Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: MOLEKULARNE PODSTAWY BIOTECHNOLOGII

Transkrypt

1 Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: Zakład Biologii Molekularnej Wydział Farmaceutyczny, WUM ul. Banacha 1, Warszawa

2 ĆWICZENIE 1 IZOLACJA raav Z KOMÓREK PAKUJĄCYCH AAV293 cz.i 1. Osad komórek AAV293 z wirusem raav zawiesić w buforze do lizy (15ml buforu/10 stransfekowanych płytek), delikatnie wymieszać, przenieść całość do jednej probówki, 2. Liza termiczna osadu komórek AAV293 zawierających raav: przygotować łaźnię z suchym lodem (-70 C ) oraz termoblok (37 C ), inkubować lizaty komórkowe naprzemiennie w -70 C (10min) oraz 37 C (10min), cykl inkubacji powtórzyć 3x vorteksując lizaty po każdej inkubacji w 37 C, 3. Do probówki z zawiesiną dodać odpowiednią ilość Benzonase (Sigma): 750U, następnie inkubować 30min w 37 C, 4. Zwirować zawiesinę z treścią komórkową: 5700rpm, 20min, RT (room temperature), supernatant przenieść do nowej probówki, 5. Przygotować narzędzia i odczynniki do nawarstwienia bańki (Becman): sterylne szklane strzykawki i igły do punkcji, przenieść lizat wirusowy do bańki unikając tworzenia bąbli, 6. Powoli podwarstwić lizat wirusowy iodixanolem o zwiększającej się %, UWAGA: W BAŃCE NIE MOGĄ ZNALEŹĆ SIĘ BĄBLE POWIETRZA! ILOŚĆ [ml/1 bankę] %IODIXANOLU 9 15%iodixanol, 1M NaCl, PBS-MK 6 25%iodixanol, Phenol Red, PBS-MK 5 40%iodixanol, PBS-MK 5 60%iodixanol, Phenol Red 7. Bankę z nawarstwionym lizatem wirusowym dopełnić od góry buforem do lizy, pozbyć się bąbli powietrza, 8. Zatknąć szyjkę bańki, uprzednio posmarowaną substancja oleistą, metalowym korkiem; zgrzać szyjkę dociskając korek rozgrzanym ramieniem zgrzewarki, przytrzymać korek do momentu, gdy szyjka przestanie się odkształcać, ściągnąć delikatnie korek, pozostawić bańkę przez noc w 4 C, *Protokół przygotowany jest na 10 (15cm) płytek z komórkami AAV293 2

3 ĆWICZENIE 2 IZOLACJA raav Z KOMÓREK PAKUJĄCYCH AAV293 cz.ii 1. Umieścić bańki w rotorze do ultrawirówki (Type 60 Ti Becman), zamknąć bańki czerwonymi wieczkami, zakręcić pokrywę rotora, umieścić rotor w ultrawirówce; wirować 85min, rpm, 18 C, 2. W tym czasie przepłukać kolumny heparynowe (Heparin-agarose type I), uprzednio wylewając z nich zawartość znad złoża, 5 ml buforu 1X PBS-MK, czynność powtórzyć 3x, (Alternatywnie kolumny można zwirować umieszczając je w probówce (Falcon 50ml): 5min, 700rpm) 3. Po wirowaniu bańkę umieszczamy na statywie; jedną igłę (jednorazową) wbijamy w górną część bańki, drugą (z podpiętą strzykawką) w przezroczystą warstwę na dolnej granicy 40% iodixanolu, ostrożnie i delikatnie zaciągać oczyszczony lizat raav (1-3ml) i przenosimy na przepłukana kolumnę heparynową; Wirus powinien przejść przez kolumnę swobodnie, pod wpływem sił grawitacji, 4. Po zatrzymaniu się lizatu wirusowego w kolumnie, przepłukać kolumnę kolejnymi porcjami (3,5ml+3,5ml+3ml) buforu 1X PBS-MK (alternatywie zwirować jak poprzednio), 5. Nanieść na kolumnę bufor do elucji 1M NaCl PBS-MK (2ml+3,3ml: kolejne porcje eluatu zebrać do oddzielnych nowych probówek), 6. Probówki z raav mrozimy w -80 C *Protokół przygotowany jest na 10 (15cm) płytek z komórkami AAV293 3

