Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej Katedra Technologii Leków i Biochemii. Biologia komórki nowotworowej: Ćwiczenie B

Transkrypt

1 Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej Katedra Technologii Leków i Biochemii Biologia komórki nowotworowej: Ćwiczenie B Badanie zmian w budowie błony cytoplazmatycznej komórek wybranych linii nowotworowych po traktowaniu związkami przeciwnowotworowymi WSTĘP Apoptoza, z grec. apoptosis (opadanie liści) nazywana programowaną śmiercią komórki, jest procesem fizjologicznym warunkującym prawidłowe funkcjonowanie organizmu, zarówno na etapie embrionalnym, jak i w późniejszym okresie. Proces apoptozy przebiega zawsze według określonego schematu. Pierwszym morfologicznym objawem są zmiany na poziomie jądra. Chromatyna ulega kondensacji i umiejscowieniu tuż pod błoną komórkową, następnie dochodzi do obkurczenia całego jądra oraz jego fragmentacji. Kolejny etap apoptozy to kondensacja cytoplazmy oraz tworzenie charakterystycznych pęcherzyków na powierzchni komórki. Z uwypukleń błony komórkowej tworzą się ciałka apoptotyczne, które są strukturami zawierającymi chromatynę, cytoplazmę oraz organelle komórkowe. Ostatnim etapem apoptozy jest fagocytoza powstałych ciałek. Apoptoza jest procesem czynnym, wymagającym aktywacji wielu genów oraz nakładu energii. W zależności od rodzaju komórki oraz czynnika indukującego, proces ten może przebiegać w rożny sposób, angażując odmienne organelle komórkowe. Dwie najlepiej poznane ścieżki apoptozy to szlak zewnętrzny (receptorowy), związany z błoną komórkową oraz wewnętrzny przebiegający z udziałem mitochondrium [1]. Rysunek 1. Główne szlaki w apoptozie [2]. 1

2 W odróżnieniu od apoptozy, nekroza jest procesem biernym i patologicznym. Ten rodzaj śmierci zachodzi pod wpływem zarówno czynników fizycznych, chemicznych jak i biologicznych, m.in. wywoływany jest przez niską i wysoką temperaturę, promieniowanie UV, a także toksyny bakteryjne. Nekroza dotyczy grupy komórek, które pęcznieją i tracą ciągłość błony komórkowej. Destrukcji ulegają organella komórkowe, m.in. mitochondria, reticulum endoplazmatyczne, jądro komórkowe oraz lizosomy. W wyniku zaburzeń w strukturze błony komórkowej dochodzi do biernego napływu wody i jonów (głównie wapnia i sodu) do wnętrza komórki. Napęczniała coraz bardziej komórka i jej organella ulegają rozpadowi, a cała zawartość jest uwalniana do przestrzeni międzykomórkowej. Rozlane składniki komórkowe wywołują odczyn zapalny, którego brak w przypadku apoptozy. Tabela 1. Charakterystyczne cechy apoptozy i nekrozy [3]. Zmiany w asymetrii i integralności błony cytoplazmatycznej komórek ulegających apoptozie. Podczas apoptotycznej śmierci komórek błona plazmatyczna zachowuje integralność, pomimo iż zachodzą w niej liczne zmiany zarówno właściwości strukturalnych jak i funkcjonalnych. W błonie plazmatycznej w procesie apoptozy obserwowana jest eksternalizacja fosfatydyloseryny (PS). Translokacja PS z monowarstwy wewnętrznej błony do zewnętrznej monowarstwy wywołana jest wzrostem aktywności skramblazy aktywowanej przez jony Ca 2+ oraz spadkiem aktywności translokazy aminofosfolipidów [4]. Rysunek 2. Udział translokazy aminofosfolipidowej w regulacji położenia fosfatydyloseryny w błonie [5]. 2

3 W późniejszej fazie apoptozy oraz nekrozie dochodzi do utraty integralności błony cytoplazmatycznej. Stosując jodek propidyny lub 7-amino-aktynomycynę D (7-AAD), które mają zdolność do przenikania przez uszkodzone błony komórkowe, które utraciły integralność, można odróżnić komórki późnoapoptotyczne i nekrotyczne od komórek wczesnoapoptotycznych, w których zachowana jest integralność błony cytoplazmatycznej. Aneksyna V jest białkiem wykazującym wysokie powinowactwo do fosfatydyloseryny na powierzchni komórek apoptotycznych. Poprzez znakowanie fluoresceiną umożliwia ona, po zastosowaniu odpowiedniej wiązki lasera, detekcję komórek umierających na drodze apoptozy. Rysunek 3. Przykładowy cytogram, oznaczenia: A-/PI- komórki żywe; A+/PI- komórki wczesnoapoptotyczne; A+/PI+ komórki późnoapoptotyczne i nekrotyczne; A-/PI+ komórki wtórnie nekrotyczne [na podstawie badań własnych]. CZĘŚĆ PRAKTYCZNA Celem ćwiczenia jest zbadanie zmian w budowie błony cytoplazmatycznej komórek, poddanych ekspozycji na chemoterapeutyk, w oparciu o podwójne barwienie komórek aneksyną V znakowaną fluoresceiną oraz 7-AAD (7-amino-aktynomycyna D). Materiały: komórki dowolnej linii nowotworowej rosnącej w postaci zawiesiny lub monowarstwy traktowane chemoterapeutykiem PBS 1 mm EDTA w PBS (tylko w przypadku hodowli adherentnej) 3

