(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/CA03/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia

Transkrypt

1 PL B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/CA03/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia (13) B1 (51) Int.Cl. C07K 14/47 ( ) C07K 14/00 ( ) A61K 39/00 ( ) A61K 38/00 ( ) A61P 25/28 ( ) (54) Peptyd, kompozycja peptydowa, kompozycja immunogenna, zastosowania kompozycji immunogennej oraz sposób określania czy związek stanowi inhibitor odkładania się i tworzenia włókienek amyloidu (30) Pierwszeństwo: , US, 60/373,914 (73) Uprawniony z patentu: THE GOVERNING COUNCIL OF THE UNIVERSITY OF TORONTO, Toronto, CA (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 17/05 (72) Twórca(y) wynalazku: PETER ST.GEORGE-HYSLOP, Toronto, CA JOANNE MCLAURIN, Toronto, CA (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 10/11 (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Marta Kawczyńska

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest peptyd pochodzący z polipeptydu beta-amyloidu, kompozycja peptydowa zawierająca mieszaninę takich peptydów, kompozycja immunogenna do indukowania wytwarzania przeciwciał specyficznie wiążących się z peptydem beta-amyloidu, zastosowania kompozycji immunogennej oraz sposób określania czy związek stanowi inhibitor odkładania się i tworzenia włókienek amyloidu Tło wynalazku Dziedzina wynalazku Niniejszy wynalazek dotyczy immunologicznych sposobów i kompozycji do leczenia choroby Alzheimera. Wynalazek niniejszy dotyczy ponadto sposobów identyfikacji związków, które hamują tworzenie płytek amyloidowych i/lub eliminują występujące płytki amyloidowe związane z chorobą Alzheimera i innymi chorobami neurodegeneracyjnymi. Stan techniki Choroba Alzheimera ( AD") jest neurodegeneracyjną chorobą mózgu stanowiącą główną przyczynę demencji wśród osób starszych. Objawy AD mogą obejmować postępującą utratę funkcji poznawczych i pamięci, zmiany osobowości, zmiany neuromięśniowe, ataki i sporadycznie zachowanie psychotyczne. Chorobę Alzheimera charakteryzuje się przez dwie odmienne zmiany neuropatologiczne: odkładanie się płytek amyloidowych w obszarach mózgu, które są krytyczne dla pamięci i innych funkcji poznawczych; oraz rozwój splątków neurofibrylarnych w komórkach nerwowych. Uważa się, że odkładanie się płytek amyloidowych, w tych krytycznych obszarach mózgu, zaburza funkcjonowanie mózgu. Podobnie, sugerowano, że splątki neurofibrylarne, które nagromadzają się w komórkach nerwowych pacjenta z AD, zaburzają komunikację między neuronami. Dalszą cechą charakterystyczną choroby Alzheimera jest obecność hydrofobowego peptydu beta amyloidu (Abeta 42 ) jako głównego składnika płytek amyloidowych. Peptyd beta amyloidu (Abeta 42 ) stanowi fragment utworzony w trakcie obróbki proteolitycznej prawidłowego integralnego białka błonowego, znanego jako prekursor białka amyloidu (ang. amyloid protein precursor, APP), lub znanego alternatywnie jako białko amyloidu A4 choroby Alzheimera. Peptydy beta amyloidu (Abeta) obejmują grupę peptydów o długości aminokwasów, które powstają w wyniku obróbki APP. Patrz Pallitto i wsp.. Biochemistry 38: (1999). Pepetydy Abeta generalnie zawierają od 11 do 15 reszt regionu przezbłonowego APP i w związku z tym zawierają region hydrofobowy, chociaż cały peptyd Abeta może mieć charakter amfifilowy. Patrz Kang i wsp., Nature: 325: (1987). Wykazano, że peptydy Abeta są toksyczne w stosunku do komórek w hodowli komórkowej. Patrz Pike i wsp., Eur. J. Pharmacol. 207: (1991); Iversen i wsp., Biochem. J. 311: 1-16 (1995). Uważa się, że toksyczność peptydów Abeta w chorobie Alzheimera jest związana z procesem agregacji rozpuszczalnych peptydów Abeta w nierozpuszczalne włókienka i następnie inkorporację włókienek w płytki amyloidowe. Patrz Pike i wsp., Eur. J. Pharmacol. 207: (1991); Pike i wsp., Brain Research, 563: (1991); i Pike i wsp., J. Neurosci. 13: (1993). Podobnie, peptydy Abeta będą tworzyły włókienka in vitro i process ten może być wykorzystywany do mierzenia hamowania agregacji Abeta oraz tworzenia włókienek. Poprzednio, kilka zespołów stosowało modele myszy transgenicznych dla choroby Alzheimera, w których myszy transgeniczne wykazujące zarówno odkładanie się amyloidu w mózgu, jak i zaburzenia poznawcze, były immunizowane preparatami antygenu Abeta 42. Wyniki tych badań wykazały, że immunizacja Abeta 42 może powodować zmniejszenie się zarówno neuropatologii podobnych do choroby Alzheimera, jak i zaburzeń pamięci przestrzennej u myszy. Patrz Schenk i wsp., Nature 400: (1999); Bard i wsp., Nature Medicine 6: (2000); Janus i wsp., Nature 408: (2000) i Morgan i wsp., Nature 408: (2000). Bard i wsp. postulowali, że immunizacja szczepionką Abeta 42 prawdopodobnie prowadzi do aktywacji mikrogleju i następnie otoczenia agregatów Abeta 42 przez mikroglej. Bard i wsp., Nature Medicine 6: (2000). Niestety nie wszystkie z mechanizmów immunologicznych leżących u podłoża zmniejszania odkładania się płytek amyloidowych i poprawy funkcji poznawczych zostały już wyjaśnione. W poprzednich badaniach biernego podawania przeciwciał 3D6 i 10D5, których epitopy stanowią reszty odpowiednio 1-5 i 3-6 Abeta, wykazano skuteczność tych przeciwciał do zmniejszania obciążenia zarówno Abeta, jak i płytkami amyloidu u myszy transgenicznych. Patrz Bard i wsp., Nature Medicine 6: (2000). Myszy były myszami transgenicznymi pod względem związanej

3 PL B1 3 z chorobą zmutowanej postaci białka prekursorowego amyloidu (APP), pod kontrolą promotora płytko- -pochodnego czynnika wzrostu (PD). Myszy te (PDAPP) wykazują nadekspresję ludzkiego białka prekursora amyloidu i ujawnia się u nich wiele z objawów patologicznych choroby Alzheimera. Patrz Bard i wsp., Nature Medicine 6: (2000). W innym badaniu wykazano, że obwodowe podawanie m266, przeciwciała przeciwko resztom Abeta, zmniejszało u myszy PDAPP obciążenie mózgu Abeta poprzez klirens osoczowy. Patrz Demattos i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: (2001). Przeciwciało m266 ukierunkowane jest na drugorzędowe miejsce immunogenne Abeta, które może wykazywać zróżnicowaną specyficzność wiązania wobec oligomerów Abeta, protofibryli i płytek lub zróżnicowany dostęp do CNS. Zarówno antygen Abeta 42, jak i APP są białkami własnymi i dlatego normalnie nie są immunogenne u osobników wykazujących ich ekspresję. W konsekwencji, próby wytworzenia szczepionek opartych na tych antygenach koniecznie wymagają indukcji autoimmunizacji. Ponadto, każdy protokół immunizacyjny usiłujący indukować autoimmunizację musi dokładnie zbadać odpowiedzi immunologiczne indukowane przez takie antygeny własne. W tym przypadku jest bardzo istotnym, aby żaden z antygenów własnych, które inkorporują Abeta 42 lub elementy Abeta 42, nie indukował autoimmunizacji wobec prawidłowego białka APP i nie zakłócał jego prawidłowego funkcjonowania. Dla opracowania skutecznych sposobów immunoterapeutycznych do leczenia AD wskazanym byłoby określenie zależnych od układu immunologicznego mechanizmów immunologicznych zmniejszenia obciążenia płytkami amyloidowymi po immunizacji antygenem typu Abeta 42. Dla projektowania kompozycji immunogennych i antygenów zawierających jedynie te epitopy o odpowiedniej aktywności biologicznej zalecane byłoby wykorzystanie wiedzy dotyczącej mechanizmu zmniejszania odkładania się płytki amyloidowej. Inną zaletą jest to, że takie kompozycje immunogenne mogą być projektowane tak, by wykluczały te epitopy, które indukują szkodliwą reakcję immunologiczną. Z tego względu istnieje zapotrzebowanie na określone antygeny, które indukują bardzo specyficzne i ograniczone odpowiedzi immunologiczne, jedynie wobec niewłaściwych (aberracyjnych) postaci antygenu Abeta. Istnieje również zapotrzebowanie na kompozycje immunogenne zawierające zdefiniowane antygeny, które mogą być zastosowane w immunoterapii w celu indukcji bardzo specyficznych i ograniczonych odpowiedzi immunologicznych, jedynie wobec postaci patogennych antygenu Abeta. Dodatkowo dogodnym byłoby wyizolowanie przeciwciał przeciwko zdefiniowanym epitopom Abeta o dogodnych właściwościach do zastosowania w immunoterapii biernej. Jeszcze dogodniejsze byłoby opracowanie oznaczeń diagnostycznych do określania, możliwie szybko po rozpoczęciu leczenia, czy pacjent dotknięty chorobą Alzheimera odniesie korzyść z leczenia kompozycjami immunogennymi z antygenami Abeta. Istnieje także zapotrzebowanie na identyfikację inhibitorów odkładania się płytki amyloidowej i tworzenia włókienek. Podsumowanie wynalazku Niniejszy wynalazek spełnia te zapotrzebowanie przez dostarczenie kompozycji immunogennych zawierających reszty 4-10 (SEQ ID NO: 1) peptydu amyloidu Abeta 42 (SEQ ID NO: 2), znane jako Abeta (4-10). Antygeny i kompozycje immunogenne według niniejszego wynalazku są użyteczne w leczeniu choroby Alzheimera, do projektowania małocząsteczkowych inhibitorów odkładania się amyloidu i jako odczynniki diagnostyczne. Ujawniono tu ponadto przeciwciała, które wiążą się z determinantą antygenową Abeta (4-10). Kompozycje immunogenne według niniejszego wynalazku i ujawnione tu przeciwciała mogą być również wykorzystywane w sposobach łagodzenia objawów choroby Alzheimera poprzez zmniejszanie obciążenia amyloidem u pacjentów dotkniętych chorobą Alzheimera. Przedmiotem wynalazku jest peptyd o wzorze: (A) n - - (Th) m - - (B) o - - Abeta (4-10 ) - - (C) p w którym każdy z A, B i C oznacza resztę aminokwasową lub sekwencję reszt aminokwasowych; w którym n, o i p niezależnie oznaczają liczby całkowite w zakresie od 0 do 20; Th oznacza niezależnie sekwencję reszt aminokwasowych, która obejmuje epitop pomocniczej komórki T; gdy o równa się 0 to Th jest bezpośrednio połączony z epitopem komórki B poprzez wiązanie peptydowe bez żadnych reszt rozdzielających; w którym m oznacza liczbę całkowitą od 1 do 5; a Abeta (4-10) stanowi (SEQ ID NO:1);

