyte- Mammal zgodnie z zalecanym protokołem (wirowanie min przy 0 obr./min w temperaturze pokojowej). Komórki jednojądrzaste z powierzchni międzyfazowej usunięto, przemyto 2x w RPMI + Add i zawiesiny PBMC doprowadzono do 2 x 6 komórek/ml w RPMI z % płodową surowicą cielęcą. [0213] Stymulowanie PBMC antygenem in vitro przeprowadzono w końcowym stęŝeniu 1 x 6 komórek/ml (w probówce FACS) z trójwaŝną szczepionką przeciw grypie typu split na µkulkach ( µg HA/szczep) lub całą FI (1 µg HA/szczep), a następnie inkubowano 2 h w 37 C z dodatkiem anty-cd28 i anty-cd49d (obydwa 1 µg/ml). [0214] Dodanie obydwu przeciwciał zwiększyło proliferację i wytwarzanie cytokin przez aktywowane komórki T i NK oraz mogło to dostarczyć sygnał współstymulujący dla indukcji CTL. [021] Ponadto PBMC stymulowano takŝe przez noc z BMDC (komórkami macierzystymi szpiku kostnego) (1 x komórek/ml) poddanymi działaniu trójwaŝnej szczepionki przeciw grypie typu split ( µg HA/szczep) lub całej FI ( µg HA/szczep), które przygotowano przez poddanie BMDC działaniu szczepionki przeciw grypie typu split (60 µg HA/szczep) lub całej trójwaŝnej szczepionki przeciw grypie FI ( µg HA/szczep) przez 6 h w 37 C. Po etapie ponownej stymulacji antygenem PBMC inkubowano przez noc w 37 C w obecności Brefeldin (1 µg/ml) w 37 C, aby zahamować wydzielanie cytokin. Wybarwianie IFN-γ/IL-2/CD4/CD8 przeprowadzono w następujący sposób: zawiesiny

63 komórek przemyto, ponownie przeprowadzono w zawiesinę w 0 µl PBS z 1% FCS zawierającego 2% odczynnik blokujący Fc (1/0; 2.4G2). Po min inkubacji w 4 C dodano 0 µl mieszaniny anty-cd4-pe (2/0) i anty-cd8 percp (3/0) i inkubowano min w 4 C. Po przemyciu PBS z 1% FCS komórki permeabilizowano przez ponowne przeprowadzenie w zawiesinę w 0 µl Cytofix-Cytoperm (zestaw BD) i inkubowano min w 4 C. Następnie komórki przemyto Perm Wash (zestaw BD) i ponownie przeprowadzono w zawiesinę w 0 µl mieszaniny anty-ifn-γ APC (1/0) + anty-il-2 FITC (1/0) rozcieńczonych w Perm Wash. Po inkubacji minimum 2 h, maksymalnie przez noc w 4 C komórki przemyto Perm Wash i ponownie przeprowadzono w zawiesinę w PBS z 1% FCS + 1% paraformaldehydem. Analizę próbek przeprowadzono przy uŝyciu FACS. śywe komórki bramkowano (FSC/SSC) i zbieranie danych przeprowadzono na ~ 0000 zdarzeń (limfocyty) lub 00 zdarzeń na komórkach T CD4+. Procent komórek IFN-γ + lub IL2+ obliczono dla populacji bramkowanych względem CD4+ i CD8+. I.2. Metody stosowane dla fretek I.2.1. Test hamowania hemaglutynacji (HI) Procedura badawcza [0216] Miana przeciwciał przeciw hemaglutyninie względem trzech szczepów wirusa grypy określono z zastosowaniem testu hamowania hemaglutynacji (HI). Zasada testu HI jest oparta na zdolności specyficznych przeciwciał przeciw grypie do hamowania hemaglutynacji czerwonych krwinek (RBC) kurczęcia przez hemaglutyninę (HA) wirusa grypy. Surowice najpierw potraktowano 2% roztworem neuraminidazy (RDE) i inaktywowano termicznie w celu usunięcia niespecyficznych inhibitorów. Po wstępnej obróbce dwukrotne rozcieńczenia surowic inkubowano z 4 jednostkami hemaglutynacji kaŝdego szczepu wirusa grypy. Następnie dodano czerwone krwinki kurczęcia i oceniano hamowanie aglutynacji biorąc pod uwagę komórki w kształcie kropli podczas odczytu. Miana wyraŝono jako odwrotność najwyŝszego rozcieńczenia surowicy, które całkowicie hamowało hemaglutynację. PoniewaŜ pierwsze rozcieńczenie surowicy wynosiło 1:, niewykrywalny poziom oznaczono jako miano wynoszące. Analiza statystyczna [0217] Analizę statystyczną przeprowadzono na mianach HI (Dzień 41, przed prowokacją) z zastosowaniem UNISTAT. Protokół zastosowany do analizy wariancji moŝna w skrócie opisać w następujący sposób: Logarytmiczne przekształcenie danych. Test Shapiro-Wilka na kaŝdej populacji (grupie) w celu potwierdzenia normalności rozkładu w grupach.

64 Test Cochrana w celu potwierdzenia jednorodności wariancji między róŝnymi populacjami (grupami). Zbadanie interakcji metodą jednoczynnikowej ANOVA. Test porównań wielokrotnych Tukeya HSD. I.2.2. Popłuczyny z nosa [0218] Płukanie nosa przeprowadzono przez podanie ml PBS do obydwu nozdrzy obudzonych zwierząt. Materiał do szczepienia zebrano na szalce Petriego i umieszczono w pojemnikach na próbki na suchym lodzie. Mianowanie wirusa w popłuczynach z nosa [0219] Wszystkie próbki pobrane z nosa najpierw wyjałowiono drogą filtracji na filtrach Spin X (Costar) w celu usunięcia jakiegokolwiek zanieczyszczenia bakteryjnego. 0 µl seryjnych dziesięciokrotnych rozcieńczeń popłuczyn z nosa przeniesiono na płytki do mikromianowania zawierające 0 µl poŝywki ( studzienek/rozcieńczenie). Następnie do kaŝdej studzienki dodano 0 µl komórek MDCK (2,4 x komórek/ml) i inkubowano w 3 C przez -7 dni. Po 6-7 dniach inkubacji poŝywkę hodowlaną delikatnie usunięto i dodano 0 µl moŝywki zawierającej 1/ WST-1 i inkubowano przez kolejne 18 h. [02] Intensywność Ŝółtego barwnika formazanowego wytworzonego przez redukcję WST-1 przez Ŝywe komórki jest proporcjonalna do liczby Ŝywych komórek obecnych w studzience pod koniec testu mianowania wirusa oraz oznacza się ją ilościowo przez pomiar absorbancji kaŝdej studzienki przy odpowiedniej długości fali (40 nanometrów). Wartość odcięcia określa się jako średnią gęstość optyczną (OD) dla niezakaŝonych komórek kontrolnych - 0,3 OD (0,3 OD odpowiadają +/- 3 odchyleniom standardowym OD niezakaŝonych komórek kontrolnych). Wynik pozytywny określa się gdy OD jest < wartości odcięcia w odróŝnieniu od wyniku negatywnego, który określa się gdy OD jest > wartości odcięcia. Miana wydalania wirusa określono według procedury Reed i Muench i wyraŝono jako logarytm TCID 0 /ml. I.3. Testy do oceny odpowiedzi immunologicznej u ludzi I.3.1. Test hamowania hemaglutynacji [0221] Odpowiedź immunologiczną oceniono przez pomiar przeciwciał HI z zastosowaniem metody opisanej przez WHO Collaborating Centre for influenza, Centres for Disease Control, Atlanta, USA (1991). [0222] Pomiary mian przeciwciał przeprowadzono na rozmroŝonych, wcześniej zamroŝonych próbkach surowicy z zastosowaniem standaryzowanej i całkowicie zatwierdzonej mikrometody z uŝyciem 4 jednostek hamowania hemaglutynacji (4 HIU) odpowiednich

65 antygenów i 0,% zawiesiny erytrocytów drobiu. Niespecyficzne inhibitory surowicze usunięto przez obróbkę termiczną i enzym niszczący receptory. [0223] Uzyskane surowice oceniono pod względem poziomu przeciwciał HI. Rozpoczynając od początkowego rozcieńczenia 1: przygotowano seryjne rozcieńczenia (dwukrotne) do końcowego rozcieńczenia 1:480. Za punkt końcowy mianowania uznano etap z najwyŝszym rozcieńczeniem, w którym zaobserwowano całkowite hamowanie (0%) hemaglutynacji. Wszystkie testy przeprowadzono w dwóch powtórzeniach. I.3.2. Test hamowania neuraminidazy [0224] Test przeprowadzono na płytkach do mikromianowania powleczonych fetuiną. Przygotowano 2-krotne seryjne rozcieńczenia surowicy odpornościowej i zmieszano ze standaryzowaną ilością wirusa grypy A H3N2, H1N1 lub wirusa grypy B. Test był oparty na aktywności biologicznej neuraminidazy, która enzymatycznie uwalnia kwas neuraminowy z fetuiny. Po odszczepieniu końcowej reszty kwasu neuraminowego odsłaniana była β-d-glaktozo-n-acetylo-galaktozamina. Do studzienek dodano aglutyninę orzecha ziemnego z Arachis hypogaea znakowaną peroksydazą chrzanową (HRP), która specyficznie wiąŝe struktury galaktozowe. Ilość związanej aglutyniny moŝna wykryć i oznaczyć ilościowo w reakcji z substratem tetrametylobenzydyną (TMB). NajwyŜsze rozcieńczenie przeciwciała, które nadal hamowało aktywność wirusowej neuraminidazy o co najmniej 0% oznaczono jako miano NI. I.3.3. Test neutralizujących przeciwciał [022] Pomiary neutralizujących przeciwciał przeprowadzono na rozmroŝonych, wcześniej zamroŝonych próbkach surowicy. Neutralizację wirusa przez przeciwciała zawarte w surowicy oceniono w teście mikroneutralizacji. Surowice zastosowano w teście bez dalszej obróbki. KaŜdą surowicę zbadano w trzech powtórzeniach. Standaryzowaną ilość wirusa zmieszano z seryjnymi rozcieńczeniami surowicy i inkubowano w celu umoŝliwienia wiązania przeciwciał z wirusem. Następnie do mieszaniny wirusa i surowicy odpornościowej dodano zawiesinę komórek zawierającą określoną ilość komórek MDCK i inkubowano w 33 C. Po okresie inkubacji replikację wirusa uwidoczniono na podstawie hemaglutynacji czerwonych krwinek kurczęcia. Miano 0% neutralizacji dla surowicy obliczono metodą Reed i Muench. I.3.4. Odporność komórkową oszacowano metodą cytometrii przepływowej ze znakowaniem cytokin (CFC) [0226] Komórki T CD4 i CD8 krwi obwodowej specyficzne względem antygenu moŝna ponownie stymulować in vitro do wytwarzania IL-2, CD40L, TNF-alfa i IFN, gdy są one inkubowane z odpowiednim antygenem. W konsekwencji komórki T CD4 i CD8 specy-

66 ficzne względem antygenu moŝna policzyć metodą cytometrii przepływowej po standardowym wyznakowaniu immunofluorescencyjnym względem fenotypu komórki, a takŝe wytwarzania wewnątrzkomórkowych cytokin. W niniejszym badaniu antygen szczepionki grypy, a takŝe peptydy pochodzące ze specyficznego białka grypy uŝyto jako antygen do ponownej stymulacji komórek T specyficznych względem grypy. Wyniki wyraŝono jako częstość komórek T CD4 lub CD8 pozytywnych względem cytokin(-y) w subpopulacji komórek T CD4 lub CD8. I.3.. Metody statystyczne I Podstawowe punkty końcowe [0227] Udział procentowy, nasilenie i związek ze szczepieniem oczekiwanych miejscowych i ogólnych oznak i objawów podczas 7-dniowego okresu obserwacji (tj. w dniu szczepienia i przez kolejnych 6 dni) po szczepieniu oraz ogólnie. Udział procentowy, nasilenie i związek ze szczepieniem nieoczekiwanych miejscowych i ogólnych oznak i objawów podczas 21-dniowego okresu obserwacji (tj. w dniu szczepienia i przez kolejnych dni) po szczepieniu oraz ogólnie. Występowanie powaŝnych cięŝkich zdarzeń niepoŝądanych podczas całego badania. I Wtórne punkty końcowe Dla humoralnej odpowiedzi immunologicznej: Obserwowane zmienne: [0228] W dniach 0 i 21: hamowanie hemaglutynacji (HI) przez surowicę oraz miana przeciwciał NI, badane osobno względem kaŝdego z trzech szczepów wirusa grypy obecnych w szczepionce (przeciwciała anty-h1n1, anty-h3n2 i anty-b). W dniach 0 i 21: miana przeciwciał neutralizujących, badane osobno względem kaŝdego z trzech szczepów wirusa grypy obecnych w szczepionce Wyprowadzane zmienne (z 9% przedziałami ufności): [0229] Średnie geometryczne mian (GMT) przeciwciał HI w surowicy z 9% przedziałami ufności (9% CI) przed i po szczepieniu Wskaźniki serokonwersji* z 9% CI w dniu 21 Współczynniki konwersji** z 9% CI w dniu 21 Wskaźniki seroprotekcji *** z 9% CI w dniu 21 GMT przeciwciał NI w surowicy (z 9% przedziałami ufności) we wszystkich punktach czasowych.

67 * Wskaźnik serokonwersji definiuje się jako procent szczepionych osób, u których stwierdzono co najmniej 4-krotny wzrost surowiczych mian HI w dniu 21 w porównaniu z dniem 0, dla kaŝdego szczepu szczepionkowego. **Współczynnik konwersji definiuje się jako krotność wzrostu w GMT HI w surowicy w dniu 21 w porównaniu z dniem 0, dla kaŝdego szczepu szczepionkowego. ***Wskaźnik ochrony definiuje się jako procent szczepionych osób z surowiczym mianem HI = 40 po szczepieniu (dla kaŝdego szczepu szczepionkowego), który normalnie przyjmuje się jako oznaczające ochronę. Dla komórkowej odpowiedzi immunologicznej (CMI) Obserwowana zmienna [02] W dniach 0 i 21: częstość komórek CD4/CD8 pozytywnych względem cytokiny na 6 w róŝnych testach. W kaŝdym teście oznacza się ilościowo komórki T CD4/CD8 względem: Antygenu peptydowego wirusa grypy (pf) (szczegółowy charakter i pochodzenie tych antygenów musi być podane/wyjaśnione) Antygenu rozszczepionego wirusa grypy (sf) Antygenu całego wirusa grypy (wf). Wyprowadzane zmienne: [0231] komórki wytwarzające co najmniej dwie róŝne cytokiny (CD40L, IL-2, IFNγ, TNFα) komórki wytwarzające co najmniej CD40L i inną cytokinę (IL-2, TNFα, IFNγ) komórki wytwarzające co najmniej IL-2 i inną cytokinę (CD40L, TNFα, IFNγ) komórki wytwarzające co najmniej IFNγ i inną cytokinę (IL-2, TNFα, CD40L) komórki wytwarzające co najmniej TNFα i inną cytokinę (IL-2, CD40L, IFNγ) I Analiza immunogenności [0232] Analiza immunogenności była oparta na całej szczepionej kohorcie. Dla kaŝdej leczonej grupy obliczono poniŝsze parametry (z 9% przedziałami ufności): Średnie geometryczne mian (GMT) dla mian przeciwciał HI i NI w dniach 0 i 21 Średnie geometryczne mian (GMT) dla mian przeciwciał neutralizujących w dniach 0 i 21. Współczynniki konwersji w dniu 21. Wskaźniki serokonwersji (SC) w dniu 21, zdefiniowane jako procent szczepionych osób, u których stwierdzono co najmniej 4-krotny wzrost surowiczych mian HI w dniu 21 w porównaniu z dniem 0. Wskaźniki ochrony w dniu 21, zdefiniowane jako procent szczepionych osób z surowiczym mianem HI = 1:40

68 Częstość limfocytów T CD4/CD8 wydzielających w odpowiedzi podsumowano (statystyka opisowa) dla kaŝdej szczepionej grupy, w kaŝdym punkcie czasowym (Dzień 0, Dzień 21) oraz dla kaŝdego antygenu (peptyd wirusa grypy (pf), rozszczepiony wirus grypy (sf) oraz cały wirus grypy (wf)). Statystyka opisowa poszczególnych róŝnic między punktami czasowymi (Przed-Po) odpowiedzi dla kaŝdej szczepionej grupy i dla kaŝdego antygenu (pf, sf i wf) w róŝnych testach. Test nieparametryczny (test Kruskalla-Wallisa) zastosowano do porównania umiejscowienia róŝnic między 3 grupami i dla kaŝdego antygenu w kaŝdym z róŝnych testów obliczono wartość statystyczną p. Wszystkie testy istotności były dwustronne. Wartości p niŝsze niŝ lub równe 0,0 uznano za istotne statystycznie. Przykład II Wytwarzanie adiuwanta liposomalnego MPL/QS21 II.3 Wytwarzanie ciekłej zawiesiny MPL [0233] Ciekły preparat MPL (jak zastosowano w niniejszym dokumencie stanowi skrót dla 3D-MPL, tj. 3-O-deacylowanego monofosforylo-lipidu A) przygotowano z liofilizowanego proszku 3D-MPL. Ciekły preparat MPL stanowi stabilna stęŝona (około 1 mg/ml) dyspersja wodna surowego materiału, która jest gotowa do stosowania w preparacie szczepionki lub adiuwanta. Schematyczne przedstawienie procesu wytwarzania przedstawiono na Figurze 1. [0234] Do uzyskania maksymalnej wielkości partii wynoszącej 12 g wytwarzanie ciekłego preparatu MPL prowadzi się w jałowych szklanych pojemnikach. Dyspergowanie MPL obejmuje następujące etapy: - przeprowadzanie w zawiesinę proszku MPL w wodzie do wstrzykiwań - rozdzielanie duŝych agregatów przez podgrzanie (obróbka termiczna) - zmniejszanie wielkości cząstek do między0 nm i 0 nm metodą mikrofluidyzacji - wstępne filtrowanie preparatu na jednostce do filtracji wstępnej Sartoclean, 0,8/0,6 µm - jałowienie preparatu drogą filtracji w temperaturze pokojowej (jednostka Sartobran P, 0,22 µm) [023] Proszek MPL jest liofilizowany metodą mikrofluidyzacji, co powoduje wytworzenie stabilnej koloidalnej dyspersji w wodzie (z cząstkami MPL o wielkości odpowiedniej do jałowienia drogą filtracji). Liofilizowany proszek MPL dysperguje się w wodzie do wstrzykiwań w celu uzyskania zawiesiny mg/ml duŝych cząstek. Następnie zawiesinę poddaje się obróbce termicznej w trakcie mieszania. Po ochłodzeniu do temperatury pokojowej rozpoczyna się proces mikrofluidyzacji w celu zmniejszenia wielkości cząstek. Mikrofluidyzację prowadzi się przy uŝyciu urządzenia Microfluidics M1EH przez ciągłą

69 68 cyrkulację dyspersji przez mikrofluidyzacyjną komorę interakcyjną, przy określonym ciśnieniu dla minimalnej liczby przejść (liczba cykli: n min ). Czas trwania mikrofluidyzacji, odpowiadający liczbie cykli, oblicza się na podstawie zmierzonego natęŝenia przepływu oraz objętości dyspersji. Dla danego urządzenia i przy danym ciśnieniu uzyskane natęŝenie przepływu moŝe się róŝnić dla róŝnych komór interakcyjnych oraz dla konkretnej komory interakcyjnej w cyklu jej uŝytkowania. W niniejszym przykładzie stosowana komora interakcyjna jest typu FY Microfluidics. PoniewaŜ wydajność mikrofluidyzacji jest związana z parą ciśnienie natęŝenie przepływu, czas obróbki moŝe się zmieniać się dla róŝnych partii. Czas wymagany dla 1 cyklu oblicza się na podstawie natęŝenia przepływu. Rozwa- Ŝanym natęŝeniem przepływu jest natęŝenie przepływu mierzone dla wody do wstrzykiwań bezpośrednio przed wprowadzeniem MPL do urządzenia. Jeden cykl definiuje się jako czas (w minutach) wymagany do jednokrotnego przejścia całej objętości MPL przez urządzenie. Czas wymagany do uzyskania n cykli oblicza się w następujący sposób: n ilość MPL do obróbki (ml)/natęŝenie przepływu (ml/min) 1 2 [0236] Zatem odpowiednio dostosowuje się liczbę cykli. Minimalna liczba cykli do przeprowadzenia (n min ) jest opisana dla korzystnych zastosowanych wyposaŝenia i komór interakcyjnych. Całkowita liczba cykli do przeprowadzenia zaleŝy od wyniku pomiaru wielkości cząstek przeprowadzonego po n min cyklach. Granica wielkości cząstek (d lim ) jest definiowana na podstawie danych z przeszłości. Pomiar realizuje się z zastosowaniem techniki spektroskopii korelacji fotonowej (PCS) i d lim wyraŝa się jako wynik jednomodalny (Z średnia). PoniŜej tej granicy mikrofluidyzację moŝna zatrzymać po n min cyklach. PowyŜej tej granicy mikrofluidyzację kontynuuje się nadal do uzyskania satysfakcjonującego zmniejszenia wielkości przez maksymalnie kolejnych 0 cykli. [0237] JeŜeli filtracji nie prowadzi się bezpośrednio po mikrofluidyzacji zdyspergowany MPL przechowuje się w +2 do +8 C do czasu przeniesienia na powierzchnię filtracyjną. Po mikrufluidyzacji dyspersję rozcieńcza się wodą do wstrzykiwań i jałowi drogą filtracji na filtrze 0,22 µm w przepływie laminarnym. Końcowe stęŝenie MPL wynosi 1 mg/ml (0,80-1, mg/ml). II.2 Wytwarzanie liposomalnego adiuwanta MPL/QS21 [0238] Adiuwant ten, nazwany AS01, zawiera 3D-MPL i QS21 w postaci wygaszonej cholesterolem i jest wytwarzany w sposób opisany w WO 96/ W szczególności adiuwant AS01 przygotowano zasadniczo w sposób opisany w Przykładzie 1.1 WO 96/ Adiuwant AS01B zawiera: liposomy, które z kolei zawierają dioleoilofosfatydylocholinę (DOPC), cholesterol i 3D MPL [w ilości 00 µg DOPC, µg cholesterolu i 0 µg 3D-

