Amplifikacja in vitro wybranych odcinków DNA i RNA metodą Loop-mediated isothermal AMPlification (LAMP)

Save this PDF as:
 WORD  PNG  TXT  JPG

Wielkość: px
Rozpocząć pokaz od strony:

Download "Amplifikacja in vitro wybranych odcinków DNA i RNA metodą Loop-mediated isothermal AMPlification (LAMP)"

Transkrypt

1 NOVAZYM POLSKA nr 1 / 2012 Amplifikacja in vitro wybranych odcinków DNA i RNA metodą Loop-mediated isothermal AMPlification (LAMP) LAMP is registered trademark owned by Eiken Chemical Co., Ltd. Opracowanie: Marta Jankowska Katedra Biotechnologii i Mikrobiologii Żywności Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu Adam Burzyński Novazym Polska POZNAŃ 2012

2 Strona2 SPIS TREŚCI WSTĘP... 3 LAMP (Loop-mediated isothermal AMPlification)... 3 Historia... 3 Publikacje naukowe na temat LAMP... 4 Zakres wykorzystywania LAMP:... 4 WIRUSY:... 4 BAKTERIE... 5 GRZYBY:... 6 PIERWOTNIAKI:... 7 GMO:... 7 LAMP - Zasada działania reakcji... 8 Zasada działania reakcji (dla 2 par starterów)... 8 Warunki reakcji LAMP Projektowanie starterów do LAMP Zasady projektowania starterów do LAMP Parametry starterów: Programy do projektowania starterów Charakterystyka produktów (amplikonów) reakcji LAMP ( LAMPlikons ) Metody detekcji Elektroforeza w żelu agarozowym Analiza turbidymetryczna Analiza turbidymetryczna w czasie rzeczywistym Analiza fluorymetryczna Fluorescencja w czasie rzeczywistym Diagnostyczne wskaźniki wydajności reakcji LAMP Badanie SNP technika LAMP Oprzyrządowanie, odczynniki i akcesoria dla izotermalnej amplifikacji DNA, firmy OptiGene Genie II zinegrowana elastyczna platforma GspSSD Polimeraza Isothermal Master Mix Zalety i wady techniki LAMP Podsumowanie Bibliografia... 22

3 Strona3 WSTĘP LAMP (Loop-mediated isothermal AMPlification) Nowatorska metoda amplifikacji kwasów nukleinowych, która pozwala na szybką identyfikację patogenów ludzkich, zwierzęcych i roślinnych. Metoda polega na syntezie nowych nici DNA na matrycy (DNA lub RNA) w kolejnych cyklach reakcji oraz zastępowaniu (wymianie) łańcuchów DNA (ang. stand displacement) przez łańcuchy nowo zsyntetyzowane. Polimeraza wykorzystywana w reakcji posiada aktywność syntezy nici DNA w kierunku 5 ->3 oraz wymiany nici, nie posiada aktywności egzonuklotydowej. Powstałe amplifikowane produkty posiadają strukturę składającą się z naprzemian odwróconych powtórzeń sekwencji matrycowej na tym samym łańcuchu DNA. Produkt LAMP jest mieszaniną łańcuchów DNA tworzących struktury typu łodyga-pętla (ang. stem-loop) różniących się wielkością, Uzyskany produkt posiada wysoką specyficzność do matrycy poprzez zastosowanie 2 par starterów komplementarnych do 6 niezależnych miejsc na matrycy w początkowym etapie reakcji oraz 4 niezależnych miejsc w kolejnych etapach LAMP. Historia Amplifikacja przebiega w warunkach izotermicznych (w stałej temperaturze) opracowanie techniki LAMP przez japońską firmę EIKEN CHEMICAL CO, LTD 2000 pierwsza publikacja naukowa nt. LAMP (Loop-mediated isothermal amplification of DNA, Notomi T,Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N, Hase T) 2002 pojawienie się na rynku komercyjnych zestawów do prowadzenia reakcji LAMP 2006 pojawienie się zestawów do wykrywania patogenów w żywności i w środowisku (Cryptosporidium, Salmonella, Escherichia coli, Listeria monocytogenes etc.) 2009 założenie w UK firmy OptiGene Ltd umowa licencyjna pomiędzy OptiGene Ltd i Eiken Chemical Co, Ltd. zezwalająca OptiGene na rozwijanie i sprzedaż urządzeń i produktów do prowadzenia LAMP 2011 wprowadzenie na rynek przez OptiGene Ltd w pełni zintegrowanej platformy Genie II do prowadzenia reakcji LAMP w czasie rzeczywistym 2012 umowa pomiędzy Novazym Polska s.c., a OptiGene Ltd o wyłączność dystrybucji na terenie Polski.

4 Strona4 Publikacje naukowe na temat LAMP Wykorzystywanie reakcji LAMP (liczba publikacji na przestrzeni lat, na podstawie PubMED) Rysunek 1Liczba publikacji w latach Obecnie >600 publikacji, (w publikacji) Zakres wykorzystywania LAMP: Wykrywanie obecności patogenów ludzkich, zwierzęcych i roślinnych. Technika jest wykorzystywana w badaniach weterynaryjnych, środowiskowych, rolnictwie, badaniach żywności, diagnostyce laboratoryjnej. Ponad 200 genów zamplifikowano techniką LAMP Szeroki zakres zastosowań (przykłady poniżej): WIRUSY: influenza A Detection of human influenza A viruses by Loop-mediated Isothermal AMPlification. Poon LL, Leung CS, Chan KH, Lee JH, Yuen KY, Guan Y, Peiris JS.J Clin Microbiol Jan; 43(1): herpes simplex Rapid diagnosis of herpes simplex virus infection by a loop-mediated isothermal amplification method. Enomoto Y, Yoshikawa T, Ihira M, Akimoto S, Miyake F, Usui C, Suga S, Suzuki K, Kawana T, Nishiyama Y, Asano Y. Clin Microbiol Feb; 43(2):951-5 Ebola virus Rapid and simple detection of Ebola virus by reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification. Kurosaki Y, Takada A, Ebihara H, Grolla A, Kamo N, Feldmann H, Kawaoka Y, Yasuda J. J Virol Methods Apr; 141(1): Epub 2006 Dec 27 porcine parvovirus Detection of porcine parvovirus by loop-mediated isothermal amplification. Chen CM, Cui SJ. J Virol Methods 2009 Feb; 155(2): Epub 2008 Nov 20 epidemic diarrhea virus Development of reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of porcine epidemic diarrhea virus. Ren X, Li P. Virus Genes Apr; 42(2): Epub 2011 Feb 1 porcine circovirus type 2 Specific, simple and rapid detection of porcine circovirus type 2 using the loop-mediated isothermal amplification method. Zhao K, Shi W, Han F, Xu Y, Zhu L, Zou Y, Wu X, Zhu H, Tan F, Tao S, Tang X. Virol J Mar 18;8:126

5 Strona5 human papillomavirus Rapid detection of the most common high-risk human papillomaviruses by loop-mediated isothermal amplification Saetiew C, Limpaiboon T, Jearanaikoon P, Daduang S, Pientong C, Kerdsin A, Daduang J.J Virol Methods Dec; 178(1-2):22-30 Visual detection of high-risk human papillomavirus genotypes 16, 18, 45, 52, and 58 by loop-mediated isothermal amplification with hydroxynaphthol blue dye.luo L, Nie K, Yang MJ, Wang M, Li J, Zhang C, Liu HT, Ma XJ.J ClinMicrobiol Oct; 49(10): Colorimetric detection of HPV6 and HPV16 by loop mediated isothermal amplification.lu CB, Luo L, Yang MJ, Nie K, Wang M, Ma XJ.Bing Du XueBao Jan; 27(1):64-70 Loop-mediated isothermal amplification method for detection of human papillomavirus type 6, 11, 16 and 18 Hagiwara M, Sasaki H, Matsuo K, Honda M, Kawase M, Nakagawa H. J Med Virol May; 79(5): BAKTERIE Mycobacterium tuberculosis Loop-mediated isothermal amplification for direct detection of Mycobacterium tuberculosis complex, M. avium, and M. intracellulare in sputum sample Iwamoto T, Sonobe T, Hayashi K.J ClinMicrobiol Jun; 41(6): Use of visual loop-mediated isotheral amplification of rimm sequence for rapid detection of Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis Zhu RY, Zhang KX, Zhao MQ, Liu YH, Xu YY, Ju CM, Li B, Chen JD.J Microbiol Methods Sep; 78(3): Epub 2009 Jul 17. Erratum in: J Microbiol Methods Nov;79(2):250 Streptococcus pneumoniae Loop-mediated isothermal amplification method targeting the lyta gene for detection of Streptococcus pneumoniae Seki M, Yamashita Y, Torigoe H, Tsuda H, Sato S, Maeno M.J Clin Microbiol Apr; 43(4): Clostridium difficile Rapid and simple method for detecting the toxin B gene of Clostridium difficile in stool specimens by loop-mediated isothermal amplification Kato H, Yokoyama T, Kato H, Arakawa Y.J Clin Microbiol 2005 Dec; 43(12): Campylobacter jejuni Development and evaluation of a loop-mediated isothermal amplification assay for rapid and simple detection of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli Yamazaki W, Taguchi M, Ishibashi M, Kitazato M, Nukina M, Misawa N, Inoue K.J Med Microbiol Apr; 57(Pt 4): Clostridium botulinum Rapid and simple detection of Clostridium botulinum types A and B by loopmediated isothermal amplification Sakuma T, Kurosaki Y, Fujinami Y, Takizawa T, Yasuda J.J ApplMicrobiol Apr; 106(4): Epub 2009 Jan 30 Salmonella A loop-mediated isothermal amplification method targets the phop gene for the detection of Salmonella in food samples Li X, Zhang S, Zhang H, Zhang L, Tao H, Yu J, Zheng W, Liu C, Lü D, Xiang R, Liu Y. Int J Food Microbiol Aug 15; 133(3): Epub 2009 Jun 1 The rapid detection of Salmonella from food samples by loop-mediated isothermal amplification (LAMP) Ueda S, Kuwabara Y.Biocontrol Sci Jun;14(2):73-6