4 4 PL B1 przy czym peptyd ten wybrany jest z grupy składającej się z SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO:38; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 45; i SEQ ID NO: 46. Przedmiotem wynalazku jest ponadto kompozycja peptydowa, charakteryzująca się tym, że zawiera mieszaninę dwóch lub więcej peptydów o wzorze: (A) n - - (Th) m, - - (B) Abeta (4-10) - - (C) p w którym każdy z A, B i C oznacza resztę aminokwasową lub sekwencję reszt aminokwasowych; w którym n, o i p niezależnie oznaczają liczby całkowite w zakresie od 0 do 20; Th oznacza niezależnie sekwencję reszt aminokwasowych, która obejmuje epitop pomocniczej komórki T; gdy o równa się 0 to Th jest bezpośrednio połączony z epitopem komórki B wiązaniem peptydowym bez żadnych reszt rozdzielających; w którym m oznacza liczbę całkowitą od 1 do 5; a Abeta (4-10) stanowi (SEQ ID NO:1); przy czym jeden z tych peptydów wybrany jest z grupy składającej się z SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO:38; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 45; i SEQ ID NO: 46. Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja immunogenna do indukowania wytwarzania przeciwciał, które specyficznie wiążą się z peptydem beta-amyloidu (SEQ ID NO: 2), charakteryzująca się tym, że zawiera: (a) antygen obejmujący epitop T-komórkowy, który zapewnia skuteczną ilość pomocy T-komórkowej i epitop B-komórkowy składający się z peptydu Abeta (4-10) (SEQ ID NO:1); przy czym antygen ten wybrany jest z grupy składającej się z SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO:36; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO:38; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 46; oraz (b) adiuwant. Korzystnie adiuwant obejmuje jedną lub więcej substancji wybranych z grupy składającej się z wodorotlenku glinu, fosforanu glinu, saponiny. Quill A, Quill A/ISCOMs, bromku dimetylo-dioktadecyloamonu/arwidyny, polianionów, kompletnego adiuwanta Freund'a, N-acetylomuramylo-L-alanylo- -D-izoglutaminy, N-acetylomuramylo-L-treonylo-D-izoglutaminy, niekompletnego adiuwanta Freunda i liposomów. Przedmiotem wynalazku jest ponadto zastosowanie kompozycji immunogennej jak określono powyżej do wytwarzania leku do leczenia osobnika dotkniętego chorobą Alzheimera. Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie kompozycji immunogennej jak określono powyżej do wytwarzania leku do zmniejszania ilości złogów amyloidu w mózgu osobnika dotkniętego chorobą Alzheimera. Przedmiotem wynalazku jest też zastosowanie kompozycji immunogennej jak określono powyżej do wytwarzania leku do deagregowania włókienek amyloidu w mózgu osobnika dotkniętego chorobą Alzheimera. Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób określania czy związek stanowi inhibitor odkładania się i tworzenia włókienek amyloidu, polegający na tym, że: (i) kontaktuje się związek z peptydem Abeta (4-10) (SEQ ID NO:1); i (ii) wykrywa się wiązanie związku z peptydem. W sposobie tym korzystnie ocenia się ponadto czy związek hamuje tworzenie włókienek amyloidu in vitro. Ujawniono tu również peptydy reprezentowane wzorem: (A) n - - (Th) m - - (B) Abeta (4-10) - - (C) p w którym każdy z A, B i C oznacza resztę aminokwasową lub sekwencję reszt aminokwasowych; w którym n, o, i p niezależnie oznaczają liczby całkowite od 0 do około 20;

5 PL B1 5 Th oznacza niezależnie sekwencję reszt aminokwasowych, która obejmuje epitop pomocniczych komórek T lub jego pobudzający układ immunologiczny analog lub segment; gdy o równa się 0 to Th jest bezpośrednio połączona z epitopem komórki B przez wiązanie peptydowe bez żadnych reszt sekwencji rozdzielającej; w którym m oznacza liczbę całkowitą od 1 do około 5; a Abeta (4-10 ) stanowi (SEQ ID NO:1), lub jego analog zawierający konserwatywną substytucję aminokwasową. Ujawniono tu również kompozycję immunogenną do indukowania wytwarzania przeciwciał, które specyficznie wiążą się z peptydem beta amyloidu (SEQ ID NO:2), zawierającą: antygen, obejmujący epitop T-komórkowy zapewniający skuteczną ilość pomocy T-komórkowej oraz epitop B-komórkowy składający się z peptydu Abeta (4-10) (SEQ ID NO: 1); i adiuwant. W pewnej postaci realizacji niniejszy wynalazek dostarcza kompozycję immunogenną do indukowania wytwarzania przeciwciał, które specyficznie wiążą się z peptydem beta amyloidu zawierającą: antygen obejmujący epitop T-komórkowy, zapewniający skuteczną ilość pomocy T-komórkowej, i epitop B-komórkowy, składający się się z peptydu Abeta (4-10) (SEQ ID NO: 1), oraz adiuwant, przy czym epitop T-komórkowy wybrany jest z grupy składającej się z: (a) jednego lub więcej epitopu T-komórkowego zlokalizowanego N-końcowo w stosunku do epitopu B-komórkowego na tym samym łańcuchu głównym białka, (b) jednego lub więcej epitopu T-komórkowego zlokalizowanego C-końcowo w stosunku do epitopu B-komórkowego na tym samym łańcuchu głównym białka, i (c) jednego lub więcej epitopu T-komórkowego zlokalizowanego na innym szkielecie głównym białka, który jest przyłączony przez wiązanie kowalencyjne do łańcucha głównego białka zawierającego epitop B-komórkowy. W szczególnej postaci realizacji ujawniono także kompozycję immunogenną zawierającą epitop B-komórkowy i epitop T-komórkowy, przy czym epitop T-komórkowy ma sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO; 20 i SEQ ID NO: 21. W innej, szczególnej postaci realizacji niniejszy wynalazek dostarcza kompozycję immunogenną zawierającą antygen i adiuwant, przy czym wspomniany adiuwant zawiera jedną lub więcej substancji wybranych z grupy składającej się z wodorotlenku glinu, fosforanu glinu, saponiny. Quill A, Quill A/ISCOMs, bromku dimetylodioktadecyloamonu/arwidyny, polianionów, kompletnego adiuwanta Freunda, N-acetylomuramylo-L-alanylo-D-izoglutaminy, N-acetylomuramylo-L-treonylo-D-izoglutaminy, niekompletnego adiuwanta Freunda i liposomów. Ujawniono tu również sposób leczenia osobnika dotkniętego chorobą Alzheimera obejmujący podawanie osobnikowi skutecznej ilości kompozycji immunogennej do indukowania wytwarzania przeciwciał, które specyficznie wiążą się z peptydem beta amyloidu (SEQ ID NO: 2) zawierającej: (a) antygen, obejmujący epitop T-komórkowy zapewniający skuteczną ilość pomocy T-komórkowej i epitop B-komórkowy, składający się z peptydu Abeta (4-10) (SEQ ID N0:1), oraz (b) adiuwant. Ujawniono tu również sposób zmniejszania ilości złogów amyloidowych w mózgu osobnika dotkniętego chorobą Alzheimera obejmujący podawanie osobnikowi skutecznej ilości kompozycji immunogennej do indukowania wytwarzania przeciwciał, które specyficznie wiążą się z peptydem beta amyloidu (SEQ ID NO: 2) zawierającej: (a) antygen, obejmujący epitop T-komórkowy zapewniający skuteczną ilość pomocy T-komórkowej oraz epitop B-komórkowy składający się z peptydu Abeta (4-10) (SEQ ID NO:1); i (b) adiuwant. Ujawniono tu także sposób deagregacji włókienek amyloidowych w mózgu osobnika dotkniętego chorobą Alzheimera obejmujący podawanie osobnikowi skutecznej ilości kompozycji immunogennej do indukowania wytwarzania przeciwciał, które specyficznie wiążą się z peptydem beta amyloidu (SEQ ID NO: 2) zawierającej: (a) antygen obejmujący epitop T-komórkowy, zapewniający skuteczną ilość pomocy T-komórkowej, oraz epitop B-komórkowy, składający się z peptydu Abeta (4-10) (SEQ ID NO:1), oraz (b) adiuwant. Ujawniono tu również wyizolowane przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen zdolne do wiązania się z peptydem Abeta (4-10 ) (SEQ ID NO:1).

6 6 PL B1 Ujawniono tu także wyizolowane przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen zdolne do wiązania się z peptydem Abeta (4-10) (SEQ ID NO:1), przy czym wspomniane przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen hamuje odkładanie się amyloidu. Ujawniono tu również wyizolowane przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen zdolne do wiązania się z peptydem Abeta (4-10) (SEQ ID NO:1), przy czym wspomniane przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen deagreguje włókienka amyloidowe. Ujawniono tu też sposób leczenia osobnika dotkniętego chorobą Alzheimera obejmujący podawanie osobnikowi skutecznej ilości przeciwciała, które rozpoznaje i wiąże się z peptydem Abeta (4-10) (SEQ ID NO:1). Ujawniono tu także sposób leczenia osobnika dotkniętego chorobą Alzheimera obejmujący podawanie osobnikowi skutecznej ilości kompozycji przeciwciała, które rozpoznaje i wiąże się z peptydem Abeta (4-10) (SEQ ID NO:1), przy czym ta kompozycja przeciwciała zawiera przeciwciała poliklonalne. Ujawniono tu również sposób leczenia osobnika dotkniętego chorobą Alzheimera obejmujący podawanie osobnikowi skutecznej ilości kompozycji przeciwciała, które rozpoznaje i wiąże się z peptydem Abeta (4-10) (SEQ ID NO:1), przy czym kompozycja przeciwciała zawiera przeciwciała monoklonalne. W jeszcze innej postaci realizacji niniejszy wynalazek dostarcza sposób do określania czy związek jest inhibitorem odkładania się i tworzenia włókienek obejmujący: kontaktowanie związku z peptydem Abeta (4-10) (SEQ ID NO:1); i wykrywanie wiązania się związku z peptydem. W innej korzystnej postaci realizacji wynalazku sposób obejmuje ponadto ocenianie czy związek hamuje tworzenie włókienek amyloidu in vitro. Ujawniono tu także sposób diagnostyczny do przewidywania skuteczności immunoterapii aktywnej w chorobie Alzheimera obejmujący: monitorowanie powstawania odpowiedzi immunologicznej wobec peptydu Abeta (4-10) (SEQ ID NO:1); przy czym pozytywna odpowiedź wobec peptydu Abeta (4-10) wskazuje, że terapię powinno się kontynuować a brak odpowiedzi immunologicznej lub bardzo słaba odpowiedź immunologiczna wskazuje, że terapii powinno się zaprzestać. Ujawniono tu również kompozycję immunogenną zawierającą: antygen i adiuwant; przy czym antygen obejmuje epitop T-komórkowy, który zapewnia skuteczną ilość pomocy T-komórkowej i epitop B-komórkowy składający się z peptydu Abeta (4-10) (SEQ ID NO:1); przy czym antygen dostarcza skuteczną ilość białkowego kontekstu strukturalnego do indukowania przeciwciał, które wiążą się z celem immunologicznym zlokalizowanym w peptydzie beta amyloidu (SEQ ID NO:2). Ujawniono tu również antygen obejmujący epitop B-komórkowy, przy czym białkowy kontekst strukturalny epitopu B-komórkowego, który zapewnia naśladowanie struktury drugorzędowej celu immunologicznego takiej jaka jest w peptydzie beta amyloidu (SEQ ID NO:2), wybrany jest z grupy składającej się z beta-kartki, skrętu w lewo, helisy, losowego zwinięcia lub ich kombinacji. W pewnych dalszych postaciach realizacji antygen zawiera epitop B-komórkowy zawierający mimetyk peptydu Abeta (4-10) (SEQ ID NO:1). Szczegółowy opis wynalazku Definicje Należy rozumieć, że następujące terminy mają, chyba że wskazano inaczej, następujące znaczenia: Adiuwant - odnosi się do substancji, które mogą być mieszaninami substancji, które łączy się z antygenem w celu wzmocnienia immunogenności antygenu w kompozycji immunogennej. Adiuwanty działają w taki sposób, że wzmacniają odpowiedź immunologiczną wobec antygenu zazwyczaj przez działanie bezpośrednio na układ immunologiczny i przez zapewnianie powolnego uwalniania antygenu. Peptyd beta amyloidu (Abeta) - odnosi się do dowolnego peptydu z grupy peptydów o resztach aminokwasowych, które powstają w wyniku obróbki z białka prekursora amyloidu (APP). W stosowanym tu znaczeniu Abeta 42 odnosi się do peptydu Abeta o 42 resztach aminokwasowych. Ponadto, Abeta (4-10) odnosi się do peptydu o 7 resztach aminokwasowych z peptydu Abeta 42 od reszty 4 do reszty 10. Jak zostanie to poniżej bardziej szczegółowo przedyskutowane, gen APP zostaje poddany alternatywnemu splicingowi w celu wytworzenia trzech powszechnych izoform, zawierających 770 aminokwasów (APP 770 ), 751 aminokwasów (APP 751 ) i 695 aminokwasów (APP 695 ). Zwyczajowo numeracja kodonów najdłuższej izoformy, APP 770, stosowana jest nawet wtedy gdy odnosi się do pozycji kodonów krótszych izoform.