70 MPL, przy czym kaŝdą wartość podano w przybliŝeniu na dawkę szczepionki], QS21 [0 µg/dawkę], bufor fosforanowy NaCl oraz wodę w objętości 0, ml. [0239] Adiuwant AS01E zawiera takie same składniki co AS01B, ale w niŝszym stęŝeniu, w ilości 00 µg DOPC, 12 µg cholesterolu, 2 µg 3D-MPL i 2 µg QS21, bufor fosforanowy NaCl i wodę do objętości 0, ml. [0240] W sposobie wytwarzania liposomów zawierających MPL, DOPC (dioleilofosfatydylocholina), cholesterol i MPL rozpuszcza się w etanolu. Błonę lipidową tworzy się przez odparowanie rozpuszczalnika pod próŝnią. Dodaje się sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (9 mm Na 2 HPO 4, 41 mm KH 2 PO 4, 0 mm NaCl) o ph 6,1 i mieszaninę poddaje się wstępnej homogenizacji, po czym prowadzi się homogenizację pod wysokim ciśnieniem 00 funtach/cal 2 (około 1 do cykli). Prowadzi to do wytworzenia liposomów, które jałowi się drogą filtracji przez membranę 0,22 µm w obszarze aseptycznym (klasa 0). Następnie jałowy produkt umieszcza się w jałowych szklanych pojemnikach i przechowuje w chłodni (+2 do +8 C). [0241] W ten sposób wytworzone liposomy zawierają MPL w błonie (postać MPL in z WO 96/33739). [0242] QS21 dodaje się do wodnego roztworu w poŝądanym stęŝeniu. Przykład III - Ocena przedkliniczna adiuwantowanych i nieadiuwantowanych szczepionek przeciw grypie na fretkach III.1. Uzasadnienie i cele [0243] ZakaŜenie grypą w modelu fretkowym blisko przypomina grypę u człowieka zarówno w odniesieniu do wraŝliwości na zakaŝenie, jak i odpowiedzi klinicznej. Fretki są wyjątkowo wraŝliwe na zakaŝenie wirusami grypy A i B bez wcześniejszego dostosowania szczepów wirusa. Zatem dostarcza to doskonały układ modelowy do badań ochrony nadawanej przez podawane szczepionki przeciw grypie. W badaniu badano skuteczność róŝnych trójwaŝnych szczepionek typu split, adiuwantowanych lub nie, w zmniejszaniu objawów choroby (temperatury ciała) oraz wydalania wirusa w wydzielinie z nosa fretek po prowokacji homologicznymi szczepami. [0244] Celem tego doświadczenia było wykazanie skuteczności adiuwantowanej szczepionki przeciw grypie w porównaniu ze szczepionką zwykłą (nieadiuwantowaną). [024] Punkty końcowe były następujące: 1) Podstawowe punkt końcowy: zmniejszenie wydalania wirusa w popłuczynach z nosa po homologicznej prowokacji. 2) Wtórne punkty końcowe: Analiza odpowiedzi humoralnej na podstawie mian HI. III.2. Projekt doświadczenia

71 70 III.2.1. Traktowanie/grupa (Tabela 1) [0246] Samice fretek (Mustela putorius furo) w wieku 14- tygodni uzyskano z MISAY Consultancy (Hampshire, Wielka Brytania). Fretki poddano szczepieniu pierwotnemu w dniu 0 reprezentującym odmienny podtyp szczepem H1N1 A/Stockholm/24/90 (4 Log TCID 0 /ml). W dniu 21 fretkom wstrzyknięto domięśniowo pełną dawkę dla człowieka (dawka szczepionki 00 µg, 1 µg HA/szczep) połączenia H1N1 A/New Caledonia//99, H3N2 A/Panama/07/99 i B/Shangdong/7/97. Następnie fretki poddano prowokacji w dniu 42 drogą donosową reprezentującym odmienny podtyp szczepem H3N2 A/Wyoming/3/03 (4, Log TCID 0 /ml). Tabela 1 Grupa Antygen(-y) + dawka 1 TrójwaŜna/zwykła 2 TrójwaŜna/MPL- QS21 w liposomach Preparat + dawka Cała HD: 1 µg HA /szczep Cała HD: 1 µg HA/ szczep 6 fretek/grupę. In/Po = Poszczególne/połączone Uwagi (schemat/droga/prowokacja) In/Po Inne traktowanie IM; Dzień 21 In Szczepienie pierwotne H1N1 (A/Stockolm/24 /90) Dzień 0 IM; Dzień 21 In Szczepienie pierwotne H1N1 (A/Stockolm/24 /90) Dzień 0 1 III.2.2. Wytwarzanie preparatów szczepionki (Tabela 2) Preparat 1: Zwykły (nieadiuwantowany) trójwaŝny preparat typu split: [0247] Do wody do wstrzykiwań dodaje się -krotnie stęŝony PBS (ph 7,4 przy stęŝeniu jednokrotnym), a takŝe mieszaninę zawierającą Tween 80, Triton X-0 i VES (ilości uwzględniające detergenty obecne w szczepach). Po minutach mieszania dodaje się 1 µg kaŝdego ze szczepów H1N1 i H3N2 oraz 17, µg szczepu B z min mieszaniem pomiędzy kaŝdym dodawaniem. Preparat miesza się przez minimum 1 minut i przechowywuje w 4 C, gdy nie jest bezpośrednio podawany. Preparat 2: TrójwaŜna szczepionka typu split adiuwantowana MPL/QS21 w liposomach: [0248] Do wody do wstrzykiwań dodaje się -krotnie stęŝony PBS (ph 7,4 przy stęŝeniu jednokrotnym), a takŝe mieszaninę zawierającą Tween 80, Triton X-0 i VES (ilości uwzględniające detergenty obecne w szczepach). Po mieszaniu przez min, dodaje się 1 µg kaŝdego ze szczepów H1N1 i H3N2 oraz 17, µg szczepu B z minutowym miesza-

72 71 niem między kaŝdym dodawaniem. Preparat miesza się przez 1 minut. Do preparatu dodaje się przedmieszkę tak zwanego DQS21-MPLin, a następnie miesza się przez minimum 1 minut. Przedmieszka DQS21-MPLin jest mieszaniną liposomów (złoŝonych z 40 mg/ml DOPC, mg/ml cholesterolu, 2 mg/ml MPL) i immunostymulanta QS21. Przedmieszkę tą inkubuje się przez minimum 1 minut przed dodaniem do trójwaŝnej mieszaniny rozszczepionego wirusa. StęŜenie MPL i QS21 w końcowym preparacie wynosi 0 µg na 00 µl. Preparat przechowuje się w 4 C, gdy nie jest bezpośrednio podawany. [0249] Uwaga: Do kaŝdego preparatu dodaje się -krotnie stęŝony PBS do uzyskania izotoniczności i jest on 1-krotnie stęŝony w końcowej objętości. Objętość H 2 O oblicza się tak aby uzyskać docelową objętość. Tabela 2: Końcowy skład preparatów 1 i 2 (preparaty wytworzone z rozszczepionymi szczepami (na 00 µl)) Preparat Antygen 1 H1N1:1 µg H3N2: 1 µg B: 17, µg 2 H1N1:1 µg H3N2: 1 µg B: 17, µg Tween 80 Triton X-0 VES DOPC Cholesterol MPL QS21 37 µg µg 0 µg µg µg 0 µg 1 mg µg 0 µg 0 µg III.2.3. Odczyty (Tabela 3) [0] Tabela 3 Odczyt Punkt czasowy Typ próbki Metoda analizy Wydalanie wirusa D+1 do D+7 po prowokacji Popłuczyny z nosa Przeciwciała anty-hi (miana HI) Przed, Po szczepieniu pierwotnym, Po immunizacji, Po prowokacji Surowice Mianowanie Test hamowania hemaglutynacji 1 III.3. Wyniki [021] Schematyczne przedstawienie wyników zamieszczono na Figurach 1 i 2. III.3.1. Odporność humoralna (Figura 1). [022] Aktywność hamowania hemaglutynacji względem szczepów szczepionkowych H3N2 (szczep szczepionkowy A/Panama/07/99 i szczep zastosowany do prowokacji A/Wyoming/3/03) mierzono w surowicy od 6 zwierząt na grupę w dniu 17 po donoso-

73 72 wym heterologicznym szczepieniu pierwotnym oraz w dniu 21 po immunizacji i w dniu 13 po prowokacji. Miana przeciwciał przeciw hemaglutyninie względem trzech szczepów grypy określono z zastosowaniem testu hamowania hemaglutynacji (HI), jak opisano w Przykładzie I.2.1. Wnioski były następujące: Dla dwóch szczepów A/H3N2 oraz dla wszystkich grup zaobserwowano wzmocnienie mian HI we wszystkich szczepionych grupach po immunizacji. Po immunizacji A/Panama/07/99 zaobserwowano statystycznie istotne wyŝsze miana anty-a/panama/07/99 HI, gdy trójwaŝna szczepionka typu split była adiuwantowana MPL/QS21 w liposomach w porównaniu ze zwykłą trójwaŝną szczepionką typu split. 1 Po immunizacji A/Panama/07/99, tylko trójwaŝna szczepionka typu split adiuwantowana MPL/QS21 w liposomach była w stanie istotnie zwiększyć miana HI względem heterologicznego szczepu A/Wyoming/3/03 (reaktywność krzyŝowa przed prowokacją tym szczepem powstałym w wyniku dryfu). Po prowokacji A/Wyoming3/03 zaobserwowano istotny wzrost mian anty- A/Wyoming/3/03 HI zarówno dla zwykłej trójwaŝnej szczepionki typu split, jak i trójwaŝnej szczepionki typu split adiuwantowanej MPL/QS21 w liposomach. Dla szczepów A/New Caledonia//99 i B/Shangdong/7/97 zaobserwowano staty- 2 stycznie istotnie wyŝsze miana HI gdy trójwaŝna szczepionka typu split była adiuwantowana MPL/QS21 w liposomach w porównaniu ze zwykłą trójwaŝną szczepionką typu split. III.3.2. Wydalanie wirusa (Figura 3). [023] Mianowanie wirusa w popłuczynach z nosa przeprowadzono dla 6 zwierząt na grupę, jak opisano szczegółowo w Przykładzie I.2.3. Płukanie nosa przeprowadzono przez podanie ml PBS do obydwu nozdrzy obudzonych zwierząt. Materiał do szczepienia zebrano na szalce Petriego i umieszczono w pojemnikach na próbki w -80 C. Dwa dni po prowokacji zaobserwowano statystycznie istotne niŝsze wydalanie wirusa dla trójwaŝnej szczepionki typu split adiuwantowanej MPL/QS21 w liposomach w porównaniu ze zwykłą trójwaŝną szczepionką typu split. W dniu 49 (7 dni po prowokacji) nie wykryto wirusa w popłuczynach z nosa.

74 III.3.3. Wnioski z doświadczenia [024] WyŜsze odpowiedzi humoralne (miana HI) zaobserwowano dla trójwaŝnej szczepionki typu split adiuwantowanej MPL/QS21 w liposomach w porównaniu ze zwykłą trójwaŝną szczepionką typu split dla wszystkich 4 szczepów. [02] Po immunizacji A/Panama/07/99 tylko trójwaŝna szczepionka typu split adiuwantowana MPL/QS21 w liposomach była w stanie istotnie zwiększyć miana HI przeciw heterologicznemu szczepowi A/Wyoming/3/03 (reaktywność krzyŝowa przed prowokacją tym szczepem). [026] MPL/QS21 w preparatach liposomowych wykazał dodatkową korzyść pod względem wydajności ochronnej u fretek (niŝsze wydalanie wirusa po prowokacji heterologicznej). Reakcja krzyŝowa obserwowana po immunizacji trójwaŝną szczepionką typu split z MPL/QS21 w liposomach przeciw szczepowi powstałemu w wyniku dryfu, zastosowanemu do prowokacji wydaje się korelować z efektem ochronnym obserwowanym u tych fretek. Przykład IV Ocena przedkliniczna adiuwantowanych i nieadiuwantowanych szczepionek przeciw grypie u szczepionych pierwotnie myszy C7BI/6 IV.1. Projekt doświadczenia i cel [027] Do tego doświadczenia zastosowano myszy C7BI/6 szczepione pierwotnie szczepem heterologicznym. [028] Celem było porównanie odpowiedzi immunologicznych, humoralnej (miana HI) i CMI (ICS, wybarwianie wewnątrzkomórkowych cytokin), wywołanych przez dostępną w handlu z GlaxoSmithKline trójwaŝną szczepionkę typu split (Fluarix ) względem trójwaŝnej szczepionki podjednostkowej (szczepionka Agrippal z Chiron), a takŝe odpowiedzi CMI uzyskanej z uŝyciem tych szczepionek adiuwantowanych liposomami, zawierającymi sam 3D-MPL, samą DQS21 (QS21 w liposomach, tj. detoksykowana QS21) lub MPL/QS21 w liposomach. W poniŝszym przykładzie preparaty przygotowano rozpoczynając od poszczególnych preparatów rozszczepionych wirusów w celu uzyskania takiego samego składu jak w szczepionce Fluarix, a nie od dawek Fluarix dostępnych w handlu. Uzyskane preparaty nazwano typu Fluarix. IV.1.1. Traktowanie/grupa [029] Samice myszy C7BI/6 w wieku 6-8 tygodni otrzymano z Harlan Horst, Holandia. Myszy poddano szczepioniu pierwotnemu w dniu 0 szczepami reprezentującymi odmienne podtypy ( µg HA całych inaktywowanych H1N1 A/Beijing/262/9, H3N2 A/Panama/07/99, B/Shangdong/7/97). W dniu 28 myszom wstrzyknięto domięśniowo 1, µg HA trójwaŝnej szczepionki typu split (A/New Caledonia//99,

75 74 A/Wyoming/3/03, B/Jiangsu//03), zwykłej lub adiuwantowanej (patrz grupy w Tabelach 4 do 6 poniŝej). Grupa Antygen/Preparat Tabela 4 1 TrójwaŜna szczepionka typu split */Zwykła (nieadiuwantowana) = typu Fluarix 2 TrójwaŜna szczepionka typu split */Liposomy zawierające 3D-MPL Inne traktowanie Heterologiczne szczepienie pierwotne D0 Heterologiczne szczepienie pierwotne D0 3 TrójwaŜna szczepionka typu split */DQS21 Heterologiczne szczepienie pierwotne D0 4 TrójwaŜna szczepionka typu split */MPL/QS21 w liposomach Heterologiczne szczepienie pierwotne D0 Aggripal (podjednostkowa) Heterologiczne szczepienie pierwotne D0 6 Aggripal (podjednostkowa)/liposomy zawierające 3D-MPL Heterologiczne szczepienie pierwotne D0 7 Aggripal (podjednostkowa)/dqs21 Heterologiczne szczepienie pierwotne D0 8 Aggripal (podjednostkowa)/mpl/qs21 w liposomach Heterologiczne szczepienie pierwotne D0 9 PBS Heterologiczne szczepienie pierwotne D0 * typu Fluarix. 16 myszy/grupę 1 IV.1.2. Wytwarzanie preparatów szczepionki Preparat dla grupy 1: [0260] Do wody do wstrzykiwań dodaje się -krotnie stęŝony PBS (ph 7,4 przy stęŝeniu jednokrotnym), a takŝe mieszaninę zawierającą Tween 80, Triton X-0 i VES (ilości uwzględniające detergenty obecne w szczepach). Po mieszaniu przez min, dodaje się 1 µg kaŝdego ze szczepów H1N1 i H3N2 oraz 1 µg szczepu B z min mieszaniem między kaŝdym dodawaniem. Preparat miesza się przez minimum 1 minut i przechowuje w 4 C gdy nie jest bezpośrednio podawany. Preparat dla grupy 2: [0261] Do wody do wstrzykiwań dodaje się -krotnie stęŝony PBS (ph 7,4 przy stęŝeniu jednokrotnym), a takŝe mieszaninę zawierającą Tween 80, Triton X-0 i VES (ilości uwzględniające detergenty obecne w szczepach). Po mieszaniu przez min, dodaje się 1 µg kaŝdego ze szczepów H1N1 i H3N2 oraz 1 µg szczepu B z minutowym mieszaniem między kaŝdym dodawaniem. Preparat miesza się przez 1 minut. Dodaje się stęŝone

76 liposomy zawierające 3D-MPL (złoŝone z 40 mg/ml DOPC, mg/ml cholesterolu, 2 mg/ml 3D-MPL) do uzyskania końcowego stęŝenia MPL wynoszącego 0 µg na dawkę. Następnie preparat miesza się przez minimum 1 minut i przechowuje w 4 C, gdy nie jest bezpośrednio podawany. Preparat dla grupy 3: [0262] Do wody do wstrzykiwań dodaje się -krotnie stęŝony PBS (ph 7,4 przy stęŝeniu jednokrotnym), a takŝe mieszaninę zawierającą Tween 80, Triton X-0 i VES (ilości uwzględniające detergenty obecne w szczepach). Po mieszaniu przez min, dodaje się 1 µg kaŝdego ze szczepów H1N1 i H3N2 oraz 1 µg szczepu B z minutowym mieszaniem między kaŝdym dodawaniem. Preparat miesza się przez 1 minut. Następnie dodaje się przedmieszkę złoŝoną z liposomów (złoŝonych z 40 mg/ml DOPC, mg/ml cholesterolu) i QS21, nazwaną DQS21 do uzyskania końcowego stęŝenia QS21 wynoszącego 0 µg na dawkę. Przedmieszkę tę inkubuje się przez co najmniej 1 minut przed dodaniem do trójwaŝnej mieszaniny rozszczepionego wirusa. Preparat miesza się przez minimum 1 minut i przechowuje w 4 C, gdy nie jest bezpośrednio podawany. Preparat dla grupy 4: [0263] Do wody do wstrzykiwań dodaje się -krotnie stęŝony PBS (ph 7,4 przy stęŝeniu jednokrotnym), a takŝe mieszaninę zawierającą Tween 80, Triton X-0 i VES (ilości uwzględniające detergenty obecne w szczepach). Po mieszaniu przez min, dodaje się 1 µg kaŝdego ze szczepów H1N1 i H3N2 oraz 1 µg szczepu B z minutowym mieszaniem między kaŝdym dodawaniem. Preparat miesza się przez 1 minut. Następnie dodaje się mieszaninę złoŝoną z liposomów zawierających 3D-MPL (złoŝonych z 40 mg/ml DOPC, mg/ml cholesterolu, 2 mg/ml 3D-MPL) i QS21 do uzyskania końcowych stęŝeń QS21 i MPL wynoszących 0 µg na dawkę. Mieszaninę tę inkubuje się przez co najmniej 1 minut przed dodaniem do trójwaŝnej mieszaniny rozszczepionego wirusa. Preparat nazwany trójwaŝna szczepionka typu split z MPL/QS21 w liposomach miesza się przez minimum 1 minut i przechowuje w 4 C, gdy nie jest bezpośrednio podawany. [0264] Uwaga: W grupach 1 do 4, dodaje się -krotnie stęŝony PBS do uzyskania izotoniczności i jest on 1-krotnie stęŝony w końcowej objętości. Objętość H 2 O oblicza się tak aby uzyskać zamierzoną objętość. Preparat dla grupy : [026] Miesza się jedną dawkę Aggripal i jednakową objętość PBS mod ph 7,4. Preparat miesza się przez minimum 1 minut i przechowuje w 4 C, gdy nie jest bezpośrednio podawany. Preparat dla grupy 6:

77 [0266] Miesza się PBS ph 7,4 i jedną dawkę Aggripal. Następnie w trakicie mieszania dodaje się liposomy zawierające 3D-MPL (złoŝone z 40 mg/ml DOPC, mg/ml cholesterolu, 2 mg/ml 3D-MPL) do uzyskania równowaŝnika 0 µg MPL na dawkę. Preparat miesza się przez minimum 1 minut i przechowuje w 4 C, gdy nie jest bezpośrednio podawany. Uwaga: Dodaje się PBS do uzyskania izotoniczności w końcowej objętości. Aggripal stanowi połowę objętości preparatu. Preparat dla grupy 7: [0267] Miesza się PBS ph 7,4 i jedną dawkę Aggripal. Następnie w trakcie mieszania dodaje się przedmieszkę liposomów (złoŝonych z 40 mg/ml DOPC, mg/ml cholesterolu) i QS21, nazwaną DQS21 do uzyskania równowaŝnika 0 µg QS21. Przedmieszkę tę inkubuje się przez co najmniej 1 minut przed dodaniem. Preparat miesza się przez minimum 1 minut i przechowuje w 4 C, gdy nie jest bezpośrednio podawany. Uwaga: Dodaje się PBS do uzyskania izotoniczności w końcowej objętości. Aggripal stanowi połowę objętości preparatu. Preparat dla grupy 8: [0268] Miesza się PBS ph 7,4 i jedną dawkę Aggripal. Podczas mieszania do preparatu dodaje się przedmieszkę zwaną DQS21-MPLin. Przedmieszka DQS21-MPLin jest mieszaniną liposomów (złoŝonych z 40 mg/ml DOPC, mg/ml cholesterolu, 2 mg/ml MPL) i immunostymulanta QS21. Przedmieszkę tę inkubuje się przez co najmniej 1 minut przed dodaniem do mieszaniny Aggripal/PBS. Ilość kaŝdego z MPL i QS21 w tym preparacie wynosi 0 µg. Preparat miesza się przez minimum 1 minut i przechowuje w 4 C, gdy nie jest bezpośrednio podawany. Uwaga: Dodaje się PBS do uzyskania izotoniczności w końcowej objętości. Aggripal stanowi połowę objętości preparatu. Grupa Tabela : Końcowy skład preparatów 1 do 4 przygotowanych z rozszczepionymi szczepami (na 1 ml) Antygen Tween 80 Triton X-0 1 H1N1: 1 µg H3N2: 1 µg B: 17, µg VES DOPC Cholesterol MPL 70 µg 1 µg 0 µg Identyczny z 1 Identyczny z 1 1 µg 0 µg 1 mg µg 0 µg - QS21 3 Identyczny z 1 Identyczny z 1 1 µg 0 µg 1 mg µg - 0 µg 4 Identyczny z 1 Identyczny z 1 1 µg 0 µg 1 mg µg 0 µg 0 µg