6 Strona6 Rapid, sensitive, and specific detection of the O4 group of Salmonella enterica by loop-mediated isothermal amplification Okamura M, Ohba Y, Kikuchi S, Takehara K, Ikedo M, Kojima T, Nakamura M.Avian Dis Jun;53(2): ) Escherichia coli O157 Development and application of a loop-mediated isothermal amplification method on rapid detection Escherichia coli O157 strains from food samples.zhao X, Li Y, Wang L, You L, Xu Z, Li L, He X, Liu Y, Wang J, Yang L. Mol Biol Rep Jun; 37(5): Epub 2009 Aug 15 Staphylococcus aureus Loop-mediated isothermal amplification assays for identification of antiseptic and methicillin-resistant Staphylococcus aureus Hanaki K, Sekiguchi J, Shimada K, Sato A, Watari H, Kojima T, Miyoshi-Akiyama T, Kirikae T.J Microbiol Methods Feb; 84(2): Epub 2010 Dec 16.) Listeria monocytogenes Rapid and sensitive detection of Listeria monocytogenes by loop-mediated isothermal amplification Tang MJ, Zhou S, Zhang XY, Pu JH, Ge QL, Tang XJ, Gao YS. Curr Microbiol 2011 Dec; 63(6): Epub 2011 Sep 21 Clostridium perfringens Detection of enterotoxigenic Clostridium perfringens in meat samples by using molecular methods Kaneko I, Miyamoto K, Mimura K, Yumine N, Utsunomiya H, Akimoto S, McClane BA. Appl Environ Microbiol Nov; 77(21): Epub 2011 Sep 2 Vibrio cholerae Sensitive and rapid detection of cholera toxin-producing Vibrio cholerae using a loopmediated isothermal amplification Yamazaki W, Seto K, Taguchi M, Ishibashi M, Inoue K. BMC Microbiol 2008 Jun 12;8:94 A rapid, simple, and sensitive loop-mediated isothermal amplification method to detect toxigenic Vibrio cholerae in rectal swab samples Okada K, Chantaroj S, Taniguchi T, Suzuki Y, Roobthaisong A, Puiprom O, Honda T, Sawanpanyalert P. Diagn Microbiol Infect Dis Feb; 66(2): Epub 2009 Oct 7 Establishment and application of a loop-mediated isothermal amplification method for rapid diagnosis of Vibrio cholerae Ke XM, Chen YY, Gao LL, DU ZP, Feng XM, Liao RY, Chen ZY, Cao YC, Chen Q. Nan Fang Yi Ke Da XueXueBao Oct; 29(10): GRZYBY: Paracoccidiodes brasiliensis Detection of gp43 of Paracoccidioides brasiliensis by the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method Endo S, Komori T, Ricci G, Sano A, Yokoyama K, Ohori A, Kamei K, Franco M, Miyaji M, Nishimura K.FEMS MicrobiolLett May 1;234(1):93-7 Candida Efficient identification of clinically relevant Candida yeast species by use of an assay combining panfungal loop-mediatedisothermal DNA amplification with hybridization to speciesspecific oligonucleotide probes Inácio J, Flores O, Spencer-Martins I.J. Clin Microbiol Feb; 46(2): Epub 2007 Dec 12 Pneumocystis pneumonia Development of a loop-mediated isothermal amplification method for diagnosing Pneumocystis pneumonia Uemura N, Makimura K, Onozaki M, Otsuka Y, Shibuya Y, Yazaki H, Kikuchi Y, Abe S, Kudoh S.J. Med Microbiol Jan;57(Pt 1):50-7

7 Strona7 PIERWOTNIAKI: Toxoplasma gondii Toxoplasma gondii: sensitive and rapid detection of infection by loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method Zhang H, Thekisoe OM, Aboge GO, Kyan H, Yamagishi J, Inoue N, Nishikawa Y, Zakimi S, Xuan X.ExpParasitol May;122(1): Epub 2009 Feb 1 Wuchereria bancrofti Development of loop-mediated isothermal amplification method for detecting Wuchereriabancrofti DNA in human blood and vector mosquitoes Takagi H, Itoh M, Kasai S, Yahathugoda TC, Weerasooriya MV, Kimura E.Parasitol Int Dec;60(4): Epub 2011 Sep 10 Plasmodium falciparum Development of a reverse transcription - loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) for clinical detection of Plasmodium falciparum gametocytes Buates S, Bantuchai S, Sattabongkot J, Han ET, Tsuboi T, Udomsangpetch R, Sirichaisinthop J, Tan-ariya P.Parasitol Int Sep; 59(3): Epub 2010 Jun 10 GMO: Detection of genetically modified organisms (GMOs) using isothermal amplification of target DNA sequences Lee D, La Mura M, Allnutt TR, Powell W. BMC Biotechnol Feb 2;9:7 Sensitive and rapid detection of genetic modified soybean (Roundup Ready) by loop-mediated isothermal amplification Liu M, Luo Y, Tao R, He R, Jiang K, Wang B, Wang L. Biosci Biotechnol Biochem 2009 Nov; 73(11): Epub 2009 Nov 7

8 Strona8 LAMP - Zasada działania reakcji Kolejne cykle wydłużania i zastępowania nici prowadzone są przy użyciu odpowiedniej polimerazy oraz 2 lub 3 par starterów rozpoznających odpowiednio 6 lub 8 miejsc matrycy. Startery wewnętrzne to FIP (Forward Inner Primer) oraz BIP (Backward Inner Primer), sekwencję ich są komplementarne do dwóch różnych odległych miejsc w sekwencji matrycy (nici sensownej i antysensownej). Startery zewnętrzne F3 (Forward) i B3(Backward) komplementarne są do zewnętrznych końców matrycy. Startery zewnętrzne są krótsze od starterów wewnętrznych i ich końcowe stężenie w reakcji jest niższe, dlatego wolniej hybrydyzują do matrycy inicjując reakcję zastępowania nici. Dodatkowo dla wzmocnienia reakcji można zastosować startery zapętlające LoopF i LoopR. Zastosowanie trzeciej pary starterów zwiększa ilość punktów startowych do reakcji LAMP, tym samym zwiększając wydajność oraz czułość reakcji. Zastosowana polimeraza DNA posiada aktywność zastępowania nici DNA (ang. strand displacement activity), dzięki czemu nie potrzebna jest dodatkowa denaturacja matrycy i reakcję można prowadzić w warunkach izotermicznych. Kluczową cechą LAMP jest utworzenie w pierwszym etapie reakcji sztucznej matrycy (ssdna) o strukturze typu łodyga-pętla, przez tzw. self-priming końców matrycy. Matryca w następnych etapach jest amplifikowana, co prowadzi do powstania mieszaniny dwuniciowego DNA o strukturach podobnych do kalafiora. Proces można podzielić na etapy: 1. Tworzenie materiału startowego do LAMP 2. Cykliczna amplifikacja 3. Elongacja i recyklizacja Zasada działania reakcji (dla 2 par starterów) Gdy dsdna osiągnie stan równowagi (65 C) wówczas pierwszy ze starterów wewnętrznych może przyłączyć się do komplementarnej sekwencji matrycy inicjując syntezę nowej nici DNA. Polimeraza DNA o aktywności zastępującej wydłuża starter w kierunku 5 ->3.

9 Strona9 Następnie starter zewnętrzny F3 hybrydyzuje do miejsca F3c matrycy i następuje jego wydłużanie. Następuje wydłużanie startera F3 w kierunku 5 ->3 oraz odsunięcie nici oflankowanej starterem FIP. Nowo powstały dsdna (powyżej) uwolniony ssdna (poniżej). Uwolniona nić ssdna oflankowana starterem FIP tworzy na końcu 5 strukturę pętli z powodu komplementarności sekwencji F1c z końca 5 do sekwencji F1 wewnątrz sekwencji. Nić ta jest matrycą dla kolejnego startera wewnętrznego BIP, następuje wydłużenie i powstanie nowej nici oraz struktura pętli powraca do formy liniowej. Następnie starter B3 przyłącza się na zewnątrz od BIP, następuje wydłużanie nowej nici i uwolnienie ssdna. Uwolniona nić ssdna tworzy strukturę pętli na obydwu końcach (struktura przypominająca hantle). Tak powstała struktura stanowi matrycę dla rozpoczęcia kolejnego etapu reakcji: cyklicznej amplifikacji. STRUKTURA STARTOWA DLA REAKCJI LAMP

10 Strona10 Rozpoczyna się etap cyklicznej amplifikacji, starter FIP przyłącza się do ssdna i zaczyna się synteza nowej kolejnej nici w kierunku 5 ->3, uwalniając wcześniej zsyntetyzowaną nić. Następnie na końcu 3 regionu B1 następuje wydłużenie nici i uwolnienie nici oflankowanej starterem FIP (9). Uwolniona nić tworzy strukturę hantli z pętlami na obydwu końcach (11). Powstała nić jest odwróceniem nici z etapu (8). Podobnie jak w etapach (8) do (11) następuje tzw. self-priming matrycy (11), dodatkowo starter BIP hybrydyzuje do regionu B2c i następuje wydłużanie starterów i zastępowanie i uwalnianie kolejnej nici DNA. W trakcie reakcji wydłużania starterów, self-priming matrycy oraz zastępowania nici powstają produkty składające się z na przemian odwróconych powtórzeń sekwencji matrycowej na tym samym łańcuchu. Animacja reakcji LAMP: Warunki reakcji LAMP Temperatura: C (~ 63 C) warunki izotermiczne Objętość reakcji: 25 l Enzym: polimeraza DNA GspSSD, 8U/reakcję Startery: o Wewnętrzne (FIP, BIP): 0.8 M o Zewnętrzne (F3, B3): 0.2 M o Zapętlające (LF, LB): 0.4 M Trójfosforany deoksyrybonukleotydów (dntps): 1.4 mm każdego Matryca: 0,5-5 l / reakcję Czas reakcji: do 1 godziny

