(LAMP) Amplifikacja in vitro wybranych odcinków DNA i RNA metodą Loop-mediated isothermal. AMPlification(LAMP) NOVAZYM POLSKA nr 1 / 2012

Transkrypt

1 NOVAZYM POLSKA nr 1 / 2012 Amplifikacja in vitro wybranych odcinków DNA i RNA metodą Loop-mediated isothermal (LAMP) AMPlification(LAMP) LAMP is registered trademark owned by Eiken Chemical Co., Ltd. Opracowanie: Marta Jankowska Katedra Biotechnologii i Mikrobiologii Żywności Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu Adam Burzyński Novazym Polska POZNAŃ 2012

2 SPIS TREŚCI WSTĘP... 3 LAMP Loop-mediated isothermal AMPlification... 3 Historia... 3 Publikacje naukowe na temat LAMP... 3 Zakres wykorzystywania LAMP:... 4 Wirusy:... 4 Bakterie:... 5 Grzyby:... 6 Pierwotniaki:... 6 GMO:... 6 LAMP - Zasada działania reakcji:... 7 Przykład reakcji (dla 2 par starterów)... 7 Warunki reakcji LAMP:... 9 Projektowanie starterów do LAMP Zasady projektowania starterów do LAMP: Parametry starterów: Programy do projektowania starterów: Detekcja i wizualizacja LAMP Charakterystyka produktów (amplikonów) reakcji LAMP ( LAMPlikons ) Metody detekcji Elektroforeza w żelu agarozowym Analiza turbidymetryczna Analiza turbidymetryczna w czasie rzeczywistym Analiza fluorymetryczna Fluorescencja w czasie rzeczywistym Diagnostyczne wskaźniki wydajności reakcji LAMP Badanie SNP metodą LAMP Oprzyrządowanie, odczynniki i akcesoria dla izotermicznej amplifikacji DNA firmy OptiGene Genie II zinegrowana elastyczna platforma GspSSD Polimeraza: Isothermal Master Mix Zalety i wady LAMP Podsumowanie Bibliografia Strona2

3 WSTĘP LAMP Loop-mediated isothermal AMPlification Nowa metoda amplifikacji kwasów nukleinowych, która pozwala na szybką identyfikację patogenów ludzkich, zwierzęcych i roślinnych. Metoda polega na syntezie nowych nici DNA na matrycy (DNA lub RNA) w kolejnych cyklach reakcji oraz zastępowaniu (wymianie) łańcuchów DNA (ang. Stand displacement) przez łańcuchy nowo zsyntetyzowane. Polimeraza wykorzystywana w reakcji posiada aktywność syntezy nici DNA w kierunku 5 ->3 oraz wymiany nici, nie posiada aktywności egzonuklotydowej Powstałeamplifikowane produkty posiadają strukturę składającą się znaprzemianodwróconychpowtórzeńsekwencjimatrycowej na tym samym łańcuchu, Produkt LAMP jest mieszaniną łańcuchów DNA tworzących struktury typu łodyga-pętla (ang. Stem-loop) różniących się wielkością, Uzyskany produkt posiada wysoką specyficzność do matrycy poprzez zastosowanie 2 par starterów komplementarnych do 6 niezależnych miejsc na matrycy w początkowym etapie reakcji oraz 4 niezależnych miejsc w kolejnych etapach LAMP. Amplifikacja przebiega w warunkach izotermicznych (w stałej temperaturze) Historia 1998 opracowanie metody LAMP przez japońską firmę EIKEN CHEMICAL CO., LTD 2000 pierwsza publikacja naukowa nt. LAMP (Loop-mediatedisothermalamplification of DNA., Notomi T,Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N, Hase T.) 2002 pojawienie się na rynku komercyjnych zestawów do prowadzenia reakcji LAMP 2006 pojawienie się zestawów do wykrywania patogenów w żywności i w środowisku (Cryptosporidium, Salmonella, Escherichia coli, Listeriamonocytogenesetc.) założenie w UK firmy OptiGeneLtd umowa licencyjna pomiędzy OptiGeneLtd i Eiken Chemical Co., Ltd. zezwalające OptiGene na rozwijanie i sprzedaż urządzeń i produktów do prowadzenia LAMP 2011 wprowadzenie na rynek przez OptiGeneLtd w pełni zintegrowanej platformy Genie II do prowadzenia reakcji LAMP w czasie rzeczywistym 2012 umowa pomiędzy Novazym Polska sc i OptiGeneLtd Publikacje naukowe na temat LAMP Wykorzystywanie reakcji LAMP (liczba publikacji na przestrzeni lat, na podstawie PubMED) Rysunek 1Liczba publikacji w latach Strona3

