PRACOWNIA Z BIOFIZYKI DLA ZAAWANSOWANYCH

Transkrypt

1 PRACOWNIA Z BIOFIZYKI DLA ZAAWANSOWANYCH Ćwiczenia laboraoryjne dla sudenów III roku kierunku Zasosowania fizyki w biologii i medycynie Biofizyka molekularna Zasosowanie spekrofluorymerii czasowo-rozdzielczej w badaniach białek (PB39) 1

2 PB39 Zasosowanie spekrofluorymerii czasowo-rozdzielczej w badaniach białek I. Wsęp Absorpcja foonów przez makrocząseczki biologiczne (np., kwasy nukleinowe, białka, chloroplasy) w zakresie długości fali 2-4 nm (bliskiego UV) lub powyżej 4 nm (świała widzialnego) może być wywołana przez sprzężone wiązania wielokrone w zasadach kwasów nukleinowych, aminokwasach aromaycznych (rypofan, yrozyna i fenyloalanina - absorpcja białek w zakresie bliskiego UV), oraz barwnikach akie jak chlorofil, karoen - absorpcja chloroplasów w zakresie widzialnym. Sosunkowo niska energia wzbudzenia elekronowego w ych cząseczkach jes związana z obecnością zdelokalizowanych wiązań ypu, kóre są akże przyczyną płaskiego charakeru ych cząseczek. Cząseczki powiązane akim układem wiązań zachowują płaską srukurę, orbiale p prosopadłe do płaszczyzny cząseczki mogą się nakładać i worzyć wielocenrowe czyli zdelokalizowane orbiale cząseczkowe zw. orbiale. W ogólności możemy mówić o sanach elekronowooscylacyjno-roacyjnych cząseczek, przy czym w środowisku wodnym w laboraorium lub w środowisku biologicznych wewnąrz żywych komórek lub kanek najważniejsze są sany elekronowo-oscylacyjne. Ponado w emperaurze pokojowej cząseczki e znajdują się w podsawowym sanie oscylacyjnym podsawowego sanu elekronowego. Absorpcja foonu o energii równej różnicy miedzy dozwolonymi sanami elekronowymi powoduje przejście cząseczki ze sanu podsawowego do wzbudzonego sanu elekronowego, naomias przejście odwrone jes realizowane poprzez emisję foonów zwaną fluorescencją. Zarówno po absorpcji jak i po emisji kwanu świała cząseczka może znaleźć się w podsawowym lub wzbudzonym sanie oscylacyjnym. Dezakywacja bezpromienisa sanu oscylacyjnego odbywa się bardzo szybko i emisja foonu odbywa się z podsawowego sanu oscylacyjnego. Absorpcja i emisja zależą od właściwości fizycznych badanej cząseczki i jej 2

3 oddziaływania z innymi cząseczkami (ooczeniem), zarówno w sanie podsawowym jak i wzbudzonym. Wybór spekroskopii emisyjnej jako podsawowego narzędzia badawczego wynika m.in. z nasępujących obserwacji. Po pierwsze, chociaż meody spekroskopii emisyjnej sanów elekronowych cząseczek biologicznych i ich kompleksów nie udzielają ak precyzyjnej informacji o srukurze jak krysalografia lub spekroskopia wielowymiarowego magneycznego rezonansu magneycznego (NMR), o można je uznać za komplemenarne, a nawe posiadające większe możliwości. Dosarczają bowiem informacji o srukurze, oddziaływaniach i dynamice układów cząseczkowych w rozworze, j. w warunkach zbliżonych do akich jakie są w żywych komórkach i kankach. W przypadku białek (enzymów) możemy o sprawdzić m.in. na podsawie pomiaru ich akywności kaaliycznej wobec ypowych ligandów (subsraów, inhibiorów) oraz na podsawie wpływu oddziaływania białek z ligandami na emisję znaczników emisyjnych przyczepionych kowalencyjnie do białek i ligandów. I.1 Funkcja wielowykładnicza opisująca zanik fluorescencji Wpływ środowiska i oddziaływań z ligandami odzwierciedlony jes w zaniku fluorescencji białka opisanym zależnością wykładniczą I( A lub wielowykładniczą M I( A Badania czynników, najczęściej opare o czasowo-rozdzielcze zaniki naężenia fluorescencji, przyczyniają się do pogłębienia wiedzy o makrocząseczkach biologicznych (białkach). Czasowo-rozdzielcze zaniki naężenia fluorescencji I( wyznacza się z równania I( = f i exp(-/ i ) oraz f i = A oi i /( A oj j ), gdzie f i udziały i-ej składowej emisji fluorescencji opisanej charakerysycznym czasem zaniku ( i ). Konsekwennie średni czas zaniku fluorescencji dany jes wzorem < e > = f i i, exp( ) exp( ) oi i1 i 3