78 77 Tabela 6: Końcowy skład preparatów do 8 przygotowanych ze szczepionką Aggripal (1 ml) Grupa Antygen DOPC Cholesterol MPL QS21 1 dawka szczepionki Aggripal Identyczny z 1 mg µg 0 µg - 7 Identyczny z 1 mg µg - 0 µg 8 Identyczny z 1 mg µg 0 µg 0 µg IV.1.3. Odczyty (Tabela 7) [0269] Tabela 7 Odczyt Punkt czasowy Typ próbki Przeciwciała anty-hi (miana HI) CD4, CD8, IL-2, IFN-γ (FACS) Dzień 21 po immunizacji (Dzień 49) Dzień 7 po immunizacji (Dzień 3) In= Poszczególne / Po= Połączone In/Po Sposób analizy Surowica In Test hamowania hemaglutynacji PBL Po Wybarwianie wewnątrzkomórkowych cytokin (ICS) IV. 2. Wyniki IV.2,1. Odpowiedź humoralna (miana HI 21 dni po immunizacji). Odpowiedzi humoralne mierzone na podstawie mian HI Figura 4. [0270] Aktywność hamowania hemaglutynacji przeciw trzem szczepom szczepionkowym (A/New Caledonia//99, A/Wyoming/3/03, B/Jiangsu//03) wykryto w dniu 21 po immunizacji w surowicy 8 zwierząt na grupę. W porównaniu z myszami immunizowanymi PBS zaobserwowano wzrost mian HI 1 po immunizacji wszystkimi badanymi kandydatami na szczepionkę przeciw grypie dla wszystkich trzech szczepów (TrójwaŜna szczepionka typu split lub TrójwaŜna szczepionka podjednostkowa). Dla wszystkich trzech szczepów, statystycznie istotnie wyŝsze miana HI zaobserwowano u myszy immunizowanych trójwaŝną szczepionką typu split adiuwantowaną samą DQS21 lub MPL/QS21 w liposomach w porównaniu z myszami immunizowanymi trójwaŝną szczepionką przeciw grypie typu split, zwykłą lub adiuwantowaną liposomami zawierającymi sam 3D-MPL. Uszeregowanie odpowiedzi humoralnej było na-

79 78 stępujące: (MPL/QS21 w liposomach = sama DQS21) > (Liposomy zawierające sam 3D-MPL = Zwykła) > PBS Dla wszystkich trzech szczepów, statystycznie istotnie wyŝsze miana HI zaobserwowano u myszy immunizowanych trójwaŝną szczepionką podjednostkową adiuwantowaną samą DQS21, liposomami zawierającymi sam 3D-MPL lub MPL/QS21 w liposomach w porównaniu z myszami immunizowanymi zwykłą trójwaŝną szczepionką typu split. Uszeregowanie odpowiedzi humoralnej było następujące: (MPL/QS21 w liposomach = sama DQS21 = liposomy zawierające sam 3D-MPL) > Zwykła > PBS. 1 TrójwaŜna szczepionka typu split i trójwaŝna szczepionka podjednostkowa wywołały podobne miana HI, gdy preparaty nie były adiuwantowane lub były adiuwantowane samą DQS21 lub MPL/QS21 w liposomach. IV.2.2. Komórkowa odpowiedź immunologiczna (ICS w dniu 7 po immunizacji). Odpowiedzi komórek T CD4 Figura [0271] PBMC od 8 myszy na grupę zebrano w dniu 7 po immunizacji i zbadano w 4 pulach po 2 myszy/grupę. Pod względem wszystkich komórek T CD4+ specyficznych względem całego wirusa grypy (eksprymujących IL-2, IFN-γ i obydwie cytokiny): Bez względu na preparat zaobserwowano identyczne odpowiedzi komórek T CD4+ między trójwaŝną szczepionką typu split i trójwaŝną szczepionką podjednostkową. WyŜsze odpowiedzi komórek T CD4+ zaobserwowano dla trójwaŝnych preparatów (typu split lub podjednostkowych) adiuwantowanych MPL/QS21 w liposomach w porównaniu z trójwaŝnymi preparatami (typu split lub podjednostkowymi) zwykłymi lub adiuwantowanymi liposomami zawierającymi sam 3D-MPL lub samą DQS21. Dla odpowiedzi komórkowej wywołanej przez trójwaŝny preparat (typu split lub 2 podjednostkowy) zaobserwowano synergiczne działanie liposomów zawierających 3D- MPL + DQS21 w porównaniu z samą DQS21 lub liposomami zawierającymi sam 3D- MPL. Uszeregowanie odpowiedzi komórkowej było następujące: MPL/QS21 w liposomach > (liposomy zawierające sam 3D-MPL = sama DQS21 = zwykła = PBS). IV.3. Podsumowanie wyników i wnioski [0272] Dla wszystkich trzech szczepów, statystycznie istotnie wyŝsze miana HI zaobser-

80 79 wowano u myszy immunizowanych trójwaŝnymi preparatami (typu split lub podjednostkowymi) adiuwantowanymi samą DQS21 lub MPL/QS21 w liposomach w porównaniu z myszami immunizowanymi zwykłymi trójwaŝnymi preparatami (typu split lub podjednostkowymi). Liposomy zawierające sam 3D-MPL wydawały się wywoływać wyŝszą odpowiedź humoralną, gdy były formułowane z trójwaŝną szczepionką podjednostkową niŝ z trójwaŝną szczepionką typu split. Bez względu na preparat uzyskano podobne odpowiedzi komórek T CD4+ dla trójwaŝnej szczepionki typu split (Fluarix) i trójwaŝnej szczepionki podjednostkowej (Agrippal). 1 2 TrójwaŜne preparaty (typu split lub podjednostkowe) adiuwantowane MPL/QS21 w liposomach wywołały wyŝsze odpowiedzi komórek T CD4+ w porównaniu z trójwaŝnymi preparatami (typu split lub podjednostkowymi) zwykłymi lub adiuwantowanymi liposomami zawierającymi sam 3D-MPL lub samą QS21 w liposomach (DQS21). Przykład V Przedkliniczne porównanie szczepionki zawierającej preparat antygenowy rozszczepionego wirusa grypy adiuwantowanej 3D-MPL/QS21 w preparacie liposomalnym (3D-MPL w dwóch róŝnych stęŝeniach) V1 - Myszy V.1.1 Projekt i cel doświadczenia [0273] W tym doświadczeniu uŝyto myszy C7B1/6 szczepionych pierwotnie heterologicznymi szczepami. Celem była analiza odpowiedzi immunologicznych, humoralnej (miana HI) i CMI (ICS, wybarwianie wewnątrzkomórkowych cytokin), wywołanych przez dostępną w handlu z GlaxoSmithKline trójwaŝną szczepionkę typu split (Fluarix ) w postaci nieadiuwantowanej oraz po adiuwantowaniu liposomami zawierającymi dwa róŝne stęŝenia 3D-MPL i QS21. V.1.2 Traktowanie/grupa [0274] Samice myszy C7BI/6 w wieku 8 tygodni otrzymano z Harlan Horst, Holandia. Myszy poddano szczepieniu pierwotnemu donosowo w dniu 0 szczepami reprezentującymi odmienne podtypy (całe inaktywowane H1N1 A/Beijing/262/9, H3N2 A/Panama/07/99, B/Shangdong/7/97). W dniu 28 myszom wstrzyknięto domięśniowo trójwaŝną szczepionkę typu split (A/New Caledonia, A/Wyoming, B/Jiangsu) zwykłą lub adiuwantowaną z dwoma róŝnymi stęŝeniami immunostymulantów w preparatach liposomalnych (patrz grupy w Tabeli 8 poniŝej).

81 80 Tabela 8 Grupa Antygen(-y) + dawka Preparat + dawka Inne traktowanie 1 TrójwaŜna szczepionka przeciw grypie typu split - 1, µg/szczep/0 µl 2 TrójwaŜna szczepionka przeciw grypie typu split - 1, µg/szczep/0 µl 3 TrójwaŜna szczepionka przeciw grypie typu split - 1, µg/szczep/0 µl 4 TrójwaŜna szczepionka przeciw grypie typu split - 1, µg/szczep/0 µl TrójwaŜna szczepionka przeciw grypie typu split - 1, µg/szczep/0 µl Zwykła Liposomy zawierające 3D-MPL 0 µg na 0, ml dawkę DQS21 0 µg na 0, ml dawkę MPL i QS21 2 µg na 0, ml dawkę MPL i QS21 0 µg na 0, ml dawkę Heterologiczne szczepienie pierwotne D0 całym inaktywowanym wirusem µg/ µl donosowo Heterologiczne szczepienie pierwotne D0 całym inaktywowanym wirusem µg/ µl donosowo Heterologiczne szczepienie pierwotne D0 całym inaktywowanym wirusem µg/ µl donosowo Heterologiczne szczepienie pierwotne D0 całym inaktywowanym wirusem µg/ µl donosowo Heterologiczne szczepienie pierwotne D0 całym inaktywowanym wirusem µg/ µl donosowo 6 PBS Brak Heterologiczne szczepienie pierwotne D0 całym inaktywowanym wirusem µg/ µl donosowo [027] Preparaty przygotowano tak jak w Przykładzie IV. V Wyniki. Odpowiedzi humoralne mierzone na podstawie mian HI Figura 24. [0276] Aktywność hamowania hemaglutynacji przeciw 3 szczepom szczepionkowym wykryto w dniu 21 po immunizacji w surowicy 9 zwierząt na grupę. W porównaniu z myszami immunizowanymi PBS zaobserwowano wzrost mian HI po immunizacji wszystkimi kandydatami na szczepionkę przeciw grypie, co zbadano dla wszystkich trzech szczepów. Dla wszystkich trzech szczepów, statystycznie istotnie wyŝsze miana HI zaobser- wowano u myszy immunizowanych trójwaŝną szczepionką typu split adiuwantowaną MPL i QS21 w jakimkolwiek stęŝeniu w porównaniu z myszami immunizowanymi zwykłą trójwaŝną szczepionką przeciw grypie typu split (maksymalna wartość p = 0,03) Nie stwierdzono istotnej statystycznie róŝnicy między dwiema grupami z adiuwan-

82 tem liposomalnym wśród grup z adiuwantem Komórkowa odpowiedź immunologiczna (ICS w dniu 7 po immunizacji) Figura 2. [0277] PBMC od 9 myszy/grupę zebrano 7 dni po immunizacji i zbadano w trzech pulach po 3 myszy/grupę. Pod względem komórek T CD4+, eksprymujących IL-2, IFN-γ i obydwie cytokiny, specyficznych względem całego wirusa grypy: Jak widać na Figurze 2 najwyŝsze odpowiedzi IFN-γ specyficznych komórek T CD4+ uzyskano po immunizacji trójwaŝną szczepionką typu split adiuwantowaną najwyŝszym stęŝeniem immunostymulantów. JednakŜe odpowiedzi IL2 i IL2 + IFN-γ komórek T były podobne między tymi dwoma stęŝeniami immunostymulantów. Przykład VI Próba kliniczna w populacji osób starszych w wieku ponad 6 lat z uŝyciem szczepionki zawierającej preparat antygenowy rozszczepionego wirusa grypy adiuwantowany MPL/QS21 w preparacie liposomalnym (3D-MPL w dwóch róŝnych stęŝeniach) VI.1. Projekt badania i cele [0278] Otwarte randomizowane badanie fazy I/II w celu wykazania równowaŝności kandydatów na szczepionki przeciw grypie z GlaxoSmithKline Biologicals zawierających róŝne adiuwanty podawanych populacji osób starszych (w wieku 6 lat i starszych) w porównaniu z Fluarix (znaną jako α-rix w Belgii) podawaną u osób dorosłych (18-40 lat) pod względem komórkowej odpowiedzi immunologicznej [0279] Wyznaczono cztery równoległe grupy: 7 osób dorosłych (w wieku lat) w jednej grupie kontrolnej otrzymującej jedną dawkę Fluarix (grupa Fluarix) 0 osób starszych (w wieku 6 lat i starszych) randomizowanych 3:3:2 na trzy grupy: - jedna grupa z 7 osobnikami otrzymującymi szczepionkę przeciw grypie adiuwantowaną AS01B - jedna grupa z 7 osobnikami otrzymującymi szczepionkę przeciw grypie adiuwantowaną AS01E - Grupa odniesienia dla grupy szczepionej przeciw grypie z 0 osobnikami otrzymującymi jedną dawkę Fluarix Podstawowy cel [0280] Podstawowym celem jest wykazanie równowaŝności 21 dni po szczepieniu adiuwantowanymi szczepionkami przeciw grypie, podawanymi osobom starszym (w wieku 6 lat i starszych) w porównaniu z Fluarix podawaną osobom dorosłym (w wieku lat) pod względem częstości specyficznych względem grypy limfocytów T CD4 wytwarzających co najmniej dwie róŝne cytokiny (CD40L, IL-2, TNF-α, IFN-γ).

83 Wtórne cele [0281] Wtórnymi celami są: 1) Ocena bezpieczeństwa i reaktogenności szczepienia kandydatami na adiuwantowane szczepionki przeciw grypie podczas 21 dni po domięśniowym podaniu szczepionki u osób starszych (w wieku 6 lat i starszych). Fluarix zastosowano jako odniesienie. 2) Ocena humoralnej odpowiedzi immunologicznej (miano przeciw hemaglutyninie) 21, 90 i 180 dni po szczepieniu kandydatami na adiuwantowane szczepionki przeciw grypie. Fluarix zastosowano jako odniesienie. Trzeciorzędowy cel [0282] Trzeciorzędowym celem jest ocena komórkowej odpowiedzi immunologicznej (wytwarzanie IFN-γ, IL-2, CD40L i TNF-α oraz odpowiedzi komórek B pamięci) 21, 90 i 180 dni po szczepieniu adiuwantowanymi szczepionkami przeciw grypie. Fluarix zastosowano jako odniesienie. VI.2. Skład szczepionki i podawanie [0283] Zastosowano dwa róŝne adiuwanty: 1. AS01B oparty na liposomach adiuwant zawierający 0 µg MPL i QS21 2. AS01E dwukrotnie rozcieńczony preparat AS01B Kontrola: pełna dawka Fluarix podawana IM. [0284] Wszystkie szczepionki są przeznaczone do podawania domięśniowego. Szczepy zastosowane w pięciu szczepionkach są tymi, które były rekomendowane przez WHO dla półkuli północnej w sezonie 0-06, tj. A/New Caledonia//99 (H1N1), A/New York/7/04 (H3N2) i B/Jiangsu//03. [028] Trzy inaktywowane antygeny rozszczepionego wirionu (jednowaŝne preparaty) zastosowane do formułowania kandydata na adiuwantowaną szczepionkę przeciw grypie były dokładnie takie same jak składniki czynne zastosowane w handlowym preparacie szczepionki przeciw grypie z inaktywowanym rozszczepionym wirionem Fluarix /α- Rix - GSK Bio. Uzyskano je z wirusów hodowanych w jajach. Szczepy grypy były tymi, które rekomendowano dla sezonu 0/06, takie jak zastosowane w handlowym preparacie Fluarix /α-rix 0/06. [0286] Szczepy zastosowane w trzech szczepionkach były tymi, które rekomendowano przez WHO dla półkuli północnej w sezonie 0-06, tj. A/New Caledonia//99 (H 1 N 1 ) IVR-116 A/New York//04 (H3N2) NYMC X-17 B/Jiangsu//03 Podobnie jak Fluarix /α-rix adiuwantowana szczepionka zawiera 1 µg hemaglutyni-

84 83 1 ny (HA) kaŝdego ze szczepów wirusa grypy na dawkę. VI.2.1. Opis partii szczepionki adiuwantowanej AS01B [0287] Kandydat na szczepionkę przeciw grypie adiuwantowaną AS01B jest dwuskładnikową szczepionką zawierającą stęŝone trójwaŝne antygeny inaktywowanych rozszczepionych wirionów obecne w szklanej fiolce i szklaną fiolkę zawierającą adiuwant AS01B. W momencie wstrzykiwania zawartość fiolki zawierającej adiuwant pobiera się i wstrzykuje do fiolki zawierającej stęŝone trójwaŝne antygeny inaktywowanych rozszczepionych wirionów. Po wymieszaniu zawartość pobiera się do strzykawki i igłę zastępuje się igłą do zastrzyków domięśniowych. ZuŜytą igłę zastępuje się igłą do zastrzyków domięśniowych i objętość doprowadza się do 1 ml. Jedna dawka roztworzonego kandydata na szczepionkę przeciw grypie adiuwantowaną AS01B odpowiada 1 ml. [0288] Kandydat na szczepionkę przeciw grypie adiuwantowaną AS01B jest szczepionką wolną od środków konserwujących. VI.2.2. Kliniczna partia szczepionki adiuwantowanej AS01B [0289] Jedna dawka roztworzonej szczepionki przeciw grypie adiuwantowanej AS01B odpowiada 1 ml. Jej skład podano w Tabeli 8. Zawiera ona 1 µg HA kaŝdego szczepu wirusa grypy, jak w zarejestrowanej szczepionce Fluarix /α-rix. Tabela 8 - Kompozycja (składniki wirusa grypy i adiuwant) roztworzonego kandydata na szczepionkę przeciw grypie adiuwantowaną AS01B Składnik Ilość na dawkę Odnośnik analityczny SKŁADNIKI CZYNNE Inaktywowane rozszczepione wiriony - A/New Caledonia//99 (H1N1) IVR µg HA Ph. Eur A/New York//04 (H3N2) NYMC X-17 1 µg HA Ph. Eur B/Jiangsu//03 1 µg HA Ph. Eur. 18 ADIUWANT AS01B - Liposomy dioleilofosfatydylocholina (DOPC) 00 µg GSK Bio 3217 cholesterol µg Ph. Eur MPL 0 µg GSK Bio QS21 0 µg GSK Bio 34 VI.2.3. Sposób wytwarzania partii szczepionki adiuwantowanej AS01B [0290] Wytwarzanie szczepionki przeciw grypie adiuwantowanej AS01B obejmuje trzy główne etapy:

85 Formułowanie końcowego trójwaŝnego preparatu (2 x stęŝonego) bez adiuwanta i wypełnianie nim pojemnika na antygen Wytwarzanie adiuwanta AS01B Roztwarzanie szczepionki przeciwwirusowej typu split adiuwantowanej AS01B bezpośrednio przed uŝyciem. Formułowanie końcowego trójwaŝnego preparatu bez adiuwanta i wypełnianie nim pojemnika na antygen [0291] Objętości trzech jednowaŝnych preparatów są oparte na zawartości HA zmierzonej dla kaŝdego jednowaŝnego preparatu przed formułowaniem oraz objętości docelowej 13 ml. StęŜoną sól fizjologiczną buforowaną fosforanami PO 4 Na/K 2 (80 µl/dawkę) i przedmieszkę Tween 80, Triton X-0 i wodorobursztynianu α-tokoferolu rozcieńcza się w wodzie do wstrzykiwań. Następnie trzy stęŝone poszczególne preparaty (A/New Caledonia//99 IVR-116, A/New York//04 NYMC X-17, B/Jiangsu//03) kolejno rozcieńcza się w powstałym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami/tween 80 - Triton X-0 - wodorobursztynian α-tokoferolu (ph 7,8, 81 mm NaCl, 1,6 mm KCl, 4,79 mm Na 2 HPO 4, 0,87 mm KH 2 PO 4, 7,2 mm NaH 2 PO 4, 72,8 mm K 2 HPO 4, 70 µg/ml Tween 80, 1 µg/ml Triton X-0 i 0 µg/ml wodorobursztynianu α-tokoferolu) w celu uzyskania końcowego stęŝenia µg HA szczepów A (H1N1 i H3N2) na ml końcowego trójwaŝnego preparatu (1 µg HA/szczep A/00 µl końcowego trójwaŝnego preparatu) i 3 µg HA szczepu B (17, µg HA/szczep B/00 µl końcowego trójwaŝnego preparatu). Pomiędzy dodaniem kaŝdego z jednowaŝnych preparatów mieszaninę miesza się przez - minut w temperaturze pokojowej. Po dodaniu ostatniego jednowaŝnego preparatu i mieszaniu przez 1- minut sprawdza się ph i doprowadza je do 7,6 ± 0,2 z uŝyciem HCl lub NaOH. [0292] Końcowym trójwaŝnym preparatem antygenów wypełnia się w sposób aseptyczny 3 ml jałowe szklane fiolki Typu I (Ph. Eur.). KaŜda fiolka zawiera objętość 600 µl (00 µl + 0 µl przepełnienia). Wytwarzanie preparatu adiuwanta AS01B i wypełnianie nim pojemnika na adiuwant [0293] Adiuwant AS01B jest wytwarzany przez zmieszanie dwóch składników: QS21 i liposomów zawierających MPL. Wytwarzanie kaŝdego z tych składników jest podsumowane poniŝej. QS21 jest triterpenowym glikozydem uzyskanym z kory drzewa Quillaja saponaria i jest wytwarzany przez Aquila Worchester, MA, USA (obecnie Antigenics). QS21 dostarcza się do GSK Biologicals jako liofilizowany proszek. Przygotowanie QS21 w GSK Bio obejmuje przeprowadzenie proszku QS21 w zawiesinę w wodzie do wstrzykiwań w stęŝeniu około mg/ml, doprowadzenie ph do ph 6,0 ± 0,2 i wyjałowienie drogą