4 Obecnie >600 publikacji, (w publikacji) Zakres wykorzystywania LAMP: Wykrywanie obecności patogenów ludzkich, zwierzęcych i roślinnych, technika wykorzystywana w badaniach weterynaryjnych, środowiskowych, rolnictwie, badaniach żywności, diagnostyce laboratoryjnej. Ponad 200 genówzamplifikowano techniką LAMP Szeroki zakres zastosowań (przykłady poniżej): Wirusy: influenza A (Detection of human influenza A viruses by loop-mediated isothermal amplification.poon LL, Leung CS, Chan KH, Lee JH, Yuen KY, Guan Y, Peiris JS.J ClinMicrobiol Jan;43(1): ) herpes simplex (Rapid diagnosis of herpes simplex virus infection by a loop-mediated isothermal amplification method. Enomoto Y, Yoshikawa T, Ihira M, Akimoto S, Miyake F, Usui C, Suga S, Suzuki K, Kawana T, Nishiyama Y, Asano Y.ClinMicrobiol Feb;43(2):951-5.) Ebola virus (Rapid and simple detection of Ebola virus by reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification. Kurosaki Y, Takada A, Ebihara H, Grolla A, Kamo N, Feldmann H, Kawaoka Y, Yasuda J. J Virol Methods Apr;141(1): Epub 2006 Dec 27. Vibrio cholerae (Sensitive and rapid detection of cholera toxin-producing Vibrio cholerae using a loop-mediated isothermal amplification. Yamazaki W, Seto K, Taguchi M, Ishibashi M, Inoue K. BMC Microbiol Jun 12;8:94. A rapid, simple, and sensitive loop-mediated isothermal amplification method to detect toxigenic Vibrio cholerae in rectal swab samples. Okada K, Chantaroj S, Taniguchi T, Suzuki Y, Roobthaisong A, Puiprom O, Honda T, Sawanpanyalert P. DiagnMicrobiol Infect Dis Feb;66(2): Epub 2009 Oct 7. Establishment and application of a loop-mediated isothermal amplification method for rapid diagnosis of Vibrio cholerae. Ke XM, Chen YY, Gao LL, DU ZP, Feng XM, Liao RY, Chen ZY, Cao YC, Chen Q. Nan Fang Yi Ke Da XueXueBao Oct;29(10): Chinese.) porcine parvovirus(detection of porcine parvovirus by loop-mediated isothermal amplification.chen CM, Cui SJ. J Virol Methods Feb;155(2): Epub 2008 Nov 20. epidemic diarrhea virus(development of reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of porcine epidemic diarrhea virus. Ren X, Li P. Virus Genes Apr;42(2): Epub 2011 Feb 1.) porcine circovirus type 2(Specific, simple and rapid detection of porcine circovirus type 2 using the loop-mediated isothermal amplification method. Zhao K, Shi W, Han F, Xu Y, Zhu L, Zou Y, Wu X, Zhu H, Tan F, Tao S, Tang X.Virol J Mar 18;8:126.) human papillomavirus (Rapid detection of the most common high-risk human papillomaviruses by loop-mediated isothermal amplification.saetiew C, Limpaiboon T, Jearanaikoon P, Daduang S, Pientong C, Kerdsin A, Daduang J.J Virol Methods Dec;178(1-2): Visual detection of high-risk human papillomavirus genotypes 16, 18, 45, 52, and 58 by loop-mediated isothermal amplification with hydroxynaphthol blue dye.luo L, Nie K, Yang MJ, Wang M, Li J, Zhang C, Liu HT, Ma XJ.J ClinMicrobiol Oct;49(10): Colorimetric detection of HPV6 and HPV16 by loop mediated isothermal amplification.lu CB, Luo L, Yang MJ, Nie K, Wang M, Ma XJ.Bing Du XueBao Jan;27(1): Chinese.Loop-mediated isothermal amplification Strona4