4 I.2 Funkcja poęgowa opisująca zanik fluorescencji Model wielowykładniczy dyskrenych i nieoddziaływających składników, pomimo jego hisorycznych zasług, bardzo częso nie jes wysarczający do opisu zaników fluorescencji w heerogenicznych układach biologicznych składających się między innymi z bardzo dużych makrocząseczek białkowych o ogromnej liczbie sopni swobody i sanów energeycznych. Ciągły rozkład czasów życia fluorescencji P() oraz funkcje zaniku fluorescencji I(, P( )exp( ) zamias I( A exp( ) lub M I ( P( )exp( ) d zamias I( Aoi exp( ) są bardziej odpowiednie. Według ego modelu funkcja zaniku powinna być sumą indywidualnych zaników z wagami P(). Dla złożonego przypadku z N ścieżkami zaniku opisanych sałymi kineycznymi i = 1/ i i N 1 i paramer heerogeniczności (q) określony jes przez względną wariancję rozkładu i liczbę ścieżek zaniku N (J. Włodarczyk & B. Kierdaszuk, Biophys. J. 85: ) q 1 2 i1 i N Podsawiając rozkład gamma za P() do I( P( )exp( ) d Orzymujemy zanik poęgowy I( I 1 1q [1 (1 q) ] oraz czynnik normalizacyjny 2 I q / i średni czas zaniku poęgowego p 3 2q 4

5 I.3 Zanik emisji fluorescencji dehydrogenazy alkoholowej Jako przykład waro omówić pomiary i analizę zaniku emisji fluorescencji dehydrogenazy alkoholowej z wąroby konia (LADH) (MW = 2 x 4) (Rys. 1), gdzie przewidywana warość średniego charakerysycznego czasu zaniku fluorescencji wynosi < e > = (5.78+/-.9) ns i < p > = (5.5+/-.2) ns, odpowiednio dla modelu wielowykładniczego i poęgowego exc / em 275/338 nm. Białko ego enzymu zawiera dwie reszy rypofanowe Trp-15 (eksponowaną) i Trp-314 (zanurzoną), kóre znajdują się odpowiednio w hydrofilowym i hydrofobowym ooczeniu. Ooczenie o wpływa zarówno na położenie pasm emisji ich fluorescencji jak i na charakerysyczne czasy zaniku (Lakowicz e al., J. Fluoresc. 6:51-59, 1996) reprezenujące e dwie sondy rypofanowe. N Schema reszy indolowej rypofanu Rys. 1 Kineyka zaniku naężenia fluorescencji dehydrogenazy alkoholowej z wąroby konia (LADH) 5

