Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej Katedra Technologii Leków i Biochemii. Biologia komórki nowotworowej: Ćwiczenie E

Transkrypt

1 Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej Katedra Technologii Leków i Biochemii WSTĘP Biologia komórki nowotworowej: Ćwiczenie E Autofagia w komórkach nowotworowych obserwacje mikroskopowe obecności tzw. kwaśnych organelli pęcherzykowych (AVOs) po działaniu związków przeciwnowotworowych Autofagia jest ewolucyjnie konserwatywnym i bardzo starym procesem, wspólnym dla wszystkich komórek organizmów eukariotycznych, zarówno jednokomórkowych drożdży, jak i wielokomórkowych ssaków. Ten kataboliczny proces znany jest przede wszystkim jako wewnątrzkomórkowy system degradacji wielkocząsteczkowych składników cytoplazmy, szczególnie białek o długim okresie półtrwania, oraz całych organelli [1]. W przypadku, gdy strawieniu ulega część cytoplazmy wraz z jej składnikami, w celu zachowania równowagi w jej wielkości i składzie, wówczas możemy określić autofagię mianem nieselektywnej. O autofagii selektywnej (specyficznej) mówimy natomiast wtedy, gdy dochodzi do degradacji ściśle określonych struktur, takich jak: agregaty białek agrefagia (ang. aggrephagy), mitochondria mitofagia (ang. mitophagy), retikulum endoplazmatyczne retikulofagia (ang. reticulophagy), rybosomy rybofagia (ang. ribophagy), peroksysomy peksofagia (ang. pexophagy) oraz bakterii i wirusów ksenofagia (ang. xenophagy) [2]. Rola autofagii: 1. Autofagia jest mechanizmem adaptacyjnym w przypadku głodzenia. 2. Autofagia umożliwia zachowanie homeostazy wewnątrzkomórkowej poprzez usuwanie zbędnych lub uszkodzonych organelli. 3. Bierze udział w procesach swoistych tkankowo, np. proces dojrzewania erytrocytów, biosynteza neuromelaniny, wewnątrzkomórkowa biogeneza surfaktantu na powierzchni pneumocytów. 4. Chroni organizm przed namnożeniem wielu bakterii i wirusów. Czynniki wywołujące autofagię: 1. Deficyt aminokwasów czy innych składników odżywczych. 2. Akumulacja uszkodzonych organelli. 3. Agregacja nieprawidłowo pofałdowanych białek. 4. Hipoksja. 5. Aktywacja onkogenów (np. Ras). 6. Uszkodzenie DNA. 7. Cytokiny, hormony. 1

2 Rodzaje autofagii: Na podstawie różnych mechanizmów dostarczania do lizosomów ładunku komórkowego przeznaczonego do degradacji, wyróżnia się 3 główne typy autofagii: 1. Makroautofagię 2. Mikroautofagię 3. Autofagię zachodzącą za pośrednictwem białek opiekuńczych (ang. CMA chaperone-mediated autophagy) Mikroautofagia. Fragmenty cytoplazmy wraz z zawartymi w niej rozpuszczalnymi białkami lub organellami, zostają bezpośrednio otoczone przez błonę lizosomalną i wnikają do lizosomów na zasadzie endocytozy. Mikroautofagia. Autofagia zależna od białek opiekuńczych - czaperonów. Proces selektywnego trawienia białek posiadających określoną sekwencję aminokwasową KFERQ (lizyna, fenyloalanina, glutaminian, arginina, glutamina). Czaperon (hsc73, należący do rodziny hsc70) rozpoznaje tą sekwencję, łączy się z receptorem Lamp2a w błonie lizosomu i substrat dostaje się do wnętrza lizosomu gdzie ulega hydrolizie. Autofagia zależna od białek opiekuńczych. 2

3 Makroautofagia. Składniki cytoplazmy, które mają ulec degradacji zostają otoczone błoną, tworząc autofagosomy o średnicy 1 m. Ulegają one następnie fuzji z lizosomami, tworząc autofagolizosomy, w których zachodzi ostateczny proces niszczenia ich zawartości przy użyciu hydrolaz lizosomalnych. Makroautofagia. Metody detekcji autofagii. Charakterystyczną cechą autofagii jest tworzenie w komórce struktur zwanych autofagolizosomami, które zalicza się do kwaśnych organelli pęcherzykowych (ang. acidic vesicular organelles, AVO). Obserwację tych struktur można prowadzić w oparciu o wybarwienie ich oranżem akrydyny (ang. acridine orange, AO). Oranż akrydyny jest metachromatycznym fluorochromem, ktory w formie nie obdarzonej ładunkiem przenika przez błony. Metachromatyczna właściwość tego związku polega na tym, że w zależności od stężenia, i co za tym idzie stopnia polimeryzacji, barwnik ten może wystepować w dwóch formach: jako monomer lub dimer. Forma monomeru posiada max. absorbancji przy długości fali 494 nm i emituje zieloną fluorescencję o max. 530 nm. W formie dimeru AO wykazuje max. absorbancji przy długości fali 465 nm i emituje pomarańczową fluoerescencję. Preferencyjne gromadzenie się oranżu akrydyny w AVO jest konsekwencją istnienia niskego ph we wnętrzu tych struktur. Oranż akrydyny, jako słaba zasada, po wniknięciu do kwaśnych organelli, ulega protonacji i tworząc agregaty wybarwia struktury AVO na kolor pomarańczowy. Obserwując pod mikroskopem komórki żywe wybarwione oranżem akrydyny 3