86 filtracji. Ciekły preparat QS21 przechowuje się w - C w polietylenowych pojemnikach. MPL stanowi 3-O-deacylo-4 -monofosforylo-lipid A uzyskany przez kolejną hydrolizę w warunakch kwasowych i zasadowych lipopolisacharydu ze szczepu Re9 Salmonella minnesota. Jest on wytwarzany przez GSK Biologicals, Hamilton, Montana. MPL w celu wytworzenia preparatu dostarcza się w postaci liofilizowanej soli trietyloaminy (TEA). W sposobie wytwarzania liposomów zawierających MPL, DOPC (dioleilofosfatydylocholinę), cholesterol i MPL rozpuszcza się w etanolu. Błonę lipidową wytwarza się przez odparowanie rozpuszczalnika pod próŝnią. Dodaje się sól fizjologiczną buforowaną fosforanami złoŝoną z 9 mm Na 2 HPO 4, 41 mm KH 2 PO 4, 0 mm NaCl o ph 6,1 i mieszaninę poddaje się wstępnej homogenizacji po czym przeprowadza się homogenizację pod wysokim ciśnieniem 00 funtów/cal 2 (+/- cykli). Prowadzi to do wytworzenia liposomów, które jałowi się drogą filtracji przez membranę 0,22 µm w obszarze aseptycznym (klasa 0). Następnie jałowy produkt umieszcza się w jałowych szklanych pojemnikach i przechowuje w chłodni (+2 do +8 C). Jałowy preparat liposomów miesza się z jałowym roztworem QS21 do sporządzania preparatu. Po min mieszania, mieszaninę dodaje się do mieszaniny wody do wstrzykiwań i 00 mm fosforan, 1M NaCl ph 6,1 przy -krotnym rozcieńczeniu. Ilość 00 mm fosforanu, 1M NaCl ph 6,1 przy -krotnym rozcieńczaniu oblicza się tak aby uzyskać izotoniczność w końcowej objętości. Sprawdza się ph. Następnie adiuwant jałowi się drogą filtracji (0,22 µm) i umieszcza w sposób aseptyczny w fiolkach. Fiolki przechowuje się w +2 do +8 C. [0294] Rozcieńczalnikiem AS01B jest opalizująca bezbarwna ciecz, wolna od obcych cząstek, zawarta w jałowej fiolce typu 1. Docelowe wypełnienie dla kaŝdej fiolki wynosi 0,7 ml aby spełnić specyfikację ( 0, ml). Roztworzenie szczepionki przeciwwirusowej typu split adiuwantowanej AS01B bezpośrednio przed uŝyciem [029] W momencie wstrzykiwania zawartość fiolki zawierającej adiuwant pobiera się i wstrzykuje do fiolki zawierającej stęŝone trójwaŝne antygeny inaktywowanych rozszczepionych wirionów. Po wymieszaniu zawartość pobiera się do strzykawki i igłę zastępuje się igłą do zastrzyków domięśniowych, a objętość doprowadza się do 1 ml. Jedna dawka roztworzonego kandydata na szczepionkę przeciw grypie adiuwantowaną AS01B odpowiada 1 ml. VI.2.4. Opis partii szczepionki adiuwantowanej AS01E [0296] Kandydat na szczepionkę przeciw grypie adiuwantowaną AS01E jest trójskładnikową szczepionką zawierającą stęŝone trójwaŝne antygeny inaktywowanych rozszczepio-

87 86 1 nych wirionów obecne w szklanej fiolce, szklaną fiolkę zawierającą adiuwant AS01B oraz szklaną fiolkę zawierającą rozcieńczalnik (roztwór chlorku sodu do wstrzykiwań) do dwukrotnego rozcieńczenia AS01B. Aby przygotować adiuwant AS01E zawartość fiolki zwierającej rozcieńczalnik pobiera się przy uŝyciu strzykawki i wstrzykuje do fiolki zwierającej adiuwant AS01B, a następnie miesza się. W momencie wstrzykiwania 600 µl adiuwanta AS01E pobiera się strzykawką z fiolki AS01E i wstrzykuje do fiolki zawierającej stęŝone trójwaŝne antygeny inaktywowanych rozszczepionych wirionów. Po wymieszaniu zawartość pobiera się do strzykawki i igłę zastępuje się igłą do zastrzyków domięśniowych. Jedna dawka roztworzonego kandydata na szczepionkę przeciw grypie adiuwantowaną AS01B odpowiada 1 ml. Kandydat na szczepionkę przeciw grypie adiuwantowaną AS01E jest szczepionką wolną od środków konserwujących. VI.2.. Skład klinicznej partii adiuwantowanej AS01E [0297] Jedna dawka roztworzonej szczepionki przeciw grypie adiuwantowanej AS01E odpowiada 1 ml. Jej skład podano w Tabeli 9. Zawiera ona 1 µg HA kaŝdego szczepu wirusa grypy, jak w zarejestrowanej szczepionce Fluarix /α-rix. Tabela 9 - Kompozycja (składniki wirusa grypy i adiuwant) roztworzonego kandydata na szczepionkę przeciw grypie adiuwantowaną AS01E Składnik Ilość na dawkę Odnośnik analityczny SKŁADNIKI CZYNNE Inaktywowane rozszczepione wiriony - A/New Caledonia//99 (H1N1) IVR µg HA Ph. Eur A/New York//04 (H3N2) NYMC X-17 1 µg HA Ph. Eur B/Jiangsu//03 1 µg HA Ph. Eur. 18 ADIUWANT AS01B - Liposomy dioleilofosfatydylocholina (DOPC) 00 µg GSK Bio 3217 cholesterol 12 µg Ph. Eur MPL 2 µg GSK Bio QS21 2 µg GSK Bio 34 VI.2.6. Sposób wytwarzania partii szczepionki adiuwantowanej AS01E [0298] Wytwarzanie szczepionki przeciw grypie adiuwantowanej AS01B obejmuje trzy główne etapy: formułowanie końcowego trójwaŝnego preparatu (2 x stęŝonego) bez adiuwanta i wy-

88 pełnianie nim pojemnika na antygen wytwarzanie adiuwanta AS01B wytwarzanie adiuwanta AS01E, a następnie roztwarzanie szczepionki przeciwwirusowej typu split adiwuantowanej AS01E bezpośrednio przed uŝyciem. Formułowanie końcowego trójwaŝnego preparatu bez adiuwanta i wypełnianie nim pojemnika na antygen [0299] Wprowadza się odniesienie do części V.2.3 dla szczepionki przeciw grypie adiuwantowanej AS01B. Wytwarzanie preparatu adiuwanta AS01B i wypełnianie nim pojemnika na adiuwant [00] Wprowadza się odniesienie do części V.2.3 dla szczepionki przeciw grypie adiuwantowanej AS01B. Roztworzenie szczepionki przeciwwirusowej typu split adiuwantowanej AS01E bezpośrednio przed uŝyciem [01] Aby przygotować adiuwant AS01E zawartość fiolki zawierającej rozcieńczalnik pobiera się przy uŝyciu strzykawki i wstrzykuje do fiolki zawierającej adiuwant AS01B, a następnie miesza się. W momencie wstrzykiwania 600 µl adiuwanta AS01E pobiera się strzykawką z fiolki AS01E i wstrzykuje do fiolki zawierającej stęŝone trójwaŝne antygeny inaktywowanych rozszczepionych wirionów. Po wymieszaniu zawartość pobiera się do strzykawki i igłę zastępuje się igłą do zastrzyków domięśniowych. Jedna dawka roztworzonego kandydata na szczepionkę przeciw grypie adiuwantowaną AS01E odpowiada 1 ml. [02] Cztery zgodne ze schematem wizyty na osobnika: w dniach 0, 21, 90 i 180 z pobraniem próbki krwi na kaŝdej wizycie do oceny immunogenności. Schemat szczepienia: jedno wstrzyknięcie szczepionki przeciw grypie w dniu 0 VI.2.7 Testy immunologiczne Test hamowania hemaglutynacji [03] Odpowiedź immunologiczną oceniono przez pomiar przeciwciał hamujących hemaglutynację (HI) z zastosowaniem metody opisanej przez WHO Collaborating Centre for Influenza, Centres for Disease Control, Atlanta, USA (1991). Pomiary mian przeciwciał przeprowadzono na rozmroŝonych, wcześniej zamroŝonych próbkach surowicy z zastosowaniem standaryzowanej i całkowicie zatwierdzonej mikrometody z uŝyciem 4 jednostek hamowania hemaglutynacji (4 HIU) odpowiednich antygenów i 0,% zawiesiny erytrocytów drobiu. Niespecyficzne inhibitory surowicze usunięto przez obróbkę termiczną i enzym niszczący receptory. Uzyskane surowice oceniono pod względem poziomu przeciwciał HI. Rozpoczynając od

89 początkowego rozcieńczenia 1: przygotowano seryjne rozcieńczenia (dwukrotne) do końcowego rozcieńczenia 1:480. Za punkt końcowy mianowania uznano etap z najwyŝszym rozcieńczeniem, w którym zaobserwowano całkowite hamowanie (0%) hemaglutynacji. Wszystkie testy przeprowadzono w dwóch powtórzeniach. Cytometria przepływowa ze znakowaniem cytokin (CFC) zastosowana do określenia częstości limfocytów T CD4 lub CD8 pozytywnych względem cytokin(-y). [04] Komórki T CD4 i CD8 krwi obwodowej specyficzne względem antygenu moŝna ponownie stymulować in vitro do wytwarzania CD40L, IL-2, TNF-alfa i IFN-γ, gdy są one inkubowane z odpowiednim antygenem. W konsekwencji komórki T CD4 i CD8 specyficzne względem antygenu moŝna policzyć metodą cytometrii przepływowej po standardowym wyznakowaniu immunofluorescencyjnym względem fenotypu komórki, a takŝe wytwarzania wewnątrzkomórkowych cytokin. W niniejszym badaniu szczepionkowe antygeny grypy będą zastosowane jako antygeny do ponownej stymulacji komórek T specyficznych względem grypy. Wyniki będą wyraŝone jako częstość komórek T CD4 lub CD8 pozytywnych względem cytokin(-y) w subpopulacji komórek T CD4 lub CD8. Test ELISPOT zastosowany do oceny częstości komórek B pamięci [0] Technologia Elispot dla komórek B pozwala na oznaczenie ilościowe komórek B pamięci specyficznych względem danego antygenu. Komórki B pamięci moŝna wzbudzać do róŝnicowania w komórki plazmatyczne in vitro po hodowli z CpG przez dni. Zatem wytworzone in vitro komórki plazmatyczne specyficzne względem antygenu moŝna policzyć z zastosowaniem testu Elispot dla komórek B. W skrócie, wytworzone in vitro komórki plazmatyczne inkubuje się na płytkach hodowlanych powleczonych antygenem. Komórki plazmatyczne specyficzne względem antygenu będą tworzyć plamki przeciwciało/antygen, które moŝna wykryć z zastosowaniem standardowej procedury immunoenzymatycznej. W niniejszym badaniu szczepy szczepionkowe wirusa grypy lub przeciwciało przeciw ludzkiej immunoglobulinie stosuje się do powleczenia płytek w celu oznaczenia ilościowego komórek plazmatycznych wydzielających odpowiednio przeciwciała przeciw grypie lub IgG. Wyniki wyraŝa się jako częstość komórek plazmatycznych specyficznych względem antygenu na milion komórek plazmatycznych wytwarzających IgG. Rozpoznawcza charakteryzacja PBMC [06] MoŜna zbadać ekspresję wybranych markerów powierzchniowych/aktywacji (tj. CD4, CD8, CD4RO, CD4RA, CD28, CD27 lub niektórych KIR). Funkcję indukowanych przez szczepionkę limfocytów T moŝna zbadać przez analizę markerów kierujących (ang. homing markers; tj. CCR7, CXCR), cytokin (cytokin T pomocniczych 1 lub T pomocniczych 2) lub przez analizę ekspresji czynników związanych z funkcjami regulatoro-

90 wymi, takimi jak Foxp3, CTLA-4 lub TGFβ. W szczególności moŝna analizować populację CD8+CD28- lub inne populacje komórek T regulatorowych w związku z odpowiedziami humoralnymi oraz komórek B i T na antygen szczepionkowy. VI.3. Wyniki immunogenności VI.3.1. Punkty końcowe CMI i wyniki [07] W celu scharakteryzowania odpowiedzi CMI po szczepieniu adiuwantowanymi szczepionkami przeciw grypie, limfocyty T CD4 i CD8 ponownie stymulowano in vitro z uŝyciem antygenów z trzech szczepów szczepionkowych (stosowanych samodzielnie lub połączonych). Limfocyty T CD4/CD8 specyficzne względem grypy policzono metodą cytometrii przepływowej po standardowym wyznakowaniu immunofluorescencyjnym wytwarzanych wewnątrzkomórkowych cytokin (IL-2, IFN-γ, TNF-α i CD40L). Ocena podstawowego punktu końcowego. [08] W dniu 21: odpowiedź CMI u wszystkich osobników pod względem częstości limfocytów T CD4 specyficznych względem grypy na 6 w testach, wytwarzających co najmniej dwie róŝne cytokiny (IL-2, IFN-γ, TNF-α i CD40L). Do oceny odpowiedzi CMI częstość CD4 specyficznych względem grypy analizowano w następujący sposób: Przy zastosowaniu podejścia równowaŝności, równowaŝność co najmniej jednego kandydata na adiuwantowaną szczepionkę przeciw grypie (podanego osobom starszym 6 lat która to grupa jest nazywana Flu osoby starsze lub Flu ELD) w porównaniu z Fluarix (podanej osobom dorosłym w wieku lat - która to grupa jest nazywana Flu osoby młode lub Flu YNG) uzyskano gdy górna granica dwustronnego 98,7% przedziału ufności stosunku średnich geometrycznych (GM) (między grupą Fluarix (18-40 lat) a kandydatem na adiuwantowaną szczepionkę przeciw grypie (grupa 6 lat) pod względem częstości komórek T CD4 specyficznych względem grypy wytwarzających co najmniej dwie cytokinyw dniu 21) wyniosła poniŝej 2,0 GM Fluatrix, dorośli UL 98,7%CI GM adiuwantowana przeciw grypie < 2 [09] 98,7% CI dla stosunków GM, 21 dni po szczepieniu, obliczono z zastosowaniem modelu analizy kowariancji (ANCOVA) na częstościach przekształconych logarytmem dziesiętnym. Model ANCOVA obejmował grupę szczepionkową jako efekt stały (Fluarix (18-40 lat) względem kandydata na adiuwantowaną szczepionkę przeciw grypie ( 6 lat)) oraz częstość przed szczepieniem jako regresor. Stosunki GM oraz ich 98,7% CI wyprowadzono jako wykładnicze przekształcenie odpowiedniego kontrastu grupy w mode-

91 90 lu. 98,7% CI dla skorygowanej GM uzyskano przez wykładnicze przekształcenie 98,7% CI średniej najmniejszych kwadratów dla grupy dla powyŝszego modelu ANCOVA. Wyniki Analiza równowaŝności (Tabela ) [03] Skorygowane GM i stosunki GM (z ich 98,7% CI) częstości limfocytów T CD4 specyficznych względem grypy wytwarzających co najmniej dwie cytokiny (IL-2, IFN-γ, TNF-α i CD40L) w dniu 21 po ponownej stymulacji in vitro połączonymi antygenami II przedstawiono w Tabeli. Dla kaŝdej adiuwantowanej szczepionki przeciw grypie górna granica dwustronnych 98,7% CI stosunków GM jest duŝo niŝsza niŝ granica kliniczna 2,0. Wskazuje to równowaŝność obydwu adiuwantowanych szczepionek przeciw grypie podawanych osobom starszym w porównaniu ze szczepionką Fluarix podawaną osobom dorosłym w wieku między 18 i 40 lat pod względem częstości CD4 specyficznych względem grypy po szczepieniu. 1 Tabela. Skorygowany stosunek GM częstości komórek T CD4 specyficznych względem grypy wytwarzających co najmniej dwie cytokiny po ponownej stymulacji połączonymi antygenami szczepionkowymi, Dzień 21 (kohorta zgodna z protokołem pod względem immunogenności) Stosunek GM (Flu YNG/AS01B) Flu YNG AS01B 98,8% CI N GM N GM Wartość LL UL , ,6 1,04 0,79 1,38 Stosunek GM (Flu YNG/AS01E) Flu YNG AS01E 98,8% CI N GM N GM Wartość LL UL , ,0 1,07 0,79 1,44 Skorygowana GM = średnia geometryczna przeciwciała skorygowana względem linii podstawowej miana; N = Liczba osobników z dostępnymi wynikami zarówno przed, jak i po szczepieniu; 98,8% CI = 98,8% przedział ufności dla skorygowanego stosunku GM (model ANCOVA: skorygowany względem linii podstawowej); LL = dolna granica, UL = górna granica; Źródło danych = Tabela IIIA w załączniku Wyniki Analiza opisowa (Figura 6) [0311] Główne stwierdzenia: 1) Przed szczepieniem odpowiedź CMI jest wyŝsza u młodych osób dorosłych niŝ u osób starszych 2) Po szczepieniu:

92 występuje działanie wzmacniające szczepionki przeciw grypie na odpowiedź CMI u młodych osób dorosłych (18-40 lat) - odpowiedź CMI u osób starszych, które otrzymały adiuwantowaną szczepionkę przeciw grypie jest porównywalna z odpowiedzią CMI u młodych osób dorosłych. RóŜnica odpowiedzi limfocytów T CD4 przed i po szczepieniu pod względem wszystkich zbadanych cytokin (IL-2, CD40L, TNF-α i IFN-γ) była istotnie wyŝsza dla szczepionek adiuwantowanych w porównaniu z Fluarix dla wszystkich testów. Analiza celu trzeciorzędowego [0312] W celu oceny trzeciorzędowego punktu końcowego częstość specyficznych względem grypy limfocytów T CD4/CD8 i komórek B pamięci zmierzono w dniach 0, 21, 90 i 180. Częstość specyficznych względem grypy limfocytów T CD4/CD8 pozytywnych względem cytokin podsumowano (statystyka opisowa) dla kaŝdej szczepionej grupy w dniach 0 i 21 dla kaŝdego antygenu. Test nieparametryczny (test Wilcoxona) zastosowano do porównania umiejscowienia róŝnicy między tymi dwoma grupami (adiuwantowana szczepionka przeciw grypie względem Fluarix ) i obliczono statystyczną wartość p dla kaŝdego antygenu w kaŝdym z róŝnych testów. Statystykę opisową poszczególnych róŝnic między odpowiedziami w dniu 21/dniu 0 (Po/Przed szczepieniem) obliczono dla kaŝdej szczepionej grupy dla kaŝdego antygenu w kaŝdym z róŝnych testów. Test nieparametryczny (test Wilcoxona) zastosowano do porównania poszczególnych róŝnic (Po/Przed szczepieniem) i obliczono statystyczną wartość p dla kaŝdego antygenu w kaŝdym z róŝnych testów. Wartości p z testu Wilcoxona zastosowano do porównania róŝnicy w częstości limfocytów T CD4 specyficznych względem grypy przedstawiono w Tabeli 11. Wyniki Ocena trzeciorzędowego punktu końcowego (Tabela 11) [0313] Główne wnioski: Przed szczepieniem GM częstości komórek T CD4 specyficznych względem grypy były podobne we wszystkich grupach osób starszych, ale wyŝsze u osób dorosłych w wieku między 18 i 40 lat. U osób starszych po szczepieniu (dzień 21) częstość limfocytów T CD4 specyficznych względem grypy była istotnie wyŝsza po szczepieniu szczepionkami adiuwantowanymi niŝ Fluarix. Po szczepieniu częstość limfocytów T CD4 specyficznych względem grypy pozostała

93 92 niŝsza u osób starszych szczepionych adiuwantowanymi szczepionkami AS01B lub AS01E niŝ u osób dorosłych w wieku między 18 i 40 lat szczepionych Fluarix. Przed szczepieniem i po szczepieniu GM częstości komórek T CD8 specyficznych względem grypy były zasadniczo podobne we wszystkich grupach. Tabela 11. Statystyka równowaŝności: wartości p z testów Kruskala-Wallisa dla ko- mórek T CD4 w kaŝdym punkcie czasowym (kohorta zgodna z protokołem pod względem immunogenności) Opis testu Wartość p AS01B względem Flu YNG AS01E względem Flu YNG dzień 0 dzień 21 dzień 0 dzień 21 WSZYSTKIE PARY <0,0001 0,0070 <0,0001 0,002 CD40L <0,0001 0,006 <0,0001 0,001 IFNγ <0,0001 0,0009 <0,0001 0,0006 IL2 <0,0001 0,0029 <0,0001 0,0021 TFNα <0,0001 0,029 <0,0001 0,0378 AS01B względem Flu ELD AS01E względem Flu ELD dzień 0 dzień 21 dzień 0 dzień 21 WSZYSTKIE PARY 0,616 0,0004 0,8744 0,0018 CD40L 0,760 0,000 0,904 0,0021 IFNγ 0,9936 0,0008 0,983 0,0029 IL2 0,6702 0,0011 0,78 0,0023 TFNα 0,40 0,0022 0,6688 0, Wyniki Ocena punktów końcowych dla humoralnej odpowiedzi immunologicznej Obserwowane zmienne: [0314] W dniach 0, 21, 90 i 180: surowicze miana przeciwciał hamujących hemaglutynację (HI) zbadano osobno dla kaŝdego z trzech szczepów wirusa grypy obecnych w szczepionce (przeciwciała anty-h1n1, anty-h3n2 i anty-b). [031] Wartość odcięcia dla przeciwciała HI przeciw wszystkim antygenom szczepionkowym określono w laboratorium przed analizą (i wynosi ona 1:). Osobnik seronegatywny jest osobnikiem, którego miano przeciwciał jest poniŝej wartości odcięcia. Osobnik seropozytywny jest osobnikiem, którego miano przeciwciał jest wyŝsze niŝ lub równe wartości odcięcia. Miano przeciwciał poniŝej wartości odcięcia w teście podano jako wartość dowolną połowy wartości odcięcia. [0316] W oparciu o miana przeciwciał HI obliczono następujące parametry:

