Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej Katedra Technologii Leków i Biochemii. Biologia komórki nowotworowej: Ćwiczenie C

Transkrypt

1 Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej Katedra Technologii Leków i Biochemii Biologia komórki nowotworowej: Ćwiczenie C Akumulacja i wewnątrzkomórkowa dystrybucja leków przeciwnowotworowych WSTĘP Większość leków w tym większość chemioterapeutyków oddziałuje z celem molekularnym znajdującym się wewnątrz komórki, który może być zlokalizowany w różnych jej kompartmentach. Substancje aktywne aby dotrzeć do celu molekularnego muszą pokonać szereg barier jakimi są przede wszystkim błony lipidowe. Znakomita większość leków przenika na drodze dyfuzji prostej zgodnie z gradientem stężeń i prawami Ficka. Cząsteczki leków, które przedostają się do wnętrza komórek na drodze dyfuzji prostej muszą posiadać określone właściwości fizyko-chemiczne: odpowiednia wielkość cząsteczki stopień jonizacji odpowiednia lipofilowość Tylko niezjonizowane małocząsteczkowe związki o średniej lipofilowości są w stanie zarówno swobodnie wejść do biwarstwy lipidowej (błony) jak i z niej wyjść. Cząsteczki posiadające ładunek nie będą w stanie wejść do błony, a z kolei cząsteczki silnie lipofilowe będą z łatwością akumulować się w błonie lipidowej ale nie będą w stanie przejść do bardziej hydrofobowego wnętrza (cytoplazmy). Dyfuzja ułatwiona zachodzi przy udziale nośnika (transportera) i jest również procesem biernym. Podobnie jak w dyfuzji prostej siłą napędową jest gradient stężeń pomiędzy środowiskiem a cytoplazmą komórki. W zależności od sposobu transportu możemy wyróżnić trzy rodzaje transporterów: 1

2 uniportery transportujące jeden rodzaj cząsteczek symportery transportujące więcej rodzajów cząsteczek (minimum dwa) w tym samym kierunku antyportery transportujące różne rodzaje cząsteczek (minimum dwa) w przeciwnych kierunkach Dzięki udziałowi nośnika w dyfuzji ułatwionej zapewniona jest wysoka specyficzność strukturalna transportowanych cząsteczek. Transport ten charakteryzuje się wysyceniem układu transportującego przy dużych stężeniach związku co prowadzi do wysycenia wszystkich miejsc wiązania po jednej stronie błony. Możliwe jest również modulowanie transportu ułatwionego przez stosowanie inhibitorów białek transportujących. Transport aktywny polega na przenoszeniu cząsteczek przez błonę komórkową wbrew gradientowi stężeń przy pomocy białek transportowych, tzw. pomp. Najważniejszą pompą transportu aktywnego jest ATPaza Na + /K + występująca praktycznie we wszystkich błonach komórkowych i pompa ATPaza H + /K +. Obie te pompy dzięki hydrolizie ATP (transport pierwotny) tworzą gradient jonów pomiędzy obłonionymi przestrzeniami, który to gradient jest siłą napędową w transporcie aktywnym wtórnym. Pompy transportu aktywnego mogą być kompetytywnie hamowane przez związki o zbliżonej budowie chemicznej do substratu, bądź też mogą być niekompetytywnie hamowane przez trucizny (np. produkty metabolizmu). Aminokwasy, cukry, rozpuszczalne w wodzie witaminy stanowią przykłady substancji transportowanych na drodze transportu czynnego. Szacuje się, że około 7% wszystkich ludzkich genów koduje białka transportowe. Dla transportu leków szczególnie istotny jest tzw. transport wektorowy rozumiany jako transport leków przez bariery (np. w wątrobie albo jelitach), które składają się ze spolaryzowanych komórek. Według aktualnej wiedzy za transport wektorowy leków odpowiedzialne są dwie rodziny białek: białka transportowe typu SLC (Solute-Carrier-Family) oraz transportery typu ABC ( ATP-Binding-Cassette Family). Białka transportowe typu SLC uczestniczą w transporcie licznych kationowych, anionowych i nienaładowanych substratów endogennych i ksenobiotyków. Obecnie odkryto około 350 różnych białek SLC, które podzielono na 47 rodzin ze względu na ich sekwencję aminokwasową. Transportery SLC mogą transportować swoje substraty zarówno do 2