5 method for detection of human papillomavirus type 6, 11, 16, and 18.Hagiwara M, Sasaki H, Matsuo K, Honda M, Kawase M, Nakagawa H. J Med Virol May;79(5): ) Bakterie: Mycobacterium tuberculosis(loop-mediated isothermal amplification for direct detection of Mycobacterium tuberculosis complex, M. avium, and M. intracellulare in sputum samples.iwamoto T, Sonobe T, Hayashi K.J ClinMicrobiol Jun;41(6): Use of visual loop-mediated isotheral amplification of rimm sequence for rapid detection of Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis.zhu RY, Zhang KX, Zhao MQ, Liu YH, Xu YY, Ju CM, Li B, Chen JD.J Microbiol Methods Sep;78(3): Epub 2009 Jul 17. Erratum in: J Microbiol Methods Nov;79(2):250.) Streptococcus pneumoniae(loop-mediated isothermal amplification method targeting the lyta gene for detection of Streptococcus pneumoniae.seki M, Yamashita Y, Torigoe H, Tsuda H, Sato S, Maeno M.J ClinMicrobiol Apr;43(4): ) Clostridium difficile(rapid and simple method for detecting the toxin B gene of Clostridium difficile in stool specimens by loop-mediated isothermal amplification.kato H, Yokoyama T, Kato H, Arakawa Y.J ClinMicrobiol Dec;43(12): Campylobacter jejuni (Development and evaluation of a loop-mediated isothermal amplification assay for rapid and simple detection of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli.yamazaki W, Taguchi M, Ishibashi M, Kitazato M, Nukina M, Misawa N, Inoue K.J Med Microbiol Apr;57(Pt 4): ) Clostridium botulinum(rapid and simple detection of Clostridium botulinum types A and B by loop-mediated isothermal amplification.sakuma T, Kurosaki Y, Fujinami Y, Takizawa T, Yasuda J.J ApplMicrobiol Apr;106(4): Epub 2009 Jan 30. Salmonella (A loop-mediated isothermal amplification method targets the phop gene for the detection of Salmonella in food samples.li X, Zhang S, Zhang H, Zhang L, Tao H, Yu J, Zheng W, Liu C, Lü D, Xiang R, Liu Y.Int J Food Microbiol Aug 15;133(3): Epub 2009 Jun 1.The rapid detection of Salmonella from food samples by loop-mediated isothermal amplification (LAMP).Ueda S, Kuwabara Y.Biocontrol Sci Jun;14(2):73-6.Rapid, sensitive, and specific detection of the O4 group of Salmonella enterica by loop-mediated isothermal amplification.okamura M, Ohba Y, Kikuchi S, Takehara K, Ikedo M, Kojima T, Nakamura M.Avian Dis Jun;53(2): ) Escherichia coli O157 (Development and application of a loop-mediated isothermal amplification method on rapid detection Escherichia coli O157 strains from food samples.zhao X, Li Y, Wang L, You L, Xu Z, Li L, He X, Liu Y, Wang J, Yang L.MolBiol Rep Jun;37(5): Epub 2009 Aug 15. Staphylococcus aureus (Loop-mediated isothermal amplification assays for identification of antiseptic and methicillin-resistant Staphylococcus aureus.hanaki K, Sekiguchi J, Shimada K, Sato A, Watari H, Kojima T, Miyoshi-Akiyama T, Kirikae T.J Microbiol Methods Feb;84(2): Epub 2010 Dec 16.) Listeria monocytogenes (Rapid and sensitive detection of Listeria monocytogenes by loopmediated isothermal amplification.tang MJ, Zhou S, Zhang XY, Pu JH, Ge QL, Tang XJ, Gao YS.CurrMicrobiol Dec;63(6): Epub 2011 Sep 21.) Strona5

6 Clostridium perfringensdetection of enterotoxigenic Clostridium perfringens in meat samples by using molecular methods.kaneko I, Miyamoto K, Mimura K, Yumine N, Utsunomiya H, Akimoto S, McClane BA. Appl Environ Microbiol Nov;77(21): Epub 2011 Sep 2. Grzyby: Paracoccidioidesbrasiliensis (Detection of gp43 of Paracoccidioidesbrasiliensis by the loopmediated isothermal amplification (LAMP) method.endo S, Komori T, Ricci G, Sano A, Yokoyama K, Ohori A, Kamei K, Franco M, Miyaji M, Nishimura K.FEMS MicrobiolLett May 1;234(1):93-7. Candida (Efficient identification of clinically relevant Candida yeast species by use of an assay combining panfungal loop-mediatedisothermal DNA amplification with hybridization to species-specific oligonucleotide probes.inácio J, Flores O, Spencer-Martins I.J ClinMicrobiol Feb;46(2): Epub 2007 Dec 12. Pneumocystis pneumonia (Development of a loop-mediated isothermal amplification method for diagnosing Pneumocystis pneumonia.uemura N, Makimura K, Onozaki M, Otsuka Y, Shibuya Y, Yazaki H, Kikuchi Y, Abe S, Kudoh S.J Med Microbiol Jan;57(Pt 1):50-7.) Pierwotniaki: GMO: Toxoplasma gondii (Toxoplasma gondii: sensitive and rapid detection of infection by loopmediated isothermal amplification (LAMP) method.zhang H, Thekisoe OM, Aboge GO, Kyan H, Yamagishi J, Inoue N, Nishikawa Y, Zakimi S, Xuan X.ExpParasitol May;122(1): Epub 2009 Feb 1.) Wuchereriabancrofti (Development of loop-mediated isothermal amplification method for detecting Wuchereriabancrofti DNA in human blood and vector mosquitoes.takagi H, Itoh M, Kasai S, Yahathugoda TC, Weerasooriya MV, Kimura E.Parasitol Int Dec;60(4): Epub 2011 Sep 10. Plasmodium falciparum(development of a reverse transcription-loopmediatedisothermalamplification(rt-lamp) for clinical detection of Plasmodium falciparum gametocytes.buates S, Bantuchai S, Sattabongkot J, Han ET, Tsuboi T, Udomsangpetch R, Sirichaisinthop J, Tan-ariya P.Parasitol Int Sep;59(3): Epub 2010 Jun 10. Detection of genetically modified organisms (GMOs) using isothermal amplification of target DNA sequences. Lee D, La Mura M, Allnutt TR, Powell W. BMC Biotechnol Feb 2;9:7. Sensitive and rapid detection of genetic modified soybean (Roundup Ready) by loop-mediated isothermal amplification. Liu M, Luo Y, Tao R, He R, Jiang K, Wang B, Wang L. BiosciBiotechnolBiochem Nov;73(11): Epub 2009 Nov 7. Strona6

