Zastosowanie chromatografii do analizy białek i kwasów nukleinowych

Transkrypt

1 Zastosowanie chromatografii do analizy białek i kwasów nukleinowych γράφειν dr inż. Marek Orłowski χρῶμα Politechnika Wrocławska Wydział Chemiczny Wydziałowy Zakład Biochemii

2 Każdy żywy organizm składa się z trzech podstawowych cząsteczek życia

3 DNA kwas deoksyrybonukleinowy (ang. DeoxyriboNucleic Acid) BIAŁKA (proteiny) (ang. proteins; gr. Πρωτεΐνη [proteini] st.gr. πρῶτος [protos]) {pierwszy, najważniejszy}

4 Struktura DNA (1953) James Watson, Francis Crick, Rosalind Franklin oraz Maurice Wilkins przedstawili światu model cząsteczki DNA (1953) Fundamental Molecular Biology, Lizabeth A. Allison, Blackwell Publishing, 2007

5 Organizacja materiału genetycznego wewnątrz komórki Fundamental Molecular Biology, Lizabeth A. Allison, Blackwell Publishing, 2007

6 GENOMIKA TRANSKRYPTOMIKA PROTEOMIKA Figure 1.2 Genomes 3 ( Garland Science 2007)

7 PROTEOMIKA NAUKA ZAJMUJACA SIĘ BADANIEM BIAŁEK I ZALEŻNOŚCI: STRUKTURA-FUNKCJA

8 SEC - ang. Size Exclusion Chromatography (chromatografia żelowa/sito molekularne/chromatografia wykluczenia) Podstawa rozdziału: wielkość i kształt cząsteczki białka

9 SEC - ang. Size Exclusion Chromatography

10 SEC - ang. Size Exclusion Chromatography PREPARACJA BIAŁKA FRAKCJONOWANIE MIESZANINY BIAŁEK SZACOWANIE MASY BIAŁKA OKREŚLENIE WŁAŚCIWOŚCI HYDRODYNAMICZNYCH BIAŁKA (Rs, VH) ANALIZA OLIGOMERYZACJI WPŁYW PTM NA WŁASCIWOŚCI HYDRODYNAMICZNE BIAŁKA WPŁYW LIGANDÓW NA WŁAŚCIWOŚCI HYDRODYNAMICZNE BIAŁKA

11 SEC - ang. Size Exclusion Chromatography

12 SEC - ang. Size Exclusion Chromatography Instrukcja do zajęć laboratoryjnych z Biochemii - Ćwiczenie G - Chromatografia żelowa, Wydziałowy Zakład Biochemii, Wydział Chemiczny, Politechnika Wrocławska Gel filtration, Principles and Methods, Amersham Pharmacia Biotech, Manual.

13 SEC - ang. Size Exclusion Chromatography

14 SEC - ang. Size Exclusion Chromatography

15 Jakość preparacji białka i jego analizy zależy często od stanu zużycia złoża

16

17

18

19 SEC umożliwia badanie oligomeryzacji białek i frakcjonowanie oligomerów

20 SEC umożliwia badanie oligomeryzacji białek

21 RODZAJE ELEKTROFOREZ W ŻELACH POLIAKRYLAMIDOWYCH WYKORZYSTYWANYCH W BIOCHEMII DO ROZDZIAŁU BIAŁEK: PAGE ang. PolyAcrylamide Gel Electrophoresis ELEKTROFOREZA NATYWNA (PAGE) ELEKTROFOREZA W WARUNKACH DENATURUJĄCYCH (SDS-PAGE) ELEKTROFOREZA NIECIĄGŁA (układ Laemmlie go) TECHNIKI ELEKTROFOREZY ŻELOWEJ (GE) ZALICZANE SĄ DO METOD CHROMATOGRAFICZNYCH

22 Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym Biochemistry, 5th edition, Jeremy M Berg, John L Tymoczko, and Lubert Stryer, New York: W H Freeman; 2002.

23 Zestaw do elektroforez PAGE

24

25 Pory w żelu powstają w wyniku sieciowania łańcuchów poliakrylamidu bisakrylamidem nadsiarczan amonu (APS) N,N,N,N- tetrametyloetylenodiamina (TEMED) Biochemistry, 5th edition, Jeremy M Berg, John L Tymoczko, and Lubert Stryer, New York: W H Freeman; 2002.

26 PARAMETRY ŻELU 2,67% C Instrukcja do zajęć laboratoryjnych z Biochemii - Ćwiczenie O Elektroforetyczny rozdział białek w żelu poliakrylamidowym, Wydziałowy Zakład Biochemii, Wydział Chemiczny, Politechnika Wrocławska 2015.

