BIOLOGIA KOMÓRKI. Podstawy mikroskopii fluorescencyjnej -1 Barwienia przyżyciowe organelli komórkowych

Transkrypt

1 BIOLOGIA KOMÓRKI Podstawy mikroskopii fluorescencyjnej -1 Barwienia przyżyciowe organelli komórkowych

2 Wstęp Komórka eukariotyczna posiada zdolność przeprowadzenia bardzo dużej liczby procesów biochemicznych w tym samym czasie. Jest to przede wszystkim warunkowane jej wewnętrznym podziałem (kompartmentalizacją) za pomocą systemu błon biologicznych na różnorodne obszary, które dzięki temu są w stanie spełniać swoje główne funkcje. Formujące się w ten sposób organelle komórkowe charakteryzują się nie tylko zróżnicowaną budową i funkcją, ale przede wszystkim odmiennym składem białkowym warunkowanym przez selektywne rozmieszczanie powstających w komórce białek. Błony biologiczne stanowią selektywnie przepuszczalną barierę dla białek oraz kwasów nukleinowych, dzięki czemu w obrębie organelli mogą rezydować charakterystyczne dla niej makrocząsteczki warunkujące ich wyspecjalizowaną funkcję. W typowej komórce eukariotycznej organelle błoniaste zajmują około połowy jej objętości, możemy wyróżnić takie przedziały jak siateczka śródplazmatyczna gładka (SER), szorstka (RER), aparat Golgiego, endosomy oraz lizosomy, które razem tworzą szlak wydzielniczy komórki, mitochondria, plastydy (komórka roślinna), cytozol, peroksysomy oraz jądro komórkowe (Tabela 1). PRZEDZIAŁ Cytozol Jądro komórkowe Retikulum endoplazmatyczne gładkie Retikulum endoplazmatyczne szorstkie Aparat Golgiego Endosomy Lizosomy Mitochondria Chloroplasty Peroksomy Tabela 1. Funkcje przedziałów błonowych komórki eukariotycznej. FUNKCJA Miejsce licznych reakcji biochemicznych oraz syntezy białek Miejsce genomu oraz syntezy RNA i DNA Synteza lipidów błon biologicznych Synteza białek (integralnych błon, wydzielanych oraz przeznaczonych do innych organelli szlaku wydzielniczego) Potranslacyjna modyfikacja białek oraz ich sortowanie Segregacja materiału pobranego przez komórkę na drodze endocytozy Degradacja wewnątrzkomórkowa Fosforylacja oksydacyjna, synteza ATP Miejsce fotosyntezy, synteza ATP Oksydacyjny rozkład lipidów oraz toksycznych cząsteczek Zastosowanie klasycznego mikroskopu świetlnego ze względu na jego małą zdolność rozdzielczą (0,2μm) ogranicza możliwość dokładnej obserwacji struktur wewnątrzkomórkowych, dlatego też w tego typu badaniach bardzo często wykorzystuje się mikroskopię elektronową, której zdolność rozdzielcza na poziomie 0,2 nm niesie ze sobą znacznie większe możliwości poznania ultrastruktury organelli komórkowych. Z jednej strony zastosowanie odpowiedniego kontrastowania związkami metali ciężkich umożliwia uwidocznienie w mikroskopie elektronowy struktur komórki, które w zróżnicowany sposób zatrzymują elektrony, z drugiej strony jest to jednak metoda wymagająca specjalistycznego i drogiego sprzętu a przede wszystkim materiału utrwalonego. Alternatywą dla tej złożonej techniki pozostają reakcje immunocytochemiczne, bazujące na swoistej reakcji antygen- 2

