SKUTECZNOŚĆ IZOLACJI JAK ZMIERZYĆ ILOŚĆ KWASÓW NUKLEINOWYCH PO IZOLACJI? JAK ZMIERZYĆ ILOŚĆ KWASÓW NUKLEINOWYCH PO IZOLACJI?

Wielkość: px

Rozpocząć pokaz od strony:

Download "SKUTECZNOŚĆ IZOLACJI JAK ZMIERZYĆ ILOŚĆ KWASÓW NUKLEINOWYCH PO IZOLACJI? JAK ZMIERZYĆ ILOŚĆ KWASÓW NUKLEINOWYCH PO IZOLACJI?"

Bartosz Krajewski
5 lat temu
Przeglądów:

1 SKUTECZNOŚĆ IZOLACJI Wydajność izolacji- ilość otrzymanego kwasu nukleinowego Efektywność izolacji- jakość otrzymanego kwasu nukleinowego w stosunku do ilości Powtarzalność izolacji- zoptymalizowanie procedury pozwalające na otrzymywanie zbliżonej wydajności i tej samej efektywności 2 Podstawowe miary masy i objętości stosowane przy oznaczaniu ilości kwasów nukleinowych : 1g (1) 1l (1) 1mg (1g x 10-3 ) 1ml (1l x 10-3 ) 1μg (1g x 10-6 ) 1μl (1l x 10-6 ) 1ng (1g x 10-9 ) 1pg (1g x ) 3 NUKLEINOWYCH PO IZOLACJI? Przybliżone szacowanie izolowanego DNA: 1 komórka ludzka zawiera ok. 6pg DNA; jeśli próbka zawiera przeciętnie 10 7 komórek, a wydajność izolacji szacujemy na poziomie 80%, to powinniśmy otrzymać ok 48mg DNA Metoda nieskuteczna! - różne rodzaje tkanek będą zawierały różną liczbę komórek; - stopień degradacji DNA w komórkach może być różny; - trudno jest określić faktyczną wydajność stosowanej metody bez odniesienia do kalibratora- żywej komórki 4 1

2 NUKLEINOWYCH PO IZOLACJI? Przybliżone szacowanie izolowanego DNA: krew obwodowa (20-60μg/ml) surowica ( μg/ml) tkanka kostna (2-25μg/mg) nabłonek jamy ustnej w ślinie (5-15μg/ml) W przypadku RNA, metoda ta jest w ogóle niemożliwa, ponieważ nie znamy ilości RNA (niskocząsteczkowego) w komórce oraz nie jesteśmy w stanie określić stopnia degradacji RNA od momentu pobrania tkanki do zakończenia izolacji. 5 Spektrofotometryczny pomiar stężenia DNA lub RNA: Spektrofotometria absorpcyjna w ultrafiolecie to selektywna absorpcja/absorbancja promieniowania elektromagnetycznego przez substancjęw tym przypadku cząsteczki kwasu nukleinowego Cząsteczki DNA i RNA absorbują światło ultrafioletowe o długości 260nm Miernikiem absorpcji jest gęstość optyczna (OD)- optical density mierzona na fotodetektorze OD= log Intensywność światła emitowanego (padającego na detektor) Intensywność światła przechodzącego przez detektor 6 7 NanoDropspektrofotometr wykorzystujący napięcie powierzchniowe do rozciągnięcia kropli roztworu i utworzenia kolumny między dwoma włóknami światłowodów, przepuszczających światło UV (w skali widzialnej). Zakres spektralny urządzenia wynosi od 220 do 750 nm. 2

3 1 OD/A 260 = 50µg/ml dwuniciowej cząsteczki DNA 1 OD/A 260 = 40µg/ml jednoniciowej cząsteczki RNA 1 OD/A 260 = 37µg/ml jednoniciowej cząsteczki DNA W pomiarze spektrofotometrycznym cząsteczki DNA oraz RNA są nierozróżnialne!!! 8 Dodatkowy pomiar absorpcji fali daje możliwość wykrycia zanieczyszczeń w próbce: 230nm (absorbowana przez związki organiczne: fenole; alkohole; izocyjanki) 280nm (absorbowana przez białka) 340nm (zanieczyszczenie próbki substancjami inne niż wymienione) 9 Prawidłowy wykres absorpcji uzyskany w spektrofotometrycznym pomiarze próbki zawierającej kwas nukleinowy 10 3

11 Iloraz OD/A 260 i OD/A 280 lub OD/A 260 i OD/A 230 (ratio) pozwala oszacować czystość kwasów nukleinowych Prawidłowa wartość Ratio A 260 /A 280 oraz A 260 /A 230 dla DNA zawiera się między 1.8-2.