11 Strona11 Projektowanie starterów do LAMP Odpowiednie zaprojektowanie starterów jest kluczowym etapem poprawnego przeprowadzenia reakcji LAMP. FIP (Forward Inner Primer) starter wewnętrzny forward, zawiera na końcu 3 region F2 komplementarny do F2c matrycy oraz na końcu 5 region F1c BIP (Backward Inner Primer) starter wewnętrzny reverse, zawiera na końcu 3 region B2 komplementarny do B2c matrycy oraz na końcu 5 region B1c F3 (Forward Primer) - starter zewnętrzny forward, zawiera w swojej sekwencji region F3 matrycy komplementarny do F3c B3 (Backward Primer) - starter zewnętrzny reverse, zawiera w swojej sekwencji region B3 matrycy komplementarny do B3c Loop F (Loop Forward Primer) starter zapętlający forward, sekwencja komplementarna do jednoniciowej pętli pomiędzy regionami F2 i F1 na końcu 5 nici ssdna o strukturze przypominającej hantle (ang. Dumbell-like structure). Loop B (Loop Backward Primer) starter zapętlający reverse, sekwencja komplementarna do jednoniciowej pętli pomiędzy regionami B2 i B1 na końcu 5 nici ssdna o strukturze przypominającej hantle (ang. Dumbell-like structure). Rysunek 2. Sekwencje starterów wykorzystywane w reakcji LAMP Zasady projektowania starterów do LAMP Odpowiednie i poprawne zaprojektowanie starterów wymaga postępowania krok po kroku zgodnie z poniższymi wskazówkami: Określenie wymagań (celu) badań o Matryca: wybór odpowiednich szczepów/rodzajów mikroorganizmów, których geny mają być amplifikowane (dawać pozytywny wynik reakcji) o Określenie odpowiednich szczepów/rodzajów mikroorganizmów, których geny nie mogą być amplifikowane (dawać negatywny wynik reakcji), Zebranie dostępnych sekwencji genów dla wszystkich szczepów/rodzajów mikroorganizmów, które mają dawać pozytywny i negatywny wynik reakcji, Dopasowanie i określenie regionów konserwatywnych w genomie szczepów/rodzajów mikroorganizmów, których geny mają być amplifikowane, - czułość LAMP Określenie regionów unikalnych (specyficznych) w genomie szczepów/rodzajów mikroorganizmów, których geny mają być amplifikowane (regiony nie występujące w genomach mikroorganizmów, które mają dawać negatywny wynik) specyficzność LAMP Wykorzystanie dostępnych programów komputerowych do projektowania starterów.

12 Strona12 W przypadku, gdy zaprojektowane startery nie dają satysfakcjonującego rezultatu (brak produktu, obecność niespecyficznych sekwencji etc.) należy ponownie zaprojektować startery. Parametry starterów: Odległość pomiędzy regionami starterów: Odległość pomiędzy końcami regionu F2 i B2 (region amplifikowany przez LAMP) powinna wynosić pz, natomiast zarówno pomiędzy F2 i F3. oraz B2 i B3 powinna wynosić 0 20 pz. Odległość dla regionów tworzących strukturę pętli (pomiędzy 5' końcem F2 i 5' końcem F1 oraz 5' końcem B2 i 3' końcem B1) powinna wynosić pz. Odległość pomiędzy regionami F2 i F3 oraz B2 i B3 powinna wynosić 0 60 pz. 5 F3 F2 B1c 3 F1c B2 B3 5 <40~60 pz> <40~60 pz> Temperatura topnienia (Tm): <0~60>pz <120~160>pz <0~60>pz Około C dla regionów bogatych w pary GC i ok C dla regionów bogatych w pary AT Tm dla każdego regionu powinna wynosić odpowiednio: ok. 65 C (64-66 C) dla F1c i B1c, ok. 60 C (59-61 C) dla F2, B2, F3, i B3 oraz ok. 65 C (64-66 C) dla starterów LoopF i LoopB. Stabilność końców Końce starterów stanowią początkowy punkt dla syntezy DNA i tym samym muszą być odpowiednio stabilne. Końce 3 regionów F2/B2, F3/B3, i LF/LB oraz koniec 5 regionów F1c/B1c powinny być zaprojektowane tak by energia swobodna wynosiła 4 kcal/mol lub mniej (dla 6 pz końca). Koniec 5 regionu F1c po amplifikacji łączy się z końcem 3 regionu F1, dlatego stabilność jest bardzo istotna. (Zmiana energii swobodnej ΔG jest różnicą pomiędzy energią swobodną produktu i energią swobodną materiału początkowego) Im niższa wartość ΔG tym z większym prawdopodobieństwem startery hybrydyzują do matrycy. Zawartość par GC powinna wynosić 50-60% w przypadku matryc bogatych w pary GC oraz 40-50% dla matryc bogatych w pary AT. Tworzenie struktur dwurzędowych: Ważne jest w szczególności dla starterów wewnętrznych, aby nie tworzyły struktur drugorzędowych typu primer-dimer. Końce 3 starterów nie mogą być komplementarne względem siebie.

13 Strona13 Inne: Jeżeli w sekwencji występują miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne, z wyjątkiem regionów dla starterów, mogą być użyte dla potwierdzenia zamplifikowanego produktu Programy do projektowania starterów Primer Explorer V4 Automatyczne oprogramowanie stworzone przez Fujitsu Ltd i Eiken Chemical Co, Ltd Wersja V4 Pracuje w środowisku Windows, Internet Explorer 5+ Dostępne na stronie internetowej: LAMP Designer (OptiGene Ltd) Automatyczne oprogramowanie stworzone przez OptiGeneLtd Posiada wbudowany algorytm wyszukiwania najlepszych sekwencji starterowych Startery przeszukiwane są pod kątem tworzenia struktur drugorzędowych, dimerów, homologii właściwości fizycznych zgodnie z zadanymi warunkami Sekwencje matrycowe mogą być pobierane z baz danych (Acession number), z pliku w formacie tekstowym oraz wklejane bezpośrednio w okienko programu Pracuje w środowisku Windows Wersja demo dostępna na stronie internetowej: Detekcja i wizualizacja produktów LAMP Charakterystyka produktów (amplikonów) reakcji LAMP ( LAMPlikons ) Tabela 1. Porównanie produktów reakcji LAMP i PCR LAMP PCR Struktura pętla-łodyga dsdna dsdna Rozmiar różny jednakowy Kształt przypominający kalafior liniowy Liczba kopii genu wiele kopii/1 amplikon 1 kopia/1 amplikon Stężenie µg/ml kopii/reakcję, 4-40 µg/ml Metody detekcji 1. Elektroforeza w żelu agarozowym Po raz pierwszy dla LAMP w 2000 roku (Notomi Tet al.) Produkty reakcji wybarwione bromkiem etydyny, rozdzielane w 2% żelu agarozowym Końcowy punkt analizy (po zakończeniu reakcji) Produkt na żelu widoczny w postaci smearu Wynik tylko jakościowy Wizualizacja w świetle UV Pozwala obserwować produkt reakcji LAMP po trawieniu restrykcyjnym.

14 Strona14 A Rysunek 3 A. Rozdział elektroforetyczny produktu amplifikacji na matrycy HBV techniką LAMP (amplifikacja w temp. 60 C przez 60 min) Linia 1. Marker masy DNA, Linia 2-4. Amplifikowane produkty z matrycy HBV, Linia 5. Kontrola ujemna, Linia 6. Kontrola pozytywna (produkt amplifikacji trawiony Sau 3A I) Rysunek 3 B. Rozdział elektroforetyczny produktu amplifikacji na matrycy PSA mrna (amplifikacja w temp. 65 C przez 60 min) Linia 1 Marker masy DNA, Linia 2. Kontrola ujemna, Linia 3-4. Amplifikowane produkty z matrycy PSA mrna, Linia 5-6. Kontrola pozytywna (produkt amplifikacji trawiony Sau 3A I) 2. Analiza turbidymetryczna B Po raz pierwszy dla LAMP w 2001 roku (Mori et al.) Powstający w trakcie reakcji produkt uboczny, pirofosforan magnezu, pozwala na ocenę wyniku poprzez analizę zmętnienia Końcowy punkt analizy (po zakończeniu reakcji) Produkt reakcji widoczny gołym okiem Wynik jakościowy W trakcie reakcji przyłączania kolejnych nukleotydów do wydłużanego łańcucha DNA podczas polimeryzacji uwalniany jest z dntp ów pirofosforan. Duża ilość powstającego piroforsforanu reaguje z jonami magnezu obecnymi w buforze reakcyjnym powstaje biały osad (zgodnie z równaniem poniżej: (DNA) n-1 + dntp = (DNA) n + P 2 O 7 4- ; P 2 O Mg 2+ = Mg 2 P 2 O 7 Zmętnienie w probówce widoczne jest kiedy stężenie pirofosforanu magnezu przekracza 0.5 mm. Do powstania pirofosforanu magnezu w stężeniu powyżej 0.5 mm potrzeba wytworzenia 4 µg DNA w 25 µl objętości reakcji. W reakcji LAMP uzyskuje się 10 µg DNA/25µl, dla porównania w reakcji PCR otrzymuje się ok. 0.2 µg DNA/25 µl, a stężenie pirofosforanu magnezu wynosi wówczas 0.02 mm, co nie pozwala na zaobserwowanie białego osadu. Dodatkowo warunki termiczne (podgrzewanie) w reakcji PCR powodują, że jony pirofosforanowe są hydrolizowane do jonów fosforanowych. Rysunek 4. Analiza turbidymetryczna produktów reakcji LAMP. Probówka 1 K(-), Probówka 2 amplikon LAMP.