7 LAMP - Zasada działania reakcji: Kolejne cykle wydłużania i zastępowania nici prowadzone są przy użyciu odpowiedniej polimerazy i 2 lub 3 par starterów rozpoznających odpowiednio 6 lub 8 miejsc matrycy. Startery wewnętrzne to FIP (Forward Inner Primer) oraz BIP (Backward Inner Primer), sekwencję ich są komplementarne do dwóch różnych odległych miejsc w sekwencji matrycy (nici sensownej i antysensownej). Startery zewnętrzne F3 (Forward) i B3(Backward) komplementarne są do zewnętrznych końców matrycy. Startery zewnętrzne są krótsze od starterów wewnętrznych i ich końcowe stężenie w reakcji jest mniejsze dlatego wolniej hybrydyzują do matrycy inicjując reakcję zastępowania nici.dodatkowo dla wzmocnienia reakcji można zastosować startery LoopF i LoopR. Zastosowana polimeraza DNA posiada aktywność zastępowania nici DNA dzięki czemu nie potrzebna jest dodatkowa denaturacja matrycy i reakcję można prowadzić w warunkach izotermicznych. Kluczową cechą LAMP jest utworzenie w pierwszym etapie reakcji sztucznej matrycy (ssdna) o strukturze typu łodyga-pętla, przez tzw. self-priming końców matrycy. Matryca w następnych etapach jest amplifikowana, co prowadzi do powstania mieszaniny dwuniciowego DNA o strukturze podobnej do kalafiora. Proces można podzielić na etapy: 1. Tworzenie materiału starterowego LAMP 2. Cykliczna amplifikacja 3. Elongacja i recyklizacja Przykład reakcji (dla 2 par starterów) Gdy dsdna osiągnie stan równowagi (65 o C) wówczas pierwszy z starterów wewnętrznych może przyłączyć się do komplementarnej sekwencji matrycy inicjując syntezę nowej nici DNA. Polimeraza DNA o aktywności zastępującej wydłuża starter w kierunku 5 ->3. Następnie starter zewnętrzny F3 hybrydyzuje do miejsca F3c matrycy i następuje jego wydłużanie Strona7

8 Następuje wydłużanie startera F3 oraz zastępowanie nici oflankowanej starterem FIP. Nowo powstały dsdna (powyżej) uwolniony ssdna (poniżej). Uwolniona nićssdna oflankowana starterem FIP tworzy na końcu 5 strukturę pętli z powodu komplementarności sekwencji F1c z końca do sekwencji F1 w środku. Nić ta jest matrycą dla kolejnego startera wewnętrznego BIP, następuje wydłużenie i powstanie nowej nici oraz struktura pętli powraca do formy liniowej. Następnie starter B3 przyłącza się na zewnątrz od BIP, następuje wydłużanie nowej nici i uwolnienie ssdna. Uwolniona nić ssdna tworzy strukturę pętli na obydwu końcach (struktura przypominająca hantle). Tak powstała struktura stanowi matrycę dla rozpoczęcia kolejnego etapu reakcji: cyklicznej amplifikacji. STRUKTURA STARTEROWA DLA REAKCJI LAMP Strona8

9 Rozpoczyna się etap cyklicznej amplifikacji, starter FIP przyłącza się do ssdna i zaczyna się synteza nowej kolejnej nici w kierunku 5 ->3, uwalniając wcześniej zsyntetyzowaną nić. Następnie na końcu 3 regionu B1 następuje wydłużenie nici i uwolnienie nici oflankowanej starterem FIP (9). Uwolniona nić tworzy strukturę hantli z pętlami na obydwu końcach (11). Powstała nic jest odwróceniem nici (8). Podobnie jak w etapach (8) do (11) następuje tzw. self-priming matrycy (11), dodatkowo starter BIP hybrydyzuje do regionu B2c i następuje wydłużanie starterów i zastępowanie i uwalnianie kolejnej nici DNA. W trakcie reakcji wydłużania starterów, self-priming matrycy oraz zastępowania nici powstają produkty składające się zna przemianodwróconychpowtórzeńsekwencji matrycowej na tym samym łańcuchu. Animacja reakcji LAMP: Warunki reakcji LAMP: Temperatura: o C (~63 o C) warunki izotermiczne Objętość reakcji: 25µl Enzym: Polimeraza DNA, 8U/reakcję Startery: o Wewnętrzne (FIP, BIP): 1,6µM o Zewnętrzne (F3, B3):0,2µM o Loop (LF, LB): 0,8 µm Trójfosforany deoksyrybonukleotydów (dntp-y): 1,4mM każdego Próba: ~5µl/reakcję Czas reakcji: do 1 godziny Strona9