3 przeciwciało, których cechą charakterystyczną jest wysoka czułość umożliwiająca detekcję sygnału poniżej zdolności rozdzielczej klasycznego mikroskopu świetlnego. Wykorzystanie różnorakich fluorochromów sprzężonych z przeciwciałami umożliwia zastosowanie w tego typu badaniach mikroskopii fluorescencyjnej, jednakże takie analizy możliwe są zazwyczaj po utrwaleniu badanych komórek i ich dość złożonej obróbce. W ostatnich latach uzyskano szereg fluorochromów, które z jednej strony wiążą się specyficznie do błon określonych organelli komórkowych, co pozwala na określenie ich ewentualnego położenia w komórce, z drugiej zaś nadają się do barwień przyżyciowych. Wśród nich wyróżnić można barwniki wiążące się do błon aparatu Golgiego (Bodipy- Ceramide), mitochondriów (Miyo-Tracker, Rodamina 123), gładkiej siateczki śródplazmatycznej (ER-Tracker) czy lizosomów (Lyso-Tracker). Barwnik DiOC 6 (3,3 - heksylokarbocyjanian jodowy) jest używany do barwienia wewnętrznych błon w komórce np. do wizualizacji siateczki śródplazmatycznej. DiIC 18 (1,1 -dioctadecyl-3,3,3 3 - tetrametylindokarbocyjanian perchloru) wiąże się natomiast z błoną komórkową, po pięciominutowej inkubacji z tym barwnikiem fluorescencję wykazują wyłącznie błony komórkowe barwionych komórek, jednak po kilkugodzinnej inkubacji zabarwione zostają również endosomy. Rodamina 123 jako silnie kationowy barwnik posiada zdolność przyłączania się do ujemnie naładowanych przedziałów komórki takich jak wewnętrzna błona mitochondriów, dzięki czemu pozwala na lokalizację tych organelli w komórce oraz śledzenie zmian w ich właściwościach, w tym potencjale transmembranowym. Do wizualizacji DNA w hodowanych komórkach stosuje się barwniki zdolne do penetracji błon komórkowych i wiążące się bezpośrednio z DNA: Hoechst bisbenzymid, a także DAPI (4,6- diamidinodihydrochloran-2-fenylindonu). Natomiast jodek propidyny barwi kwasy nukleinowe, a barwienie jedynie struktur bogatych w DNA lub RNA można uzyskać stosując trawienie RNazą lub DNazą Cel ćwiczenia: Ćwiczenie ma na celu praktyczne zapoznanie się z budową i funkcjonowaniem mikroskopu fluorescencyjnego oraz z wykorzystaniem przyżyciowych technik wizualizacji organelli komórki. Materiały: Hodowle ludzkich prawidłowych fibroblastów skóry na szkiełkach w szalkach Petriego Pożywka do hodowli ludzkich fibroblastów: Modified Eagle Medium (MEM) z dodatkiem oraz antybiotyków (100 i.u./ml peniciliny, 10 μg/ml neomycyny, 10 μg/ml streptomycyny) Zbuforowany roztwór soli fizjologicznej (PBS) z jonami wapnia i magnezu Barwniki przyżyciowe: DiIC 18 (0,9 mm) DiOC 6 (0,25 mg/ml) Hoechst (0,1 mg/ml) Wykonanie ćwiczenia: 1. Grupę podzielić na dwuosobowe zespoły, każda osoba z zespołu wykorzystuje barwnik Hoechst oraz inny barwnik przyżyciowy 2. Przygotować mikroskop do pracy w jasnym polu oraz kontraście faz 3