15 Strona15 3. Analiza turbidymetryczna w czasie rzeczywistym Po raz pierwszy dla LAMP w 2003 roku (Mori et al.) Pomiar w czasie rzeczywistym pozwala wyeliminować etap szacowania ilości produktu po zakończeniu reakcji Pomiar podobny do analizy spektrofotometrycznej Analiza jakościowa i ilościowa produktu reakcji Analiza turbidymetryczna jest pomiarem pośrednim ilości DNA, gdyż opiera się na pomiarze stężenia produktu ubocznego reakcji - pirofosforanu magnezu. Określana jest zależność pomiędzy ilością powstającego pirofosforanu magnezu, a ilością powstającego DNA. Rysunek 5. Pomiar zmętnienia produktów reakcji LAMP w czasie rzeczywistym. 4. Analiza fluorymetryczna Po raz pierwszy dla LAMP w 2000 roku (Notomi Tet al.) Detekcja produktu przez fluorescencję Detektorami są cząsteczki fluorochromu emitujące światło o określonej długości po związaniu się z dwuniciowym DNA, takie jak bromek etydyny, SYBR Green I, kalceina etc. Końcowy punkt analizy (po zakończeniu reakcji) Analiza jakościowa Wizualizacja w świetle UV, ale produkt reakcji można obserwować gołym okiem A B Rysunek 6 A. Wizualizacja fluorymetryczna reakcji LAMP (fluorochrom: kalceina). Jony pirofosforanowe usuwają jony manganu z kalceiny, a fluorescencja wzrasta im więcej kalceiny łączy się z uwolnionymi z dntps jonami magnezu. Probówka 1 K(-), Probówka 2 amplikon LAMP Rysunek 6 B. Wizualizacja fluorymetryczna reakcji LAMP (fluorochrom: bromek etydyny) obraz w świetle UV. Probówka 1 - K-, Probówka 2 amplikon LAMP

16 Strona16 5. Fluorescencja w czasie rzeczywistym Pomiar w czasie rzeczywistym, pozwala to wyeliminować etap szacowania produktu po zakończeniu reakcji Analiza jakościowa i ilościowa produktu reakcji Monitorowanie przyrostu liczby kopii badanej sekwencji w czasie, przez pomiar fluorescencji Specyficzność reakcji - analiza temperatury annealingu produktu. A B Rysunek 7A. Pomiar fluorescencji produktu reakcji LAMP w czasie rzeczywistym. Rysunek 7 B. Krzywa annealingu produktu reakcji LAMP.

17 Strona17 Diagnostyczne wskaźniki wydajności reakcji LAMP Przed przystąpieniem do obliczania wskaźników wydajności LAMP należy: 1. określić, które z badanych prób mają dać wynik pozytywny, a które negatywny 2. zebrać jak największą liczbę prób, które będą stanowiły odniesienie (tzw. próby referencyjne) faktycznie dające wynik pozytywny oraz faktycznie dające wynik negatywny 3. zbadać każdą próbę i określić, które w reakcji LAMP dają wynik pozytywny, a które wynik negatywny 4. zebrane dane liczbowe umieścić w tabeli tzw. tablicy 2x2 Wskaźniki: P. odniesienia (+) P. odniesienia (-) Test (+) Prawdziwie dodatnie (PD) Fałszywie dodatnie (FD) suma (PD+FD) Test (-) Fałszywie ujemne (FJ) Prawdziwie ujemne (PJ) suma (FN+PN) SUMA suma (PP+FJ) suma (FD+PJ) SUMA Czułość zdolność do wykrycia badanej cechy, stosunek wyników prawdziwie dodatnich do faktycznie posiadających daną cechę. CZ = PP / (PP+FN) [%] Specyficzność część negatywnych prób odniesienia, która w reakcji dała wynik negatywny, stosunek wyników prawdziwie ujemnych do faktycznie nieposiadających danej cechy. Sp = PJ / FD+PJ [%] Predykcja dodatnia iloraz wyników prawdziwie dodatnich oraz sumy wyników prawdziwie dodatnich i fałszywie dodatnich (czyli wszystkich dodatnich wyników testu). Pd = PD / (PD+FD) [%] Predykcja ujemna iloraz wyników prawdziwie ujemnych oraz sumy wyników prawdziwie ujemnych i fałszywie ujemnych (czyli wszystkich ujemnych wyników testu). Wydajność określa jak często w reakcji otrzymujemy poprawny wynik. W = (PP+PJ) / SUMA

18 Strona18 Badanie SNP technika LAMP Polimorfizm pojedynczego nukleotydu (ang. Single Nucleotide Polymorphism, SNP) jest to zmienność sekwencji DNA, która polega na zmianie pojedynczego nukleotydu pomiędzy osobnikami danego gatunku lub drugim, odpowiadającym chromosomem danemu osobnikowi. Wysoka specyficzność reakcji LAMP powoduje, że tylko docelowa dzika sekwencja (wild type allele - nie zawierająca SNP) zostanie zamplifikowana spośród sekwencji homologicznych. Występowanie polimorfizmu pojedynczego nukleotydu można potwierdzić przez brak amplifikowanego produktu w reakcji. Możliwe to jest dzięki odpowiedniemu zaprojektowaniu starterów do reakcji. Startery FIP i BIP do reakcji SNP-LAMP projektowane są w taki sposób, że na końcach 5 zawierają nukleotyd SNP. Kiedy matrycą w reakcji jest sekwencja bez polimorfizmu (WT allele) wówczas w trakcie reakcji powstaje struktura startowa i reakcja jest kontynuowana. W przypadku, gdy matrycą jest zmutowana sekwencja genu zawierająca polimorfizm (MUT allele), nie otrzymujemy produktu w reakcji. Rysunek 8. Przebieg reakcji LAMP ukierunkowanej na identyfikację polimorfizmu SNP w sekwencji. Animacja reakcji LAMP:http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/snps_anim.html

19 Strona19 Oprzyrządowanie, odczynniki i akcesoria dla izotermalnej amplifikacji DNA, firmy OptiGene. OptiGene stosuje izotermalną metodę amplifikacji znaną jako LAMP, która została opracowana przez Eiken Chemical Company Ltd z Japonii. Dużą zaletą tej metody jest prowadzenie reakcji w stałej temperaturze, co eliminuje konieczność stosowania specjalistycznej aparatury. W wielu przypadkach nie potrzebna jest ekstrakcja DNA. Czas oczekiwania na wynik reakcji jest bardzo krótki, np min (detekcja produktu w trakcie trwania reakcji). Genie II zinegrowana elastyczna platforma Genie II to zaawansowane narzędzie, które pozwala na prowadzenie izotermalnej reakcji w czasie rzeczywistym (Real-time) w przenośnej platformie o niskim poborze mocy, dedykowanej do badań laboratoryjnych. System zamknięty prowadzenia reakcji zapobiega kontaminacji amplifikowanym produktem. Genie II jest urządzeniem wyposażonym w dwa niezależne bloki grzejne, każdy mieszczący 8 mikroprobówek (0.2 ml), odpowiednich dla urządzenia. Genie II posiada funkcję gradientową oraz umożliwia zaprogramowanie dodatkowego annealingu dla potwierdzenia obecności amplifikowanego produktu. Najważniejsze funkcje: szybka izotermiczna amplifikacja potwierdzenie poprawności wyniku poprzez analizę krzywej annealingu (podobna do analizy krzywej topnienia produktu) niskie koszty i łatwość obsługi kompaktowe, przenośne i wytrzymałe urządzenie zasilanie sieciowe lub bateryjne łatwy dostęp do danych przez urządzenie USB obsługa za pomocą komputera lub niezależnie przez ekran dotykowy. Rysunek 9. Genie II urządzenie do prowadzenia reakcji LAMP i detekcji produktu.