10 Projektowanie starterów do LAMP Odpowiednie zaprojektowanie starterów jest kluczowym etapem poprawnego przeprowadzenia reakcji LAMP. FIP (Forward Inner Primer) - zawiera na końcu 3 region F2 komplementarny do F2c matrycy oraz na końcu 5 region F1c. BIP (Backward Inner Primer) - zawiera na końcu 3 region B2 komplementarny do B2c matrycy oraz na końcu 5 region B1c F3 (ForwardPrimer) - starter zewnętrzny zawiera w swojej sekwencji region F3 matrycy komplementarny do F3c B3 (BackwardPrimer) - starter zewnętrzny zawiera w swojej sekwencji region B3 matrycy komplementarny do B3c Loop F (LoopForwardPrimer) sekwencja komplementarna do jednoniciowej pętli pomiędzy regionami F2 i F1 na końcu 5 nici ssdnao strukturze przypominającej hantle (ang.dumbelllikestructure). Loop B (LoopBackwardPrimer) - sekwencja komplementarna do jednoniciowej pętli pomiędzy regionami B2 i B1 na końcu 5 nici ssdnao strukturze przypominającej hantle (ang.dumbelllikestructure). Rysunek 2 Sekwencje starterów wykorzystywane w reakcji LAMP Zasady projektowania starterów do LAMP: Odpowiednie i poprawne zaprojektowanie starterów wymaga postępowania krok po kroku zgodnie z poniższymi wskazówkami: Określenie wymagań (celu) badań o Matryca: Wybór odpowiednich szczepów/rodzajów mikroorganizmów, których geny mająbyć amplifikowane (dawać pozytywny wynik reakcji), o Określenie odpowiednich szczepów/rodzajów mikroorganizmów, których geny nie mogą być amplifikowane (dawać negatywny wynik reakcji), Zebranie dostępnych sekwencji genów dla wszystkich szczepów/rodzajów mikroorganizmów, którą mają dawać pozytywny i negatywny wynik reakcji, Dopasowanie i określenie regionów konserwatywnych w genomie szczepów/rodzajów mikroorganizmów, których geny mają być amplifikowane, - (czułość LAMP), Określenie regionów unikalnych (specyficznych) w genomie szczepów/rodzajów mikroorganizmów, których geny mają być amplifikowane (regiony nie występujące w genomach mikroorganizmów, które mają dawać negatywny wynik) (specyficzność (LAMP) Strona10

11 Wykorzystanie dostępnych programów komputerowych do projektowania starterów. W przypadku gdy zaprojektowane startery nie dają satysfakcjonującego rezultatu (brak produktu, obecność niespecyficznych sekwencji etc.) należy ponownie zaprojektować startery. Parametry starterów: Odległość pomiędzy regionami starterów: Odległość pomiędzy końcami regionu F2 i B2 (region amplifikowany przez LAMP) powinna wynosić pz, natomiast zarówno pomiędzy F2 i F3. oraz B2 i B3 powinna wynosić 0 20 pz. Odległość dla regionów tworzących strukturę pętli (pomiędzy 5' końcem F2 i 5' końcem F1, 5' końcem B2 i 3' końcem B1) powinna wynosić pz. Odległość pomiędzy regionami F2 i F3 oraz B2 i B3 powinna wynosić 0 do F3 F2 B1c 3 F1c B2 B3 5 <40~60 pz> <40~60 pz> <0~60>pz <120~160>pz <0~60>pz Temperatura topnienia (Tm): Około o C dla regionów bogatych w pary GC i ok o C dla regionów bogatych w pary AT Tm dla każdego region powinna wynosić odpowiednio: ok. 65 C (64-66 C) dla F1c i B1c, ok 60 C (59-61 C) dla F2, B2, F3, i B3, iok. 65 C (64-66 C) dla starterówloop. Stabilność końców Końce starterów stanowią początkowy punkt dla syntezy DNA i tym samym musi posiadać pewien stopień stabilności. Końce 3 regionów F2/B2, F3/B3, i LF/LB oraz koniec 5 regionów F1c/B1c powinny być zaprojektowane tak by energia swobodna wynosiła 4kcal/mol lub mniej (dla 6pz końca). Koniec 5 regionu F1c po amplifikacji łączy się z końcem 3 regionu F1 dlatego stabilność jest bardzo istotna. (Zmiana energii swobodnej ΔG jest różnicą pomiędzy energią swobodną produktu i energią swobodną materiału początkowego) Im niższa wartość ΔG tym częściej startery przyłączają się do matrycy. Zawartość par GC powinna wynosić 50-60% w przypadku matryc bogatych w pary GC, 40-50% dla matryc bogatych w pary AT. Tworzenie struktur dwurzędowych: Ważne jest w szczególności dla starterów wewnętrznych aby nie tworzyły struktur dwurzędowych typu primer-dimer. Końce 3 starterów nie mogą być komplementarne względem siebie. Inne: Jeżeli w sekwencji występują miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne, z wyjątkiem regionów dla starterów mogą być użyte dla potwierdzenia zamplifikowanego produktu Strona11

12 Programy do projektowania starterów: Primer Explorer V4 Automatyczne oprogramowanie stworzone przez Fujitsu Ltd i EikenChemical Co, Wersja V4, Pracuje w środowisku Windows, Internet Explorer 5+ Dostępne na stronie internetowej: LAMP Designer (OptiGene Ltd) Automatyczne oprogramowanie stworzone przez OptiGeneLtd, Posiada wbudowany algorytm wyszukiwania najlepszych sekwencji starterowych Startery przeszukiwane są podkątem tworzenia struktur drugorzędowych, dimerów, homologiii właściwości fizycznych zgodnie z zadanymi warunkami. Sekwencje matrycowe mogą być pobierane z baz danych (Acession number), z pliku w formacie tekstowym oraz wklejane bezpośrednio w okienko programu. Pracuje w środowisku Windows Wersja demo dostępna na stronie internetowej: Strona12