6 I.4 Zanik emisji fluorescencji zredukowanego nikoynamidu w NADH Ten fragmen pracowni doyczy zbadania zaniku emisji fluorescencji zredukowanej formy dwunukleoydu nikoynamidu i adeniny (NADH) (Kierdaszuk e al., Biophys. Chem. 62:1-13, 1996). Projek pracowni przewiduje akże wprowadzenie do meodologii pracy z makrocząseczkami biologicznymi (białkami) i zapoznanie się z nowoczesnymi echnikami spekroskopii fluorescencyjnej wysokiej rozdzielczości czasowej. Sała szybkości zderzeń (k d ) podczas reakcji sacking-desacking między cząseczkami zredukowanego nikoynamidu i adeniny w kofakorze NADH (reduced nicoinamide adenine dinucleoide) zależy od zaniku naężenia emisji NMNH (reduced nicoinamide nucleoide), kóry jes opisany funkcją dwu-wykładniczą z czasami charakerysycznymi: m1 =.25 ns (A 1 =.97) i m2 =.76 ns (A 2 =.3). Naomias zanik fluorescencji NADH jes opisany funkcją dwu-wykładniczą z czasami charakerysycznymi: d1 =.27 ns (A d1 =.72) i d2 =.59 ns (A d2 =.28). Zderzenia e nie wpływają na składnik króko żyjący, naomias składnik d2 =.59 ns jes wynikiem dynamicznego wygaszania składnika m2 sanu wzbudzonego zredukowanego nikoynamidu przez pierścień adeniny. Wyznacz sałą dezakywacji promienisej reszy zredukowanego nikoynamidu oraz sałą szybkości zderzeń między cząseczką nikoynamidu i adeniny w kofakorze NADH. II. Wymagania przy kolokwium wsępnym Warunkiem przysąpienia do części eksperymenalnej ćwiczenia jes zaliczenie kolokwium wsępnego. Wybór sposobu przeprowadzenia kolokwium wsępnego j forma pisemna czy usna, pyania oware czy zamknięe należy do prowadzącego ćwiczenie. 1. Maeriał z zakresu spekroskopii molekularnej absorpcyjnej i emisyjnej oraz zasosowania spekroskopii do badania właściwości molekuł: Kęckiego Podsawy spekroskopii molekularnej, Barrowa, Wsęp do spekroskopii molekularnej Kowalczyka Fizyka cząseczek Lakowicza, Principles of Fluorescence Specroscopy 6

7 2. Maeriał z zakresu budowy badanych molekuł i ich roli biologicznej: Fishera i Arnolda Chemia dla biologów, krókie wykłady Hamesa i Hoopera Biochemia, krókie wykłady Z książek ych (lub innych podanych na końcu opisu w sekcji Lieraura) należy przeczyać ylko yle, aby być przygoowanym do omówienia poniższych zagadnień: 1. Podsawowe definicje związane z promieniowaniem elekromagneycznym i pomiarami spekroskopowymi oraz sanami elekronowo-oscylacyjnymi cząseczek. 2. Pomiar absorpcji promieniowania elekromagneycznego - schema zasady pomiarów absorpcji (spekrofoomer jedno- i dwuwiązkowy) - co rozumiemy pod pojęciem widmo absorpcyjne? - ilościowy opis absorpcji (paramery pasma spekralnego) - czynniki deerminujące kszał i szerokość konuru pasma absorpcyjnego 3. Absorpcyjne widmo elekronowe ze srukurą oscylacyjną i prawo Lambera-Beera. 4. Pomiar widm emisji i wzbudzenia fluorescencji oraz zaniku naężenia fluorescencji: - charakerysyczny czas zaniku fluorescencji - wkłady składników oraz średni czas zaniku - wpływ środowiska oraz lepkości na widma emisji i wzbudzenia fluorescencji - wpływ środowiska oraz lepkości na zanik fluorescencji III. Badane obieky W ćwiczeniu są rejesrowane i analizowane widma absorpcji, widma emisji i wzbudzenia fluorescencji zaniki emisji fluorescencji rozworów wodnych składników białek czyli wybranych aminokwasów oraz dehydrogenazy alkoholowej z wąroby konia (LADH) i jej kompleksu ze zredukowaną formą dinukleoydu nikoynamidu i adeniny (NADH). Badane w ćwiczeniu związki o: Wybrane aminokwasy aromayczne - rypofan, yrozyna Białko (dehydrogenaza alkoholowa z wąroby konia, LADH) Kofakor (zredukowana forma dinukleoydu nikoynamidu i adeniny, NADH) IV. Przebieg ćwiczenia Sudenci orzymują przygoowane wcześniej rozwory wodne badanych związków (w buforze o ph 7.). Sężenie rozworów jes znane i odpowiednie do rejesracji widm przy użyciu dosępnych spekrofoomerów. Wszyskie widma będą rejesrowane dla rozworów umieszczonych w kuweach kwarcowych o długości drogi opycznej 1 cm. Objęość badanego rozworu w kuwecie powinna być równa 2 ml. Ćwiczenie wykonywane jes na spekrofoomerze dwuwiązkowym pracującym w zakresie promieniowania UV-VIS (Varian 5Bio), spekrofluorymerze seady-sae (FluoroMax) oraz wysokiej rozdzielczości czasowej Chronos (ISS). Wykonanie ćwiczenia: 1. Zapoznanie się ze spekromerem absorpcyjnym pracującym w zakresie promieniowania UV-VIS, spekrofluorymerem seady-sae (FluoroMax) oraz spekrofluorymerem wysokiej rozdzielczości czasowej Chronos (ISS). 2. Sprawdzenie przepuszczalności sosowanego 2mM buforu hepes (ph 7) i kuwe kwarcowych czyli rejesracja ich widm w zakresie 2-6 nm. 3. Rejesracja widm absorpcyjnych rozworów yrozyny, rypofanu, LADH i NADH w zakresie 2-6 nm (zdolność rozdzielcza spekrofoomeru 1 nm). 7