7 PL B1 7 Antygen - antygeny według niniejszego wynalazku stanowią kombinacje epitopów pomocniczych komórek T i epitopów B-komórkowych. Epitop pomocniczych komórek T może być zlokalizowany N-końcowo lub C-końcowo względem epitopu B-komórkowego na tym samym łańcuchu głównym białka. Epitop T-komórkowy może być również zlokalizowany na innym łańcuchu głównym polipeptydu, który jest kowalencyjnie przyłączony do polipeptydu zawierającego epitop B-komórkowy tak jak, przykładowo, mały peptyd jest kowalencyjnie przyłączony do cząsteczki nośnika, takiej jak hemocyjanina ze skałoczepa (ang. keyhole limpet, KLH), w celu zapewnienia immunogenności. Ewentualnie, epitop komórki T może być nie-kowalencyjnie zasocjowany z epitopem komórki B przez połączenie epitopu komórki T i B w kompozycji adiuwantem. Obróbka antygenu - odnosi się do procesu, w którym antygeny zewnątrzkomórkowe z bakterii, wirusów lub kompozycji immunogennych pobierane są przez komórki prezentujące antygen (APC) na drodze endocytozy lub fagocytozy. Następnie, antygen ulega fragmentacji przez endosomy lub lizosomy a fragmenty peptydowe umieszczane są w bruzdach wiążących cząsteczek MHC klasy I i MHC klasy II. Prezentacja antygenu - odnosi się do procesu, w którym cząsteczki MHC klasy I i MHC klasy II wiążą się z krótkimi przetworzonymi antygenami i prezentują te peptydy na powierzchni komórki w celu przeszukiwania przez komórki T poprzez interakcję zależną od receptora komórki T. Epitop B-komórkowy - odnosi się do części antygenu, która jest celem wiązania przeciwciała i o której wiadomo również, że jest determinantą antygenową. Dla białkowych determinant antygenowych epitop B-komórkowy odnosi się do reszt aminokwasowych w szczególnej 3-wymiarowej aranżacji zazwyczaj odpowiadającej strukturze natywnej. Inaczej niż w przypadku epitopów T-komórkowych, epitopy B-komórkowe mogą być niezwykle wrażliwe na konformację białka. Skuteczna ilość - odnosi się do ilości kompozycji immunogennej według wynalazku, opisanych tu przeciwciał lub ich fragmentów wiążących antygen, które osiągają dowolne z określonych celi terapii. Skuteczna ilość ma również obejmować zarówno profilaktyczne, jak i terapeutyczne zastosowania kompozycji, przeciwciał lub ich fragmentów wiążących antygen. Epitop pomocniczej komórki T - epitopy pomocniczych komórek T (epitop Th) (epitop T-komórkowy) są peptydami, które wiążą się z cząsteczkami MHC klasy II i służą do aktywacji komórek T CD4+ aby zapewnić pomoc w postaci cytokin dla komórek B w wytwarzaniu odpowiedzi na antygen w postaci przeciwciał. Cząsteczki MHC klasy II załadowane są przetworzonymi fragmentami peptydowymi o długości od około 7 do około 30 reszt, w przedziałach komórkowych, które komunikują się ze środowiskiem zewnątrzkomórkowym. Dlatego, epitopy pomocniczych komórek T ogólnie reprezentują fragmenty obcych białek. Cel immunologiczny - odnosi się do rzeczywistego 3-wymiarowego epitopu (natywnego) w złogu amyloidowym lub krążących peptydach Abeta, który próbuje naśladować epitop B-komórkowy w antygenie. Przeciwciała przeciw białku zazwyczaj są specyficzne dla szczególnych sekwencji aminokwasowych w szczególnej strukturze drugorzędowej. Idealnie, indukowanie przeciwciał wobec antygenu naśladowcy antygenowego epitopu skutkuje wytwarzaniem przeciwciał, które rozpoznają i wiążą się z natywnym epitopem jaki występuje w patologicznych złogach amyloidowych lub krążących peptydach Abeta. Immunogen - odnosi się do antygenu, dla którego istnieją dowody, że jest immunogenny. Immunogenność - odnosi się do zdolności antygenu do prowokowania odpowiedzi immunologicznej. Antygeny, ogólnie, aby być imunogennymi muszą być zasocjowane z komórkami prezentującymi antygen. Wiele czynników wpływa na immunogenność, włączając wielkość antygenu, strukturę, sekwencję, stopień obcości, obecność adiuwanta, stan układu immunologicznego pacjenta, jak również inne czynniki genetyczne. Peptyd - odnosi się do małej liczby, zazwyczaj 2, lub więcej, aminokwasów połączonych ze sobą. Polipeptyd - odnosi się do dłuższych łańcuchów aminokwasów połączonych ze sobą, ale o sekwencji lub długości ogólnie niezdefiniowanej. Terminy białko, peptyd i polipeptyd sporadycznie będą stosowane wymiennie. Ogólny epitop pomocniczej komórki T - odnosi się do epitopów pomocniczych komórek T zdolnych do indukowania T-komórkowych odpowiedzi aktywacyjnych (pomocy T-komórkowej) u dużej liczby osobników wykazujących ekspresję zróżnicowanych haplotypów MHC tj. populacji genetycznie zróżnicowanej. Takie epitopy funkcjonują u różnych osobników heterogennej populacji i uważane są za ogólne epitopy Th.

8 8 PL B1 Łańcuch główny białka lub polipeptydu - odnosi się do powtarzanej jednostki reprezentującej aminokwas jako część sekwencji białka. Łańcuch główny polipeptydu składa się z sekwencji trzech atomów: azotu amidowego (N-H); węgla alfa (C); i węgla karbonylowego (C=O): które mogą być ogólnie przedstawione następująco: -N-C-C- Białko - ogólnie odnosi się do specyficznych łańcuchów i aminokwasów o zdefiniowanej sekwencji, długości i zwiniętej konformacji, ale białko, polipetyd i peptyd mogą być sporadycznie stosowane wymiennie. Terapia lub leczenie - obejmuje następujące cele: (1) zapobieganie występowaniu niepożądanych objawów lub stanów patologicznych u podmiotu, u którego jeszcze nie rozpoznano ich występowania; (2) hamowanie niepożądanych objawów lub stanów patologicznych, tj. zatrzymywanie ich postępu; lub (3) łagodzenie objawów lub stanów patologicznych lub uwalnianie od nich, tj. wywoływanie regresji objawów lub stanów patologicznych. Kompozycje i sposoby według niniejszego wynalazku mają swe źródło w stwierdzeniu niniejszych twórców, że na zależne od układu immunologicznego zmniejszenie złogów płytek amyloidowych i odpowiadającą temu poprawę funkcji poznawczych można wpływać przez specyficzne odpowiedzi immunologiczne w postaci przeciwciał wobec szczególnego celu immunologicznego lub epitopu B-komórkowego w Abeta 42. Ten krytyczny cel immunologiczny został zidentyfikowany przez niniejszych twórców jako reszty 4-10 (FRHDSGY) (SEQ ID NO:1) Abeta 42, co odpowiada resztom 675 do 681 białka prekursora amyloidu (APP), zgodnie z numeracją kodonów najdłuższej izoformy, APP 770. W konsekwencji niniejsi twórcy określili ważny mechanizm immunologiczny zależnego od układu immunologicznego zmniejszania odkładania się płytek amyloidowych po immunizacji antygenami typu Abeta 42. Niniejsi twórcy stwierdzili, że przeciwciała rozpoznające i wiążące się z resztami 4-10 (FRHDSGY)(SEQ ID NO:1) Abeta 42 hamują tworzenie się włókienek Abeta i neurotoksyczność Abeta. Ponadto, niniejsi twórcy stwierdzili, że przeciwciała rozpoznające i wiążące się z resztami 4-10 (FRHDSGY) Abeta 42, deagregują utworzone włókienka Abeta 42. Ponadto, niniejsi twórcy ujawniają, że przeciwciała wytworzone podczas immunizacji Abeta 42 znoszą in vitro śmierć komórek wywołaną przez Abeta. Niniejszy wynalazek zrealizowano z użyciem myszy TgCRND8 jako modelu ludzkiej AD. Myszy TgCRND8 są użyteczne jako model AD, dlatego że przenoszą ludzki podwójnie zmutowany transgen APP 695 pod kontrolą promotora białka prionowego i wykazują postępujące nagromadzanie peptydu Abeta 42 oraz neurytycznych płytek amyloidowych w korze mózgowej (neuropatologiczna oznaka AD), którym towarzyszy postępujące zaburzenie funkcji poznawczych. Patrz Chishti i wsp., J. Biol. Chem., 276: (2001). Ujawniono tu również przeciwciała specyficznie ukierunkowane na N-terminalny peptyd Abeta, które zostały wytworzone podczas immunizacji myszy C57BL6 x C3H protofibrilarnymi postaciami Abeta 42. Ujawniono tu ponadto sekwencję Abeta FRHDSGY (SEQ ID NO:1) odpowiadającą Abeta (4-10), która reprezentuje epitop krytyczny dla odporności ochronnej dla choroby Alzheimera. Dodatkowo, w niniejszym wynalazku zidentyfikowano epitop Abeta (4-10 ) jako cel immunologiczny do wytwarzania korzystnej odporności ochronnej u pacjentów dotkniętych chorobą Alzheimera. Prezentacja antygenu Prezentacja antygenu odnosi się do molekularnych i komórkowych zdarzeń, w których antygeny są pobierane i przetwarzanie przez komórki prezentujące antygen (APC). Przetworzone fragmenty antygenu są następnie prezentowane komórkom efektorowym, które następnie ulegają aktywacji i zapoczątkowują odpowiedź immunologiczną. Jako najbardziej aktywne komórki prezentujące antygen scharakteryzowane zostały makrofagi (które są bezpośrednimi produktami rozwoju monocytów), komórki dendrytyczne i pewne komórki B. Kluczowymi cząsteczkami w prezentacji antygenu i procesie odpowiedzi immunologicznej są cząsteczki MHC, które są polimorficzną rodziną genów kodowanych chromosomowo w regionie znanym jako główny układ zgodności tkankowej MHC. Cząsteczki MHC klasy I i klasy II u ludzi oznaczone są jako cząsteczki HLA (antygen ludzkich leukocytów). Pewne cząsteczki MHC mają za zadanie prezentację unikalnych fragmentów molekularnych na powierzchni komórek i ułatwianie ich rozpoznawania przez komórki T i inne komórki efektorowe układu immunologicznego. Patrz D.H. Margulies, "The Major Histocompatibility Complex", str w Fundamental Immunology, wydanie czwarte, wydane przez W.F. Paul, Lippencott-Raven, Filadelfia, PA (1999). Ponadto, cząsteczki MHC klasy I