94 Średnie geometryczne mian (GMT) przeciwciała HI w dniach 0 i 21, obliczone przez zastosowanie antylogarytmu średniej logarytmicznych przekształceń miana. Współczynniki serokonwersji (SF) w dniu 21, zdefiniowane jako krotność wzrostu GMT HI w surowicy w dniu 21 w porównaniu z dniem 0. Wskaźniki serokonwersji (SC) w dniu 21, zdefiniowane jako procent szczepionych osób z mianem HI przed szczepieniem < 1: i mianem po szczepieniu 1:40 lub mianem przed szczepieniem 1: i minimalnie 4-krotnym wzrostem miana po szczepieniu. Wskaźniki seroprotekcji (SPR) w dniu 21 określono jako procent szczepionych osób z mianem HI w surowicy 1:40. 9% CI dla GM uzyskano dla kaŝdej grupy osobno. Najpierw uzyskano 9% CI dla średniej miana przekształconego logarytmicznie przyjmując, Ŝe miana przekształcone logarytmicznie mają rozkład normalny z nieznaną wariancją. Następnie 9% CI dla GM uzyskano przez wykładnicze przekształcenie 9% CI dla średniej miana przekształconego logarytmicznie [0317] Brakującego wyniku serologicznego dla konkretnego pomiaru przeciwciała nie zastępuje się. Zatem osoba bez serologicznego wyniku w danym punkcie czasowym nie przyczynia się do analizy testu dla tego punktu czasowego. Wyniki humoralnych odpowiedzi immunologicznych (Figura 7 i Tabela 12) [0318] GMT przeciwciał HI przed szczepieniem dla wszystkich trzech szczepów szczepionkowych były w tym samym zakresie w 4 grupach leczonych. Po szczepieniu stwierdzono wyraźny wpływ 2 adiuwantów, który to wzrost dotyczył odpowiedzi humoralnej u osób starszych, w porównaniu ze standardową szczepionką Fluarix w tej samej populacji (Figura 7, przedstawiono na skali liniowej, ale ten sam wpływ był oczywiście obserwowany gdy został przedstawiony na skali logarytmicznej). [0319] GMT są istotnie wyŝsze dla H1N1 w przypadku AS01E istotnie wyŝsze dla H3N2 w przypadku obydwu adiuwantów. Nie stwierdzono istotnej róŝnicy pod względem GMT po szczepieniu między tymi dwoma grupami osobników otrzymujących adiuwantowane szczepionki. [03] 21 dni po szczepieniu osoby otrzymujące Fluarix (18-40 lat) wykazywały wyŝszą odpowiedź HI względem szczepów New Caledonia i B/Jangsu. [0321] Jak przedstawiono w Tabeli 12 adiuwantowane szczepionki przeciw grypie przekroczyły wymagania organów europejskich dla dorocznej rejestracji szczepionek przeciw grypie z rozszczepionym wirionem [ Note for Guidance on Harmonization of Require-

95 94 ments for Influenza Vaccines for the immunological assessment of the annual strain changes (CPMP/BWP/214/96)] u osób w wieku powyŝej 60 lat. [0322] Po szczepieniu stwierdzono statystyczną róŝnicę pod względem wskaźników seroprotekcji pod kątem przeciwciał HI między grupą Fluarix ( 6 lat) a Flu/AS01B i Flu/AS01E dla szczepu A/H1N1/ New Caledonia Dla kaŝdego szczepu szczepionkowego wskaźniki seroprotekcji dla 2 grup adiuwantowanych szczepionek przeciw grypie są w tym samym zakresie w porównaniu z grupą Fluarix (18-40 lat). [0323] Dla kaŝdego szczepu szczepionkowego wskaźniki serokonwersji dla 2 grup adiuwantowanych szczepionek przeciw grypie są w tym samym zakresie w porównaniu z grupą Fluarix (18-40 lat) za wyjątkiem szczepu New Caledonia. Tabela 12. Wskaźniki seroprotekcji i wskaźniki serokonwersji oraz współczynniki konwersji w dniu 21 (kohorta zgodna z protokołem pod względem immunogenności) Szczepy Grupa N Wskaźnik seroprotekcji (miano HI 40) % Wskaźnik serokonwersji ( 4- krotny wzrost) [9% CI] % Standard EU (> 60 lat) > 60% > % > 2,0 Standard EU (< 60 lat) > 70% > 40% > 2, A/New Caledonia (H1N1) A/New York (H3N2) B/Jiangsu (B) Współczynnik konwersji [9% CI] % Flu Yng 7 0 [9,-0] 77,3 [66,2-86,2] 3,1 [21,9-6,4] Flu osoby starsze 49 71,4 [6,74-83,42],6 [18,3-4,4] 3,7 [2,4-,7] FluAS01B 7 97,3 [90,70-99,68] 48,0 [36,-9,8] 4, [3,3-6,1] FluAS01E 7 93,3 [8,12-97,80] 2,0 [40,2-63,7],0 [3,6-6,9] Flu Yng 7 93,3 [8,12-97,80] 76,0 [64,7-8,1] 9,2 [7,1-11,8] Flu osoby starsze 49 81,6 [67,98-91,24] 69,4 [4,6-81,7] 8,2 [,7-11,8] FluAS01B 7 96,0 [88,7-99,17] 8,3 [7,3-92,4] 13,1 [,0-17,1] FluAS01E 7 93,3 [8,12-97,80] 80,0 [69,2-88,4] 14, [,4-,2] Flu Yng 7 0 [9,-0] 81,3 [70,7-89,] 13,9 [,1-19,1] Flu osoby starsze 49 93,9 [83,13-98,72] 44,9 [,7-9,8] 4,3 [3,0-6,1] FluAS01B 7 0 [9,-0] 6,3 [3,-76,0],2 [4,2-6,] FluAS01E 7 97,3 [90,70-99,68] 70,7 [9,0-80,6] 6,7 [,1-8,9] N= całkowita liczba osobników; %= procent osobników z mianem w dniu 21 w wyszczególnionym zakresie; CI = przedział ufności

96 9 1 VI.3.2. Wnioski dotyczące immunogenności [0324] Częstość CD4 specyficznych względem grypy przed szczepieniem była istotnie niŝsza u starszych osób dorosłych w porównaniu z osobami dorosłymi w wieku między 18 i 40 lat. Po szczepieniu Fluarix częstość po szczepieniu (dzień 21) pozostała niŝsza u starszych osób dorosłych w porównaniu z młodszymi. Z drugiej strony wykazano równowaŝność pod względem częstości CD4 specyficznych względem grypy po szczepieniu adiuwantowanymi szczepionkami osób starszych w porównaniu ze szczepieniem Fluarix osób dorosłych w wieku między 18 i 40 lat. W odniesieniu do humoralnej odpowiedzi immunologicznej pod względem odpowiedzi przeciwciał HI wszystkie szczepionki przeciw grypie spełniły wymagania organów europejskich odnośnie dorocznej rejestracji inaktywowanych szczepionek przeciw grypie [ Note for Guidance on Harmonisation of Requirements for Influenza Vaccines for the immunological assessment of the annual strain changes (CPMP/BWP/214/96)]. U starszych osób dorosłych adiuwantowane szczepionki wywoływały co najmniej tendencję do wyŝszej humoralnej odpowiedzi immunologicznej na hemaglutyninę wirusa grypy niŝ Fluarix. Istotną róŝnicę między humoralną odpowiedzią immunologiczną przeciw kaŝdemu szczepowi szczepionkowemu wytworzoną u starszych osobników przez adiuwantowane szczepionki w porównaniu z Fluarix podsumowano w Tabeli 13. W porównaniu z osobami dorosłymi w wieku między 18 i 40 szczepionymi Fluarix, starsi osobnicy szczepieni adiuwantowanymi szczepionkami wykazywali tendencję do wyŝszych GMT po szczepieniu i wyŝszego współczynnika serokonwersji w dniu 21 przeciw szczepowi A/New York. 2 Tabela 13. Szczepy wirusa grypy, dla których zaobserwowano istotnie wyŝszą humoralną odpowiedź immunologiczną (w oparciu o nienachodzące na siebie 9% CI) u starszych osobników szczepionych róŝnymi adiuwantowanymi szczepionkami w porównaniu z Fluarix w tej samej populacji. GMT po szczepieniu Współczynnik serokonwersji Wskaźnik seroprotekcji FluAS01B A/New York A/New Caledonia FluAS01E A/New Caledonia A/New York A/New Caledonia GMT po szczepieniu = Średnia geometryczna miana po szczepieniu Wskaźnik serokonwersji VI.4 Wnioski dotyczące reaktogenności

97 96 VI.4.1. Notowanie zdarzeń niepoŝądanych (AE) [032] Zanotowano oczekiwane objawy (patrz Tabela 14) występujące podczas 7- dniowego okresu obserwacji (dzień szczepienia i 6 kolejnych dni). Zanotowano takŝe nieoczekiwane objawy występujące podczas 21-dniowego okresu obserwacji (dzień szczepienia oraz +3 kolejne dni). Nasilenie następujących AE oceniono w sposób opisany w Tabeli 1. Tabela 14. Oczekiwane miejscowe/ogólne zdarzenia niepoŝądane Oczekiwane miejscowe AE Ból w miejscu wstrzyknięcia Zaczerwienienie w miejscu wstrzyknięcia Obrzęk w miejscu wstrzyknięcia Krwiak Oczekiwane ogólne AE Zmęczenie Gorączka Bol głowy Ból mięśni Dreszcze Ból stawu w ręce, w której wykonano zastrzyk Ból stawu w innych miejscach Uwaga: Temperaturę mierzono wieczorem. Gdy dodatkowe pomiary temperatury wykonywano w innych punktach czasowych dnia notowano najwyŝszą temperaturę. Tabela 1. Skale nasilenia oczekiwanych objawów u osób dorosłych Zdarzenie niepoŝądane Stopnie nasilenia Parametr Ból w miejscu wstrzyknięcia 0 Brak Zaczerwienienie w miejscu wstrzyknięcia Obrzęk w miejscu wstrzyknięcia Krwiak w miejscu wstrzyknięcia Gorączka* 1 Przy dotknięciu 2 Przy poruszeniu kończyny Ból głowy 0 Brak 3 UniemoŜliwia normalną aktywność Zanotować największą średnicę powierzchni w mm Zanotować największą średnicę powierzchni w mm Zanotować największą średnicę powierzchni w mm Zanotować temperaturę w C/ F 1 Łatwy do tolerowania 2 Zakłóca normalną aktywność 3 UniemoŜliwia normalną aktywność

98 Zdarzenie niepoŝądane 97 Stopnie nasilenia Parametr Zmęczenie 0 Brak Ból stawu w ręce, w której wykonano zastrzyk oraz w innych miejscach 1 Łatwe do tolerowania 2 Zakłóca normalną aktywność 3 UniemoŜliwia normalną aktywność 0 Brak 1 Łatwy do tolerowania Ból mięśni 0 Brak 2 Zakłóca normalną aktywność 3 UniemoŜliwia normalną aktywność 1 Łatwy do tolerowania Dreszcze 0 Brak 2 Zakłóca normalną aktywność 3 UniemoŜliwia normalną aktywność 1 Łatwe do tolerowania 2 Zakłócają normalną aktywność 3 UniemoŜliwiaja normalną aktywność *Gorączkę określono jako temperaturę mierzoną pod pachą 37, C (99, F) 1 [0326] Maksymalne nasilenie miejscowego zaczerwienienia/obrzęku w miejscu wstrzyknięcia oceniono następująco: 0 oznacza 0 mm; 1 oznacza > 0 - mm; 2 oznacza > - 0 mm; 3 oznacza > 0 mm. Maksymalne nasilenie gorączki oceniono następująco: 1 oznacza > 37, - 38,0 C; 2 oznacza > 38,0-39,0 C; 3 oznacza > 39,0 [0327] Badacz przeprowadza ocenę nasilenia wszystkich innych AE, tj. nieoczekiwanych objawów, włącznie z SAE (cięŝkimi zdarzeniami niepoŝądanymi) zanotowanymi podczas badania. Ocena jest oparta na ocenie klinicznej przeprowadzonej przez badacza. Nasilenie kaŝdego z zanotowanych AE przypisano do jednej z poniŝszych kategorii: 1 (łagodne) = AE, które jest łatwo tolerowane przez pacjenta, wywołuje minimalny dyskomfort i nie zakłóca aktywności Ŝycia codziennego; 2 (średnie) = AE, które wywołuje wystarczający dyskomfort aby zkłócać normalne aktywności Ŝycia codziennego; 3 (powaŝne) = AE, które uniemoŝliwia normalne aktywności Ŝycia codziennego (U osób dorosłych/nastolatków takie AE będzie przykładowo uniemoŝliwiać pójście do

99 pracy/szkoły oraz będzie wymagać podawania terapii korygującej). VI.4.2. Notowanie zdarzeń niepoŝądanych (AE) [0328] U osób starszych reaktogenność obserwowana dla adiuwantowanych szczepionek pod względem zarówno objawów miejscowych, jak i ogólnych, była wyŝsza niŝ dla Fluarix. Nie tylko częstość występowania, ale takŝe nasilenie objawów było zwiększone po szczepieniu szczepionkami adiuwantowanymi (Figura 8). Zaobserwowano tendencję do częstszych objawów stopnia 3 w grupie, która otrzymywała szczepionkę adiuwantowaną o najwyŝszym stęŝeniu immunostymulantów (MPL, QS21) w porównaniu z grupą, która otrzymywała szczepionkę adiuwantowaną, w której immunostymulanty były w niŝszym stęŝeniu. JednakŜe we wszystkich przypadkach objawy szybko ustępowały. Przykład VII: Ocena przedkliniczna adiuwantowanych szczepionek przeciw HPV u myszy. [0329] W badaniu tym zastosowano dwuwaŝna kompozycję antygenową ludzkiego wirusa brodawczaka (HPV) przez połączenie cząstek wiruso-podobnych (VLP) wytworzonych z L1 z HPV 16 i L1 z HPV 18 jako antygenu. Celem tego badania było porównanie skuteczności tego preparatu antygenowego przy formułowaniu z AS01B oraz rozcieńczeniem 1/ AS01B w porównaniu z adiuwantem obecnie występującym w szczepionce GSK przeciw rakowi szyjki macicy, AS04 (MPL na ałunie). VII.1 - Szczepienie [03] Myszom (n = 12 na grupę) wstrzyknięto w dniach 0 i 28 preparat szczepionki zło- Ŝony z L1 HPV16/18 (2 µg lub 0, µg kaŝdego) uzyskanych w procesie Hi- 80/80L oraz formułowany z AS04 (0 µg MPL formułowany z ałunem) lub AS01B (0 µg QS21-0 µg MPL w 0, ml) 1/ i 1/0 dawki dla człowieka. PoniewaŜ badania te przeprowadzono na myszach 1/ dawki dla człowieka moŝna podać jako równowaŝnik preparatu AS01B dla ludzi, tj. 0 µg QS21 i 0 µg MPL w 0, ml oraz 1/0 moŝna przyjąć za rozcieńczenie 1/ preparatu AS01B dla ludzi, tj. µg QS21 i µg MPL w 0, ml. Próbki krwi pobrano w dniach 14 i 4 po II dawce w celu zbadania całkowitych przeciwciał anty-l1 specyficznych względem typu w poszczególnych surowicach. Wybarwianie wewnątrzkomórkowych cytokin przeprowadzono w dniach 7 i 14 po II dawce na PBMC oraz w dniu 4 po II dawce z zastosowaniem komórek śledziony. Częstość komórek B pamięci specyficznych względem VLP zmierzono w dniu 4 po II dawce z zastosowaniem komórek śledziony. VII.2 - ELISA Anty-L1 HPV 16/18 [0331] Ocenę ilościową przeciwciał anty-l1 HPV-16 i HPV-18 przeprowadzono z zastosowaniem ELISA z uŝyciem L1 HPV-16 i HPV-18 do powleczenia. Antygeny rozcieńczono w końcowym stęŝeniu 0, µg/ml w PBS i adsorbowano przez noc w 4 C w studzien-

100 kach 96-studzienkowych płytek do mikromianowania (Maxisorp Immuno-plate, Nunc, Dania). Następnie płytki inkubowano przez 1 h w 37 C z PBS zawierającą 1% albuminę surowicy bydlęcej (bufor wysycający). Surowice rozcieńczone w buforze zawierającym PBS + 0,1% Tween + 1% BSA dodano do płytek powleczonych L1 HPV i inkubowano przez 1 h min w 37 C. Następnie płytki przemyto czterokrotnie PBS 0,1% Tween i do kaŝdej studzienki dodano sprzęŝone z biotyną przeciwciało przeciw mysiej Ig (Dako, UK) rozcieńczone 1/00 w buforze wysycającym i inkubowano 1 h min w 37 C. Po etapie przemywania dodano streptawidynę sprzęŝoną z peroksydazą chrzanową (Dako, UK) rozcieńczoną 1/00 w buforze wysycającym na kolejnych min w 37 C. Płytki przemyto jak wskazano powyŝej i inkubowano przez min w temperaturze pokojowej z 0,04% roztworem o-fenylenodiaminy (Sigma), 0,03% H 2 O 2 w 0,1% Tween, 0,0M buforze cytrynianowym ph 4,. Reakcję zatrzymano 2N H 2 SO 4 i odczytano przy 492/6 nm. Miana ELISA obliczono z próbki odniesienia z zastosowaniem SoftMaxPro (stosując równanie z czterema parametrami) i wyraŝono w EU/ml. VII.3 Wybarwienie wewnątrzkomórkowych cytokin (ICS) [0332] Wewnątrzkomórkowe wybarwienie cytokin komórek T przeprowadzono na PBL w dniach 7 i 14 po II dawce oraz na komórkach śledziony w dniu 4 po drugiej immunizacji. Od myszy zebrano PBMC (1 pula/grupę) lub komórki śledziony (4 pule z 3 narządów na grupę). Stymulację komórek śledziony antygenem in vitro przeprowadzono w końcowym stęŝeniu 6 komórek/ml (96-studzienkowa mikropłytka) z VLP 16 lub 18 ( µg/ml) + przeciwciał CD49d CD28 (1 µg/ml), a następnie inkubowano 3 h w 37 C. Po etapie ponownej stymulacji antygenem komórki inkubowano przez noc w obecności Brefeldyny (1 µg/ml) w 37 C w celu zahamowania wydzielania cytokin. Wybarwianie komórek przeprowadzono w następujący sposób: zawiesiny komórek przemyto, ponownie przeprowadzono w zawiesinę w 0 µl PBS z 1% FCS zawierającego 2% odczynnik blokujący Fc (1/0; 2.4G2). Po inkubacji przez min w 4 C, dodano 0 µl mieszaniny anty-cd4-apc (1/0) i anty-cd8 percp (1/0) i inkubowano przez min w 4 C. Po przemyciu PBS z 1% FCS komórki permeabilizowano przez ponowne przeprowadzenie w zawiesinę w 0 µl Cytofix-Cytoperm (zestaw BD) i inkubowano min w 4 C. Następnie komórki przemyto Perm Wash (zestaw BD) i ponownie przeprowadzono w zawiesinę w 0 µl mieszaniny anty-ifn-γ APC (1/0) + anty-il-2 FITC (1/0) rozcieńczonych w Perm Wash. Po inkubacji przez 2 h w 4 C komórki przemyto Perm Wash i ponownie przeprowadzono w zawiesinę w PBS z 1% FCS + 1% paraformaldehydem. Analizę próbek przeprowadzono przy uŝyciu FACS. śywe komórki bramkowano (FSC/SSC) i zebieranie danych przepro-