20 Strona20 GspSSD Polimeraza Polimeraza z Geobacillus sp. pozwala na uzyskanie z niewielkiej ilości matrycy aż 10 9 kopii DNA w czasie krótszym niż 30 minut. Pozwala na amplifikację matrycy w znacznie krótszym czasie w porównaniu do Bst Polimerazy. Pozwala na uzyskanie produktu o wysokiej specyficzności. Ze względu na aktywność zastępowania nici (ang. strand displacement activity) pozwala na prowadzenie reakcji w warunkach izotermicznych bez konieczności wykorzystywania specjalistycznej aparatury jak w przypadku reakcji amplifikacji in vitro metodą PCR. Nie wymaga wstępnej denaturacji matrycy. Ze względu na niewielką aktywność odwrotnej transkryptazy pozwala na amplifikowanie RNA z wysoką specyficznością, bez dodatkowego dodawania odwrotnej transkryptazy. Isothermal Master Mix Izotermalna mieszanina do amplifikacji techniką LAMP, pozwala na fluorescencyjną detekcję produktu na platformie Genie II oraz innych urządzeniach fluorymetrycznych ustawionych na wzbudzenie przy 488 nm i emisję przy 520 nm. Może być także wykorzystywana w aparatach do qpcr lub Real-time PCR ustawionych na kanał FAM. Krzywa annealingu jest generowana dla potwierdzenia obecności produktu. Eliminuje to konieczność prowadzenia dodatkowej detekcji w żelach agarozowych i analizy turbidymetrycznej oraz pozwala na prowadzenie reakcji w systemie zamkniętym (close-tube system). Typowe warunki reakcji dla Isothermal Master Mix to: Amplifikacja 30 minut w temp 65 C Annealing co 0,05 C w przedziale 98 C 80 C

21 Strona21 Zalety i wady techniki LAMP Zalety: Wady: Szybka, krótki czas reakcji (można zaobserwować produkt po 20 min) Czuła i specyficzna, dzięki zastosowaniu starterów rozpoznających 6-8 miejsc na matrycy Izotermalna, możliwość prowadzenia reakcji w stałej temperaturze Prostsze i tańsze urządzenia niż w Real-time PCR, przy porównywalnej czułości Nie wymaga wstępnej denaturacji matrycy Produkt reakcji można zaobserwować gołym okiem Trudniejsze i bardziej czasochłonne projektowanie starterów do reakcji w porównaniu do PCR Nie wszystkie badania DNA są specyficzne do sekwencji Biorąc pod uwagę powyższe zalety i wady, można stwierdzić, że metoda LAMP jest odpowiednia tam gdzie mamy do czynienia z ograniczonymi zasobami, gdzie wyniki potrzebne są w krótkim czasie oraz prowadzone analizy są specyficzne, co do sekwencji. Natomiast nie nadaje się do analizy nieznanych sekwencji DNA i RNA. Podsumowanie LAMP jest nową innowacyjną i szybko rozwijającą się techniką amplifikacji kwasów nukleinowych LAMP doskonale nadaje się w sytuacjach, gdy mamy do czynienia z ograniczonymi zasobami sprzętowymi, a prowadzone analizy wymagają bardzo szybkich wyników LAMP umożliwia specyficzną amplifikację matrycy (startery rozpoznają 6-8 różnych sekwencji matrycy) Projektowanie starterów dla reakcji LAMP jest bardziej złożone niż w przypadku PCR, ale udogodnienie stanowią specjalne oprogramowanie do projektowania Nie wymaga denaturacji matrycy, całość reakcji przebiega w stałych warunkach temperaturowych Wydajność amplifikacji jest bardzo wysoka, wyższa niż Real-time PCR LAMP pozwala na znaczące skrócenie czasu analizy (do 1h) LAMP jest mniej wrażliwy na obecność inhibitorów, nie zawsze wymagana jest izolacja DNA Pozwala na amplifikację RNA bez dodawania odwrotnej transkryptazy Produkt uboczny powstający w reakcji LAMP, pirofosforan magnezu, pozwala na obserwację wyniku w świetle UV i widzialnym (analiza turbidymetryczna) Możliwy pomiar ilościowy produktu w czasie rzeczywistym Umożliwia prowadzenie reakcji w systemie zamkniętym, co pozwala uniknąć zanieczyszczeń w próbie Zastosowanie zintegrowanej platformy Genie II umożliwia prowadzenie reakcji w czasie rzeczywistym i ilościowe oznaczenie produktu.

22 Strona22 Bibliografia Kaneko H, Kawana T, Fukushima E, Suzutani T. Tolerance of loop-mediated isothermal amplification to a culture medium and biological substances.j BiochemBiophys Methods Apr 10;70(3): Epub 2006 Aug 30. Mori Y, Nagamine K, Tomita N, Notomi T.Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation.biochembiophys Res Commun Nov 23;289(1): Mori Y, Kitao M, Tomita N, Notomi T.Real-time turbidimetry of LAMP reaction for quantifying template DNA.J BiochemBiophys Methods May 31;59(2): Nagamine K, Hase T, NotomiT.Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers.mol Cell Probes Jun;16(3): Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, YonekawaT, Watanabe K, Amino N, Hase T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res Jun 15;28(12):E63. Parida M, Sannarangaiah S, Dash PK, Rao PV, Morita K.Loop mediated isothermal amplification (LAMP): a new generation of innovative gene amplification technique; perspectives in clinical diagnosis of infectious diseases.rev Med Virol Nov-Dec;18(6): Strony www: Novazym Polska s.c., ul. Żywokostowa 23, Poznań, tel , fax ,

(LAMP) Amplifikacja in vitro wybranych odcinków DNA i RNA metodą Loop-mediated isothermal. AMPlification(LAMP) NOVAZYM POLSKA nr 1 / 2012

(LAMP) Amplifikacja in vitro wybranych odcinków DNA i RNA metodą Loop-mediated isothermal. AMPlification(LAMP) NOVAZYM POLSKA nr 1 / 2012 NOVAZYM POLSKA nr 1 / 2012 Amplifikacja in vitro wybranych odcinków DNA i RNA metodą Loop-mediated isothermal (LAMP) AMPlification(LAMP) LAMP is registered trademark owned by Eiken Chemical Co., Ltd. Opracowanie:

Bardziej szczegółowo

Nr 4/2014 Amplifikacja in vitro wybranych odcinków DNA i RNA metodą Loop-mediated isothermal AMPlification (LAMP)

Nr 4/2014 Amplifikacja in vitro wybranych odcinków DNA i RNA metodą Loop-mediated isothermal AMPlification (LAMP) Nr 4/2014 Amplifikacja in vitro wybranych odcinków DNA i RNA metodą Loop-mediated isothermal AMPlification (LAMP) Opracowanie: Adam Burzyński Novazym Polska Marta Jankowska Katedra Biotechnologii i Mikrobiologii

Bardziej szczegółowo

LAMP. szybka i specyficzna detekcja patogenów

LAMP. szybka i specyficzna detekcja patogenów LABORATORIUM 5-6/2014 DIAGNOSTYKA LABORATORYJNA LAMP szybka i specyficzna detekcja patogenów STRESZCZENIE W obecnych czasach istnieje potrzeba opracowywania szybkich, tanich i skutecznych metod diagnostycznych

Bardziej szczegółowo

Ampli-LAMP Babesia canis

Ampli-LAMP Babesia canis Novazym Products Zestaw do identyfikacji materiału genetycznego pierwotniaka Babesia canis canis techniką Loop-mediated Isothermal AMPlification (LAMP) Numery katalogowe produktu: AML-Bc-200 AML-Bc-400

Bardziej szczegółowo

Ampli-LAMP Goose Parvovirus

Ampli-LAMP Goose Parvovirus Novazym Products Zestaw do identyfikacji materiału genetycznego parwowirusa GPV u gęsi techniką Loop-mediated Isothermal AMPlification (LAMP) Numery katalogowe produktu: AML-GPV-200 AML-GPV-400 Wydanie

Bardziej szczegółowo

Ampli-LAMP Salmonella species

Ampli-LAMP Salmonella species Novazym Products Novazym Polska ul. Żywokostowa 23, 61-680 Poznań, tel. +48 0 61 610 39 10, fax +48 0 61 610 39 11, email info@novazym.com Zestaw do identyfikacji materiału genetycznego bakterii z rodzaju

Bardziej szczegółowo

Powodzenie reakcji PCR wymaga właściwego doboru szeregu parametrów:

Powodzenie reakcji PCR wymaga właściwego doboru szeregu parametrów: Powodzenie reakcji PCR wymaga właściwego doboru szeregu parametrów: dobór warunków samej reakcji PCR (temperatury, czas trwania cykli, ilości cykli itp.) dobór odpowiednich starterów do reakcji amplifikacji

Bardziej szczegółowo

TaqNovaHS. Polimeraza DNA RP902A, RP905A, RP910A, RP925A RP902, RP905, RP910, RP925

TaqNovaHS. Polimeraza DNA RP902A, RP905A, RP910A, RP925A RP902, RP905, RP910, RP925 TaqNovaHS RP902A, RP905A, RP910A, RP925A RP902, RP905, RP910, RP925 RP902A, RP905A, RP910A, RP925A RP902, RP905, RP910, RP925 TaqNovaHS Polimeraza TaqNovaHS jest mieszaniną termostabilnej polimerazy DNA

Bardziej szczegółowo

Zastosowanie metody RAPD do różnicowania szczepów bakteryjnych

Zastosowanie metody RAPD do różnicowania szczepów bakteryjnych Zastosowanie metody RAPD do różnicowania szczepów bakteryjnych Wstęp teoretyczny Technika RAPD (ang. Random Amplification of Polymorphic DNA) opiera się na prostej reakcji PCR, przeprowadzanej na genomowym

Bardziej szczegółowo

Genetyczne modyfikowanie organizmów Kierunek OCHRONA ŚRODOWISKA, II rok semestr letni 2015/16

Genetyczne modyfikowanie organizmów Kierunek OCHRONA ŚRODOWISKA, II rok semestr letni 2015/16 Genetyczne modyfikowanie organizmów Kierunek OCHRONA ŚRODOWISKA, II rok semestr letni 2015/16 Ćwiczenie 3 Identyfikacja genetycznie modyfikowanych roślin w produktach spożywczych - jakościowe badanie obecności

Bardziej szczegółowo

TaqNova-RED. Polimeraza DNA RP20R, RP100R

TaqNova-RED. Polimeraza DNA RP20R, RP100R TaqNova-RED Polimeraza DNA RP20R, RP100R RP20R, RP100R TaqNova-RED Polimeraza DNA Rekombinowana termostabilna polimeraza DNA Taq zawierająca czerwony barwnik, izolowana z Thermus aquaticus, o przybliżonej

Bardziej szczegółowo

RT31-020, RT , MgCl 2. , random heksamerów X 6

RT31-020, RT , MgCl 2. , random heksamerów X 6 RT31-020, RT31-100 RT31-020, RT31-100 Zestaw TRANSCRIPTME RNA zawiera wszystkie niezbędne składniki do przeprowadzenia syntezy pierwszej nici cdna na matrycy mrna lub całkowitego RNA. Uzyskany jednoniciowy

Bardziej szczegółowo

Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA

Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA Zakład Biologii Molekularnej Wydział Farmaceutyczny, WUM ul. Banacha 1, 02-097 Warszawa IZOLACJA DNA Z HODOWLI KOMÓRKOWEJ.