9 PL B1 9 i klasy II mają za zadanie wiązanie peptydów w komórkach prezentujących antygen i następnie oddziaływanie z receptorami komórek T na powierzchni komórek T. Dokładniej, cząsteczki MHC klasy I wiążą się z i prezentują próbki własnych peptydów komórki, włącznie z endogennymi, cytozolowymi białkami, podlegającymi de novo translacji wirusami i antygenami nowotworowymi. Cząsteczki MHC klasy I generalnie prezentują peptydy o około 7 do około 16 resztach długości, które rozpoznawane są przez cytotoksyczne komórki T CD8+. Cząsteczki MHC klasy I zaangażowane są w uskutecznianie odpowiedzi cytotoksycznych komórek T, przy czym komórki zakażone wirusem są zabijane. Niniejszy wynalazek dotyczy głównie epitopów komórek T, które służą do aktywacji komórek T CD4+, które mogą zapewnić pomoc komórkom B w wytwarzaniu odpowiedzi na antygen w postaci przeciwciał. Epitopy pomocniczych komórek T (epitop Th) wiążą się z cząsteczkami MHC klasy II, które załadowane są fragmentami peptydowymi o od około 7 do około 30 resztach długości, w kompartmentach komórkowych, które komunikują się ze środowiskiem zewnątrzkomórkowym. Patrz D.H. Margulies, "The Major Histocompatibility Complex", str w Fundamental Immunology, wydanie czwarte, wydane przez W.F. Paul, Lippencott-Raven, Philadelphia, PA (1999) (Margulies). Dokładniej, cząsteczki MHC klasy II wiążą się z i prezentują komórkom T CD4+ próbki peptydów, które są wchłaniane przez komórki prezentujące antygen ze środowiska zewnątrzkomórkowego. Komórki T CD4+ ulegają następnie aktywacji i zapewniają pomoc komórkom B w postaci cytokin przy wytwarzaniu przeciwciał. U ludzi, cząsteczki MHC klasy II obejmują cząsteczki HLA-DR, HLA-DQ i HLA-DP, które występują w różnych genetycznie kodowanych allelach. Kompozycje immunogenne według niniejszego wynalazku obejmują antygeny zawierające epitop B-komórkowy i epitop T-komórkowy, które są przetwarzane i prezentowane jako białka lub fragmenty peptydowe przez MHC na powierzchni tak zwanych "komórek prezentujących antygen", i są rozpoznawane przez limfocyty T CD4+ jako komórki efektorowe. W celu zapewnienia przetrwania immunologicznego fizjologia cząsteczek MHC jest tak opracowana, że mogą one prezentować możliwie najszersze spektrum peptydów antygenowych. W konsekwencji liczba kopii zdefiniowanego peptydu antygenowego na powierzchni komórek prezentujących antygen jest bardzo niska (zwielokrotnienie o 10 2 danego peptydu antygenowego przy całkowitej populacji receptorów peptydowych wynoszącej w przybliżeniu 10 5 ). Oznacza to, że na powierzchni komórek prezentujących antygen eksponowana jest bardzo heterogenna mieszanina peptydów antygenowych związanych z cząsteczkami MHC ("ligandy peptydowe"). Termin epitop T-komórkowy" odnosi się do sekwencji białka, która wywołuje aktywację pomocniczych limfocytów T CD4+ (Th) po obróbce antygenu i prezentacji peptydu w kieszeni wiążącej cząsteczki MHC klasy II. Receptory komórek T alfa/beta na powierzchni komórek T oddziałują z kompleksem peptyd-mhc klasy II, który służy jako bodziec dla aktywacji. W efekcie natywna konformacja epitopu komórki T nie jest istotna, a jedynie istotna jest sekwencja pierwszorzędowa oraz zdolność wiązania się ze szczególną cząsteczką MHC. Niniejszy wynalazek dotyczy peptydów, w szczególności peptydów syntetycznych, które zdolne są do indukowania przeciwciał wobec patologicznych postaci Abeta, takich jak te znajdowane w płytkach amyloidowych i we włókienkach. Immunogenność peptydu odnosi się do zdolności peptydu do indukowania odpowiedzi w postaci przeciwciał, obejmującej przeciwciała, które specyficznie wiążą się z "epitopem B-komórkowym" lub "determinantą antygenową" w peptydzie. Patrz R.N. Germain, "Antigen Processing and Presentation", str w Fundamental Immunology, wydanie czwarte, wydane przez W.F. Paul, Lippencott- Raven, Filadelfia, PA (1999) (Germain). Aby być immunogennym, peptyd zawierający epitop B-komórkowy musi być prezentowany w połączeniu z antygenem MHC klasy II lub epitopem komórki T klasy II. Epitop T-komórkowy zazwyczaj jest przetwarzany z immunogenu podczas obróbki antygenu przez komórki prezentujące antygen i następnie wiąże się z cząsteczką MHC klasy II w sposób zależny od sekwencji. Patrz Germain. Ten kompleks MHC klasy II epitop komórki T rozpoznawany jest przez limfocyty T CD4+ (komórki Th). Komórki Th mają zdolność do wywoływania proliferacji specyficznych komórek B produkujących cząsteczki przeciwciał, które zdolne są do odróżniania zasocjowanego epitopu komórki B od prezentowanego immunogenu. Zatem, wytwarzanie przeciwciała, które jest specyficzne dla szczególnego epitopu komórki B jest powiązane z obecnością epitopu komórki T w obrębie lub zasocjowanego z immunogenem. Inne powikłanie powstaje w przypadku gdy antygen nie jest obcym białkiem. Ze względu na to, że Abeta jest cząsteczką własną, nie powinna ona zawierać żadnych epitopów Th, które indukują

10 10 PL B1 aktywację limfocytów i zatem odpowiedź w postaci przeciwciał przeciwko sobie samej. Dlatego należy zapewnić obce epitopy komórki T poprzez zawarcie specyficznych sekwencji pochodzących z silnych immunogenów obcych, włącznie z toksyną botulinową, toksyną krztuśca, białkiem F wirusa odry oraz antygenem powierzchniowym wirusa zapalenia wątroby typu B (HBsAg) i innym. Takie sekwencje epitopów komórek T mogą być zawarte w tym samym łańcuchu głównym białka co epitop B-komórkowy, którym jest peptyd Abeta (4-10). Lokalizacja epitopu komórki T względem epitopu B-komórkowego może być albo N-końcowa, albo C-końcowa. Ewentualnie, epitop komórki T może być dostarczony na oddzielnym łańcuchu głównym białka, znanym jako cząsteczka nośnikowa, która może być, ale niekoniecznie, związana kowalencyjnie z peptydem zawierającym epitop B-komórkowy. Dodatkowe epitopy komórki T mogą być wybrane z użyciem następujących procedur znanych w dziedzinie, takich jak kwasowa elucja i sekwencjonowanie z użyciem spektroskopii masowej peptydów związanych cząsteczkami MHC klasy II z oczyszczonych immunochromatograficznie cząsteczek klasy II jak ujawniono w Rudensky i wsp., Nature 353: (1991); Chicz i wsp., Nature 358: (1992); i Hunt i wsp.. Science 256: (1992). Idealnie, wybrane epitopy Th zdolne są, dogodnie, do wzbudzania aktywacyjnych odpowiedzi komórek T (pomoc komórek T) u dużej liczby osobników z ekspresją zróżnicowanych haplotypów MHC. Oznacza to, że te epitopy funkcjonują u wielu różnych osobników heterogennej populacji i uważane są za ogólne epitopy Th. Ogólne epitopy Th mają tę zaletę, że wzbudzają silne odpowiedzi w postaci przeciwciał anty-abeta u większości członków zróżnicowanej populacji. Epitopy pomocniczych komórek T według wynalazku wybierane są nie tylko ze względu na zdolność do wywołania odpowiedzi immunologicznych u większości członków danej populacji, ale również ze względu na zdolność do powodowania odpowiedzi typu pamięci przypominania (ang. memory/recall response). Większość z pacjentów ludzkich otrzymujących immunoterapię Abeta okaże się być już immunizowana szczepionkami pediatrycznymi przeciwko odrze, śwince, różyczce, błonicy, krztuścowi i tężcowi. Ci pacjenci zostali już uprzednio poddani ekspozycji na więcej niż jeden z epitopów Th obecnych w mieszaninie immunogenów. Taka wcześniejsza ekspozycja na epitop Th poprzez immunizację standardowymi szczepionkami powinna spowodować powstanie klonów komórek Th, które mogą natychmiastowo odpowiedzieć i zapewnić pomoc dla odpowiedzi w postaci przeciwciał. Epitop pomocniczych komórek T stanowi sekwencję aminokwasów (aminokwasy naturalne lub nie-naturalne), która obejmuje epitop T. Epitop pomocniczych komórek T może składać się z ciągłego lub nieciągłego epitopu. Zatem nie każda reszta aminokwasowa epitopu pomocniczych komórek T jest pożądaną częścią epitopu. W związku z tym epitopy Th, włączając analogi i segmenty epitopów Th, zdolne są do nasilania lub stymulowania odpowiedzi immunologicznej wobec Abeta. Immunodominanty epitopów pomocniczych komórek T wykazują szeroką reaktywność w populacjach ludzi i zwierząt o znacznie rozbieżnych typach MHC. Patrz Cells i wsp. J. Immunol. 140: (1988); Demotz i wsp. J. Immunol. 142: (1989); Chong i wsp. Infect. Immun. 60: (1992). Epitop pomocniczych komórek T przedmiotowych peptydów ma od około 10 do około 50 reszt aminokwasowych, dogodnie od około 10 do około 40 reszt aminokwasowych, dogodniej od około 10 do około 30 reszt aminokwasowych, jeszcze dogodniej od około 10 do około 20 reszt aminokwasowych, lub w szczególności od około 10 do około 15 reszt aminokwasowych. W przypadku występowania wielokrotnych epitopów komórek T pomocniczych (tj. n > 2), każdy epitop pomocniczej komórki T może być niezależnie taki sam, albo inny. Epitop pomocniczej komórki T może obejmować analogi, substytucje, delecje i insercje od jednej do około 10 reszt aminokwasowych w epitopie pomocniczej komórki T. Segmenty epitopu pomocniczej komórki T są ciągłymi częściami epitopu pomocniczej komórki T, które są wystarczające do wzmocnienia lub stymulowania odpowiedzi immunologicznej wobec Abeta. Epitop pomocniczej komórki T może być oddzielony od epitopu B-komórkowego za pomocą jednej lub więcej reszt aminokwasowych grupy rozdzielającej. Opisane tu epitopy Th obejmują epitopy pomocniczych komórek T powierzchniowego antygenu wirusa zapalenia wątroby typu B (HB-Th), epitopy pomocniczych komórek T toksyny krztuśca (PT-Th), epitopy pomocniczych komórek T toksyny tężca (TT-Th), epitopy pomocniczych komórek T białka F wirusa odry (MV-Th), epitopy pomocniczych komórek T głównego białka błony zewnętrznej Chlamydia trachamates (CT-Th), epitopy pomocniczych komórek T toksyny błonicy (DT-Th), epitopy pomocniczych komórek T sporozoitu typu circumsporozoite" Plasmodium falciparum (PF-Th), epitopy pomocniczych komórek T izomerazy triozofosforanowej Schistosoma mansoni (SM-Th), epitopy pomocniczych komórek T Tra T Escherichia coli (TraT-Th) oraz wzmagające odpowiedź immunologiczną ana-