27 EMSA ang. Electrophoretic Mobility-Shift Assay ELEKTROFOREZA NATYWNA (PAGE) BADANIE ODDZIAŁYWAŃ : BIAŁKO DNA BADANIE ODDZIAŁYWAŃ: BIAŁKO /LIGAND DNA BADANIE ODDZIAŁYWAŃ : KOMPLEKSY BIAŁKOWE DNA Fried, M. & Crothers, D.M. (1981) Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Res. 9,

28 EMSA ang. Electrophoretic Mobility-Shift Assay 5 -AGCGACAAGGGTTCAATGCACTTGTCCAATGAA-3 UspDBD EcRDBD 3 -TCGCTGTTCCCAAGTTACGTGAACAGGTTACTT hsp27 pal Niedziela-Majka A. et al. (2000) Eur. J. Biochem. 267, Orłowski M. et al., (2004) Molecular Endocrinology 18 (9):

29 EMSA ang. Electrophoretic Mobility-Shift Assay 5 -AGCGACAAGGGTTCAATGCACTTGTCCAATGAA-3 EcRDBD EcRDBD 3 -TCGCTGTTCCCAAGTTACGTGAACAGGTTACTT hsp27 pal Niedziela-Majka A. et al. (2000) Eur. J. Biochem. 267, Orłowski M. et al., (2004) Molecular Endocrinology 18 (9):

30 EMSA ang. Electrophoretic Mobility-Shift Assay Orłowski M. et al., (2004) Molecular Endocrinology 18 (9):

31 Elektroforeza SDS-PAGE

32 Elektroforeza SDS-PAGE natywne białko polianion Biochemistry, 5th edition, Jeremy M Berg, John L Tymoczko, and Lubert Stryer, New York: W H Freeman; 2002.

33 Elektroforeza SDS-PAGE w układzie nieciągłym (wg Laemmli ego) Gly pi = 6,07 Instrukcja do zajęć laboratoryjnych z biochemii I Ćwiczenie O Chromatografia żelowa, Wydziałowy Zakład Biochemii, Wydział Chemiczny, Politechnika Wrocławska 2015 Laemmli, U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriofage T4. Nature 227:

34 Elektroforeza SDS-PAGE i wizualizacja białek przy użyciu barwnika błękitu CBB (ang. Coomassie Brillant Blue)

35 Biochemistry, 5th edition, Jeremy M Berg, John L Tymoczko, and Lubert Stryer, New York: W H Freeman; 2002.

36

37 Analiza DNA elektroforeza agarozowa

38 Cząsteczka dsdna ma formę podwójnej helisy i jest polianionem Figure 1.8a Genomes 3 ( Garland Science 2007)

39 ANALIZA DNA Analityka medyczna Kryminalistyka Archeologia Antropologia

40 Podstawowe techniki wykorzystywane w badaniach DNA: Trawienie restrykcyjne DNA Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) Sekwencjonowanie DNA A C G T Analiza wyników elektroforeza agarozowa lub poliakrylamidowa

41 Trawienie DNA z wykorzystaniem endonukleaz restrykcyjnych Fundamental Molecular Biology, Lizabeth A. Allison, Blackwell Publishing, 2007

42 Elektroforeza i wizualizacja DNA Fundamental Molecular Biology, Lizabeth A. Allison, Blackwell Publishing, 2007

43 Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) (ang. Polymerase Chain Reaction) Berg, J.M., Tymoczko, J.L., Stryer, L., Biochemia, PWN 2009

44 Elektroforeza i wizualizacja DNA przy użyciu barwnika bromku etydyny

45

46 Analiza zmian kształtu plazmidowego DNA w elektroforezie agarozowej przy różnych stężeniach bromku etydyny Biochemistry, 5th edition, Jeremy M Berg, John L Tymoczko, and Lubert Stryer, New York: W H Freeman; 2002.

47 SYBR GREEN umożliwia wizualizację DNA w żelach

48 ACRIDINE ORANGE - umożliwia wizualizację DNA w żelach i w żywych komórkach

49 Sekwencjonowanie DNA

50 Sekwencjonowanie DNA Fundamental Molecular Biology, Lizabeth A. Allison, Blackwell Publishing, 2007

51 Podstawowa literatura/źródła: 1. Size Exclusion Chromatography, Principles and Methods, GE Healthcare Life Sciences. 2. Berg, J.M., Tymoczko, J.L., Stryer, L., Biochemia, PWN Laemmli, U.K., Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriofage T4. Nature 227: , Pieprzyk J., Zbela, A., Jakób, M., Ożyhar, A., Orłowski, M., Homodimerization propensity of the intrinsically disordered N- terminal domain of Ultraspiracle from Aedes aegypti. Biochim Biophys Acta 1844: , Instrukcja do zajęć laboratoryjnych z Biochemii I - Ćwiczenie O - Elektroforetyczny rozdział białek w żelu poliakrylamidowym, Wydziałowy Zakład Biochemii, Wydział Chemiczny, Politechnika Wrocławska Instrukcja do zajęć laboratoryjnych z Biochemii I - Ćwiczenie G - Chromatografia żelowa, Wydziałowy Zakład Biochemii, Wydział Chemiczny, Politechnika Wrocławska A Guide to Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Detection, BIO-RAD Manual. 8. Fundamental Molecular Biology, Lizabeth A. Allison, Blackwell Publishing, Walkowiak, B., Techniki chromatografii cieczowej - przykłady zastosowań, Amersham Pharmacia Biotech, Lublin, Morpol, Walkowiak, B., Kochmańska, V., Elektroforeza - przykłady zastosowań, praca zbiorowa, Amersham Biosciences, Electrophoresis, Acrylamide Polymerization - A Practical Approach, BIO-RAD Manual. 12. Fried, M. & Crothers, D.M. (1981), Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Res. 9, Gel filtration, Principles and Methods, Amersham Pharmacia Biotech, Manual.

52 DZIĘKUJĘ ZA UWAGĘ dr inż. Marek Orłowski Politechnika Wrocławska Wydział Chemiczny Wydziałowy Zakład Biochemii