4 11 Iloraz OD/A 260 i OD/A 280 lub OD/A 260 i OD/A 230 (ratio) pozwala oszacować czystość kwasów nukleinowych Prawidłowa wartość Ratio A 260 /A 280 oraz A 260 /A 230 dla DNA zawiera się między Ratio A 260 /A 280 = 2.0 informuje, że maksymalna absorpcja fali przez kwasy nukleinowe (A 260 ) jest 2x większa niż absorpcja fali przez zanieczyszczenia w próbce (czyli, kwasu nukleinowego jest w próbce 200% więcej niż zanieczyszczeń) Prawidłowa wartość Ratio A 260 /A 280 oraz A 260 /A 230 dla RNA zawiera się między Poszczególne oligonukleotydy (w czystej postaci) będą wykazywały różne wartości Ratio A 260 /A 280 : GTP TTP CTP UTP ATP

5 Ratio: A 260 /A 280 =1.8 A 260 /A 230 =2.0 Ratio: A 260 /A 280 =2.0 A 260 /A 230 =0.5 etanol Ratio A 260 /A 280 =1.5 A 260 /A 230 =1.0 fenol/trizol Ratio A 260 /A 280 =0.5 A 260 /A 230 =3.5 EDTA 14 Fluorymetryczny pomiar stężenia DNA lub RNA (spektroskopia fluorescencyjna): oddziaływane fotonów z molekułami powoduje wzbudzenie elektronów walencyjnych. Wzbudzone elektrony spontanicznie powracają do stanu podstawowego, emitując nadmiar energii w postaci światła Związki fluorescencyjne (znaczniki fluorescencyjne) wiążą się specyficznie z DNA i/lub RNA emitując światło o określonej długości Miernikiem emisji jest wydajność kwantowa (Q)- mierzona na fotodiodzie Q= Liczba wyemitowanych fotonów Liczba zabsorbowanych fotonów 15 Bromek etydyny (pochodna akrydyny); DNA (RNA) λabs=493nm; λem=620nm λ- widmo= długość fali, dla której fluorescencja jest największa Hoechst (pochodna bisimidazolu); DNA mniejszy rowek helisy λabs=350nm; λem=461nm 16 5

Reaktywna pochodna cząsteczki fluorescencyjnejfluorofor selektywnie wiąże się ze specyficznym regionem lub grupą funkcyjną w cząsteczce docelowej, może być przyłączony chemicznie lub biologicznie - W

6 Reaktywna pochodna cząsteczki fluorescencyjnejfluorofor selektywnie wiąże się ze specyficznym regionem lub grupą funkcyjną w cząsteczce docelowej, może być przyłączony chemicznie lub biologicznie - W pomiarze fluorymetrycznym cząsteczki DNA oraz RNA są rozróżnialne!!! - Pomiar jest ponad 1000 x czulszy niż spektroskopia - Pomiar nie pozwala wykryć zanieczyszczeń 17 CO ZROBIĆ, GDY STĘŻENIE KWASÓW NUKLEINOWYCH JEST ZBYT MAŁE? Wytrącić etanolem i zawiesić w mniejszej objętości (DNA) Zagęścić 18 6

Podobne dokumenty

JAK ZMIERZYĆ ILOŚĆ KWASÓW NUKLEINOWYCH PO IZOLACJI? JAK ZMIERZYĆ ILOŚĆ KWASÓW NUKLEINOWYCH PO IZOLACJI?

JAK ZMIERZYĆ ILOŚĆ KWASÓW NUKLEINOWYCH PO IZOLACJI? JAK ZMIERZYĆ ILOŚĆ KWASÓW NUKLEINOWYCH PO IZOLACJI? Podstawowe miary masy i objętości stosowane przy oznaczaniu ilości kwasów nukleinowych : 1g (1) 1l (1) 1mg (1g x 10-3 ) 1ml (1l x 10-3 ) 1μg (1g x 10-6 ) 1μl (1l x 10-6 ) 1ng (1g x 10-9 ) 1pg (1g x 10-12