11 PL B1 11 logi i segmenty dowolnych z tych epitopów Th. Szereg wykazujących szeroką reaktywność epitopów Th opisanych jest w Patencie U.S.A. nr 5,759,551 wydanym dla Ladd i wsp. Przykłady sekwencji epitopów komórek T pomocniczych dostarczone są poniżej:

12 12 PL B1 W pewnych postaciach realizacji ujawniono tu epitop T-komórkowy o sekwencji aminokwasowej wybranej z grupy składającej się z: SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; i SEQ ID NO: 21; Wzorzec antygenu Kompozycje immunologiczne według niniejszego wynalazku zawierają antygen, obejmujący epitop T-komórkowy zapewniający skuteczną ilość pomocy T-komórkowej oraz epitop B-komórkowy składający się z Abeta (4-10). Peptydy antygenowe tu ujawnione reprezentowane są następującymi wzorami: I. (A) n - - (Th) m - - (B) Abeta (4-10) - - (C) p II. (A) n - - Abeta (4-10) - - (B) (Th) m - - (C) p III. (D) q - - Abeta (4-10) (E) r w których A, C, D i E niezależnie oznaczają resztę aminokwasową lub sekwencję reszt aminokwasowych; w których B, grupa rozdzielająca, oznacza resztę aminokwasową albo sekwencję reszt aminokwasowych; gdy o równa się 0 to Th jest bezpośrednio połączony z epitopem komórki B poprzez wiązanie peptydowe bez reszt grupy rozdzielającej; w których n, o i p oznaczają niezależnie liczby całkowite od 0 do około 20; gdy o równa się 0 to Th jest bezpośrednio połączony z epitopem komórki B poprzez wiązanie peptydowe bez reszt grupy rozdzielającej; w których m oznacza liczbę całkowitą od 1 do około 5; w których q i r niezależnie oznaczają liczby całkowite z zakresu od 0 do około 100; Th niezależnie oznacza sekwencję reszt aminkwasowych, która obejmuje epitop pomocniczej komórki T lub jego wzmagający odpowiedź immunologiczną analog lub segment zawierający konserwatywną substytucję; Th może występować w powtórzeniach tandemowych; Abeta (4-10) oznacza reszty 4-10 (FRHDSGY) z Abeta 42 SEQ ID NO:1, lub jego wzmagający odpowiedź immunologiczną analog lub segment zawierający konserwatywną substytucję; Abeta (4-10)

13 PL B1 13 SEQ ID NO: 1 może występować w powtórzeniach tandemowych lub w inny sposób występować w wielokrotnych powtórzeniach. Wynalazek obejmuje również zdefiniowane w zastrzeżeniach kompozycje dwóch lub więcej peptydów reprezentowanych wzorami I, II i III. Jeden lub więcej peptydów o wzorze I może być połączonych z wytworzeniem kompozycji. Ewentualnie jeden lub więcej peptydów o wzorach I, II i i III może być połączonych z wytworzeniem mieszaniny lub kompozycji. Peptydy antygenowe tu ujawnione mają od około 20 do około 100 reszt aminokwasowych, ewentualnie od około 20 do około 80 reszt aminokwasowych. W pewnej postaci realizacji wyn a- lazku peptydy antygenowe według niniejszego wynalazku mają od około 20 do około 60 reszt aminokwasowych, dogodnie od około 20 do około 50 reszt aminokwasowych, i jeszcze dogodniej od około 25 do około 40 reszt aminokwasowych. W innej zalecanej postaci realizacji peptyd ant y- genowy ma od około 20 do około 35 reszt aminokwasowych. Gdy A, B, C, D i E są resztami aminokwasowymi, mogą być dowolnymi aminokwasami niewystępującymi naturalnie lub dowolnymi aminokwasami występującymi naturalnie. Aminokwasy niewystępujące naturalnie obejmują, ale bez ograniczeń, beta-alaninę, ornitynę, norleucynę, norwalinę, hydroksyprolinę, tyroksynę, kwas gamma-aminomasłowy, homoserynę, cytrulinę i podobne. Naturalnie występujące aminokwasy obejmują alaninę, argininę, asparaginę, kwas asparaginowy, cysteinę, kwas glutaminowy, glutaminę, glicynę, histydynę, izoleucynę, leucynę, lizynę, metioninę, fenyloalaninę, prolinę, serynę, treoninę, tryptofan, tyrozynę i walinę. Ponadto, gdy m oznacza przynajmniej jeden, a dwie lub więcej z grup A, B, C, D lub E są aminokwasami, to każdy aminokwas oznacza niezależnie taki sam lub inny aminokwas. Aminokwasy grup A, B, C, D lub E mogą być modyfikowane kwasami tłuszczowymi. Przykładowo, N-końcowo lub C-końcowo wobec epitopu Abeta można dodać 1 lub więcej epsilonpalmitoilo-lizyn, a cały peptyd może być zakotwiczony na powierzchni nośników. Nośniki mogą zawierać immunostymulator w postaci lipidu. Patrz Nicolau i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: (2002). W celu skonstruowania antygenów białkowych epitop Abeta (4-10) może być włączony do dendrimerów białkowych poprzez zastosowanie strategii sprzęgania ortogonalnego. Specjalnie skonstruowane dendrimery mogą tworzyć podstawę do składania skutecznych antygenów szcz e- pionkowych, włączając, przykładowo, konstrukcję peptydów wieloantygenowych jak to opisano w Patencie U.S.A. nr 6,310,810 dla Tarn. Peptydy syntetyczne jako antygeny i szczepionki W wielu przypadkach udowodniono, że zastosowanie jako immunogenu, do opracowywania skutecznych szczepionek i immunoterapii do leczenia chorób człowieka, całego białka lub glikoproteiny oraz czynników zakaźnych jest nieskuteczne albo ze względu na brak immunogenności, albo skutkuje nasileniem zakażenia lub choroby ze względu na zawarcie nie mających działania ochronnego epitopów. Patrz Osterhaus i wsp. Vaccine, 7: (1989); Gilbert i wsp., Virus Research, 7: (1987); Burke, D. Perspect. Biol. Med., 35: (1992). Zastosowanie syntetycznych antygenów peptydowych w szczepionkach lub kompozycjach immunogennych może przezwyciężyć wiele z problemów związanych ze szczepionkami rekombinowanymi. Zalety stosowania peptydów syntetycznych, które odpowiadają specyficznym dom e- nom obejmują: wybór i włączenie jedynie epitopów o działaniu ochronnym; eliminacja epitopów nasilających chorobę; eliminacja szkodliwych epitopów autoimmunizacyjnych; eliminacja materiału zakaźnego; i to, że peptydy syntetyczne są dobrze zdefiniowane chemicznie i mogą być wytw a- rzane po rozsądnych kosztach. Patrz Arnon i Horwitz, Curr. Opin. Immunol., 4: , (1992). Wadą jest to, że małe peptydy syntetyczne mogą nie zawierać dokładnych sekwencji aminokwasowych niezbędnych do przetwarzania i wiązania białek głównego układu zgodności tka n- kowej (MHC) klasy I i II, w celu prezentacji układowi immunologicznemu. Patrz Rothbard, Biotechnology, 20: , (1992). Inną wadą jest to, że 3-wymiarowa struktura roztworu małych peptydów może być inna, niż ta w natywnym białku i, dlatego, peptyd taki niekoniecznie będzie wzbudzać humoralną odpowiedź immunologiczną o odpowiedniej specyficzności i powinowactwie wraz z uzyskaniem ochronnej odporności. Patrz Bernard i wsp. Aids. Res. and Hum. Retroviruses, 6: , (1990). Antygeny peptydowe według niniejszego wynalazku mogą być wytwarzane na szereg różnych sposobów. Peptyd, ze względu na swój względnie mały rozmiar, może być syntetyzowany w roztworze lub na nośniku stałym zgodnie z konwencjonalnymi technikami. Obecnie komercyjnie

14 14 PL B1 dostępne są różne syntetyzery automatyczne i manualne, i można je wykorzystywać zgodnie ze znanymi protokołami. Patrz, przykładowo. Patent U.S.A. nr 5,827,666 dla Finn i wsp.; Stewart i Young, Solid Phase Peptide Synthesis, wyd. 2-gie., Pierce Chemical Co., 1984; i Tarn i wsp., J. Am Chem. Soc. (1983) 105: Ewentualnie można zastosować technologię hybrydowego DNA, w której syntetyczny gen wytwarza się z użyciem pojedynczych nici kodujących polipeptyd lub zasadniczo komplementa r- nych do nich nici, przy czym pojedyncze nici zachodzą na siebie i mogą być połączone w środowisku do hybrydyzacji w celu zhybrydyzowania. Zhybrydyzowane nici mogą być następnie ligowane z utworzeniem kompletnego genu i, poprzez wybór odpowiednich końców, gen można wstawić do wektora ekspresyjnego, z których wiele jest obecnie łatwo dostępnych. Patrz, na przykład, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Wydanie Drugie (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (tu "Sambrook i wsp., 1989"). Następnie mogą być one eksprymowane w prokariotycznych lub eukariotycznych układach ekspresyjnych w celu wytworzenia pożądanych peptydów. Nośniki Dla zapewnienia pomocy komórek T, antygeny epitopu Abeta (4-10) według wynalazku, takie jak opisane w tym zgłoszeniu, mogą być sprzęgane z cząsteczką nośnika. Zalecane cząsteczki nośnika, do których kowalencyjnie przyłącza się (sprzęga) antygeny według wynalazku są nietoksyczne, farmaceutycznie dopuszczalne i o wystarczającej do wytworzenia odpowiedzi immunologicznej u ssaków wielkości. Przykłady odpowiednich cząsteczek nośnika obejmują toksoid tężca, hemocyjaninę ze sk a- łoczepa (KLH) i peptydy odpowiadające epitopom komórek T (to jest T1 i T2) glikoproteiny otoczkowej gp120, które mogą zastępować cząsteczki nośnikowe niepochodzące z wirusa AIDS (Cease, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84: 4249, 1987; Kennedy i wsp., J. Biol. Chem. 262: 5769, 1987). Peptydy mogą być również podawane z farmaceutycznie dopuszczalnym adiuwantem, na przykład, tzw. Alum", lub sprzęgane z cząsteczkami nośnika bardziej immunogennymi niż toksoid tężca. Wiązanie cząsteczki nośnika z antygenem peptydowym według wynalazku może być albo bezpośrednie albo za pomocą cząsteczki rozdzielającej. Cząsteczki rozdzielające są, dogodnie, nietoksyczne i reaktywne. Odpowiednią cząsteczkę rozdzielającą do wiązania sekwencji Abeta (4-10), lub jej części, z cząsteczką nośnika mogą zapewnić dwie reszty glicyny dodane na aminokońcowym końcu peptydu; ewentualnie, sekwencje Abeta (4-10), lub ich części, mogą być przykładowo syntetyzowane w bezpośrednim sąsiedztwie do, przykładowo, innej immunogennej sekwencji amyloidu. W celu sprzęgania z cząsteczką nośnika cysteiny można dodać albo na N lub C końcu peptydu Abeta (4-10) albo, w celu utworzenia większych agregatów molekularnych, można przyłączać je do obu końców w celu ułatwienia polimeryzacji międzyłańcuchowej za pomocą tworzenia wiązań disiarczkowych. Sprzęganie cząsteczki nośnika z peptydem dokonywane jest z użyciem środka sprzęgającego. Dogodnie stosuje się heterofunkcyjny środek sprzęgający - ester M-maleimidobenzoilo-N- -hydroksysukcynoimidu (MBS) lub związek rozpuszczalny w wodzie ester m-maleimidobenzoilosulfosykcynoimidu (sulfo-mbs), jak opisano przez Green i wsp., Cell, 28: 477 (1982); oraz przez Palker i wsp., Proc. Nat' Acad. Sci. U.S.A. 84: 2479 (1987). Do sprzęgania peptydów z innymi cząsteczkami dostępnych jest wiele innych środków sprzęgających, takich jak aldehyd glutarowy. Sposoby sprzęgania są dobrze znane w dziedzinie. Patrz przykładowo rozdział 9 (strony ) i rozdział 11 (strony ) w Bioconjugate Techniques autorstwa G.T. Hermanson, Academic Press, San Diego 1996). Adiuwanty Dwie z charakterystycznych cech antygenów to ich immunogenność lub zdolność do indukowania odpowiedzi immunologicznej in vivo (włączając tworzenie specyficznych przeciwciał), oraz ich antygenowość, to jest zdolność do selektywnego rozpoznawania przez przeciwciała, kt ó- re są specyficzne wobec sekwencji i struktury. Pewne antygeny są jedynie słabo immunogenne w przypadku gdy podawane są same. W konsekwencji, słabo immunogennemu antygenowi może nie udać się wzbudzenie odpowiedzi immunologicznej niezbędnej do zapewnienia skutecznej immunoterapii lub ochrony dla organ i- zmu.