Bardziej szczegółowo

Ćwiczenie 3 Oznaczenie polimorfizmu genetycznego cytochromu CYP2D6 metodą PCR w czasie rzeczywistym (rtpcr) przy użyciu sond typu TaqMan

Ćwiczenie 3 Oznaczenie polimorfizmu genetycznego cytochromu CYP2D6 metodą PCR w czasie rzeczywistym (rtpcr) przy użyciu sond typu TaqMan Ćwiczenie 3 Oznaczenie polimorfizmu genetycznego cytochromu CYP2D6 metodą PCR w czasie rzeczywistym (rtpcr) przy użyciu sond typu TaqMan Klasyczna metoda PCR jest metodą jakościową, nie ilościową co np.

Bardziej szczegółowo

Glimmer umożliwia znalezienie regionów kodujących

Glimmer umożliwia znalezienie regionów kodujących Narzędzia ułatwiające identyfikację właściwych genów GLIMMER TaxPlot Narzędzia ułatwiające amplifikację tych genów techniki PCR Primer3, Primer3plus PrimerBLAST Reverse Complement Narzędzia ułatwiające

Bardziej szczegółowo

Ćwiczenie 2. Identyfikacja płci z wykorzystaniem genu amelogeniny (AMGXY)

Ćwiczenie 2. Identyfikacja płci z wykorzystaniem genu amelogeniny (AMGXY) Ćwiczenie 2. Identyfikacja płci z wykorzystaniem genu amelogeniny (AMGXY) Cel ćwiczenia Amplifikacja fragmentu genu amelogeniny, znajdującego się na chromosomach X i Y, jako celu molekularnego przydatnego

Bardziej szczegółowo

TECHNIKI ANALIZY RNA TECHNIKI ANALIZY RNA TECHNIKI ANALIZY RNA

TECHNIKI ANALIZY RNA TECHNIKI ANALIZY RNA TECHNIKI ANALIZY RNA DNA 28SRNA 18/16S RNA 5SRNA mrna Ilościowa analiza mrna aktywność genów w zależności od wybranych czynników: o rodzaju tkanki o rodzaju czynnika zewnętrznego o rodzaju upośledzenia szlaku metabolicznego

Bardziej szczegółowo

PCR. Aleksandra Sałagacka

PCR. Aleksandra Sałagacka PCR Aleksandra Sałagacka Reakcja PCR naśladuje proces replikacji DNA in vitro pozwala na amplifikację określonego krótkiego (kilkadziesiąt kilka tys.pz) fragmentu DNA obecnie najważniejsze narzędzie biologii

Bardziej szczegółowo

Zestaw do wykrywania Babesia spp. i Theileria spp. w kleszczach, krwi i hodowlach komórkowych

Zestaw do wykrywania Babesia spp. i Theileria spp. w kleszczach, krwi i hodowlach komórkowych Nr kat. PK25N Wersja zestawu: 1.2012 Zestaw do wykrywania spp. i Theileria spp. w kleszczach, krwi i hodowlach komórkowych dwie oddzielne reakcje PCR 2x50 reakcji PCR (50 µl), włączając w to kontrole Zestaw

Bardziej szczegółowo

Zestaw dydaktyczny. genotypowanie szczepów 5taphy/ococcus aureus metodą PCR-RFLP

Zestaw dydaktyczny. genotypowanie szczepów 5taphy/ococcus aureus metodą PCR-RFLP 2014-07-17 Zestaw dydaktyczny EasyGenotyping PCR-RFLP - S. aureus genotypowanie szczepów 5taphy/ococcus aureus metodą PCR-RFLP Celem ćwiczenia jest przeprowadzenie typowania genetycznego dostarczonych

Bardziej szczegółowo

PCR - ang. polymerase chain reaction

PCR - ang. polymerase chain reaction PCR - ang. polymerase chain reaction łańcuchowa (cykliczna) reakcja polimerazy Technika PCR umożliwia otrzymywanie dużej liczby kopii specyficznych fragmentów DNA (czyli amplifikację zwielokrotnienie fragmentu

Bardziej szczegółowo

AmpliTest Salmonella spp. (Real Time PCR)

AmpliTest Salmonella spp. (Real Time PCR) AmpliTest Salmonella spp. (Real Time PCR) Zestaw do wykrywania sekwencji DNA specyficznych dla bakterii z rodzaju Salmonella techniką Real Time PCR Nr kat.: BAC01-50 Wielkość zestawu: 50 oznaczeń Objętość

Bardziej szczegółowo

PCR - ang. polymerase chain reaction

PCR - ang. polymerase chain reaction PCR - ang. polymerase chain reaction łańcuchowa (cykliczna) reakcja polimerazy Technika PCR umożliwia otrzymywanie dużej liczby kopii specyficznych fragmentów DNA (czyli amplifikację zwielokrotnienie fragmentu

Bardziej szczegółowo

Badanie próbek żywności na obecność Genetycznie Zmodyfikowanych Organizmów. Rozdział 9

Badanie próbek żywności na obecność Genetycznie Zmodyfikowanych Organizmów. Rozdział 9 Badanie próbek żywności na obecność Genetycznie Zmodyfikowanych Organizmów Rozdział 9 Wykrywanie jakościowe kukurydzy MON810, kukurydzy Bt-176 i soi Roundup Ready metodą PCR M. Querci, M. Maretti, M. Mazzara

Bardziej szczegółowo

Optymalizacja warunków reakcji PCR w gradiencie temperatury i magnezu

Optymalizacja warunków reakcji PCR w gradiencie temperatury i magnezu Protokół pochodzi ze strony molekularnie.wordpress.com Kopiowanie i rozpowszechnianie wyłącznie w całości, z zachowaniem praw autorskich zgodnie z zasadami licencji GNU Dziękuję za uszanowanie mojej pracy,

Bardziej szczegółowo

PCR - ang. polymerase chain reaction

PCR - ang. polymerase chain reaction PCR - ang. polymerase chain reaction Technika PCR umożliwia otrzymywanie dużej liczby kopii specyficznych fragmentów DNA (czyli amplifikację zwielokrotnienie fragmentu DNA) Jest to reakcja powielania (replikacji)

Bardziej szczegółowo

Farmakogenetyka Biotechnologia Medyczna I o

Farmakogenetyka Biotechnologia Medyczna I o ĆWICZENIE 2 Oznaczanie polimorfizmu cytochromu CYP2D6 za pomocą tradycyjnych metod biologii molekularnej: PCR-RFLP I. Łańcuchowa reakcja polimerazy PCR (polymerase chain reaction) Technika PCR rozwinęła

Bardziej szczegółowo

Ćwiczenie 3. Amplifikacja genu ccr5 Homo sapiens wykrywanie delecji Δ32pz warunkującej oporność na wirusa HIV

Ćwiczenie 3. Amplifikacja genu ccr5 Homo sapiens wykrywanie delecji Δ32pz warunkującej oporność na wirusa HIV Ćwiczenie 3. Amplifikacja genu ccr5 Homo sapiens wykrywanie delecji Δ32pz warunkującej oporność na wirusa HIV Cel ćwiczenia Określenie podatności na zakażenie wirusem HIV poprzez detekcję homo lub heterozygotyczności

Bardziej szczegółowo

Klonowanie molekularne Kurs doskonalący. Zakład Geriatrii i Gerontologii CMKP

Klonowanie molekularne Kurs doskonalący. Zakład Geriatrii i Gerontologii CMKP Klonowanie molekularne Kurs doskonalący Zakład Geriatrii i Gerontologii CMKP Etapy klonowania molekularnego 1. Wybór wektora i organizmu gospodarza Po co klonuję (do namnożenia DNA [czy ma być metylowane

Bardziej szczegółowo

Applied Biosystems 7500 Fast Real Time PCR System, czyli Mercedes wśród termocyklerów do analizy PCR w czasie rzeczywistym

Applied Biosystems 7500 Fast Real Time PCR System, czyli Mercedes wśród termocyklerów do analizy PCR w czasie rzeczywistym Applied Biosystems 7500 Fast Real Time PCR System, czyli Mercedes wśród termocyklerów do analizy PCR w czasie rzeczywistym Rynek aparatury laboratoryjnej pęka w szwach od ilości różnych aparatów przeznaczonych

Bardziej szczegółowo

Ćwiczenie numer 6. Analiza próbek spożywczych na obecność markerów GMO

Ćwiczenie numer 6. Analiza próbek spożywczych na obecność markerów GMO Ćwiczenie numer 6 Analiza próbek spożywczych na obecność markerów GMO 1. Informacje wstępne -screening GMO -metoda CTAB -qpcr 2. Izolacja DNA z soi metodą CTAB 3. Oznaczenie ilościowe i jakościowe DNA

Bardziej szczegółowo

Metody badania polimorfizmu/mutacji DNA. Aleksandra Sałagacka Pracownia Diagnostyki Molekularnej i Farmakogenomiki Uniwersytet Medyczny w Łodzi

Metody badania polimorfizmu/mutacji DNA. Aleksandra Sałagacka Pracownia Diagnostyki Molekularnej i Farmakogenomiki Uniwersytet Medyczny w Łodzi Metody badania polimorfizmu/mutacji DNA Aleksandra Sałagacka Pracownia Diagnostyki Molekularnej i Farmakogenomiki Uniwersytet Medyczny w Łodzi Mutacja Mutacja (łac. mutatio zmiana) - zmiana materialnego