4 3. Wybrać do doświadczenia po jednej szalce z komórkami wysianymi na szkiełkach, komórki oglądnąć w mikroskopie odwróconym Barwienie przyżyciowe błony komórkowej barwnikiem DiIC 18 oraz jąder komórkowych barwnikiem Hoechst Przygotować 1ml roztworu barwnika DiIC 18 o stężeniu 9μM w pożywce hodowlanej Zlać płyn hodowlany z szalki, komórki przepłukać 1 ml ciepłego PBS a następnie zalać 1 ml przygotowanego roztworu barwnika Szalki inkubować przez 20 min w cieplarce w 37 o C Po zadanym czasie do roztworu barwnika w szalce z komórkami dodać barwnik Hoechst w takiej objętości aby jego stężenie w płynie hodowlanym wyniosło 1 μg/ml, dokładnie rozpipetować i szalkę ponownie umieścić w cieplarce na 10 min Po zakończonej inkubacji szkiełka z komórkami 3x delikatnie przepłukać ciepłym PBS Wyczyścić szkiełko podstawowe i nakropić na nie 20 μl PBS, na kroplę nałożyć Preparaty oglądać w mikroskopie kontrastowo-fazowym, a następnie przełączyć mikroskop do pracy w epi-fluorescencji ( zmienić obiektywy, włączyć lampę rtęciową Oglądnąć preparat przy wzbudzeniu UV oraz światłem zielonym. Porównać obrazy komórek w kontraście-faz i w epi-fluorescencji. Barwienie przyżyciowe siateczki śródplazmatycznej barwnikiem DiOC 6 oraz jąder komórkowych barwnikiem Hoechst Przygotować 1 ml roztworu barwników DiOC 6 w stężeniu 2,5 μg/ml oraz Hoechst w stężeniu 1 μg/ml w ciepłej pożywce hodowlanej 2. Usunąć pożywkę hodowlaną z szalki, komórki przepłukać 1 ml ciepłego PBS, po czym natychmiast zalać 1ml ciepłego roztworu barwników 3. Szalki z komórkami inkubować przez 10 min w cieplarce w 37 o C 4. Po zakończonej inkubacji szkiełko z komórkami przepłukać delikatnie 3x ciepłym PBS 5. Wyczyścić szkiełko podstawowe i nakropić na nie 20 μl PBS, na kroplę nałożyć 6. Preparaty oglądać w mikroskopie kontrastowo-fazowym, a następnie przełączyć mikroskop do pracy w epi-fluorescencji (zmienić obiektywy, włączyć lampę rtęciową Oglądnąć preparat przy wzbudzeniu UV oraz światłem niebieskim. Porównać obrazy komórek w kontraście-faz i w epi-fluorescencji. Barwienie przyżyciowe mitochondriów Rodaminą 123 oraz jąder komórkowych barwnikiem Hoechst Przygotować 1 ml roztworu Rodaminy 123 o stężeniu 1μg/ml w pożywce hodowlanej 2. Zlać płyn hodowlany z szalki, następnie komórki na szkiełkach przepłukać 1 ml ciepłego PBS, po czym zalać 1 ml przygotowanego roztworu Rodaminy Szalkę inkubować przez 50 min w cieplarce w 37 o C 4

5 4. Po zadanym czasie do roztworu barwnika w szalce z komórkami dodać barwnika Hoechst w takiej ilości, aby jego stężenie w medium wyniosło 1 μg/ml, dokładnie rozpipetować i szalkę ponownie umieścić w cieplarce na 10 min 5. Po zakończonej inkubacji komórki na szkiełkach przepłukać 3x ciepłym PBS 6. Wyczyścić szkiełko podstawowe i nakropić na nie 20 μl PBS, na kroplę nałożyć 7. Preparaty oglądać w mikroskopie kontrastowo-fazowym, a następnie przełączyć mikroskop do pracy w epi-fluorescencji (zmienić obiektywy, włączyć lampę rtęciową Oglądnąć preparat przy wzbudzeniu UV oraz światłem zielonym. Porównać obrazy komórek w kontraście-faz i w epi-fluorescencji. 8. Oglądnąć preparaty przygotowane przez kolegów z zespołu i porównać je między sobą. Zakres materiału, jaki należy przygotować do ćwiczeń: Budowa i zasada działania mikroskopu fluorescencyjnego Barwniki fluorescencyjne stosowane w biologii komórki Zastosowanie fluorescencji w biologii komórki i diagnostyce klinicznej Budowa i funkcje podstawowych organelli wewnątrzkomórkowych Metody wizualizacji w komórce poszczególnych organelli Zalecana literatura: B. Alberts i in.: Podstawy biologii komórki, PWN 2005, część druga, rozdział 15 Red. J. Kawiak, M. Zabel: Seminaria z cytofizjologii, Wrocław 2002, rozdział 8 M. Pluta: Mikroskopia optyczna. Mikroskopia fluorescencyjna, rozdział 9 str