101 0 1 2 wadzono na ~ 000 zdarzeń (limfocyty). Procent komórek IFN-γ + lub IL2+ obliczono dla populacji bramkowanych względem CD4+ i CD8+. VII.4 Pamięć komórek B [0333] 4 dni po drugiej immunizacji myszy uśmiercono i komórki śledziony oddzielono z przy uŝyciu gradientu Lymphoprep (Cedarlane). Następnie komórki B ponownie przeprowadzono w zawiesinę w poŝywce RPMI 1640 (Gibco) zawierającej dodatki (1 mm pirogronian sodu, endogenne aminokwasy MEM, Pen/Strep, Glutamina i β-2 merkaptoetanol), % płodową surowicę cielęcą, 0 U/ml rhil-2 (ebioscience) i 3 µg/ml CpG. Komórki hodowano pięć dni w końcowym stęŝeniu 6 komórek/ml w ml na studzienkę 6- studzienkowej płytki o płaskim dnie. Po etapie aktywacji etanolem płytki nitrocelulozowe (Multiscreen-IP; Millipore) powleczono µg/ml VLP lub kozimi przeciwciałami przeciw mysiej Ig (GAM; Sigma) rozcieńczonymi 1/0 w PBS. Po etapie wysycania pełną po- Ŝywką 0 µl 2. 6 komórek/ml dodano do płytek powleczonych VLP i 0 µl 6 i. komórek/ml dodano do płytek GAM. Po czasie inkubacji 2 h w 37 C, płytki przechowywano przez noc w 4 C. Płytki przemyto czterokrotnie PBS z 0,1% Tween i do płytek dodano przeciwciało przeciw mysiej Ig Biot rozcieńczone 1/0 w PBS z 1% BSA, % FCS (bufor rozcieńczający) i płytki inkubowano przez 2 h w 37 C. Po etapie przemywania dodano Extravidin HRP (Sigma) rozcieńczoną 1/0 w buforze rozcieńczającym na kolejną 1 h w 37 C. Płytki przemyto jak powyŝej i inkubowano przez min w temperaturze pokojowej z roztworem AEC (Sigma). Reakcję zatrzymano przez delikatne przepłukanie płytek wodą wodociągową. Gdy płytki wysuszono, odczytano je w KS400. VII. Analiza statystyczna [0334] Średnie dla preparatów porównano z zastosowaniem jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA 1). Analizę przeprowadzono na danych przekształconych logarytmem dziesiętnym w celu normalizacji. Gdy wykryto istotną róŝnicę między średnimi procesowymi (wartość p 0,0) przeprowadzono porównania średnich parami przy poziomie istotności 0,0 (test porównań wielokrotnych Studenta-Newmana-Keulsa). VII.6 - Wyniki [033] Mszy immunizowano jak w VII.1 powyŝej. Zastosowano następujące grupy: Grupa Antygen Adiuwant Rozcieńczenie adiuwanta 1 L1 HPV µg AS04 1/ dawki dla człowieka (HD) (równowaŝnik 0 µg MPL na 0, ml HD) 2 L1 HPV , µg AS04 1/0 dawki dla człowieka (równowaŝnik µg MPL na 0, ml HD)

102 Grupa Antygen 1 Adiuwant Rozcieńczenie adiuwanta 3 L1 HPV µg AS04 1/ dawki dla człowieka (równowaŝnik 0 µg MPL na 0, ml HD) 4 L1 HPV , µg AS04 1/0 dawki dla człowieka (równowaŝnik µg MPL na 0, ml HD) L1 HPV µg AS01B 1/ dawki dla człowieka (równowaŝnik 0 µg MPL na 0, ml HD) 6 L1 HPV , µg AS01B 1/0 dawki dla człowieka (równowaŝnik µg MPL na 0, ml HD) 7 L1 HPV µg AS01B 1/ dawki dla człowieka (równowaŝnik 0 µg MPL na 0, ml HD) 8 L1 HPV , µg AS01B 1/0 dawki dla człowieka (równowaŝnik µg MPL na 0, ml HD) 1 VII.6.1 Odpowiedzi humoralne [0336] Zaobserwowano brak istotnego zakresu dawek dla obydwu zbadanych dawek antygenów dla kaŝdego z rozcieńczeń adiuwanta pod kątem mian przeciwciał anty-l1 HPV 16 lub mian przeciwciał anty-l1 HPV 18 (Figura 9) [0337] Zaobserwowano brak istotnego zakresu dawek dla obydwu zbadanych dawek kaŝdego adiuwanta dla dowolnej dawki antygenu pod kątem mian przeciwciał anty-l1 HPV 16. [0338] Gdy obserwowano odpowiedzi przeciwciał anty-l1 HPV 18 zaobserwowano niewielki wzrost miana w przypadku AS01B (1/ HD) w porównaniu z AS01B (1/0 HD), co zmierzono w dniu 14 po II dawce (2,-krotny zakres dawki, wartość p = 0,003), jednakŝe zakres ten był obserwowany tylko w przypadku 2 µg antygenu, a nie w przypadku 0, µg antygenu (wartość p = 0,0867). W dniu 4 po II dawce nie stwierdzono istotnego zakresu dawek w przypadku obydwu zbadanych dawek kaŝdego adiuwanta bez względu na dawkę antygenu. VII.6.2 Odpowiedzi komórkowe Wybarwianie wewnątrzkomórkowych cytokin [0339] Nie zaobserwowano wpływu zakresu dawki antygenu dla dwóch zbadanych dawek antygenów bez względu na dawkę adiuwanta dla L1 HPV 18. Podobne częstości komórek T CD4+ specyficznych względem VLP16 uzyskano dla obydwu zbadanych dawek antygenów z róŝnymi dawkami adiuwantów. (Figura ). [0340] Niewielki wpływ dawki (2,6-krotny, wartość p = 0,0009 dla L1 HPV 18, 2-krotny, wartość p = 0,0187 dla L1 HPV 16) zaobserwowano dla AS01B (1/ HD) w porównaniu

103 z AS01B (1/0 HD), jednakŝe zakres ten obserwowano tylko w przypadku 2 µg antygenu, a nie w przypadku 0, µg antygenu. Specyficzne komórki B pamięci [0341] Nie zaobserwowano wpływu zakresu dawki antygenu dla obydwu zbadanych dawek antygenów bez względu na dawkę adiuwanta dla L1 HPV 16 lub 18 (Figura 11). [0342] Nie zaobserwowano wpływu zakresu dawki adiuwanta dla obydwu zbadanych dawek adiuwantów bez względu na dawkę antygenu dla L1 HPV 17 lub 18. [0343] Jak moŝna zaobserwować na podstawie powyŝszych wyników z uŝyciem rozcieńczenia 1/ AS01B wytwarza się preparat o wydajności w kompozycjach immunogennych równowaŝnej względem samego AS01B. Przykład VIII: Ocena przedkliniczna adiuwantowanych szczepionek przeciw S. pneumoniae u myszy [0344] Pneumokokową szczepionką zastosowaną w tym badaniu była 11-waŜna adiuwantowana konigatowa szczepionka przeciw pneumokokom (11PCV/AS) składająca się z mieszaniny 11 koniugatów polisacharydów pneumokoków adiuwantowana AS01B albo AS01E. Koniugaty zawierają oczyszczone polisacharydy S. pneumoniae serotypów 1, 3, 4,, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F i 23F, z których kaŝdy jest niezaleŝnie sprzęŝony z białkiem nośnikowym, anatoksyną błoniczą (DT), anatoksyną tęŝcową (TT) albo białkiem D z H. influenzae (PD). Szczepionki są obecne jako liofilizowany proszek do roztworzenia jednym z ciekłych adiuwantów. [034] 11 PCV/AS wytworzono w następujący sposób: Warunki aktywacji i sprzęgania są specyficzne dla kaŝdego polisacharydu. Podano je w tabeli poniŝej. Polisacharyd dostosowany pod względem wielkości (za wyjątkiem PS, 6B i 23F) rozpuszczano w 2M NaCl lub wodzie do wstrzykiwań (WFI). Optymalne stę- Ŝenie polisacharydu oszacowano dla wszystkich serotypów. Wszystkie serotypy, za wyjątkiem serotypu 18C sprzęgano bezpośrednio z białkiem nośnikowym, jak opisano szczegółowo poniŝej. [0346] Z roztworu podstawowego 0 mg/ml w acetonitrylu lub roztworze acetonitryl/woda 0%/0% dodano CDAP (stosunek CDAP/PS 0,7 mg/mg PS) do roztworu polisacharydu. 1, minuty później dodano 0,2 M-0,3M NaOH do uzyskania specyficznego ph aktywacji. Aktywację polisacharydu prowadzono w tym ph podczas 3 minut w 2 C. Do aktywowanego polisacharydu dodano oczyszczone białko (białko D lub DT) (którego ilość zaleŝy od wyjściowego stosunku PS/białko nośnikowe) i reakcję sprzęgania prowadzono w specyficznym ph przez czas do 2 godzin (zaleŝnie od serotypu) z regulacją ph. Następnie w celu dezaktywacji nieprzereagowanych grup estru cyjanianowego do mieszaniny dodano

104 M roztwór glicyny. ph doprowadzono do ph dezaktywacji (ph 9,0). Roztwór mieszano przez minut w 2 C, a następnie przez noc w 2-8 C z ciągłym powolnym mieszaniem. Przygotowanie 18C: [0347] 18C sprzęŝono z białkiem nośnikowym przez łącznik dihydrazyd kwasu adypinowego (ADH). Polisacharyd serotypu 18C poddano mikrofluidyzacji przed sprzęganiem. Derywatyzacja anatoksyny tęŝcowej z uŝyciem EDAC [0348] W celu przeprowadzenia derywatyzacji anatoksyny tęŝcowej oczyszczoną TT rozcieńczono do 2 mg/ml w 0,2M NaCl i dodano środek rozdzielający ADH w celu uzyskania końcowego stęŝenia 0,2 M. Gdy rozpuszczanie środka rozdzielającego zakończono ph doprowadzono do 6,2. Następnie dodano EDAC (1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimid) do końcowego stęŝenia 0,02M i mieszaninę mieszano przez 1 godzinę z regulacją ph. Reakcję kondensacji zatrzymano przez zwiększenie ph do 9,0 na co najmniej minut w 2 C. Następnie derywatyzowaną TT diafiltrowano (membrana o punkcie odcięcia kda) w celu usunięcia pozostającego ADH i odczynnika EDAC. Ostatecznie preparat TT AH wyjałowiono drogą filtracji do etapu sprzęgania i przechowywano w -70 C. Chemiczne sprzęganie TT AH z PS 18C [0349] Szczegóły parametrów sprzęgania moŝna znaleźć w Tabeli 1. 2 gramy mikrofluidyzowanego PS rozcieńczono w określonym stęŝeniu w wodzie i doprowadzono do 2M NaCl przez dodanie NaCl w proszku. Dodano roztwór CDAP (0 mg/ml świeŝo przygotowany w 0/0 obj./obj. acetonitrylu/wfi) do uzyskania odpowiedniego stosunku CDAP/PS. ph podniesiono do ph aktywacji 9,0 przez dodanie 0,3M NaOH i roztwór stabilizowano w tym ph do czasu dodania TT AH. Po 3 minutach dodano derywatyzowaną TT AH ( mg/ml w 0,2M NaCl) do uzyskania stosunku TT AH /PS wynoszącego 2; ph regulowano do ph sprzęgania 9,0. Roztwór pozostawiono na jedną godzinę z regulacją ph. W celu dezaktywacji do mieszaniny PS/TT AH /CDAP dodano 2M roztwór glicyny. ph doprowadzono do ph dezaktywacji (ph 9,0). Roztwór mieszano przez min w 2 C, a następnie pozostawiono na noc w 2-8 C z ciągłym powolnym mieszaniem. Oczyszczanie koniugatów: [0] Koniugaty oczyszczano drogą filtracji Ŝelowej z zastosowaniem kolumny do filtracji Ŝelowej Sephacryl 00HR zrównowaŝonej 0,1M NaCl (S00HR dla 18C) w celu usunięcia małych cząstek (włącznie z DMAP) i niesprzęŝonego PS i białka. Ze względu na

105 4 róŝne wielkości cząsteczek składników reakcji koniugaty PS-PD, PS-TT lub PS-DT zostały wymyte najpierw, po czym został wymyty wolny PS, a następnie wolne PD lub wolna DT oraz ostatecznie DMAP i inne sole (NaCl, glicyna). Frakcje zawierające koniugaty wykryto za pomocą UV 280 nm. Frakcje połączono według ich Kd, wyjałowiono drogą filtracji (0,22 µm) i przechowywano w +2-8 C. Określono stosun- ki PS/Białko w preparatach koniugatów. Specyficzne warunki aktywacji/sprzęgania/dezaktywacji dla koniugatów PS S. pneumoniae-białko D/TT/DT [031] Serotyp 1 (mikrofluidyzacja) StęŜenie PS (mg/ml) 6B 7F (mikrofluidyzacja) Rozpuszczanie PS StęŜenie PD (mg/ml) Początkowy stosunek PS/PD (wag./wag.) StęŜenie CDAP (mg/mg PS) ph akt. =ph sprz. =ph dezak. 3 (mikrofluidyzacja) 4 (mikrofluidyzacja) 2, 3,0 2, 7,1,0,0 WFI 2M NaCl WFI WFI 2M NaCl 2M NaCl,0,0,0,0,0,0 1,/1 1/1 1,/1 1/1 1,1/1 1,2/1 0,0 0,7 0,0 0,79 0,83 0,7 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,/9,/9,0 9,0/9,0/9,0 9,/9,/9,0 9,/9,/9, Serotyp 9V (mikrofluidyzacja) 14 (mikrofluidyzacja) 18C (mikrofluidyzacja) 19F (mikrofluidyzacja) StęŜenie PS (mg/ml),0,0 4, 9,0 2,38 Rozpuszczanie PS 2M NaCl 2M NaCl 2M NaCl 2M NaCl 2M NaCl StęŜenie białka nośnikowego (mg/ml) Początkowy stosunek białko nośnikowe/ps (wag./wag.) StęŜenie CDAP (mg/mg PS) 23F,0,0,0 (TT),0 (DT),0 1,2/1 1,2/1 2/1 1,/1 1/1 0,0 0,7 0,7 1, 0,79 ph akt. =ph sprz. =ph dezak. 9,/9,/9,0 9,/9,/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,/9,/9,0

106 1 2 [032] Następnie 11 koniugatów zmieszano ze sobą i końcowy preparat antygenowy zmieszano z odpowiednim adiuwantem przed immunizacją. Grupy 40 4-tygodniowych samic myszy Balb/c immunizowano IM w dniach 0, 14 i 28 z uŝyciem 0,1 µg 11-waŜnych koniugatów PS sformułowanych z AS01B albo AS01E. Przeciwciała IgG anty-ps oznaczono z zastosowaniem ELISA w surowicy zebranej w dniu 42. [033] Jak moŝna zaobserwować na Figurze 12 zaobserwowano porównywalne odpowiedzi między rozcieńczonym preparatem AS01E i preparatem AS01B, za wyjątkiem PS 14, dla którego wyŝszą odpowiedź zaobserwowano w przypadku AS01B, i PS 19F, dla którego wyŝszą odpowiedź zaobserwowano w przypadku AS01E. Przykład IX: Ocena przedkliniczna adiuwantowanych i nie adiuwantowanych kompozycji immunogennych wirusa cytomegalii. IX.1: Świnki morskie. IX.1.1 Przeciwciała anty-gb według ELISA [034] Oznaczenie ilościowe przeciwciał anty-gb przeprowadzono metodą ELISA stosując gb jako antygen powlekający. Antygen rozcieńczono do końcowego stęŝenia wynoszącego 4 µg/ml w PBS i 0 µl inkubowano przez noc w 4 C w 96-studzienkowych płytkach do mikromianowania. Następnie płytki wysycono przez 1 godzinę w 37 C z uŝyciem 0 µl PBS zawierającej 1% albuminę surowicy bydlęcej. Dodano dwukrotne seryjne rozcieńczenia surowicy (0 µl/studzienkę) i całość inkubowano przez 1 godzinę i minut w 37 C. Płytki przemyto 4-krotnie PBS 0,1% Tween i do kaŝdej studzienki dodano 0 µl przeciwciała przeciw IgG świnki morskiej sprzęŝonego z peroksydazą chrzanową (Dako, UK) i całość inkubowano przez 1 godzinę i minut w 37 C. Płytki przemyto 4-krotnie PBS 0,1% Tween i 1 raz wodą. Następnie inkubowano je przez min w 22 C ze 0 µl roztworu o-fenylenodiaminy (Sigma) w 0,1M buforze cytrynianowym ph 4,2. Reakcję tą zatrzymano z uŝyciem 0 µl 2N H 2 SO 4 i odczytano przy 490/6 nm. Miana według ELISA odczytano przez interpolację wartości OD wobec próbki odniesienia z zastosowaniem SoftMaxPro. Miana wyraŝono w EU/ml. [03] Analizy statystyczne przeprowadzono na danych uzyskanych z testów Elisa z dnia 14 po 2 dawce z zastosowaniem UNISTAT. Protokół zastosowany do analizy wariancji moŝna w skrócie opisać następująco: 1) Logarytmiczne przekształcenie danych 2) Test Shapiro-Wilka na kaŝdej populacji (grupie) w celu potwierdzenia normalności rozkładu 3) Test Cochrana w celu potwierdzenia jednorodności wariancji między róŝnymi popu-

107 6 1 2 lacjami (grupami) 4) Analiza wariancji na wybranych danych (jednoczynnikowa) ) Test porównań wielokrotnych Tukeya HSD IX.1.2 Test neutralizacji [036] Przed testem komórki MRC (000 komórek/0 µl poŝywki MEM) rozmieszczono w 96-studzienkowych mikropłytkach i inkubowano przez 3 dni w 37 C z CO 2. Wykonano dwukrotne rozcieńczenia inaktywowanych surowic ( min w 6 C) i inkubowano je z 0 µl roztworu wirusa (800/ml) przez 1 godzinę w 37 C. Po inkubacji do 96- studzienkowych mikropłytek zawierających pojedynczą warstwę komórek MRC dodano 0 µl mieszaniny surowica/wirus. Płytki odwirowano przy 00 obr./min przez 1 godzinę w 3 C. Po całonocnej inkubacji w 37 C płytki utrwalono 80% roztworem acetonu ( minut w - C). Roztwór acetonu usunięto i komórki pozytywne względem CMV wykrywano z zastosowaniem przeciwciała monoklonalnego specyficznego przeciw najwcześniejszemu antygenowi przez 1 godzinę w 37 C. Płytki przemyto 3-krotnie PBS i do kaŝdej studzienki dodano sprzęŝone z biotyną przeciwciało przeciw mysiej Ig i inkubowano przez 1 godzinę w 37 C. Po etapie przemycia dodano streptawidynę sprzęŝoną z peroksydazą chrzanową na dodatkowe minut w 37 C. Płytki przemyto 4-krotnie i inkubowano przez minut z roztworem True-blue. Specyficzne barwne sygnały oceniono przez zbadanie pod mikroskopem. Miana neutralizacji wyraŝono jako odwrotność najwyŝszego rozcieńczenia surowicy powodującego 0% obniŝenie liczby komórek pozytywnych względem CMV w porównaniu z kontrolą z wirusem (CMV plus komórki bez surowicy). IX.1.3 Protokoły immunizacji [037] Immunizowano 4 grupy. KaŜda grupa zawierała 8 samic świnek morskich Hartley Crl:(ha) w wieku - 8 tygodni, za wyjątkiem grupy kontrolnej (grupa 4), która zawierała tylko 4 osobniki. Osobniki immunizowano IM w dniach 0 i 28. Próbki surowicy zebrano 28 dni po pierwszej immunizacji i 14 dni po drugiej immunizacji. Testy ELISA przeprowadzono w sposób opisany powyŝej na surowicy pobranej w dniu 28 po I dawce i 14 po II dawce. Testy neutralizacji przeprowadzono w sposób opisany powyŝej na próbce z 14 dni po II dawce. Grupy były takie jak opisano poniŝej: Grupa Antygen Adiuwant 1 gb NaCl 2 gb AS01B 3 gb AS01E 4 NaCl NaCl

108 7 1 [038] Antygen przygotowano w następujący sposób: antygen szczepionkowy eksprymowano w komórkach jajnika chomika chińskiego (CHO) jako gb**, skróconą chimerę zawierającą sekwencje peptydowe z glikoproteiny gd wirusa opryszczki pospolitej 2 (HSV2) na swoim N i C-końcu. Białko gb** jest skrócone w swojej domenie C-końcowej, która zawiera sekwencję zakotwiczającą w błonie, a zatem jest wydzielane do supernatantu hodowli. Dla trzech pierwszych grup 1 µg gb** roztworzone w 00 µl PBS, AS01B albo AS01E (przygotowane według powyŝszego Przykładu II.2) wstrzyknięto domięśniowo. W grupie 4 sam PBS podano domięśniowo. IX Wyniki [039] Jak moŝna zaobserwować na Figurze 13 istotnie wyŝsze miana anty-gb według ELISA zaobserwowano dla dwóch grup z adiuwantem w porównaniu ze zwykłym gb (8- i,-krotnie wyŝsze dla odpowiednio gb i AS01B oraz gb/as01e). Miana przeciwciał po II dawce były w niewielkim stopniu nieznacznie wyŝsze (1,-krotnie) w grupie gb/as01b w porównaniu z grupą gb/as01e. Test porównań wielokrotnych: Tukeya - HSD Grupa Przypadki Średnia Zwykła AS01E AS01B Zwykła 8 4,7917 ** ** AS01E 8,293 ** AS01B 8,6942 ** Zwykła < AS01E = AS01B 2 [0360] Pod względem mian neutralizacji (Figura 14): Nie stwierdzono specyficznych przeciwciał neutralizujących w grupie ze zwykłym gb Specyficzne przeciwciała neutralizujące wykryto dla obydwu grup z adiuwantem. Podobne poziomy przeciwciał neutralizujących zaobserwowano dla obydwu grup z adiuwantem. IX.2 - Myszy IX ELISA anty-gb [0361] Oznaczenie ilościowe przeciwciał anty-gb przeprowadzono metodą ELISA stosując gb jako antygen powlekający. Antygen rozcieńczono do końcowego stęŝenia 1 µg/ml w PBS i 0 µl inkubowano przez noc w 4 C w 96-studzienkowych płytkach do mikromianowania. Następnie płytki wysycono przez 1 godzinę w 37 C z uŝyciem 0 µl PBS zawierającej 1% albuminę surowicy bydlęcej. Dodano dwukrotne seryjne rozcieńczenia