4 Uwodnienie membrany Zakład Biologii Molekularnej, Wydział Farmaceutyczny, WUM. ĆWICZENIE 3 Preparatyka raav DIALIZA raav Bufor dializacyjny: 1X PBS, x obj. próbki, Czas trwania dializy: 1h zmiana buforu, 2h zmiana buforu noc, 4oC, zebranie próbki 1. Worki dializacyjne zanurzyć w buforze dializacyjnym na 0,5h, 2. Wyjąć woreczki z buforu, związać jeden koniec nanieść próbkę wirusa i związać woreczek UWAGA: MEMBRANA NIE MOŻE DOTKNĄĆ ŻADNEJ POWIERZCHNI! TRAWIENIE raav DNAZĄ I ORAZ PROTEINAZĄ K 1. Przygotować probówki o objętości 0,5ml, przygotować mix odczynników zgodnie z danymi w tabeli (Vkońcowe=50 µl), odczynnik µl/próbę Stężenie końcowe 10X bufor 5 1X(10mM Tris HCl, 2,5mM MgCl2, 0,1mM CaCl2) DNase I 3,7 7500U/ml H2O 36,3? raav 5? 2. Inkubować próbę 30min w temp.37 C, 3. Inaktywować DNazę I poprzez inkubację próby przez 10min w 65 C, 4. Do części prób potraktowanych DNazą dodać 2 µl Proteinazy K (20 µg), inkubować 60min. w 50 C, 5. Inaktywację Proteinazy przeprowadzić poprzez 20min. inkubację próby w 95 C, ĆWICZENIE 4 Szacowanie miana raav REAKCJA DNAzowania i proteinazowania 1. Przygotować reakcję real-time PCR: Rozmrozić odczynniki oraz materiał do badania, W reakcji qpcr należy uwzględnić: o 8 punktów krzywej wzorcowej: X*10^10 - X*10^3 o raav2 niedializowany 1X [ND] o raav2 dializowany 1X [D] o raav2 niedializowany DNase(+) 1X [ND,Dnase] o raav2 dializowany DNase(+) 1X [D,Dnase] o raav2 niedializowany DNase(+)Protease(+) 1X [ND,Dnase, Prot.] o raav2 dializowany DNase(+)Protease(+) 1X [D,Dnase, Prot.] o NTC: non template control 4

5 2 osoby (niedializowany, DNase(+), DNase(+)Protease(+)) {ND, D+, D+K+} 2 osoby (dializowany, DNase(+), DNase(+)Protease(+)) {D, D+, D+K+} 1 osoba przygotowuje rozcieńczenia plazmidu lacz co 10. (od1-12) Przygotowanie seryjnych rozcieńczeń (10-krotnych) plazmidu paav/lacz; Vkońcowa= 50µl, zakres rozcieńczeń. Przygotować odpowiednią ilość probówek ze sterylną wodą (po 45µl), Do pierwszej probówki (I rozcieńczenie) przenieść 5µl stocku plazmidu paav/lacz, zworteksować i tą samą ilość rozcieńczonego plazmidu przenieść do kolejnej probówki (rozcieńczenie I) Kolejne rozcieńczenia przygotować w ten sam sposób, Seryjne rozcieńczenia przechowywać w temperaturze -70 C REAKCJA REAL-TIME PCR (SYBRGreen) PRZYGOTOWANIE KRZYWEJ WZORCOWEJ paavlacz DO REAKCJI qpcr 1. Przeliczenie stężenia paav/lacz na liczbę kopii cząsteczek plazmidu przypadająca /µl Dane: Wlk.plazmidu: 7272bp Stężenie plazmidu: 5243,3 ng/µl = 5,243 µg/µl Algorytm liczenia: Założenie: 1bp (base pair)=650g/mol (dsdna) UWAGA! Miano wirusa określa się na podstawie krzywej wyliczonej dla ssdna 1b=325 g/mol 1base g/mol 7272bases X g/mol X g w 1 molu (6,022*10^23 cząstek substancji) 1 g to Y cząstek Y/10^6 = ilość cząsteczek/µg 1 µg Y/10^6 cząstek 5,243µg (w 1 µl) Z cząstek Ilość cząstek plazmidu/µl (I rozcieńczenie): Ilość cząstek plazmidu/reakcję (I rozcieńczenie): Kalkulator: Przygotować mix reakcyjny (Vkońcowa=10µl/próbę): ODCZYNNIK ilość µl /1 próbę ilość µl/ 5

6 BUFOR 5 SYBRGreen Primer F 0,5 Primer R 0,5 H2O 3 DNA 1 prób Rozporcjować mix na płytce w ilości pomniejszonej o matrycę, która będzie dodana do każdej studzienki, W pierwszej kolejności, w wyznaczonym, na poniższym schemacie, miejscu, do studzienki z mixem reakcyjnym dodać wodę (NTC); następnie rozpipetować kolejne punkty krzywej wzorcowej, a w ostatniej kolejności do studzienek na płytce dodać materiał badany; zaraz po nałożeniu 1 pełnej kolumny studzienek, należy zabezpieczyć ją wieczkiem, Rozkład punktów krzywej wzorcowej oraz prób na płytce: krzywa D, ND, D, ND, D, ND, D, ND, D+, D+, D+, D+, D+, D+, D+, D+, D+K+ D+K+ D+K+ D+K+ D+K+ D+K+ D+K+ D+K+ NTC NTC Po nałożeniu wszystkich prób na płytkę należy ją zrównoważyć i zwirować (1, 2200rpm), następnie wstawić do aparatu i wprowadzić odpowiednie ustawienia w programie do qpcr, Omówienie wyników: 6