4 widzi się charakterystyczne skupiska pomarańczowo wybarwionych kwaśnych organelli na tle zielonej cytoplazmy. Przyrost tych struktur w komórce po wpływem działania chemoterapeutyku świadczy o indukcji autofagii. CZĘŚĆ PRKTYCZNA Celem ćwiczenia jest obserwacja mikroskopowa kwaśnych organelli pęcherzykowych (AVOs) świadczących o indukcji autofagii przez wybrany chemoterapeutyk w komórkach nowotworowych. Materiały: Sprzęt: płytki Petriego 100 mm, szkiełka podstawowe i nakrywkowe, komórki dowolnej linii nowotworowej rosnącej w postaci monowarstwy, pożywka hodowlana z dodatkiem 10% FBS i antybiotyków, trypsyna, wyjściowy roztwór badanego związku, PBS ph = 7,2, oranż akrydyny (stock 1 mg/ml). inkubator CO 2, licznik komórek Coulter, mikroskop fluorescencyjny, cytowirówka, pipety automatyczne, rękawiczki jednorazowe. WYKONANIE ĆWICZENIA 1. Komórki będące w logarytmicznej fazie wzrostu zaszczepić na 10 mm płytki Petriego w ilości 0.5 mln na 10 ml pożywki, a następnie inkubować w atmosferze 5% CO 2 w temperaturze 37 o C przez 24 godziny, celem przyklejenia się komórek do podłoża. przygotowuje Prowadzący 2. Po 24 godzinnej preinkubacji dodać badany związek, a następnie inkubować określoną długość czasu (stężenie i czas ekspozycji danego związku określa Prowadzący ćwiczenie). wykonuje Prowadzący 4

5 WYKONUJĄ STUDENCI: 3. Po zakończonej inkubacji komórek z badanym związkiem do każdej z płytek dodać 10 µl oranżu akrydyny (stężenie końcowe 1 µg/ml) i barwić przez 15 minut w ciemności, w inkubatorze CO Po zakończeniu barwienia zawartość płytki przenieść do probówki typu falcon, a następnie komórki odkleić za pomocą 1.5 ml trypsyny na płytkę (3-5 minut inkubacji w 37 o C). Po odklejeniu komórek dodać je do tej samej probówki typu falcon. 5. Komórki wirować przez 5 minut przy 1000 obr./min. w temperaturze 4 o C. Następnie przepłukać dwukrotnie 5 ml PBS-u i wirować w takich samych warunkach. 6. Odessać supernatant pod próżnią, zawiesić w 2 ml PBS-u i dokładnie rozpipetować. 7. Pobrać 200 µl zawiesiny komórkowej i nawirować na szkiełko podstawowe za pomocą cytowirówki (600 obr./min, 4 min. temperatura pokojowa). 8. Dodać kroplę PBS-u na nawirowane komórki na szkiełku podstawowym, przykryć szkiełkiem nakrywkowym i oglądać w mikroskopie fluorescencyjnym Olympus BX60 przy długości fali 460 nm, fotografując przy powiększeniu 200x i 400x. Zdjęcia wykonane zostaną przy pomocy oprogramowania Studio Lite. PRZYGOTOWANIE SPRAWOZDANIA 1. Podać cel i opisać przebieg ćwiczenia wraz z wyjaśnieniem zasad postępowania. 2. Na podstawie otrzymanych zdjęć preparatów mikroskopowych wyjaśnić czy badany związek indukował autofagię w komórkach nowotworowych. Porównać zdjęcia komórek traktowanych i nietraktowanych (kontrolnych) badanym związkiem. LITERATURA 1. Lamparska-Przybysz M, Motyl T. Autofagia - narzędzie przeżycia czy śmierci komórki nowotworowej? Postępy Biologii Komórki, 32(1), 13-22, Liang C, Jung JU. Autophagy genes as tumor suppressors. Current Opinion in Cell Biology, 22(2), ,