3 wewnątrz, jak i na zewnątrz komórki. Transportery typu SLC przenoszą cząsteczki na drodze dyfuzji ułatwionej (zgodnie z gradientem stężeń uniportery) lub na drodze wtórnego transportu aktywnego (wbrew gradientowi stężeń substancji transportującej, ale z wykorzystaniem wcześniej wytworzonego gradientu jonów symportery, antyportery). Białka transportowe typu ABC wykorzystują energię z hydrolizy ATP, do transportu cząsteczek wbrew gradientowi stężeń przez błony wewnątrzkomórkowe lub na zewnątrz komórki. Obecnie znanych jest 51 białek transportowych, które podzielono na 7 rodzin (ABCA do ABCG). Wszystkie transportery tego typu mają jedną lub dwie sekwencje aminokwasowe wiążące i hydrolizujące ATP. Bardzo dobrze zbadanym przedstawicielem białek transportowych ABC jest P-glikoproteina (ABCB1; P-gp; P-170), którą odkryto podczas badań nad rozwojem oporności nowotworów na chemoterapeutyki. Białko to może wypompowywać chemoterapeutyki z wnętrza komórek nowotworowych, zmniejszając w ten sposób ich stężenie w miejscu docelowym. P-gp jest białkiem błonowym o masie cząsteczkowej 170 kd, kodowanym przez MDR1 (Multi-Drug-Resistance-Gen-1) i składającym się z dwóch części. Każda część posiada 6 domen transmembranowych i miejsce wiązania ATP, które dzięki hydrolizie ATP zapewnia energię potrzebną do transportu. P-gp często występuje w tych samych komórkach co enzym cytochromu P-450 CYP3A4. Poza tym większość substratów P-gp jest metabolizowana przez CYP3A4, zatem oba białka są częścią większego mechanizmu, który zapewnia transport rozpuszczalnego w wodzie metabolitu przez błonę na zewnątrz komórki. CZĘŚĆ PRAKTYCZNA Celem ćwiczenia jest porównanie akumulacji i kinetyki wyrzutu (wypompowywania) pochodnych akrydyny w komórkach ludzkiej białaczki promielocytarnej HL-60 oraz w wywodzących się z nich komórkach HL-60/VINC nadeksprymujących transporter ABCB2 (P-gp). Wykorzystując właściwości fluorescencyjne akrydyn przy pomocy mikroskopii fluorescencyjnej zobrazowana zostanie również wewnątrzkomórkowa dystrybucja leku. Materiały: komórki białaczki promielocytarnej HL-60 i komórki nadeksprymujące transporter ABCB2 HL-60/VINC lub inny układ komórkowy złożony z komórek typu dzikiego i komórek nadeksprymujących pompy typu ABC pożywka hodowlana z dodatkiem 10% FBS i antybiotyków 75% metanol 3

4 roztwór wyjściowy badanego leku Sprzęt: czytnik mikropłytek Asys UVM340 pipety automatyczne probówki typu falcon probówki typu Eppendorf rękawiczki jednorazowe statywy na probówki wortex szalki Petriego płytki 96-dołkowe wirówki WYKONANIE ĆWICZENIA 1. Na szalce Petriego do 10 ml hodowli komórek HL-60 lub HL-60/VINC (gęstość komórek 1 mln/ml) dodajemy wybrany związek, np. C-1311 pochodna imidazoakrydonu w stężeniu 10 µm i inkubujemy przez określony czas wg. schematu w tabeli poniżej: Linia komórkowa HL-60 lub HL-60/VINC Czas Czas post-inkubacji akumulacji 0 min - Dodanie związku - 6 próbek 5 min - 15 min - 45 min - Odpłukanie związku po 45 min inkubacji - 3 próbki - 5 min - 15 min - 45 min 2. Oznaczenia akumulacji: po określonym czasie inkubacji ze związkiem, próbki przenosimy do 15 ml probówek typu falcon i wirujemy przez 5 min przy 200 g w 4 C 4