109 surowicy (0 µl/studzienkę) i inkubowano przez 1 godzinę minut w 37 C. Płytki przemyto 4-krotnie PBS 0,1% Tween i do kaŝdej studzienki dodano 0 µl streptawidyny sprzęŝonej z peroksydazą chrzanową na kolejnych minut w 37 C. Płytki przemyto 4-krotnie PBS 0,1% Tween i 1 raz wodą. Następnie inkubowano je przez min w 22 C ze 0 µl 7% roztworu tetrametylobenzydyny w 0,1M buforze cytrynianowym ph,8. Reakcję tą zatrzymano z uŝyciem 0 µl 0,4N H 2 SO 4 i odczytano przy 40/6 nm. Miana według ELISA odczytano przez interpolację wartości OD wobec próbki odniesienia z zastosowaniem SoftMaxPro. Miana wyraŝono w EU/ml. [0362] Analizy statystyczne przeprowadzono na danych uzyskanych z testów ELISA z dnia 14 po 2 dawce z zastosowaniem UNISTAT. Protokół zastosowany do analizy wariancji moŝna w skrócie opisać następująco: 1) Logarytmiczne przekształcenie danych 2) Test Shapiro-Wilka na kaŝdej populacji (grupie) w celu potwierdzenia normalności rozkładu 3) Test Cochrana w celu potwierdzenia jednorodności wariancji między róŝnymi populacjami (grupami) 4) Analiza wariancji na wybranych danych (jednoczynnikowa) ) Test porównań wielokrotnych Tukeya HSD IX.2.2 Test neutralizacji [0363] Przed testem komórki MRC (000 komórek/0 µl poŝywki MEM) rozmieszczono w 96-studzienkowych mikropłytkach i inkubowano przez 3 dni w 37 C z % CO 2. Wykonano dwukrotne rozcieńczenia (60 µl) inaktywowanych surowic ( min w 6 C) i inkubowano je z 60 µl roztworu wirusa (800 IPU/ml) przez 1 godzinę w 37 C. Po inkubacji do 96-studzienkowych mikropłytek zawierających komórki MRC dodano 0 µl mieszaniny surowica/wirus. Płytki odwirowano przy 00 obr./min przez 1 godzinę 3 C. Po całonocnej inkubacji w 37 C płytki utrwalono 80% roztworem acetonu ( minut w - C). Roztwór acetonu usunięto i komórki pozytywne względem CMV wykrywano z zastosowaniem specyficznego przeciwciała monoklonalnego przeciw najwcześniejszemu antygenowi I (IE-I) przez 1 godzinę w 37 C. Płytki przemyto 3-krotnie PBS i do kaŝdej studzienki dodano sprzęŝone z biotyną przeciwciało przeciw mysiej Ig i inkubowano przez 1 godzinę w 37 C. Po etapie przemycia dodano streptawidynę sprzęŝoną z peroksydazą chrzanową na dodatkowe minut w 37 C. Płytki przemyto 4-krotnie i inkubowano minut z roztworem True-blue. Specyficzne barwne sygnały oceniono przez zbadanie pod mikroskopem. Miana neutralizacji wyraŝono jako odwrotność najwyŝszego rozcieńczenia surowicy wywołującego 0% obniŝenie liczby komórek pozytywnych względem CMV w

110 9 1 porównaniu z kontrolą z wirusem (CMV plus komórki bez surowicy). IX Wybarwianie wewnątrzkomórkowych cytokin [0364] Wykrywanie wewnątrzkomórkowych cytokin komórek T przeprowadzono na PBL w dniach 7 i 14 po drugiej immunizacji. PBL zebrano od myszy i połączono (1 pula na grupę). Stymulację limfocytów antygenem in vitro (końcowe stęŝenie 7 komórek/ml) przeprowadzono z uŝyciem puli peptydów obejmujących sekwencję CMV lub białka gb. Mieszaninę PBL/antygen inkubowano 2 h w 37 C. Następnie komórki inkubowano przez noc w obecności brefeldyny (1 µg/ml) w 37 C w celu zahamowania wydzielania cytokin. Wybarwianie komórek przeprowadzono w następujący sposób: zawiesiny komórek przemyto, ponownie przeprowadzono w zawiesinę w 0 µl PBS z 1% FCS zawierającej 2% odczynnik blokujący Fc. Po min inkubacji w 4 C dodano 0 µl mieszaniny anty-cd4 PE i anty-cd8 percp i inkubowano przez min w 4 C. Po etapie przemycia PBS z 1% FCS błony komórkowe permeabilizowano przez ponowne przeprowadzenie w zawiesinę w 0 µl Cytofix=Cytoperm (zestaw Beckton Dickinson) i inkubowano min w 4 C. Następnie komórki przemyto Perm Wash (zestaw BD) i ponownie przeprowadzono w zawiesinę w 0 µl mieszaniny anty-ifn-γ APC + anty-il-2 FITC rozcieńczonych w Perm Wash. Po inkubacji przez 2 godziny w 4 C komórki ponownie przeprowadzono w zawiesinę w PBS z 1% FCS + 1% paraformaldehydem. Analizę próbek przeprowadzono przy uŝyciu FACS. śywe komórki bramkowano i zebieranie danych przeprowadzono na +/- 000 zdarzeń. Procent komórek IFN-γ + lub IL2+ obliczono dla populacji bramkowanych względem CD4+ i CD8+. IX.2.4- Protokoły immunizacji [036] Immunizowano 4 grupy. KaŜda z grup zawierała 12 samic myszy C7BI/6 w wieku 4 - tygodni. Grupa Antygen Adiuwant 1 gb PBS 2 gb AS01B 3 gb AS01E 4 NaCl NaCl 2 [0366] Antygen przygotowano w następujący sposób: antygen szczepionkowy eksprymowano w komórkach jajnika chomika chińskiego (CHO) jako gb**, skróconą chimerę zawierającą sekwencje peptydowe z glikoproteiny gd wirusa opryszczki pospolitej 2 (HSV2) na swoim N i C-końcu. Białko gb** jest skrócone w swojej domenie C-końcowej, która zawiera sekwencję zakotwiczającą w błonie, a zatem jest wydzielane do supernatantu ho-

111 1 1 dowli. [0367] Dla kaŝdej grupy gb** w stęŝeniu 1, µg/dawkę roztworzono w 62 µl PBS lub adiuwantu AS01B lub AS01E (przygotowanego według powyŝszego Przykładu II.2 zawierającego stęŝenie odpowiednio 0 µl immunostymulantów na ml lub 0 µl immunostymulantów na ml). 0 µl (tj. 1/ dawki dla człowieka 0, ml) wstrzyknięto domięśniowo. Jednej grupie kontrolnej myszy wstrzyknięto roztwór soli. Zastrzyki wykonano w dniach 0 i 28. Próbki surowicy zebrano 14 dni po drugim zastrzyku dla testów ELISA i neutralizacji. PBL zebrano 7 i 21 po drugim zastrzyku do przeprowadzenia ICS. IX.2. - Wyniki Miana anty-gb według ELISA (Figura 1). [0368] W grupie nieadiuwantowanego gb zaobserwowano bardzo słaby do niewykrywalnego poziom przeciwciał anty-gb. JednakŜe wysoką odpowiedź przeciwciał (6- i 66- krotnie wyŝszą) zaobserwowano dla obydwu grup z adiuwantami, odpowiednio AS01B i AS01E. Nie stwierdzono istotności statystycznej między grupami AS01B i AS01E. Test porównań wielokrotnych: Tukeya - HSD Grupa Przypadki Średnia Zwykła AS01E AS01B Zwykła 12 2,1132 ** ** AS01E 12 3,9317 ** AS01B 12 3,937 ** Zwykła<AS01E = AS01B 2 Miana neutralizacji anty-cmv (Fig. 16) [0369] Istotnie wyŝsze miana neutralizacji anty-gb zaobserwowano dla dwóch grup z adiuwantem w porównaniu z grupą ze zwykłym gb. Nie zaobserwowano istotnej róŝnicy w mianach przeciwciał neutralizujących między preparatami AS01B i AS01E. Odporność komórkowa [0370] Ze względu na bardzo niski poziom odpowiedzi obserwowanej po ponownej stymulacji w próbkach z 7 dnia po II dawce nie moŝna przeprowadzić rozróŝnienia pomiędzy grupami i nie moŝna zaobserwować wyraźnej odpowiedzi na stymulację CD4 i CD8 (Figura 17). Te niskie do niewykrywalnych odpowiedzi były prawdopodobnie spowodowane problemami technicznymi podczas przygotowywania próbki. JednakŜe odpowiedzi mogły być obserwowane 21 dni po drugim zastrzyku. Dane dotyczące CD4 (Figura 18) pokazują brak róŝnicy po ponownej stymulacji gb ( µg/ml) lub peptydami (2 µg/ml lub 4 µg/ml). Podobny profil cytokin obserwuje się dla AS01E i AS01B. Nie moŝna zaobserwować wyraźnej odpowiedzi na stymulację CD8 (Figura 19)

112 [0371] Doświadczenia te pokazują, Ŝe dla innej kompozycji antygenowej oraz w dwóch róŝnych organizmach adiuwant zawierający niŝszy poziom immunostymulantów jest tak skuteczny immunologicznie jak ten, który zawiera wyŝszy ich poziom. X: Ocena przedkliniczna adiuwantowanej szczepionki RTS,S X.1 - Preparat [0372] Kompozycję antygenową RTS,S wytwarza się w Saccharomyces cervisiae i zawiera ona dwa białka RTS i S, które składają się wewnątrzkomórkowo i spontanicznie w mieszane polimeryczne struktury w postaci cząstek, z których kaŝda szacunkowo zawiera, średnio 0 polipeptydów. RTS jest 1 kda hybrydowym łańcuchem polipeptydowym o 424 aminokwasach (aa) obejmujących 189 aa wyprowadzonych z antygenu powierzchniowego sporozoitu szczepu NF3 pasoŝyta malarii P. falciparum (antygen CSP, aa 7 do 39) w fuzji z N-końcową częścią białka S wirusa zapalenia wątroby typu B. Białko S jest 24 kda polipeptydem (o długości 226 aminokwasów) odpowiadającym antygenowi powierzchniowemu wirusa zapalenia wątroby typu B. Liofilizowany osad antygenu zawiera w przybliŝeniu 0 µg (gdy jest przeznaczony do formułowania w 0, ml z AS01B) lub 2 µg (gdy jest przeznaczony do formułowania w 0, ml z AS01E) antygenu. [0373] AS01B i AS01E przygotowano przez zmieszanie róŝnych składników (PBS, liposomów, MPL i QS21) w zbiorniku oraz mieszanie w warunkach aseptycznych. Następnie produkt wyjałowiono drogą filtracji przed napełnieniem fiolek lub strzykawek. Ciekły adiuwant przechowywano w +2 C do +8 C przed zastosowaniem do roztworzenia liofilizowanego osadu antygenu. X.2 Doświadczenia na myszach [0374] Przeprowadzono dwa doświadczenia na myszach mające na celu porównanie odpowiedzi immunologicznych specyficznych względem RTS,S wywołanych przez RTS,S/AS01B w porównaniu z RTS,S sformułowanym z AS01E. W kaŝdym doświadczeniu myszy C7BI/6 ( myszy/grupę) immunizowano domięśniowo trzykrotnie z przerwami dwutygodniowymi, lub 2, µg RTS,S sformułowanego z adiuwantami AS01B lub AS01E. Jako kontrole, dwie grupy immunizowano samym AS01B albo AS01E. Odpowiedzi przeciwciał specyficzne względem HBs i CS oceniono dla kaŝdej myszy metodą ELISA 1 dni po trzeciej immunizacji. Średnie geometryczne mian przeciwciał oraz ich 9% przedziały ufności obliczono dla wszystkich myszy otrzymujących taką samą terapię w obydwu doświadczeniach. Analizy statystyczne oceniające wpływ adiuwanta oraz wpływ dawki antygenu przeprowadzono na połączonych danych z obydwu doświadczeń. Specyficzne odpowiedzi komórek T CD4 i CD8 zmierzono z zastosowaniem cytometrii przepływowej 7 dni po drugiej i trzeciej immunizacji na pulach krwinek od myszy na

113 grupę. Zatem dla kaŝdej grupy w kaŝdym doświadczeniu otrzymano dwie wartości. Humoralna odpowiedź immunologiczna [037] Jak przedstawiono na Figurach i 21 obydwa adiuwanty, AS01B i AS01E, wywoływały silne porównywalne odpowiedzi przeciwciał przeciw CSP i HBs. Trójczynnikowa ANOVA na GMT anty-csp wykazała brak istotnych róŝnic między AS01B i AS01E dla dawek lub 2, µg RTS,S. Dla dawki µg stwierdzono, Ŝe adiuwant AS01B wywoływał wyŝsze miana anty-cs niŝ AS01E, a stosunek GMT grupa AS01B/grupa AS01E wynosił 1,93 (9% CI: 1,33-2,79; p = 0,001) Specyficzna komórkowa odpowiedź immunologiczna [0376] Figury 22 i 23 przedstawiają poziomy komórek T CD4 i CD8 specyficznych względem CSP i HBs, które eksprymują IL-2 i/lub IFN gamma. Zaobserwowano tendencję do wyŝszej odpowiedzi CD4 specyficznych względem CSP dla AS01B w porównaniu z AS01E po trzech immunizacjach, podczas gdy odpowiedź komórek T CD8 dla AS01E była równowaŝna z lub lepsza niŝ dla AS01B. Zaobserwowano tendencję do wyŝszej odpowiedzi CD4 specyficznych względem HBs dla AS01B w porównaniu z AS01E po trzech immunizacjach, za wyjątkiem niŝszej dawki RTS,S dla której poziomy komórek T CD4 były porównywalne między tymi dwoma adiuwantami. Odpowiedzi komórek T CD8 specyficzne względem HBs wywołane przez RTS,S formułowany z AS01E były równowaŝne lub lepsze niŝ odpowiedzi wywołane przez RTS,S formułowany z AS01B. [0377] UwaŜa się, Ŝe róŝnice te są w granicach oczekiwanej zmienności dla komórkowych testów immunologicznych. [0378] Ocena przedkliniczna szczepionki RTS,S/AS01E u myszy ujawniła dopuszczalny profil bezpieczeństwa, podobny do RTS,S/AS01B. XI: Ocena kliniczna RTS,S/AS01E. [0379] Preparaty wytworzono tak jak w Przykładzie X powyŝej. Sacharozę zastosowano jako zaróbkę w liofilizowanym osadzie antygenu. Tak jak w Przykładzie X ciekły adiuwant zastosowano do roztworzenia liofilizowanego antygenu. AS01E przygotowano w sposób opisany w Przykładzie II.2 i przechowywano w +2 do +8 C do czasu gdy był potrzebny do roztworzenia. [0380] Randomizowane badanie II fazy metodą podwójnie ślepej próby pod kątem bezpieczeństwa i immunogenności RTS,S adiuwantowanego AS01E jest obecnie prowadzone na dzieciach w wieku 18 miesięcy do 4 lat Ŝyjących w Gabonie. Schemat szczepienia obejmuje szczepienie w miesiącu 0, 1, 2. Cele są następujące dla RTS,S/AS01E podawanej w 3

114 dawkach domięśniowo w schemacie w miesiącu 0, 1, 2 dzieciom w wieku 18 miesięcy do 4 lat Ŝyjącym w obszarze endemicznego występowania malarii: Równorzędne podstawowe cele ocena bezpieczeństwa do jednego miesiąca po Dawce 3. wykazanie równowaŝności ze szczepionką RTS,S adiuwantowaną emulsją typu olej w wodzie pod względem odpowiedzi przeciwciał anty-cs jeden miesiąc po Dawce 3. Wtórne cele ocena reaktogenności do jednego miesiąca po Dawce 3 wykazanie równowaŝności ze szczepionką RTS,S adiuwantowaną emulsją typu olej w wodzie pod względem odpowiedzi przeciwciał anty-hbs jeden miesiąc po Dawce 3. opisanie seroprotekcji przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu B do jednego miesiąca po Dawce 3 opisanie odpowiedzi przeciwciał anty-cs do jednego miesiąca po Dawce 3 Trzeciorzędowe cele bezpieczeństwo między 1 miesiącem po Dawce 3 do 12 miesięcy po Dawce 3 humoralna odpowiedź immunologiczna na antygen CS do 12 miesięcy po Dawce 3 humoralna odpowiedź immunologiczna na antygen HBs do 12 miesięcy po Dawce 3 Badawcze cele ocena odpowiedzi immunologicznej z udziałem komórek T na antygen CS do 12 miesięcy po Dawce 3 ocena odpowiedzi immunologicznej komórek B pamięci na antygen CS do 12 miesięcy po Dawce 3 opisanie odpowiedzi przeciwciał anty-cs do jednego miesiąca po Dawce 3 według udokumentowanego statusu immunizacji HBV w teście przesiewowym. [0381] Do badania włączono 180 osobników, przy czym 90 osobnikom podawano szczepionkę adiuwantowaną wcześniej zatwierdzonym opatentowanym adiuwantem w postaci emulsji typu olej w wodzie (nazwaną kontrola w Tabelach poniŝej), a 90 osobnikom podawano szczepionkę adiuwantowaną AS01E. Zbadano zdrowych chłopców i dziewczynki w wieku 18 miesięcy do 4 lat. Szczepionki podawano drogą IM do lewego mięśnia naramiennego.

115 114 Występowanie i charakter objawów (oczekiwanych i nieoczekiwanych) zanotowanych podczas 7-dniowego (Dni 0-6) okresu po szczepieniu po kaŝdej dawce oraz ogólnie (Cała szczepiona kohorta) Dawka 1 Dawka 2 Dawka 3 Ogólnie/dawkę Ogólnie/osobnika Jakikolwiek objaw Objawy ogólne Objawy miejscowe 9% CI 9% CI 9% CI Grupa N n % LL UL N n % LL UL N n % LL UL Gr ,4 34,0, ,6 16,9 3, ,2 14,1 32,2 Gr ,2 41,4 62, ,9 19,8 39, ,6 2,7 46,3 Gr ,8 4,8 67, ,9, 1, ,8 29, 0,8 Gr ,9 49,9 71, ,8 34,1, ,1 28,8 0,1 Gr ,0 86, 98, ,0,3 2, ,6 83,4 96, Gr , 90,0 99, ,8 47,6 69, ,9 8,3 97,4 Gr ,4 8,2 70, ,6 29,8 41, ,2 44,0 6,4 Gr , 63, 7, ,9 37,8 0, ,3 49,1 61, Gr ,7 90,6 99, ,7,9 76, ,2 84,6 96,8 Gr ,4 87, 98, ,8 67,8 8, ,3 86,1 97, Gr. 1 = RTS,S.AS01E Gr. 2 = kontrola LL = dolna granica UL = górna granica Dla kaŝdej dawki oraz ogólnie/osobnika: N= liczba osobników z co najmniej jedną podaną dawką n/%= liczba/procent osobników wykazujących co najmniej jeden typ objawu bez względu na podaną badaną szczepionkę Dla ogólnie/dawkę: N= liczba podanych dawek n/%= liczba/procent dawek, po których wystąpił co najmniej jeden typ objawu bez względu na podaną badaną szczepionkę 9% CI = dokładny 9% przedział ufności, LL = dolna granica, UL = górna granica

116 11 [0382] Dane te pokazują, Ŝe dla szczepionki RTS,S adiuwantowanej AS01E uzyskano dopuszczalne wyniki dotyczące reaktogenności w populacji pediatrycznej w porównaniu z preparatem kontrolnym. [0383] Odpowiedzi serologiczne zmierzono przez ocenę odpowiedzi przeciwciał na powtórne podanie HBs i CSP (anty-r32lr). Surowicę do oznaczenia przeciwciał zebrano podczas badania przesiewowego, w dniu 60 oraz w dniu 90 (przy drugim szczepieniu i przy trzecim szczepieniu). Poziomy przeciwciał przeciw CS zmierzono z zastosowaniem standardowej metody ELISA stosując płytkę z zaadsorbowanym antygenem R32LR ze standardowym przeciwciałem odniesienia jako kontrolą zgodnie ze standardową procedurą operacyjną laboratorium. Wyniki zanotowano w EU/ml. [0384] Przeciwciała przeciw antygenowi powierzchniowemu wirusa zapalenia wątroby typu B zmierzono z zastosowaniem dostępnego w handlu testu immunologicznego ELISA (zestaw testowy AUSAB EIA z Abbott) lub równowaŝnego według instrukcji do testu. Wyniki zanotowano w miu/ml.