13 Detekcja i wizualizacja LAMP Charakterystyka produktów (amplikonów) reakcji LAMP ( LAMPlikons ) Tabela 1 Porównanie produktów reakcji LAMP i PCR LAMP PCR Struktura pętla-łodyga dsdna dsdna Rozmiar różny jednakowy Kształt Przypominający kalafior liniowy Liczb kopii genu wiele kopii/1 amplikon 1 kopia/1 amplikon Stężenie µg/ml kopii/reakcję, 4-40 µg/ml Metody detekcji 1. Elektroforeza w żelu agarozowym Po raz pierwszy dla LAMP w 2000 roku (Notomi Tet al.) Produkty reakcji wybarwione bromkiem etydyny, rozdzielane w 2% żelu agarozowym, Końcowy punkt analizy (po zakończeniu reakcji), Produkt na żelu widoczny w postaci smearu, Wynik tylko jakościowy, Wizualizacja w świetle UV, Pozwala obserwować produkt reakcji LAMP po trawieniu restrykcyjnym. A Rysunek 3 A. Rozdział elektroforetyczny produktu amplifikacji HBV metodą LAMP (amplifikacja w 60 o C przez 60 min) Tor 1. Marker, Tor 2-4 zamplifikowany HBV, Tor 5 K- Tor 6 K+ (produkt amplifikacji trawiony Sau 3A I) Rysunek 3 B. Rozdział elektroforetyczny produktu amplifikacji PSA mrna (amplifikacja w 65oC przez 60 min) Tor 1.Marker, Tor 2K- Tor 3-4 zamplifikowany PSA mrna, Tor 5-6 K+ (produkt amplifikacji trawiony Sau 3A I) 2. Analiza turbidymetryczna B Po raz pierwszy dla LAMP w 2001 roku (Mori et al.), Powstający w trakcie reakcji produkt uboczny, pirofosforan magnezu, pozwala na ocenę wyniku poprzez analizę zmętnienia Końcowy punkt analizy, (po zakończeniu reakcji) Produkt reakcji widoczny gołym okiem Wynik jakościowy W trakcie reakcji przyłączania kolejnych nukleotydów do wydłużanego łańcucha DNA polimeryzacji uwalniany jest z dntp ów pirofosforan. Duża ilość powstającego Strona13

14 piroforsforanureaguje z jonami magnezu obecnymi w buforze reakcyjnym powstaje biały osad (zgodnie z równaniem poniżej: (DNA) n-1 + dntp = (DNA) n + P 2 O 7 4- ; P 2 O Mg 2+ = Mg 2 P 2 O 7 Zmętnienie w probówce widoczne jest kiedy stężenie pirofosforanu magnezu przekracza 0,5mM. Do powstania pirofosforanu magnezu w stężeniu powyżej 0,5mM potrzeba wytworzenia 4µgDNA w 25µl objętości reakcji. W reakcji LAMP uzyskuje się 10µg DNA/25µl, w porównaniu w reakcji PCR otrzymuje się ok. 0,2µg DNA/25µl, stężenie pirofosforanu magnezu wynosi wówczas 0,02mM, co nie pozwala na zaobserwowanie białego osadu. Dodatkowo warunki termiczne (podgrzewanie) w reakcji PCR powodują że jony pirofosforanowe są hydrolizowane do jonów fosforanowych. Rysunek 4 Analiza turbidymetryczna LAMP. Probówka 1 - K-, Probówka 2 amplikon LAMP. 3. Analiza turbidymetryczna w czasie rzeczywistym Po raz pierwszy dla LAMP w 2003 roku (Mori et al.) Pomiar w czasie rzeczywistym, pozwala to wyeliminować etap szacowania produktu po zakończeniu reakcji Pomiar podobny do analizy spektrofotometrycznej Analiza jakościowa i ilościowa produktu reakcji Analiza turbidymetryczna jest pomiarem pośrednim ilości DNA, gdyż opiera się na pomiarze stężenia produktu ubocznego- pirofosforanu magnezu. Określana jest zależność pomiędzy ilością powstającego pirofosforanu magnezu a ilością powstającego DNA. Rysunek 5 Pomiar zmętnienia produktu reakcji LAMP w czasie rzeczywistym. Strona14

15 4. Analiza fluorymetryczna Po raz pierwszy dla LAMP w 2000 roku (Notomi Tet al.) Detekcja produktu przez fluorescencję, Detektorami są cząsteczki fluorochromu emitujące światło o określonej długości po związaniu się z dwuniciowym DNA, takie jak bromek etydyny, SYBR Green I, kalceina etc. Końcowy punkt analizy, (po zakończeniu reakcji) Analiza jakościowa Wizualizacja w świetle UV, ale produkt reakcji można obserwować gołym okiem A B Rysunek 6 A Wizualizacja fluorymetryczna reakcji LAMP (Fluorochrom: Kalceina) Jony pirofosforanowe usuwają jony manganu z kalceiny, fluorescencja wzrasta im więcej kalceiny łączy się z uwolnionymi z DTP-ów jonami magnezu. Probówka 1 - K-, Probówka 2 amplikon LAMP Rysunek6 B Wizualizacja fluorymetryczna reakcji LAMP (Fluorochrom: Bromek Etydyny) obraz w świetle UV; Probówka 1 - K-, Probówka 2 amplikon LAMP 5. Fluorescencja w czasie rzeczywistym Pomiar w czasie rzeczywistym, pozwala to wyeliminować etap szacowania produktu po zakończeniu reakcji Analiza jakościowa i ilościowa produktu reakcji Monitorowanie przyrostu liczby kopii badanej sekwencji w czasie przez pomiar fluorescencji Specyficzność reakcji, analiza temperatury annealingu produktu A B Rysunek 7A Pomiar fluorescencji reakcji LAMPw czasie rzeczywistym Rysunek 7 B Krzywa annealingu produktu reakcji LAMP Strona15