5 supernatant odrzucamy, a pelet komórkowy (odnotować kolor peletu) zawieszamy w 500 µl 75% metanolu i intensywnie worteksujemy przez 2-3 minuty Przenosimy zawiesinę do 1,5 ml Eppendorfa i wirujemy przez 5 min przy g w 4 C supernatant przenosimy do nowych 1,5 ml Eppendorfów i zachowujemy a pelet odrzucamy (odnotować kolor peletu) 3. Oznaczenie stopnia wyrzutu (wypompowywania) leku z komórki: po 45 min inkubacji komórek ze związkiem, komórki przenosimy do 15 ml probówek typu falcon i wirujemy przez 5 min przy 200 g w 4 C pożywkę odrzucamy a osad komórkowy zawieszamy w 10 ml świeżej pożywki RPMI 1640 suplementowanej 10% bydlęcej surowicy płodowej i przenosimy na szalki Petriego komórki inkubujemy w 37 C i atmosferze 5% CO 2 przez czas zaznaczony w tabeli powyżej po określonym czasie inkubacji, próbki przenosimy do 15 ml probówek typu falcon i wirujemy przez 5 min przy 200 g w 4 C supernatant odrzucamy, a pelet komórkowy (odnotować kolor peletu) zawieszamy w 500 µl 75% metanolu i intensywnie worteksujemy przez 2-3 minuty przenosimy zawiesinę do 1,5 ml Eppendorfa i wirujemy przez 5 min przy g w 4 C supernatant przenosimy do nowych 1,5 ml Eppendorfów i zachowujemy a pelet odrzucamy (odnotować kolor peletu) 4. Przygotowanie krzywej wzorcowej i pomiar absorbancji krzywą wzorcową przygotowujemy w 1,5 ml Eppendorfach, poprzez rozcieńczenie 10 mm roztworu wyjściowego związku do końcowych stężeń: 100, 75, 50, 25 i 10 µm w 75% metanolu 5. Pomiar absorbancji zebrane próbki w punkcie 2 i 3 oraz rozcieńczenia krzywej wzorcowej przenosimy do studzienek płytki 96-dołkowej w ilości 200 µl na studzienkę dla każdej z próbek wykorzystujemy 2 studzienki pomiaru absorbancji dokonujemy używając czytnika płytek przy długości fali równej maksimum absorbancji związku (dla związku C-1311 maksimum absorbancji wynosi 380 nm) 6. Wewnątrzkomórkowa dystrybucja związku 5

6 przygotowane przez prowadzącego preparaty komórki inkubowane ze związkiem i wybarwione fluorochromami specyficznie barwiącymi DNA i na przykład lizosomy, obserwujemy z użyciem odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w komorę środowiskową zdjęcia wykonujemy przy różnej długości fali światła wzbudzającego, odnotowując jakie struktury przy danym wzbudzeniu są widoczne PRZYGOTOWANIE SPRAWOZDANIA 1. Wykreślić krzywą wzorcową Abs=f(C mol ). 2. Na podstawie krzywej wzorcowej obliczyć stężenie w µm w zebranych próbkach. 3. Sporządzić wykres przedstawiający kinetykę akumulacji i wyrzucania związku z komórek C mol =f(t). 4. Wiedząc, że w jednej próbce było 10 mln komórek i całość związku po zawieszeniu w 500 µl 75% metanolu przeszła z komórek do metanolu, oblicz ilość związku w nanomolach przypadającą na jedną komórkę. Mediana rozkładu średnicy komórek dla HL-60 wynosi 12 µm, zaś masa cząsteczkowa związku C-1311 wynosi 423 g/mol. 5. Posiłkując się wykonanymi zdjęciami opisz w jakich kompartmentach komórki gromadzi się badany związek. LITERATURA 1. Mutschler E., Geisslinger G., Kroemer H. K., Menzel S., Ruth P. Farmakologia i toksykologia ; Redakcja naukowa: Droździk M., Kocić I., Pawlak D.; MedPharm; ISBN: ; Wrocław; Marquardt D., McCrone S., Center MS. Mechanisms of multidrug resistance in HL60 cells: detection of resistance-associated proteins with antibodies against synthetic peptides that correspond to the deduced sequence of P-glycoprotein. Cancer Research, 50(5), ,