117 116 Wskaźniki seropozytywności i GMC dla przeciwciał anty-cs (Cała szczepiona kohorta) >= 0, ELU/ML GMC 9% CI 9% CI Przeciwciało Grupa Punkt czasowy N n % LL UL wartość LL UL Min Max Anty-CS Gr. 1 Gr. 2 BADANIE PRZESIEWOWE ,0 0,0 4,1 0,3 0,3 0,3 <0, <0, PII(D60) ,4 0 81,9 64,9 3,2 4,6 68,6 PIII(D90) ,2 0 21,6 178,8 29,9 14,3 1922,3 BADANIE PRZESIEWOWE ,1 0,0 6,0 0,3 0,2 0,3 <0, 0, PII(D60) ,4 0 6,9 4,7 70,9 3,6 2380,9 PIII(D90) , 0 164,8 134,1 2,6 6,3 93,6 Gr. 1 = RTS,S.AS01E Gr. 2 = Kontrola GMC = średnia geometryczna stęŝenia przeciwciała obliczona dla wszystkich osobników N = liczba osobników dla których były dostępne wyniki n/% = liczba/procent osobników ze stęŝeniem w wyszczególnionym zakresie 9% CI = 9% przedział ufności; LL = dolna granica, UL = górna granica MIN/MAX = Minimum/Maksimum

118 117 Wskaźniki seropozytywności i GMC dla przeciwciał anty-hbs (Cała szczepiona kohorta) >= MIU/ML GMC 9% CI 9% Cl Przeciwciało Grupa Punkt czasowy N n % LL UL wartość LL UL Min Max Anty-HBs Gr. 1 Gr. 2 BADANIE PRZESIEWOWE ,3 37,6 9,2 40,8 23,3 71,4 <, ,6 PII(D60) ,7 93, ,4 4684, ,7 <, PIII(D90) , ,7 1316, 39278, 21, BADANIE PRZESIEWOWE ,1,8 2,0,0 12,8 31,0 <,0 796,4 PII(D60) ,7 93, ,0 1963,1 6749,3 <, PIII(D90) , ,0 1311, ,9 178, Gr. 1 = RTS,S.AS01E Gr. 2 = Kontrola GMC = średnia geometryczna stęŝenia przeciwciała obliczona dla wszystkich osobników N = liczba osobników dla których były dostępne wyniki n/% = liczba/procent osobników ze stęŝeniem w wyszczególnionym zakresie 9% CI = 9% przedział ufności; LL = dolna granica, UL = górna granica MIN/MAX = Minimum/Maksimum

119 [038] Dane te pokazują, Ŝe preparat szczepionki RTS,S adiuwantowany AS01E wywołał dopuszczalne humoralne odpowiedzi immunologiczne w populacji pediatrycznej w porównaniu z zatwierdzoną kontrolą. Przykład XII: Ocena przedkliniczna preparatu wirusa ospy wietrznej i półpaśca z AS01B w porównaniu z AS01E. [0386] Kandydat na szczepionkę składał się ze skróconego białka otoczki VZV, ge, wytworzonego w komórkach CHO. [0387] Do tego badania myszy C7BL/6 (n=48) poddano szczepieniu pierwotnemu jedną dawką Varilrix dla człowieka (HD) (~4 log pfu/dawkę) podawaną podskórnie. Pięć tygodni po szczepieniu pierwotnym Varilrix myszy podzielono na grup po 12 myszy i w dniach 0 i 28 wstrzykiwano im domięśniowo (do mięśnia piszczelowego) µg samego ge, µg ge + AS01E* (1/ HD) lub µg ge + AS01B (1/ HD). Kontrolnej grupie myszy (tylko szczepiona pierwotnie) wstrzyknięto sól (0,9% NaCl). Odpowiedzi immunologiczne oceniono w dniach 14 i/lub po drugim szczepieniu. Oznaczono poziomy wszystkich przeciwciał specyficznych względem ge i częstość komórek T CD4 i CD8 wytwarzających cytokiny (IL2/IFNγ). Odpowiedzi przeciwciał specyficzne względem ge: [0388] Opracowano test ELISA w celu wykrycia i oznaczenia ilościowego przeciwciał specyficznych względem ge w surowicy myszy z zastosowaniem białka ge jako antygenu powlekającego. Miana według ELISA określono jako odwrotność rozcieńczenia surowicy, które wywołało absorbancję (gęstość optyczna) zmierzoną jako równą 0% maksymalnej wartości absorbancji. Miana według ELISA obliczono z zastosowaniem analizy regresyjnej. [0389] Dane wykazują, Ŝe ge AS01E i ge AS01B wywołały podobne poziomy przeciwciał specyficznych względem ge (wartości p > 0,0). Obydwa preparaty wywołały istotnie wyŝsze odpowiedzi w porównaniu z samym antygenem ge (-13-krotnie, wartości p < 0,0) zarówno 14, jak i dni po II dawce (Figura 26). 14 dni po II dawce 9% CI dni po II dawce 9% CI Grupa GMT (EU/ml) LL UL GMT (EU/ml) LL UL ge qe/as01e ge/as01b Varilrix Odpowiedzi CD4 i CD8 specyficzne względem ge

120 [0390] Wytwarzanie cytokin oceniono w komórkach T CD4 i CD8 z zastosowaniem techniki wybarwiania wewnątrzkomórkowych cytokin. Komórki śledziony wyizolowano z kaŝdej grupy 12 myszy dni po II dawce i połączono w 4 grupach po 3 śledziony. Komórki śledziony (1 x 6 ) inkubowano przez 2 godziny w obecności peptydów ge (63 peptydy) obejmujących całe białko ge ( aa peptydy nachodzące na siebie o aa), a następnie inkubowano przez noc w obecności brefeldyny. Następnie komórki wybarwiono fluorescencyjnym mab specyficznym względem CD4/CD8 na powierzchni komórek oraz po permeabilizacji względem wewnątrzkomórkowych cytokin IL-2 i IFNγ. [0391] Jak przedstawiono na Figurze 26, pomimo Ŝe podobne profile cytokin (IL2/IFNγ) były wywołane przez preparaty ge AS01B i ge AS01E, preparat AS01B wywoływał większe natęŝenie odpowiedzi komórek CD4 i CD8 wytwarzających cytokiny (2-krotność, p>0,0 dla CD4, 3,6-krotność, p>0,0 dla CD8). Ze względu na nieoczekiwanie wysoką zmienność odpowiedzi komórek T zdolność wykrycia istotnej róŝnicy między dawkami adiuwanta była bardzo ograniczona (<0%). Co istotne ge sformułowane z AS01B lub AS01E wywoływało odpowiedź komórek T CD4 wytwarzających cytokiny o istotnie większym nasileniu (13,3-krotność, p< 0,0) niŝ samo ge. WyŜsze poziomy komórek CD8 zostały takŝe wywołane przez ge sformułowane z AS01B lub AS01E (3,8-krotność, p> 0,0) w porównaniu z samym antygenem ge. Przykład XIII: Ocena przedkliniczna AS01B względem AS01E w modelu grypy u fretek. Materiały i Metody [0392] Samice fretek (Mustela putorius furo) w wieku 4-6 miesięcy uzyskano z MISAY Consultancy (Hampshire, Wielka Brytania). Fretki poddano szczepieniu pierwotnemu w dniu 0 reprezentującym odmieny podtyp szczepem H1N1 A/Stockholm/24/90 (4LogTCID0/ml), µl podane donosowo. W dniu 21 fretkom wstrzyknięto domięśniowo pełną dawkę dla człowieka (dawka szczepionki 00 µg, 1 µg HA na szczep A, 17, µg na szczep B) połączenia H1N1 A/New Caledonia C//99 (1 µg/ml), H3N2 A/Wyoming/3/03 (1 µg/ml) i B/Jiangsu//03 (17, µg/ml). Następnie fretki poddano prowokacji w dniu 42 na drodze donosowej µl reprezentującego odmienny podtyp szczepu Wh.A/NY//04 (4,1 Log TCID0/ml). Szczepienia w dniu 21 przeprowadzono z uŝyciem zwykłego preparatu trójwaŝnego ( zwykła w poniŝszych Tabelach) lub preparatu trójwaŝnego adiuwantowanego AS01B ( AS01B w poniŝszych Tabelach) lub AS01E ( AS01E w poniŝszych Tabelach). Preparaty przygotowano w sposób przedstawiony w powyŝszym Przykładzie 3. Monitorowanie temperatury ciała:

121 [0393] Temperaturę u osobników monitorowano podczas okresu prowokacji i oceniano ją z zastosowaniem telemetrycznych implantów, które rejestrowały temperaturę kaŝdego pojedynczego zwierzęcia co 1 minut przed i po prowokacji. Wszystkie implanty sprawdzano i odnawiano oraz przeprowadzono nową kalibrację z uŝyciem DSI przed umieszczeniem w jamie otrzewnowej. Podczas tych pomiarów wszystkie zwierzęta umieszczano indywidualnie w pojedynczych klatkach. Temperatury rejestrowano co 1 minut przez okres od 6 dni przed szczepieniem pierwotnym do 4 dni po szczepieniu pierwotnym, a takŝe 3 dni przed prowokacją do 7 dni po prowokacji. Test hamowania hemaglutynacji (HI). Procedura testowa [0394] Miana przeciwciał przeciw hemaglutyninie względem trzech szczepów wirusa grypy oznaczono z zastosowaniem testu hamowania hemaglutynacji (HI). Zasada testu HI jest oparta na zdolności specyficznych przeciwciał przeciw grypie do hamowania hemaglutynacji czerwonych krwinek (RBC) kurczęcia przez hemaglutyninę (HA) wirusa grypy. Surowice najpierw potraktowano 2% roztworem neuraminidazy (RDE) i inaktywowano termicznie w celu usunięcia niespecyficznych inhibitorów. Po wstępnej obróbce dwukrotne rozcieńczenia surowicy inkubowano z 4 jednostkami hemaglutynacji kaŝdego szczepu wirusa grypy. Następnie dodano czerwone krwinki kurczęcia i oceniano hamowanie aglutynacji biorąc pod uwagę komórki w kształcie kropli podczas odczytu. Miana wyraŝono jako odwrotność najwyŝszego rozcieńczenia surowicy, które całkowicie hamowało hemaglutynację. PoniewaŜ pierwsze rozcieńczenie surowicy wynosiło 1:, niewykrywalny poziom oznaczono jako miano równe. Analiza statystyczna [039] Analizę statystyczną przeprowadzono na mianach HI z zastosowaniem UNISTAT. Protokół zastosowany do analizy wariancji moŝna w skrócie opisać w następujący sposób: Logarytmiczne przekształcenie danych Test Shapiro-Wilka na kaŝdej populacji (grupie) w celu potwierdzenia normalności rozkładu w grupach Test Cochrana w celu potwierdzenia jednorodności wariancji między róŝnymi populacjami (grupami) Jednoczynnikowa analiza wariancji przeprowadzona na grupach Test porównań wielokrotnych Tukeya HSD Mianowanie wirusa w popłuczynach z nosa [0396] Wszystkie próbki pobrane z nosa najpierw wyjałowiono drogą filtracji na filtrach

122 Spin X (Costar) w celu usunięcia jakiegokolwiek zakaŝenia bakteryjnego. 0 µl seryjnych dziesięciokrotnych rozcieńczeń popłuczyn z nosa przeniesiono na płytki do mikromianowania zawierające 0 µl poŝywki ( studzienek/rozcieńczenie). Następnie do kaŝdej studzienki dodano 0 µl komórek MDCK (2,4 x komórek/ml) i inkubowano w 3 C przez 6-7 dni. Po 6-7 dniach inkubacji poŝywkę hodowlaną delikatnie usunięto i dodano 0 µl poŝywki zawierającej 1/ WST-1 i całość inkubowano przez kolejne 18 godzin. Intensywność Ŝółtego barwnika formazanowego wytworzonego przez redukcję WST-1 przez Ŝywe komórki jest proporcjonalna do liczby Ŝywych komórek obecnych w studzience pod koniec testu mianowania wirusa i oznacza się ją ilościowo przez pomiar absorbancji kaŝdej studzienki przy odpowiedniej długości fali (40 nanometrów). Wartość odcięcia określono jako średnią OD dla niezakaŝonych komórek kontrolnych - 0,3 OD (0,3 OD odpowiadają +/- 3 odchyleniom standardowym OD niezakaŝonych komórek kontrolnych). Wynik pozytywny określa się gdy OD jest < wartości odcięcia w odróŝnieniu od wyniku negatywnego, który określa się gdy OD jest > wartości odcięcia. Miana wydalania wirusa określono według procedury Reed i Muench i wyraŝono jako logarytm TCID 0 /ml. Test limfoproliferacji [0397] PBMC zebrano przez wirowanie w gradiencie gęstości ( min przy 0 obr./min i 4 C) stosując roztwór Ficoll Cedarlane lympholyte mammal. PBMC ponownie przeprowadzono w zawiesinę w ml poŝywki hodowlanej (RPMI/Add w 4 C) i % normalnej surowicy fretek. Dodatki obejmowały 0 mm pirogronian sodu, endogenne aminokwasy MEM, Penicylinę/streptomycynę, glutaminę i 00 x stęŝony β2-merkaptoetanol. ŚwieŜo wyizolowane PBMC zastosowano natychmiast do testów proliferacji in vitro. Komórki umieszczono w 96-studzienkowych płytkach do hodowli tkankowych o płaskim dnie przy 2 x komórek/studzienkę i hodowano z róŝnymi stęŝeniami antygenu (0,1 do 1 µg HA całego inaktywowanego wirusa) przez 44 do 96 h, a następnie znakowano przez podziałanie 0, µci [ 3 H] tymidyny. Włączanie znacznika radioaktywnego oceniono 4 do 16 h później z zastosowaniem emisyjnej spektroskopii promieniowania β. Wyniki [0398] ObciąŜenie wirusem w popłuczynach z nosa po prowokacji. [0399] Popłuczyny z nosa zebrano 2 dni przed szczepieniem pierwotnym (szczepienie pierwotne = dzień 0), 1, 2 i 7 dni po szczepieniu pierwotnym, a takŝe 4 dni przed prowokacją (prowokacja = dzień 42) i przez okres 7 dni po prowokacji.

123 122 Grupa Zwykła 0,82 1,84,3 1,8 0,8 1,82,77 4,44 1,97 0,9 AS01E 0,82 2,11,83 1,6 0,8 1,62 4,93 4,1 2,4 0,8 AS01B 0,81 2,26,38 1,91 0,82 1,74 2,2 1,89 1, 0,9 1 2 Patrz wyniki na Figurze 27. Wydalanie wirusa po szczepieniu pierwotnym Szczytowe wydalanie wirusa zaobserwowano u wszystkich fretek 2 dni po szczepieniu pierwotnym. 7 dni po szczepieniu pierwotnym we wszystkich grupach zaobserwowano tylko szczątkowe obciąŝenie wirusem. Wydalanie wirusa po prowokacji [0400] Pik wydalania wirusa zaobserwowano 24 godziny po prowokacji. Mianowanie wirusa 3 dni po prowokacji wykazało wysokie miana wirusa (brak ochrony) u fretek immunizowanych zwykłą trójwaŝną szczepionką typu split. NiŜsze obniŝenie wydalania wirusa zaobserwowano u fretek immunizowanych trójwaŝną szczepionką typu split z AS01E niŝ obserwowane dla trójwaŝnej szczepionki typu split adiuwantowanej AS01B. Monitorowanie temperatury: [0401] Temperaturę ciała monitorowano od 6 dni przed szczepieniem pierwotnym (szczepienie pierwotne = dzień 0) do 4 dni poszczepieniu pierwotnym, a takŝe od 3 dni przed prowokacją do 7 dni po prowokacji (prowokacja = dzień 42). Pomiary wykonywano co 1 minut i średnią obliczono do południa dla kaŝdej grupy. Wyniki moŝna zobaczyć na Figurze 28. Po szczepieniu pierwotnym [0402] Monitorowanie temperatury ciała przed, podczas i po szczepieniu pierwotnym nie wykazało wzrostu temperatury we wszystkich grupach. Po prowokacji [0403] Interpretacja monitorowania temperatury ciała jest trudna. Niewielki wzrost temperatury ciała zaobserwowano po prowokacji u fretek immunizowanych zwykłą trójwaŝną szczepionką typu split i trójwaŝną szczepionką typu split z AS01E, ale nie trójwaŝną szczepionką typu split z AS01B. PoniŜszy wynik uzyskano dla kilku fretek ze wzrostem temperatury ciała >0,4 C. Wzrost temperatury po prowokacji Zwykła trójwaŝna szczepionka: /8 (+0,4, +0,4, +0,, +0,7, +0,8)

124 123 TrójwaŜna szczepionka z AS01B 0/8 TrójwaŜna szczepionka z AS01E 6/8 (+0,4, +0,4, +0,, +0,, +0,9, +1,6) [0404] Odczyt ten jest mniej pewny niŝ inne odczyty zastosowane u fretek. [040] Test hamowania hemaglutynacji (HI) [0406] Próbki surowicy zebrano 4 dni przed szczepieniem pierwotnym, 17 dni po szczepieniu pierwotnym, 21 dni po immunizacji i 13 dni po prowokacji. Wyniki moŝna zobaczyć na Figurach 29 i. Dla wszystkich trzech szczepów szczepionkowych statystycznie istotnie wyŝsze miana HI zaobserwowano u fretek immunizowanych trójwaŝną szczepionką typu split adiuwantowaną AS01B lub AS01E w porównaniu ze zwykłą trójwaŝną szczepionką typu split. Między obydwiema grupami z adiuwantem zaobserwowano brak róŝnicy. W porównaniu do innych grup zaobserwowano statystycznie istotnie wyŝsze miana HI w wyniku reakcji krzyŝowej względem A/New York H3N2 (szczep zastosowany do prowokacji) po immunizacji fretek trójwaŝnymi szczepionkami typu split adiuwantowanymi AS01B. ZastrzeŜenia patentowe Kompozycja immunogenna w objętości odpowiedniej do dawki dla człowieka zawierająca antygen lub preparat antygenowy w połączeniu z adiuwantem, który to adiuwant zawiera immunologicznie czynną frakcję saponiny pochodzącą z kory Quillaja Saponaria Molina obecną w postaci liposomu oraz lipopolisacharyd, przy czym zarówno ta frakcja saponiny, jak i ten lipopolisacharyd są obecne w tej dawce dla człowieka na poziomie między 1 µg i µg. 2. Kompozycja immunogenna według zastrzeŝenia 1, w której ta kompozycja adiuwantowa ponadto zawiera sterol, przy czym stosunek saponina:sterol wynosi od 1:1 do 1:0 wag./wag. 3. Kompozycja immunogenna według któregokolwiek z zastrzeŝeń 1 do 2, w której tę immunologicznie czynną frakcję saponiny stanowi QS Kompozycja immunogenna według któregokolwiek z zastrzeŝeń 2 do 3, w której ten sterol stanowi cholesterol.. Kompozycja immunogenna według któregokolwiek z powyŝszych zastrzeŝeń, w której ten lipopolisacharyd stanowi pochodna lipidu A. 6. Kompozycja immunogenna według zastrzeŝenia, w której tę pochodną lipidu A stanowi 3D-MPL.

125 Kompozycja immunogenna według zastrzeŝenia 6, w której stosunek QS21:3D-MPL wynosi 1:1. 8. Kompozycja immunogenna według któregokolwiek z powyŝszych zastrzeŝeń, w której ten lipopolisacharyd jest obecny w ilości 2 µg. 9. Kompozycja immunogenna według któregokolwiek z powyŝszych zastrzeŝeń, w której ten lipopolisacharyd jest obecny w ilości 1-1 µg.. Kompozycja immunogenna według któregokolwiek z powyŝszych zastrzeŝeń, w której ta saponina jest obecna w ilości 1-2 µg. 11. Kompozycja immunogenna według zastrzeŝenia, w której ta saponina jest obecna w ilości 2 µg. 12. Kompozycja immunogenna według zastrzeŝenia, w której ta saponina jest obecna w ilości 1 - µg. 13. Kompozycja immunogenna według któregokolwiek z powyŝszych zastrzeŝeń, w której ta objętość dawki odpowiednia do stosowania u człowieka wynosi między 0, i 1, ml. 14. Kompozycja immunogenna według zastrzeŝenia 7, w której QS21 i 3D-MPL są na poziomie między - µg. 1. Kompozycja adiuwantowa w objętości odpowiedniej do stosowania w dawce kompozycji immunogennej dla człowieka, zawierająca między 1 i µg lipopolisacharydu oraz między 1 i µg immunologicznie czynnej frakcji saponiny obecnej w postaci liposomu. 16. Kompozycja adiuwantowa według zastrzeŝenia 1, w której ten lipopolisacharyd stanowi pochodna lipidu A. 17. Kompozycja adiuwantowa według zastrzeŝenia 16, w której tę pochodną lipidu A stanowi 3D-MPL. 18. Kompozycja adiuwantowa według któregokolwiek z zastrzeŝeń 1 17, w której tę immunologicznie czynną frakcję saponiny stanowi QS Kompozycja adiuwantowa według któregokolwiek z zastrzeŝeń 1 18, w której ta objętość odpowiednia do dawki dla człowieka wynosi µl.. Kompozycja adiuwantowa według któregokolwiek z zastrzeŝeń 1 18, w której ta objętość odpowiednia do dawki dla człowieka wynosi 360 µl. 21. Kompozycja adiuwantowa według któregokolwiek z zastrzeŝeń 1 18, w której ten lipopolisacharyd jest obecny w ilości 2 µg. 22. Kompozycja adiuwantowa według któregokolwiek z zastrzeŝeń 1 18, w której ten lipopolisacharyd jest obecny w ilości µg.

126 Kompozycja adiuwantowa według któregokolwiek z zastrzeŝeń 1 18, w której ten lipopolisacharyd jest obecny w ilości µg. 24. Kompozycja adiuwantowa według któregokolwiek z zastrzeŝeń 1 23, w której ta immunologicznie czynna saponina jest obecna w ilości 2 µg. 2. Kompozycja adiuwantowa według któregokolwiek z zastrzeŝeń 1 23, w której ta immunologicznie czynna saponina jest obecna w ilości µg. 26. Kompozycja adiuwantowa według któregokolwiek z zastrzeŝeń 1 23, w której ta immunologicznie czynna saponina jest obecna w ilości µg. 27. Dawka kompozycji immunogennej według któregokolwiek z zastrzeŝeń 1 do 14 dla człowieka do stosowania w medycynie. Uprawniony: Pełnomocnik: GlaxoSmithKline Biologicals S.A. mgr inŝ. Agnieszka Marszałek Rzecznik patentowy

127 126 Figura 1 Proszek MPL Zawiesina ( mg/ml) Obróbka termiczna Chłodzenie Mikrofluidyzacja Rozcieńczanie do 2 mg/ml Wstępna filtracja na filtrze 0,6 µm Filtracja na filtrze 0,2 µm Rozcieńczanie do 1 mg/ml Przechowywanie w +2/+8 o C

128 127

129 128

130 129

131 1

132 131

133 132

134 133

135 134

136 13

137 136

138 137

139 138

140 139

141 140

142 141

143 142

144 143

145 144

146 14

147 146

148 147

149 148

150 149