15 PL B1 15 Immunogenność antygenu można zwiększyć poprzez podawanie go w mieszaninie z substancjami dodatkowymi, nazywanymi adiuwantami. Adiuwanty działają tak, by zwiększyć odp o- wiedź immunologiczną wobec antygenu albo poprzez działanie bezpośrednio na układ immu nologiczny, albo przez zapewnienie powolnego uwalniania antygenu. Zatem, adiuwant modyfikuje farmakokinetyczne właściwości antygenu i wydłuża czas oddziaływania między antygenem a układem immunologicznym. Zastosowanie adiuwantów jest dobrze znane w dziedzinie i zastosować można wiele różnych adiuwantów. Wytwarzanie kompozycji immunogennych oraz zastosowanie adiuwantów opisane jest ogólnie w Vaccine Design--The subunit and adjuvant approach (Wyd. Powell and Newman) Pharmaceutical Biotechnology tom 6 Plenum Press Najbardziej rozpowszechnionymi adiuwantami są adiuwanty w postaci kompletnego adiuwanta Freund'a, emulsja zawierająca martwe mykobakterie w roztworze soli fizjologicznej w oleju mineralnym oraz niekompletny adiuwant Freund'a, który nie zawiera mykobakterii. Adiuwanty zdolne są albo do zwiększania intensywności odpowiedzi immunologicznej wobec antygenu, albo do wywoływania specyficznej aktywacji układu immunologicznego. Istnieje pięć ogólnych kategorii adiuwantów obejmujących (1) sole glinu, takie jak wodorotlenek glinu lub fosforan glinu; (2) środki powierzchniowo czynne, takie jak saponina i Quill A, Quill A/ISCOMs, bromek dimetylo-dioktadecylo-amonu/arwidyna; (3) polianiony; (4) pochodne bakteryjne, takie jak kompletny Freund'a, N-acetylomuramylo-L-alanylo-D-izoglutamina (dipeptydy muramylowe), N-acetylomuramylo-L-treonylo-D-izoglutamina (treonylo MDP); (5) podłoża i materiały do powolnego uwalniania, takie jak niekompletny Freund'a (emulsja olejowa), liposomy. Patrz New Generation Vaccines, Rozdział 11, strony , Adjuvants for a New Generation of Vaccines autorstwa A.C. Allison i N.E. Byars, Marcel Dekker, Nowy Jork, 1990). Kompozycje immunogenne według niniejszego wynalazku zawierają antygen i adiuwant. Odpowiednie adiuwanty obejmują alum", który jest solą glinu, taką jak żel wodorotlenku glinu lub fosforanu glinu, ale również może być to sól wapnia, żelaza lub cynku. Inne odpowiednie adi u- wanty obejmują nierozpuszczalne zawiesiny acylowanej tyrozyny lub acylowane cukry, pochodne kationowe lub anionowe polisacharydów lub polifosfazeny. Do stworzenia układu adiuwantowego można zastosować kombinacje adiuwantów. Odpowiednie układy adiuwantowe obejmują, na przykład, kombinację monofosforylolipidu A, dogodnie 3-de-O-acylowany monofosforylolipid A (3D-MPL) wraz z solą glinu. Alternatywny układ adiuwantowy obejmuje, na przykład, RIBI ADJUVANT SYSTEM TM, który stanowi kombinację monofosforylolipidu A, dogodnie 3-de-0-acylowany monofosforylolipid A (3D-MPL), syntetyczny dikorynomykolan trehalozy (ang. trehalose dicorynomycolate) oraz materiały szkieletu ściany komórkowej. Wzmocniony układ obejmuje kombinację monofosforylolipidu A i pochodnej saponiny, zwłaszcza kombinację QS21 i 3D-MPL jak ujawniono w publikacji WO 94/00153, lub mniej reaktogenną kompozycję, w której QS21 jest tłumiony jak ujawniono w publikacji WO 96/ Szczególnie silny preparat adiuwanta wykorzystujący QS21, 3D-MPL i tokoferol w emulsji olej/woda opisany jest w WO 95/17210 i jest on preparatem zalecanym. Ewentualnie kompozycje immunogenne według niniejszego wynalazku mogą być zawarte w liposomach lub nośnikach jak opisano w patencie U.S.A. dla Fullerton, o nr 4,235,877. Struktura przeciwciała W niniejszym wynalazku bierze pod uwagę przeciwciała lub ich fragmenty wiążące antygen, które wiążą się z epitopem Abeta (4-10) i hamują odkładanie się amyloidu oraz tworzenie włókienek. Ogólnie, wiadomo, że podstawowa jednostka strukturalna przeciwciała zawiera tetramer. Każdy tetramer zawiera dwie identyczne pary łańcuchów polipeptydowych, każda para ma jeden łańcuch "lekki" (około 25 kda) i jeden łańcuch "ciężki" (około kda). Aminokońcowa część każdego łańcucha może zawierać region zmienny o około 100 do 110 lub więcej aminokwasach odpowiedzialny głównie za rozpoznanie antygenu. Karboksy-końcowa część każdego łańcucha może definiować region stały, odpowiedzialny głównie za funkcję efektorową. Zazwyczaj, ludzkie łańcuchy lekkie klasyfikuje się jako łańcuchy lekkie kappa i lambda. Ponadto, ludzkie łańcuchy ciężkie klasyfikuje się zazwyczaj jako łańcuchy ciężkie mu, delta, gamma, alfa lub epsilon, i definiują one izotyp przeciwciała odpowiednio jako IgM, IgD, IgG, IgA i IgE. W łańcuchach lekkich i ciężkich regiony zmienne i stałe połączone są razem poprzez region "J" o około 12 lub więcej aminokwasach, przy czym łańcuch ciężki zawiera również region "D" o około 10 lub więcej aminokwasach. Patrz J.K. Frazer i J.D. Capra, "Inmunoglobulins: Structure and Function", str w Funda-

16 16 PL B1 mental Immunology, Wydanie Czwarte, wydane przez W.F. Paul, Lippencott-Raven, Filadelfia, PA (1999) (Frazer). Regiony zmienne każdej pary łańcuch lekki/ciężki mogą tworzyć miejsce wiązania przeciwciała. Zatem, ogólnie, nienaruszone przeciwciało ma dwa miejsca wiązania antygenu. Za wyjątkiem bifunkcyjnych lub bispecyficznych przeciwciał, te dwa miejsca są, uogólniając, takie same. Zazwyczaj, wszystkie łańcuchy wykazują taką samą strukturę ogólną o względnie konserwowanych regionach zrębowych (FR) połączonych trzema regionami hiperzmiennymi, nazywanymi również regionami determinującymi dopasowanie lub CDR. CDR z dwóch łańcuchów każdej pary są zazwyczaj dopasowane z regionami zrębowymi, umożliwiając wiązanie ze specyficznym epitopem. Ogólnie ujmując, od N- do C- końca, łańcuchy lekkie i ciężkie obejmują domeny FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. Przypisanie aminokwasów do każdej domeny następuje, uogólniając, zgodnie z definicjami zawartymi w Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 i 1991)), lub Chothia, i wsp., J Mol. Biol. 196: (1987); Chothia, i wsp., Nature 342: (1989). Typy przeciwciał Termin "cząsteczka przeciwciała" obejmuje, ale bez ograniczenia, przeciwciała i ich fra g- menty. Termin obejmuje przeciwciała monoklonalne, przeciwciała poliklonalne, przeciwciała b i- specyficzne, fragmenty Fab przeciwciała, fragmenty F(ab) 2 przeciwciała, fragmenty Fv przeciwciała (np. V H lub V L ), jedno łańcuchowe fragmenty Fv przeciwciała i fragmenty dsfv przeciwciała. Ponadto, cząsteczki przeciwciał mogą być w pełni ludzkimi przeciwciałami, przeciwciałami hum a- nizowanymi lub przeciwciałami chimerycznymi. Zalecane cząsteczki przeciwciał stanowią przeciwciała monoklonalne, całkowicie ludzkie. Zalecane cząsteczki przeciwciał anty-abeta (4-10) rozpoznają ludzkie białka i peptydy amyloidu Abeta; jednakże niniejsze ujawnienie obejmuje również cząsteczki przeciwciał, które rozp o- znają białka i peptydy amyloidu Abeta innych gatunków, dogodnie ssaków (np. myszy, szczura, królika, owcy lub psa). Ponadto, przeciwciała anty-abeta (4-10) mogą pochodzić z ludzkiego przeciwciała monoklonalnego. Takie przeciwciała uzyskiwane są z myszy transgenicznych, które zostały tak zmienione, żeby w odpowiedzi na prowokację antygenem wytwarzały specyficzne, ludzkie przeciwciała. W tej technice elementy lokus ludzkich łańcuchów lekkich i ciężkich wprowadza się do szczepów myszy uzyskanych z linii zarodkowych komórek macierzystych, które zawierają celowane przerwy w endogennych loci łańcucha ciężkiego i lekkiego. Myszy transgeniczne mogą wytwarzać ludzkie przeciwciała specyficzne dla antygenów ludzkich, a myszy mogą być stosowane do wytwarzania hybrydom wydzielających ludzkie przeciwciała. Sposoby uzyskiwania ludzkich przeciwciał z myszy transgenicznych są opisane przez Green i wsp., Nature Genet. 7: 13 (1994), Lonberg i wsp., Naturę 368: 856 (1994) i Taylor 10 i wsp., Int. Immun. 6: 579 (1994). W zalecanej postaci realizacji w pełni ludzkie przeciwciała monoklonalne skierowane przeciwko Abeta (4-10) wytwarza się z użyciem myszy transgenicznych niosących części ludzkiego układu immunologicznego zamiast układu immunologicznego myszy. Te myszy transgeniczne, do których można się tu odnosić jako do myszy "HuMAb", zawierają ludzkie miniloci genu immunoglobuliny, które koduje niepoddane rearanżacji sekwencje ludzkich immunoglobulin łańcucha ciężkiego (mu i gamma) oraz łańcucha lekkiego kappa, wraz z celowanymi mutacjami, które inaktywują endogenne loci łańcucha mu i kappa (Lonberg, N., i wsp., (1994) Nature 368 (6474): ). W związku z powyższym myszy wykazują zmniejszoną ekspresję mysich IgM lub kappa, a w odpowiedzi na immunizację, wprowadzone transgeny ludzkiego łańcucha lekkiego i ciężkiego poddawane są przełączaniu klas oraz mutacjom somatycznym z wytworzeniem ludzkich monoklonalnych przeciwciał IgG o wysokim powinowactwie (Lonberg, N., i wsp., (1994), powyżej; przegląd w Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113: ; i Lonberg, N., i wsp., (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: Wytwarzanie myszy HuMab jest powszechnie znane w dziedzinie i opisane w, przykładowo, Lonberg, i wsp., (1994) Nature 368(6474): ; Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113: ; Lonberg, N., i wsp., (1995) Intern. Rev. Immunol, tom 13: 65-93; Fishwild, D., i wsp., (1996) Nature Biotechnology 14: Patrz ponadto, Patenty U.S.A. o numerach 5,814,318; 5,874,299; i 5,770,429; wszystkie dla Lonberg i Kay, oraz GenPharm International; Patent U.S.A. nr 5,545,807 dla Surani, i wsp.