16 Diagnostyczne wskaźniki wydajności reakcji LAMP Przed przystąpieniem do obliczania wskaźników wydajności LAMP należy: 1. Określić, które z badanych prób mają dać wynik pozytywny a które negatywny, 2. Zebrać jak największą liczbę prób, które stanowią będą stanowiły odniesienie (tzw. próby referencyjne): faktycznie dające wynik pozytywny, faktycznie dające wynik negatywny 3. Zbadać każdą próbę i określić, które w reakcji LAMP dają wynik pozytywny, a które wynik negatywny 4. Zebrane dane liczbowe umieścić w tabeli tzw. tablicy 2X2 Wskaźniki: P. odniesienia (+) P. odniesienia (-) Test (+) Prawdziwie dodatnie (PD) Fałszywie dodatnie (FD) suma (PD+FD) Test (-) Fałszywie ujemne (FJ) Prawdziwie ujemne (PJ) suma (FN+PN) SUMA suma (PP+FJ) suma (FD+PJ) SUMA Czułość zdolność do wykrycia badanej cechy, stosunek wyników prawdziwie dodatnich do faktycznie posiadających daną cechę. CZ=PP/(PP+FN) [%] Specyficzność część negatywnych prób odniesienia, która w reakcji dała wynik negatywny, stosunek wyników prawdziwie ujemnych do faktycznie nie posiadających danej cechy. Sp= PJ/FD+PJ [%] Predykcja dodatnia iloraz wyników prawdziwie dodatnich oraz sumy wyników prawdziwie dodatnich i fałszywie dodatnich (czyli wszystkich dodatnichwyników testu). Pd=PD/(PD+FD) [%] Predykcja ujemna iloraz wyników prawdziwie ujemnych oraz sumy wyników prawdziwie ujemnych i fałszywie ujemnych (czyli wszystkich ujemnych wyników testu). Wydajność określa jak często w reakcji otrzymujemy poprawny wynik W=(PP+PJ)/SUMA Strona16

17 Badanie SNP metodą LAMP Polimorfizm pojedynczego nukleotydu(ang.singlenucleotidepolymorphism, SNP) to zmienność sekwencjidna, która polega na zmianie pojedynczegonukleotydu pomiędzy osobnikami danego gatunku lub drugim, odpowiadającymchromosomemdanego osobnika. Wysoka specyficzność co do sekwencji reakcji LAMP powoduje, że tylko docelowa sekwencja (zawierająca SNP) zostanie zamplifikowana spośród sekwencji homologicznych. Występowanie polimorfizmu pojedynczego nukleotydu można potwierdzić przez obecność zamplifikowanego produktu w reakcji. Możliwe to jest przez dzięki odpowiedniemu zaprojektowaniu starterów do reakcji. Startery FIP i BIP do reakcji SNP-LAMP projektowane są w taki sposób, że na końcach 5 zawierają SNP (Wild Type allele). Kiedy matrycą w reakcji jest allel WT wówczas w trakcie reakcji powstaje struktura starterowa i reakcja jest kontynuowana. W przypadku gdy matrycą jest zmutowana sekwencja genu nie otrzymujemy produktu w reakcji. Rysunek 8 Przebieg reakcji LAMP dla SNP Animacja reakcji LAMP: Strona17

18 Oprzyrządowanie, odczynniki i akcesoria dla izotermicznej amplifikacji DNA firmy OptiGene. OptiGene stosuje izotermiczne metodę amplifikacji znane jako LAMP, która została opracowana przez EikenChemical Company Ltd z Japonii. Dużą zaletą tej metody jest prowadzenie reakcji w stałej temperaturze, co eliminuje konieczność stosowania specjalistycznej aparatury. W wielu przypadkach nie potrzebna jest ekstrakcja DNA. Czas oczekiwania na wynik reakcji jest bardzo krótki (detekcja produktu w trakcie trwania reakcji). Genie II zinegrowana elastyczna platforma Genie II to zaawansowanenarzędzie, którepozwala na wykrywanie bakterii i wirusówna poziomie molekularnym. Pozwala na prowadzenie izotermicznej reakcji w czasie rzeczywistym (Real-time)na przenośnej platformie o niskim poborze mocy dedykowanej dla badań laboratoryjnych. System zamknięty prowadzenia reakcji zapobiega kontaminacji amplifikowanego produktu. Genie II jest urządzeniem wyposażonym w dwa niezależne bloki grzejne każdy mieszczący 8 mikroprobówek (0,2 ml), odpowiednich dla urządzenia. Genie II posiada funkcję gradientową oraz umożliwia zaprogramowanie dodatkowego annealingu dla potwierdzenia obecności amplifikowanego produktu. Najważniejsze funkcje: Szybka izotermiczna amplifikacja Potwierdzenie poprawności wyniku poprzez analizę krzywej annealingu (podobna do analizy krzywej topnienia produktu) Niskie koszty i łatwość obsługi Kompaktowe, przenośne i wytrzymałe urządzenie Zasilanie sieciowe lub bateryjne Łatwy dostęp do danych przez urządzenie USB Obsługa za pomocą komputera lub niezależnie przez ekran dotykowy Rysunek 9 Genie II urządzenie do prowadzenia i detekcji produktu reakcji LAMP GspSSD Polimeraza: Polimeraza z Geobacillus sp. pozwala na uzyskanie z niewielkiej ilości matrycy 10 9 kopii DNA w czasie krótszym niż 30 minut. Pozwala na amplifikację matrycy w znacznie krótszym czasie w porównaniu do Bst Polimerazy. Pozwala na uzyskanie produktu o wysokiej specyficzności, Strona18