4 Annexin V Apoptosis Detection Kit (BD Bioscences) pożywka hodowlana z dodatkiem 10% FBS i antybiotyków 0.05% trypsyna w HBSS (tylko w przypadku hodowli adherentnej) woda dejonizowana Sprzęt: cytometr przepływowy Guava easycyte 8 (Millipore) pipety automatyczne probówki typu falcon probówki cytometryczne rękawiczki jednorazowe statywy na probówki cytometryczne i typu falcon wortex pompka wodna wirówka WYKONANIE ĆWICZENIA Przygotowanie komórek (wykonuje prowadzący) Komórki wybranej linii komórkowej w fazie logarytmicznego wzrostu zaszczepić na płytki Petriego o średnicy 60 mm. Traktować wybranym chemoterapeutykiem przez 3, 6, 24 i 48 godzin. Analiza zmian w budowie błony cytoplazmatycznej komórek pod wpływem związku przeciwnowotworowego (wykonują studenci) 1. W przypadku hodowli zawiesinowej przejść do punktu 4. W przypadku hodowli adherentnej zebrać pożywkę znad monowarstwy (zawierającą komórki martwe, mitotyczne i apoptotyczne) do probówki typu falcon. 2. Przemyć komórki na szalce Petriego 3 ml roztworu EDTA w PBS. Odessać i przenieść do probówki typu falcon. 3. Dodać 1 ml roztworu trypsyny w celu odklejenia komórek od podłoża. Odessać i przenieść do probówki typu falcon. 4. Inkubować płytkę w 37 C przez 5 min. Spłukać komórki z naczynia pożywką hodowlaną, rozpipetować i przenieść do probówki typu falcon. 5. Wirować próbki przez 5 min przy 250g w temperaturze pokojowej. 4

5 6. W przypadku hodowli zawiesinowej przejść do punktu 7. W przypadku hodowli adherentnej przepłukać 5 ml zimnego PBS, wirując 5 min przy 250g w temperaturze 4 C. 7. Zawiesić pellet w 5 ml zimnego PBS. Przenieść 500 μl zawiesiny do probówki cytometrycznej i zliczyć za pomocą cytometru przepływowego. 8. Przenieść 500 tys. komórek do świeżej probówki typu falcon. Wirować przez 5 min przy 250g w temperaturze 4 C. 9. Zawiesić pellet w 500 μl buforu wiążącego. Przenieść 100 μl zawiesiny do świeżej probówki cytometrycznej. 10. Dodać po 2.5 μl roztworów Aneksyny V-FITC oraz 7-AAD. Delikatnie wymieszać na worteksie. Inkubować 15 min w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. 11. Dodać 400 μl buforu wiążącego. Zanalizować za pomocą cytometru przepływowego, zliczając sygnał z zdarzeń w dwóch kanałach: Green (525/30 nm) dla Aneksyny V-FITC oraz Red (695/50 nm) dla 7-AAD, wzbudzając laserem Blue (488 nm). PRZYGOTOWANIE SPRAWOZDANIA 1. Podać cel i opisać w sposób zwięzły przebieg ćwiczenia wraz z wyjaśnieniem zasad postępowania. 2. Na podstawie otrzymanych cytogramów określić rodzaje śmierci komórkowej indukowane przez badany chemoterapeutyk w komórkach badanej linii. 3. Na podstawie statystycznej analizy wyników, przedstawić graficznie procentowy udział komórek w populacjach zróżnicowanych pod względem zmian w strukturze błony cytoplazmatycznej. LITERATURA 1. A. Stępień, M. Izdebska, A. Grzanka. Rodzaje śmierci komórki. Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej, 61, , R. Paduch, M. Klatka, J. Klatka. Rodzaje śmierci komórki. Pomeranian Journal of Life Science, 61(4), , Z. Jóźwiak, A. Marczak. Rola kanałów jonowych w procesie apoptozy. Postępy Biochemii, 52(4), , A. Marczak, Z. Jóźwiak. Zaburzenia asymetrycznego rozmieszczenia fosfatydyloseryny w błonie komórkowej - najnowsze teorie. Postępy Biologii Komórki, 34(2), ,