17 PL B1 17 W celu wytworzenia w pełni ludzkich przeciwciał monoklonalnych przeciwko Abeta (4-10), myszy HuMab można immunizować kompozycjami zawierającymi antygen Abeta (4-10) według niniejszego wynalazku. Dogodnie, po pierwszej immunizacji, myszy będą w wieku 6-16 tygodni. Przykładowo, kompozycje immunogenne zawierające antygen Abeta (4-10) według niniejszego wynalazku mogą być stosowane do śródotrzewnowej immunizacji myszy HuMab. Myszy mogą być ró w- nież immunizowane całymi komórkami HEK293, które są stabilnie transformowane lub transfekowane genem zawierającym Abeta (4-10). "Antygenowy polipeptyd Abeta (4-10) " może odnosić się do polipeptydu Abeta (4-10) lub jego dowolnego fragmentu, który wzbudza odpowiedź immnunologiczną anty-abeta (4-10) u myszy HuMab. Ogólnie, myszy transgeniczne HuMAb odpowiadają najlepiej w przypadku gdy wstępnie immunizowane są śródotrzewnowo (IP) antygenem w kompletnym adiuwancie Freund'a, po czym w każdym następnym tygodniu immunizacjami IP (zazwyczaj do całkowitej ilości 6) antygenem w niekompletnym adiuwancie Freund'a. Myszy mogą być immunizowane, początkowo, komórkami z ekspresją Abeta (4-10) (np. stabilnie transformowane komórki HEK293), po czym rozpuszczalnym fragmentem antygenu zawierającym Abeta (4-10), takim jak kompozycje immunogenne według niniejszego wynalazku, i w sposób ciągły otrzymywać naprzemienne immunizację dwoma antyg e- nami. Odpowiedź immunologiczną można monitorować podczas trwania protokołu immunizacji w próbkach osocza uzyskiwanych przez skrwawianie pozaoczodołowe lub ogona. Osocze można następnie poddawać badaniu pod kątem obecności przeciwciał anty-abeta (4-10), na przykład za pomocą ELISA, a myszy z wystarczającymi mianami immunoglobulin można wykorzystywać do fuzji. 3 dni przed uśmierceniem i usunięciem śledziony myszy mogą być stymulowane dożylnie podanym antygenem. Oczekuje się, że potrzebne może być przeprowadzenie 2-3 fuzji dla każdego antygenu. Dla każdego antygenu można immunizować kilka myszy. Przykładowo, można i m- munizować całkowitą ilość dwunastu myszy HuMAb szczepów HC07 i HC012. Komórki hybrydoma, które wytwarzają monoklonalne, w pełni ludzkie przeciwciała anty- Abeta (4-10) mogą być następnie wytwarzane za pomocą sposobów powszechnie znanych w dziedzinie. Sposoby te obejmują, ale bez ograniczenia, techniki hybrydom oryginalnie opracowane przez Kohler, i wsp., Nature 256: (1975); jak również technikę triomy opracowaną przez Hering, i wsp., Biomed. Biochim. Acta. 47: (1988) oraz Hagiwara, i wsp., Hum. Antibod. Hybridomas 4: 15 (1993); technikę hybrydomy ludzkich komórek B (Kozbor, i wsp., Immunology Today 4: ); oraz Cote, i wsp.. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 80: (1983); oraz technikę hybrydomy EBV- (Cole, i wsp., w Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., str , 1985). Dogodnie mysie splenocyty izoluje się i poddaje fuzji z PEG z mysią linią komórkową szpiczaka według standardowych protokołów. Powstałe tak hybrydomy przeszukuje sie następnie pod kątem wytwarzania przeciwciał specyficznych dla antygenu. Przykładowo, zawiesiny pojedynczych komórek z limfocytów śledziony od immunizowanych myszy poddaje się fuzji z jedną szóstą liczby niewydzielających mysich komórek szpiczaka P3X63-Ag8.653 (ATCC, CRL 1580) z 50% PEG. Komórki umieszcza się na płytkach płaskodennych do mikromiareczkowania w przybliżeniu w ilości 2 x 10 5 komórek, po czym następuje dwu tygodniowa inkubacja w pożywce selekcyjnej zawierającej 20% płodową surowicę cielęcą, 18% kondycjonowane pożywki "653", 5% origen (IGEN), 4 mm L-glutaminę, 1 mm L-glutaminę, 1 mm pirogronian sodu, 5 mm HEPES, 0,055 mm 2-merkaptoetanol, 50 jednostek/ml penicyliny, 50 mg/ml streptomycyny, 50 mg/ml gentamycyny i IX HAT (Sigma; HAT dodaje się 24 godziny po fuzji). Po dwóch tygodniach komórki hoduje się w pożywce, w której HAT zastępuje się HT. Poszczególne studzienki przeszukuje się następnie za pomocą ELISA pod kątem ludzkich monoklonalnych przeciwciał IgM i IgG anty-abeta (4-10). Po wystąpieniu intensywnego wzrostu hybrydomy, pożywkę obserwuje się zazwyczaj po dniach. Hybrydomy wydzielające przeciwciała przenosi się na nowe płytki, przeszukuje ponownie i jeżeli wciąż są pozytywne pod względem ludzkich przeciwciał monokl o- nalnych IgG anty- Abeta (4-10), mogą być one subklonowane przynajmniej dwukrotnie poprzez ograniczające rozcieńczenia. Stabilne subklony hoduje się następnie w hodowli tkankowej in vitro w celu wytworzenia małych ilości przeciwciała do charakteryzacji. Cząsteczki przeciwciał anty-abeta mogą być również wytwarzane rekombinacyjnie (np. w układzie ekspresyjnym E.coli/T7 jak dyskutowano powyżej). W tej postaci realizacji kwasy n u- kleinowe kodujące cząsteczki przeciwciała (np. V H lub V L ) wprowadzane są do plazmidu opartego na pet i poddawane ekspresji w układzie E.coli/T7. Istnieje kilka sposobów wytwarzania przeciwciał rekombinacyjnych, które są dobrze znane w dziedzinie. Jeden z przykładów sposobu wytw a-

18 18 PL B1 rzania przeciwciał rekombinacyjnych ujawniony jest w Patencie U.S.A. nr 4,816,567. Cząsteczki przeciwciała mogą być również wytwarzane rekombinacyjnie w komórkach CHO lub NSO. W stosowanym tu znaczeniu termin "przeciwciało monoklonalne" odnosi się do przeciwciała uzyskanego z populacji zasadniczo homogennych przeciwciał, tj. poszczególne przeciwciała składające się na populację są identyczne za wyjątkiem możliwych naturalnie występujących mutacji, które mogą występować w niewielkich ilościach. Przeciwciała monoklonalne są wysoko specyfic z- ne, ukierunkowane przeciwko pojedynczemu miejscu antygenowemu. Zaletą przeciwciał monoklonalnych jest to, że mogą być one syntetyzowane przez hodowlę hybrydomy, zasadniczo niez a- nieczyszczoną innymi immunoglobulinami. Modyfikator "monoklonalne" wskazuje na charakter przeciwciała uzyskiwanego z zasadniczo homogennej populacji przeciwciał i nie ma być rozumiany jako wymagający wytwarzania przeciwciała jakąkolwiek szczególną metodą. Jak wspomniano powyżej, przeciwciała monoklonalne, które mają być użyte zgodnie z wynalazkiem mogą być w y- twarzane z użyciem sposobu hybrydomy opisanego po raz pierwszy przez Kohler, i wsp., Nature 256: 495 (1975). Przeciwciało poliklonalne oznacza przeciwciało, które zostało wytworzone wśród innych lub w obecności innych przeciwciał. Ogólnie, przeciwciała poliklonalne, wytwarza się z limfocytów B w obecności kilku innych limfocytów B, które wytwarzały inne, nieidentyczne przeciwciała. Zazwyczaj, przeciwciała monoklonalne wytwarza się bezpośrednio w immunizowanym zwierzęciu. Termin "przeciwciało w pełni ludzkie" odnosi się do przeciwciała, które obejmuje jedynie sekwencje ludzkich immunoglobulin. Podobnie, "przeciwciało mysie" odnosi się do przeciwciała, które obejmuje jedynie sekwencje immunoglobulin mysich. Niniejsze ujawnienie obejmuje "przeciwciało chimerowe" - przeciwciało, które obejmuje ujawniony tu region zmienny poddany fuzji lub w postaci chimery z regionem przeciwciała (np. regionem stałym) z innego gatunku niż człowiek (np. mysz, koń, królik, pies, krowa, kurczak). Te przeciwciała mogą być stosowane do modulowania ekspresji lub aktywności Abeta (4-10) u gatunków innych niż człowiek. "Przeciwciało humanizowane" odnosi się do przeciwciała, które zawiera CDR nie człowieka w zrębie skądinąd przeciwciała ludzkiego lub region zmienny nieczłowieka przyłączony do regionu stałego skądinąd przeciwciała ludzkiego. W niniejszym ujawnieniu bierze się również pod uwagę przeciwciała humanizowane, które zawierają CDR lub region zmienny z gatunku innego niż czł o- wiek, który obejmuje ujawnioną tu sekwencję aminokwasową regionu zmiennego lub CDR. Immunoglobuliny można przypisać do różnych klas w zależności od sekwencji aminokwasowych domeny stałej ich łańcuchów ciężkich. Występuje przynajmniej pięć głównych klas imm u- noglobulin: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM a kilka z nich można ponadto podzielić na podklasy (izotypy), np. IgG-1, IgG-2, IgG-3 i IgG-4; IgA-1 i IgA-2. Ujawnione tu cząsteczki przeciwciała stanowią dogodnie IgG-1 lub IgG-4. Ujawnione tu przeciwciała według wynalazku mogą być sprzężone ze znacznikami izotopowymi, takimi jak 99 Tc, 90 Y, 111 In, 32 P, 14 C, 125 I, 3 H, 131 I, 11 C, 15 O, 13 N, 18 F, 35 S, 51 Cr, 57 To, 226 Ra, 60 Co, 59 Fe, 57 Se, 152 Eu, 67 Cu, 217 Ci, 211 At, 212 Pb, 46 Sc, 109 Pd, 234 Th, i 40 K, oraz znacznikami nie radioizotopowymi, takimi jak 157 Gd, 55 Mn, 52 Tr, 56 Fe. Ujawnione tu przeciwciała według wynalazku mogą być sprzężone ze znacznikami fluorescencyjnymi lub chemiluminescencyjnymi, włączając fluorofory, takie chelaty pierwiastków ziem rzadkich, fluoresceina i jej pochodne, rodamina i jej pochodne, izotiocyjanina, fikoerytryna, fikocyjanina, allofikocyjanina, aldehyd o-ftalowy, fluoreskamina, 152 Eu, dansyl, umbeliferon, lucyferyna, znacznik luminalowy, znacznik izoluminalowy, znacznik aromatyczny ester akrydyny, znacznik imidazolowy, znacznik sól akrydyny, znacznik ester szczawianu, znacznik ekworynowy, 2,3-dihydroftalazynodiony, biotyna/awidyna, znaczniki spinowe oraz trwałe wolne rodniki. Do sprzęgania ujawnionych tu cząsteczek przeciwciał z różnymi ugrupowaniami można z a- stosować dowolną technikę znaną w dziedzinie, włącznie ze sposobami opisanymi przez Hunter, i wsp., Nature 144: 945 (1962); David, i wsp., Biochemistry 13: 1014 (1974); Pain, i wsp., J. Immunol. Meth. 40: 219 (1981); i Nygren, J., Histochem. and Cytochem. 30:1407 (1982). Sposoby sprzęgania przeciwciał są sposobami konwencjonalnymi i dobrze znanymi w dziedzinie. Ujawniono tu również pewne sposoby terapeutyczne oparte na podawaniu kompozycji immunogennych zawierających Abeta (4-10) lub cząsteczek, które wiążą się z peptydami Abeta. Zatem, antygeny zawierające Abeta (4-10) mogą być podawane w celu hamowania nasilonego odkładania się płytek amyloidowych w starzeniu, chorobach człowieka, takich jak choroba Alzheimera.