8 4. Rejesracja zaników emisji fluorescencji w rozworze wodnym, w kórym lepkość zmniejszała się przy wzroście emperaury, jeżeli lepkość a dla poszczególnych emperaur wynosi kg m -1 s -1 (T = 15.4 o C), 1-3 kg. s -1. m -1 s -1 (25 o C) i kg m -1 s -1 (T = 44.4 o C). 5. (Sałe fizyczne: N A = 6.22 x 1 23 mol -1, R = J K -1 mol -1, k B = 1.38 x 1-23 J. K -1 ) 6. Po rejesracji wszyskich widm pliki należy przesłać na własne kono poczowe lub przegrać na własny pendrive. W przypadku plików rejesrowanych przez niekóre spekrofoomery konieczna jes konwersja plików do formau eksowego. V. Rapor z wykonanego ćwiczenia W opisie ćwiczenia należy uwzględnić Wsęp, w kórym mogą być omówione ogólne zagadnienia spekroskopii absorpcyjnej i emisyjnej, mające związek z wykonywanym zadaniem, oraz Maeriały i meody, w kórych należy przedsawić sosowaną aparaurę, badane związki i warunki pomiarów. Nasępnie, w części Wyniki i Dyskusja należy przedsawić, opisać i zinerpreować zarejesrowane widma absorpcji, zaniki emisji fluorescencji i wykonane obliczenia czasów zaniku emisji fluorescencji. 1. Inerpreacja widma konrolnego kuwey i rozpuszczalnika (wody, buforu). Dlaczego musimy używać kuwey kwarcowej a nie szklanej? 2. Analiza zależności zarejesrowanych widm absorpcyjnych od budowy cząseczek, j. porównanie widm aminokwasów aromaycznych i widma białka. 3. Jakie są charakerysyczne długość fali absorpcji dla białek i ich składników? 4. Analiza zaniku rozworów yrozyny, rypofanu, LADH i NADH. VI. Lieraura JR Lakowicz, Principles of Fluorescence Specroscopy Z. Kęcki, Podsawy spekroskopii molekularnej G. Barrow, Wsęp do spekroskopii molekularnej Praca zbiorowa pod redakcją W. Zielińskiego i A. Rajcy Meody spekroskopowe i ich zasosowanie do idenyfikacji związków organicznych J. A. Barlrop i J. D. Coyle, Foochemia, podsawy P. Kowalczyk Fizyka cząseczek J. Sadlej Spekroskopia molekularna J. Fisher, J.R.P. Arnold Chemia dla biologów, krókie wykłady B.D. Hames, N.M. Hooper Biochemia, krókie wykłady A akże, w razie porzeb: H. Haken, H. C. Wolf, Fizyka molekularna z elemenami chemii kwanowej H. A. Saab, Wsęp do eoreycznej chemii organicznej W. Kołos, Chemia kwanowa J. Simons, Foochemia i spekroskopia L. A. Kazicyna i N. B. Kupleska, Meody spekroskopowe wyznaczania srukury związków organicznych 8