19 Pozwala na prowadzenie reakcji w warunkach izotermicznych bez konieczności wykorzystywania specjalistycznej aparatury jak w przypadku reakcji amplifikacji In vitro metodą PCR Nie wymaga wstępnej denaturacji matrycy Pozwala na zamplifikowanie RNA z wysoką specyficznością, bez dodatkowego dodawania odwrotnej transkryptazy. Isothermal Master Mix Izotermiczna mieszanina do amplifikacji, (Master mix) do prowadzenia reakcji LAMP, pozwala na fluorescencyjną detekcję produktu na platformie Genie II oraz innych urządzeniach fluorymetrycznych ustawionych na wzbudzenie przy 488nM i emisję przy 520nM. Może być także wykorzystywana na urządzeniach dla reakcji ilościowego PCR (qpcr, Real-time PCR) ustawionych na kanał FAM. Krzywa annealingu jest generowana dla potwierdzenia produktu. Eliminuje to konieczność prowadzenia dodatkowej detekcji w żelach agarozowych i analizy turbidymetrycznej oraz pozwala na prowadzenie reakcji w systemie zamkniętym. (close-tube system) Typowe warunki reakcji dla Isothermal Master Mix to: Amplifikacja 30 minut w 65 o C Annealing co 0,05 o C w przedziale 98 o C 80 o C Strona19

20 Zalety i wady LAMP Zalety: Wady: Szybka, krótki czas reakcji (można zaobserwować produkt po 20 min) Czuła i specyficzna, dzięki zastosowaniu starterów rozpoznających 6-8 miejsc na matrycy, Izotermiczna, możliwość prowadzenia reakcji w stałej temperaturze Prostsze i tańsze urządzenia niż w real-time PCR, przy porównywalnej czułości Nie wymaga wstępnej denaturacji matrycy Produkt reakcji można zaobserwować gołym okiem Trudniejsze i bardziej czasochłonne projektowanie starterów do reakcji w porównaniu do PCR Nie wszystkie badania DNA są specyficzne do sekwencji Biorąc pod uwagę powyższe zalety i wady, można stwierdzić, że metoda LAMP jest odpowiednia tam gdzie mamy do czynienia z ograniczonymi zasobami, gdzie wyniki potrzebne są w krótkim czasie oraz prowadzone badania są specyficzne co do sekwencji. Natomiast nie nadaje się do analizy nieznanych sekwencji DNA i RNA. Podsumowanie LAMP jest nową innowacyjną i rozwijającą się techniką amplifikacji kwasów nukleinowych, LAMP doskonale nadaje się w sytuacjach gdy mamy do czynienia z ograniczonymi zasobami sprzętowymi, a prowadzone analizy wymagają bardzo szybkich wyników, LAMP umożliwia specyficzną amplifikację matrycy (startery rozpoznają 6-8 różnych sekwencji matrycy) Projektowanie starterów dla reakcji LAMP jest bardziej złożone niż w przypadku PCR, ale udogodnienie stanowią specjalne oprogramowanie do projektowania, Nie wymaga denaturacji matrycy, całość reakcji przebiega w stałych warunkach temperaturowych. Wydajność amplifikacji jest bardzo wysoka porównywalna do Real-time PCR, LAMP pozwala na znaczące skrócenie czasu analizy (do 1h), LAMP jest mniej wrażliwy na obecność inhibitorów, nie zawsze wymagana jest izolacja DNA Pozwala na amplifikację RNA bez dodawania odwrotnej transkryptazy, Produkt uboczny powstający w reakcji LAMP, pirofosforan magnezu, pozwala na obserwację wyniku w świetle UV i widzialnym. Możliwy pomiar ilościowy produktu w czasie rzeczywistym. Umożliwia prowadzenie reakcji w systemie zamkniętym, co pozwala uniknąć zanieczyszczeń w próbie. Zastosowanie zintegrowanej platformy Genie II umożliwia prowadzenie reakcji w czasie rzeczywistym i ilościowe oznaczenie produktu. Strona20