19 PL B1 19 Ujawniono tu również sposoby wytwarzania, identyfikowania, oczyszczania, charakteryzowania antygenów i analogów Abeta (4-10) ; oraz sposoby stosowania antygenów i analogów Abeta (4-10) ). Antygeny Abeta (4-10) mogą być wytwarzane poprzez modyfikacje, włączając cięcie proteolityczne większych peptydów amyloidu izolowanych ze źródeł naturalnych, z użyciem technik inżynierii genetycznej, lub syntezy chemicznej, np. syntezy peptydów w fazie stałej; lub mogą być wytwarzane de novo z użyciem metodologii inżynierii genetycznej lub syntezy peptydów w fazie stałej. Biologia molekularna W niniejszym wynalazku wykorzystane mogą być znane w dziedzinie konwencjonalne techniki biologii molekularnej, mikrobiologii i rekombinacji DNA. Techniki tego rodzaju zostały w pełni wyjaśnione w literaturze. Patrz, przykładowo, Sambrook, Pritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Wydanie Drugie (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (tutaj "Sambrook i wsp., 1989"); DNA Cloning: A Practical Approach, tomy I i II (wyd. D. N. Glover 1985); Oligonucleotide Synthesis (wyd. M. J. Gait 1984); Nucleic Acid Hybridization [wyd. B. D. Hames & S. J. Higgins (1985)]; Transcription And Translation [wyd. B. D. Hames & S. J. Higgins, (1984)]; Animal Cell Culture [wyd. R. I. Freshney, (1986)]; Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F. M. Ausubel i wsp. (wyd.). Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994). Myszy CRND 8 Myszy TgCRMDS stanowią model zwierzęcy AD, w którym występują duże poziomy syntezy Abeta i odkładania się amyloidu w CNS w wieku 3 miesięcy. Patrz publikacja międzynarodowa nr W001/97607 opublikowana 12/27/01. Ponadto, myszy TgCRNDS wykazują zmiany w funkcjach poznawczych w tym samym okresie czasu co zapoczątkowanie odkładania się amyloidu. Model myszy transgenicznej TgCRND8 cechuje się dużym podobieństwem z naturalnie występującym fenotypem choroby Alzheimera, w oparciu o ekspresję w CNS białka amyloidu Abeta, jak również analizę histologiczną, neurologię i deficyty behawioralne. W celu wytworzenia trzech powszechnych izoform, gen APP poddawany jest alternatywnemu splicingowi. W większości tkanek ekspresji ulega najdłuższa izoforma, zawierająca 770 am i- nokwasów (APP 770 ) i druga co do długości izoforma zawierająca 751 aminokwasów (APP 751 ). Trzecia, najkrótsza, izoforma zawierająca 695 aminokwasów (APP 695 ), ulega ekspresji głównie w mózgu. Zwyczajowo numeracja kodonów najdłuższej izoformy, APP 770, stosowana jest nawet w przypadku odnoszenia się do krótszych izoform. Mysz transgeniczna TgCRND8 zawiera transgen eksprymujący zmutowaną postać specyficznej dla mózgu izoformy APP 695 ; transgen ten przenosi obydwie mutacje APP szwedzką i "Indiana". cdna APP 695 wytworzono tak, że zawiera (stosując numerację kodonów APP 695 ) mutacje K595N/M596L (mutacja szwedzka i V642F (mutacja Indiana). Do tych i innych mutacji APP będzie się tu ogólnie odnosić stosując bardziej powszechny system numerowania kodonów APP 770 tzn. dla tych mutacji, K670N/M671L (mutacja szwedzka) i V717F (mutacja Indiana). Kasetę cdna podwójnego mutanta APP 695 wstawiono do kosmidowego wektora ekspresyjnego, costet, który zawiera promotor białka prionowego chomika syryjskiego. Wektor wprowadzono za pomocą mikrowstrzyknięcia do oocytu myszy w celu stworzenia transgenicznej linii TgCRND8. U myszy tych w wieku trzech miesięcy występują mnogie rozlane złogi amyloidowe, w którym to okresie widoczne są deficyty w uczeniu przestrzennym. W celu wytworzenia myszy bitransgenicznych, myszy TgCRND8 krzyżowano z wieloma innymi myszami transgenicznymi obciążonymi mutacjami związanymi z AD, które wykazują jeszcze inne nasilone neuropatologie związane z AD. Podawanie i zastosowania medyczne Ujawniono tu również sposoby stosowania antygenu Abeta (4-10) do identyfikacji leków, które zakłócają wiązanie się Abeta 42 z płytkami. Jeden z takich aspektów obejmuje oznaczenia do wyszukiwania leków w celu identyfikacji leków, które naśladują i/lub uzupełniają wpływ Abeta 42. W jednej z takich postaci realizacji bibliotekę leku przeszukuje się poprzez oznaczanie aktywności wiązania peptydu zawierającego Abeta (4-10) ze specyficzną małą cząsteczką. Monitoruje się wpływ ewentualnego leku na powinowactwo Abeta 42 do płytek. Jeżeli lek zmniejsza powinowactwo wiązania Abeta 42 do płytek, staje się lekiem kandydującym. Leki mogą być wyszukiwane pod względem ich zdolności do przerywania tworzenia się płytek, powstrzymywania procesu włókienkog e- nezy lub deagregacji już utworzonych włókienek.

20 20 PL B1 Antygeny, przeciwciała lub inne związki użyteczne w niniejszym wynalazku mogą być wprowadzane jako komponenty kompozycji farmaceutycznej. Kompozycje farmaceutyczne zawierają dogodnie terapeutyczną lub profilaktyczną ilość przynajmniej jednego z antygenów, przeciwciał lub innych ich związków z farmaceutycznie skutecznym nośnikiem. Do wytwarzania kompozycji farmaceutycznych użytecznych w niniejszych sposobach należy zastosować taki nośnik farmaceutyczny, który jest dla pacjenta substancją zgodną, nietoksyczną, odpowiednią do dostarczania antygenów, przeciwciał lub ich fragmentów wiążących lub związków terapeutycznych zidentyfikowanych zgodnie ze sposobami tu ujawnionymi. Jako nośnik stosowane mogą być jałowa woda, alkohol, tłuszcze, woski, obojętne ciała stałe a nawet liposomy. Do kompozycji farmaceutycznych wprowadzone mogą być również farmaceutycznie dopuszczalne adiuwanty (środki buforujące, środki dyspergujące). Przeciwciała i kompozycje farmace u- tyczne je zawierające są szczególnie użyteczne do podawania pozajelitowego, tj. dożylnie, dotę t- niczo, śródmięśniowo lub podskórnie. Jednakże, użyteczne są również preparaty donosowe i inne preparaty aerozolowe. Stężenie związku takiego jak przeciwciało w preparacie do podawania może się znacząco różnić, tj. od poniżej około 0,5%, zazwyczaj przynajmniej 1% aż do 15 lub 20% lub więcej wagowo, i wybiera się je głównie na podstawie objętości cieczy, lepkości itp., zalecanych dla szczególnej wybranej drogi podawania. Właściwe sposoby wytwarzania kompozycji do podawania będą znane lub oczywiste dla specjalistów w dziedzinie i opisane zostały szczegółowo, przykładowo, w Remington's Pharmaceutical Science, wydanie 18-ste, Mack Publishing Co., Easton, Pa. (1990). Kompozycje immunogenne według niniejszego wynalazku, albo ewentualnie opisane tu przeciwciała lub ich fragmenty wiążące antygen podaje się w terapeutycznie skutecznych dawkach wystarczających do modulowania odkładania się u podmiotu amyloidu (lub złogów amyl o- idu). "Terapeutycznie skuteczna dawka" dogodnie moduluje odkładanie się amyloidu o przynajmniej około 20%, dogodniej o przynajmniej około 40%, jeszcze dogodniej o przynajmniej około 60%, i jeszcze dogodniej o przynajmniej około 80% względem podmiotów niepoddawanych tra k- towaniu. Zdolność sposobu do modulowania odkładania się amyloidu można oceniać na układach modelowych, które mogą przewidywać skuteczność w modulowaniu odkładania się amyloidu w chorobach człowieka, takich jak modele zwierzęce znane w dziedzinie, włączając, np. sposób opisany w publikacji PCT nr WG 96/28187) lub sposobami in vitro, np. sposobem Chakrabartty'ego opisanym w publikacji PCT nr WO 97/07402, lub na opisanym tu układzie modelowym TgCRND8. Ponadto, ilość lub rozmieszczenie złogów amyloidu u podmiotu można w sposób nie inwazyjny monitorować in vivo, na przykład, przez zastosowanie znakowanych radioaktywnie wskaźników, które mogą asocjować ze złogami amyloidu, po czym przeprowadza się scyntygrafię dla zobrazowania złogów amyloidu (patrz np. Aprile, C. i wsp., Eur. J. Nuc. Med. 22: 1393 (1995); Hawkins, P. N., Baillieres Clin. Rheumatol. 8:635 (1994) i odsyłacze tam cytowane). Zatem, przykładowo, w celu określenia wpływu związku terapeutycznego na odkładanie się złogów amyloidu u podmiotu można oceniać, po okresie leczenia zgodnie ze sposobami według wynalazku, ilość złogów amyloidu u podmiotu i porównywać z ilością złogów u podmiotu przed rozpoczęciem leczenia związkiem terapeutycznym według wynalazku. Powinno być zrozumiałym, że zdolność opisanego tu sposobu do modulowania odkładania się amyloidu lub ilości złogów amyloidu można, w pewnych postaciach realizacji, oceniać poprzez obserwowanie objawów i oznak związanych z odkładaniem się amyloidu lub ilością złogów amyl o- idu in vivo. Zatem, przykładowo, zdolność opisanego tu sposobu do zmniejszania odkładania się amyloidu lub ilości złogów amyloidu może być związana z możliwą do zaobserwowania poprawą objawów klinicznych choroby lub stanu związanych ze złogami amyloidu, lub spowolnieniem albo opóźnieniem postępu objawów stanu chorobowego. Zatem, monitorowanie objawów klinicznych choroby może być użyteczne do oceny skuteczności opisanego tu sposobu do modulowania amyloidu. Sposoby tu opisane mogą być użyteczne do leczenia skrobawicy związanej z innymi chor o- bami, w których występuje odkładanie się amyloidu. Klinicznie skrobawica może być określona jako pierwotna, wtórna, rodzinna i izolowana. Amyloidy zostały podzielone na kategorie ze względu na typ białka amyloidowego zawartego w amyloidzie. Nieograniczające przykłady amyloidów, które można modulować, w oparciu o identyfikację ich białek amyloidowych, są następujące (związana z nimi choroba podana jest w nawiasie po białku amyloidowym): beta-amyloid (choroba Alzheimera, zespół Downa, dziedziczny krwotok mózgowy typu duńskiego ze skrobawicą, angi o-