Bardziej szczegółowo

PCR bez izolacji testujemy Direct PCR Kits od ThermoFisher Scientific

PCR bez izolacji testujemy Direct PCR Kits od ThermoFisher Scientific PCR bez izolacji testujemy Direct PCR Kits od ThermoFisher Scientific Specjalnie dla Was przetestowaliśmy w naszym laboratorium odczynniki firmy Thermo Scientific umożliwiające przeprowadzanie reakcji

Bardziej szczegółowo

Prowadzący: dr Lidia Boss znacznik fluorescencyjny (np. SYBR Green II)

Prowadzący: dr Lidia Boss znacznik fluorescencyjny (np. SYBR Green II) Uniwersytet Gdański, Wydział Biologii Biologia i Biologia Medyczna II rok Katedra Biologii Molekularnej Przedmiot: Biologia Molekularna z Biotechnologią ============================================================================

Bardziej szczegółowo

AmpliTest Panel odkleszczowy (Real Time PCR)

AmpliTest Panel odkleszczowy (Real Time PCR) AmpliTest Panel odkleszczowy (Real Time PCR) Zestaw do wykrywania sekwencji DNA specyficznych dla bakterii Borrelia burgdorferi, Anaplasma, Ehrlichia oraz pierwotniaków rodzaju Babesia (B. canis, B. gibsoni,

Bardziej szczegółowo

PL 217144 B1. Sposób amplifikacji DNA w łańcuchowej reakcji polimerazy za pomocą starterów specyficznych dla genu receptora 2-adrenergicznego

PL 217144 B1. Sposób amplifikacji DNA w łańcuchowej reakcji polimerazy za pomocą starterów specyficznych dla genu receptora 2-adrenergicznego PL 217144 B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 217144 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 391926 (22) Data zgłoszenia: 23.07.2010 (51) Int.Cl.

Bardziej szczegółowo

AmpliTest Chlamydia/Chlamydophila (Real Time PCR)

AmpliTest Chlamydia/Chlamydophila (Real Time PCR) AmpliTest Chlamydia/Chlamydophila (Real Time PCR) Zestaw do wykrywania sekwencji DNA specyficznych dla bakterii z rodzajów Chlamydia i Chlamydophila techniką Real Time PCR Nr kat.: BAC18-50 BAC18-100 Wielkość

Bardziej szczegółowo

METODY MOLEKULARNE STOSOWANE W TAKSONOMII

METODY MOLEKULARNE STOSOWANE W TAKSONOMII METODY MOLEKULARNE STOSOWANE W TAKSONOMII AUTOR: MAGDALENA DUDEK Taksonomia jest nauką, której głównym celem jest badanie, opisywanie oraz klasyfikacja organizmów. W oparciu o różnice i podobieństwa łączy

Bardziej szczegółowo

Metody badania ekspresji genów

Metody badania ekspresji genów Metody badania ekspresji genów dr Katarzyna Knapczyk-Stwora Warunki wstępne: Proszę zapoznać się z tematem Metody badania ekspresji genów zamieszczonym w skrypcie pod reakcją A. Lityńskiej i M. Lewandowskiego

Bardziej szczegółowo

DETEKCJA PATOGENÓW POWODUJĄCYCH ZAPALENIE OPON MÓZGOWO-RDZENIOWYCH

DETEKCJA PATOGENÓW POWODUJĄCYCH ZAPALENIE OPON MÓZGOWO-RDZENIOWYCH DETEKCJA PATOGENÓW POWODUJĄCYCH ZAPALENIE OPON MÓZGOWO-RDZENIOWYCH Detekcja enterowirusów Detekcja sześciu typów ludzkich herpeswirusów (HHV) Detekcja pięciu bakterii Seeplex Detekcja patogenów powodujących

Bardziej szczegółowo

2. Przedmiot zamówienia: Odczynniki chemiczne do izolacji DNA i reakcji PCR, wymienione w Tabeli 1. Nazwa odczynnika Specyfikacja Ilość*

2. Przedmiot zamówienia: Odczynniki chemiczne do izolacji DNA i reakcji PCR, wymienione w Tabeli 1. Nazwa odczynnika Specyfikacja Ilość* Poznao, 6 lutego 2012 r. Zapytanie ofertowe nr 001 /2012 dotyczące zakupu odczynników chemicznych do izolacji DNA i reakcji PCR GENESIS Polska Sp. z o.o Ul. Za Cytadelą 19, 61-659 Poznao NIP 778 13 56

Bardziej szczegółowo

PCR PCR. Model replikacji semikonserwatywnej

PCR PCR. Model replikacji semikonserwatywnej PCR Łańcuchowa reakcja polimerazy (Polymerase Chain Reaction) amplifikacja (namnożenie wielu kopii cząsteczki kwasu nukleinowego) w pierwotnej wersji wykorzystująca model replikacji semikonserwatywnej

Bardziej szczegółowo

Część I Zakup zestawów diagnostycznych do GMO.

Część I Zakup zestawów diagnostycznych do GMO. Załącznik 4a Część I Zakup zestawów diagnostycznych do GMO. NAZWA WIELKOŚC OPAKNIA RAZEM WARTOŚĆ 1 2 3 4 5 6 7 8=4*7 9 10 11 1. Zestaw do izolacji DNA - zestaw służący do izolacji DNA z surowego materiału

Bardziej szczegółowo

7. Metody molekularne jako źródło informacji botanicznej i lichenologicznej

7. Metody molekularne jako źródło informacji botanicznej i lichenologicznej 7. Metody molekularne jako źródło informacji botanicznej i lichenologicznej 7.2. Metody biologii molekularnej (technika PCR, sekwencjonowanie DNA) wykorzystywane w taksonomii roślin Autor: Magdalena Dudek

Bardziej szczegółowo

dr hab. Beata Krawczyk Katedra Mikrobiologii PG

dr hab. Beata Krawczyk Katedra Mikrobiologii PG Metody amplifikacji kwasów nukleinowych dr hab. Beata Krawczyk Katedra Mikrobiologii PG Publikacja współfinansowana ze środków Unii Europejskiej pj j w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego Amplifikacja

Bardziej szczegółowo

PCR PCR. Model replikacji semikonserwatywnej

PCR PCR. Model replikacji semikonserwatywnej PCR Łańcuchowa reakcja polimerazy (Polymerase Chain Reaction) amplifikacja (namnożenie wielu kopii cząsteczki kwasu nukleinowego) w pierwotnej wersji wykorzystująca model replikacji semikonserwatywnej

Bardziej szczegółowo

ĆWICZENIE 1 i 2 Modyfikacja geu wołowej beta-laktoglobuliny przy użyciu metody Overlap Extension PCR (wydłużania nakładających się odcinków)

ĆWICZENIE 1 i 2 Modyfikacja geu wołowej beta-laktoglobuliny przy użyciu metody Overlap Extension PCR (wydłużania nakładających się odcinków) ĆWICZENIE 1 i 2 Modyfikacja geu wołowej beta-laktoglobuliny przy użyciu metody Overlap Extension PCR (wydłużania nakładających się odcinków) Celem ćwiczenia jest wprowadzenie mutacji punktowej do genu

Bardziej szczegółowo

Część I Zakup zestawów diagnostycznych do GMO.

Część I Zakup zestawów diagnostycznych do GMO. Załącznik 4a Część I Zakup zestawów diagnostycznych do GMO. NAZWA WIELKOŚC OPAKOWANIA JEDNOSTK OWA VAT % RAZEM WARTOŚĆ 1 2 3 4 5 6 7 8=4*7 9 10 11 1. Zestaw do izolacji DNA - zestaw służący do izolacji

Bardziej szczegółowo

The best custom qpcr assay development service in the World. Kontrola jakości: Certyfikaty ISO9001:2008, ISO 13485:2003 & EN ISO 13485:2012

The best custom qpcr assay development service in the World. Kontrola jakości: Certyfikaty ISO9001:2008, ISO 13485:2003 & EN ISO 13485:2012 The best custom qpcr assay development service in the World PrimerDesign Ltd The Mill Yard, Nursling Street Southampton, United Kingdom http://www.primerdesign.co.uk Kontrola jakości: Certyfikaty ISO9001:2008,

Bardziej szczegółowo

AmpliQ 5x HOT EvaGreen HRM Mix (ROX)

AmpliQ 5x HOT EvaGreen HRM Mix (ROX) Novazym Products Novazym Polska ul. Żywokostowa 23, 61-680 Poznań, tel. +48 0 61 610 39 10, fax +48 0 61 610 39 11, email info@novazym.com AmpliQ 5x HOT EvaGreen HRM Mix (ROX) Gotowy premix zawierający

Bardziej szczegółowo

Opis przedmiotu zamówienia wraz z wymaganiami technicznymi i zestawieniem parametrów

Opis przedmiotu zamówienia wraz z wymaganiami technicznymi i zestawieniem parametrów Załącznik nr 1 do SIWZ Nazwa i adres Wykonawcy Opis przedmiotu zamówienia wraz z wymaganiami technicznymi i zestawieniem parametrów Przedmiot zamówienia; automatyczny system do diagnostyki molekularnej:

Bardziej szczegółowo

Ćwiczenia 1 Wirtualne Klonowanie Prowadzący: mgr inż. Joanna Tymeck-Mulik i mgr Lidia Gaffke. Część teoretyczna:

Ćwiczenia 1 Wirtualne Klonowanie Prowadzący: mgr inż. Joanna Tymeck-Mulik i mgr Lidia Gaffke. Część teoretyczna: Uniwersytet Gdański, Wydział Biologii Katedra Biologii Molekularnej Przedmiot: Biologia Molekularna z Biotechnologią Biologia II rok ===============================================================================================

Bardziej szczegółowo

EKSTRAHOWANIE KWASÓW NUKLEINOWYCH JAK ZMIERZYĆ ILOŚĆ KWASÓW NUKLEINOWYCH PO IZOLACJI? JAK ZMIERZYĆ ILOŚĆ KWASÓW NUKLEINOWYCH PO IZOLACJI?

EKSTRAHOWANIE KWASÓW NUKLEINOWYCH JAK ZMIERZYĆ ILOŚĆ KWASÓW NUKLEINOWYCH PO IZOLACJI? JAK ZMIERZYĆ ILOŚĆ KWASÓW NUKLEINOWYCH PO IZOLACJI? EKSTRAHOWANIE KWASÓW NUKLEINOWYCH Wytrącanie etanolem Rozpuszczenie kwasu nukleinowego w fazie wodnej (met. fenol/chloroform) Wiązanie ze złożem krzemionkowym za pomocą substancji chaotropowych: jodek

Bardziej szczegółowo

Ilość TAK TAK TAK TAK TAK TAK

Ilość TAK TAK TAK TAK TAK TAK Postępowanie WB.2420.6.2013.NG ZAŁĄCZNIK NR 5 L.p. Nazwa asortymentu parametry techniczne Ilość Nazwa wyrobu, nazwa producenta, określenie marki, modelu, znaku towarowego Cena jednostkowa netto (zł) Wartość

Bardziej szczegółowo

PL B1. UNIWERSYTET PRZYRODNICZY W LUBLINIE, Lublin, PL BUP 26/11

PL B1. UNIWERSYTET PRZYRODNICZY W LUBLINIE, Lublin, PL BUP 26/11 PL 214501 B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 214501 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 391458 (51) Int.Cl. C12Q 1/68 (2006.01) C12N 15/29 (2006.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej

Bardziej szczegółowo

Autor: dr Mirosława Staniaszek

Autor: dr Mirosława Staniaszek Zakład Hodowli Roślin Ogrodniczych Pracownia Genetyki i Hodowli Roślin Warzywnych Fot. J. Sobolewski Procedura identyfikacji genu Frl warunkującego odporność pomidora na Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici

Bardziej szczegółowo

Wykład 14 Biosynteza białek

Wykład 14 Biosynteza białek BIOCHEMIA Kierunek: Technologia Żywności i Żywienie Człowieka semestr III Wykład 14 Biosynteza białek WYDZIAŁ NAUK O ŻYWNOŚCI I RYBACTWA CENTRUM BIOIMMOBILIZACJI I INNOWACYJNYCH MATERIAŁÓW OPAKOWANIOWYCH

Bardziej szczegółowo

Wprowadzenie do genetyki sądowej. Materiały biologiczne. Materiały biologiczne: prawidłowe zabezpieczanie śladów

Wprowadzenie do genetyki sądowej. Materiały biologiczne. Materiały biologiczne: prawidłowe zabezpieczanie śladów Wprowadzenie do genetyki sądowej 2013 Pracownia Genetyki Sądowej Katedra i Zakład Medycyny Sądowej Materiały biologiczne Inne: włosy z cebulkami, paznokcie możliwa degradacja - tkanki utrwalone w formalinie/parafinie,

Bardziej szczegółowo

Biologia Molekularna z Biotechnologią ===============================================================================================

Biologia Molekularna z Biotechnologią =============================================================================================== Uniwersytet Gdański, Wydział Biologii Biologia i Biologia Medyczna II rok Katedra Genetyki Molekularnej Bakterii Katedra Biologii i Genetyki Medycznej Przedmiot: Katedra Biologii Molekularnej Biologia

Bardziej szczegółowo

AmpliTest TBEV (Real Time PCR)

AmpliTest TBEV (Real Time PCR) AmpliTest TBEV (Real Time PCR) Zestaw do wykrywania sekwencji RNA specyficznych dla TBEV (Tick-borne encephalitis virus) techniką Real Time PCR Nr kat.: RV03-50 Wielkość zestawu: 50 oznaczeń Objętość pojedynczej

Bardziej szczegółowo

WYKORZYSTANIE IZOTERMALNEJ AMPLIFIKACJI DNA ZA POŚREDNICTWEM PĘTLI W DIAGNOSTYCE ROŚLIN

WYKORZYSTANIE IZOTERMALNEJ AMPLIFIKACJI DNA ZA POŚREDNICTWEM PĘTLI W DIAGNOSTYCE ROŚLIN POSTĘPY BIOLOGII KOMÓRKI TOM 39 2012 NR 4 (653 668) WYKORZYSTANIE IZOTERMALNEJ AMPLIFIKACJI DNA ZA POŚREDNICTWEM PĘTLI W DIAGNOSTYCE ROŚLIN EXPLORATION OF LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION OF DNA

Bardziej szczegółowo

Projektowanie reakcji multiplex- PCR

Projektowanie reakcji multiplex- PCR Projektowanie reakcji multiplex- PCR Dzięki nowoczesnym, wydajnym zestawom do PCR, amplifikacja DNA nie jest już takim wyzwaniem, jak w latach 80-tych i 90-tych. Wraz z poprawą metodyki, pojawiły się ciekawe

Bardziej szczegółowo

OGŁOSZENIE DODATKOWYCH INFORMACJI, INFORMACJE O NIEKOMPLETNEJ PROCEDURZE LUB SPROSTOWANIE

OGŁOSZENIE DODATKOWYCH INFORMACJI, INFORMACJE O NIEKOMPLETNEJ PROCEDURZE LUB SPROSTOWANIE 1/ 7 ENOTICES_JMY53 - ID:2010-XXXXXX Formularz standardowy 14 PL Publikacja Suplementu do Dziennika Urzędowego Unii Europejskiej 2, rue Mercier, L-2985 Luksemburg Faks (352) 29 29-42670 E-mail: ojs@publications.europa.eu

Bardziej szczegółowo

DETEKCJA PATOGENÓW DRÓG MOCZOWO-PŁCIOWYCH

DETEKCJA PATOGENÓW DRÓG MOCZOWO-PŁCIOWYCH DETEKCJA PATOGENÓW DRÓG MOCZOWO-PŁCIOWYCH Detekcja i identyfikacja 7 patogenów dróg moczowo-płciowych Detekcja Neisseria gonorrhoeae i Chlamydia trachomatis Detekcja Trichomonas vaginalis i Mycoplasma

Bardziej szczegółowo

Transformacja pośrednia składa się z trzech etapów:

Transformacja pośrednia składa się z trzech etapów: Transformacja pośrednia składa się z trzech etapów: 1. Otrzymanie pożądanego odcinka DNA z materiału genetycznego dawcy 2. Wprowadzenie obcego DNA do wektora 3. Wprowadzenie wektora, niosącego w sobie

Bardziej szczegółowo

Poradnik: Optymalizacja reakcji PCR algorytm postępowania

Poradnik: Optymalizacja reakcji PCR algorytm postępowania Poradnik: Optymalizacja reakcji PCR algorytm postępowania Jak przeprowadzić optymalizację reakcji PCR? Co zmienić w metodyce, by pozbyć się produktów niespecyficznych? Jak poprawić plon reakcji? Od czego

Bardziej szczegółowo

DNA musi współdziałać z białkami!

DNA musi współdziałać z białkami! DNA musi współdziałać z białkami! Specyficzność oddziaływań między DNA a białkami wiążącymi DNA zależy od: zmian konformacyjnych wzdłuż cząsteczki DNA zróżnicowania struktury DNA wynikającego z sekwencji

Bardziej szczegółowo

Ćwiczenie 3 PCR i trawienie DNA enzymami restrykcyjnymi

Ćwiczenie 3 PCR i trawienie DNA enzymami restrykcyjnymi Uniwersytet Gdański, Wydział Biologii Katedra Genetyki Molekularnej Bakterii Katedra Biologii i Genetyki Medycznej Katedra Biologii Molekularnej Biologia i Biologia Medyczna II rok Przedmiot: Biologia

Bardziej szczegółowo

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych Hybrydyzacja kwasów nukleinowych Jaka jest lokalizacja tego genu na chromosomie? Jakie jest jego sąsiedztwo? Hybrydyzacja - powstawanie stabilnych struktur dwuniciowych z cząsteczek jednoniciowych o komplementarnych

Bardziej szczegółowo

SCENARIUSZ LEKCJI BIOLOGII Z WYKORZYSTANIEM FILMU PCR sposób na DNA.

SCENARIUSZ LEKCJI BIOLOGII Z WYKORZYSTANIEM FILMU PCR sposób na DNA. SCENARIUSZ LEKCJI BIOLOGII Z WYKORZYSTANIEM FILMU PCR sposób na DNA. SPIS TREŚCI: 1. Wprowadzenie. 2. Części lekcji. 1. Część wstępna. 2. Część realizacji. 3. Część podsumowująca. 3. Karty pracy. 1. Karta

Bardziej szczegółowo

PL B1. UNIWERSYTET PRZYRODNICZY W LUBLINIE, Lublin, PL BUP 04/14. SYLWIA OKOŃ, Dąbrowica, PL KRZYSZTOF KOWALCZYK, Motycz, PL

PL B1. UNIWERSYTET PRZYRODNICZY W LUBLINIE, Lublin, PL BUP 04/14. SYLWIA OKOŃ, Dąbrowica, PL KRZYSZTOF KOWALCZYK, Motycz, PL PL 220315 B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 220315 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 400252 (22) Data zgłoszenia: 06.08.2012 (51) Int.Cl.

Bardziej szczegółowo

Mieszanina trójfosforanów deoksyrybonukleotydów (dntp: datp, dgtp, dctp, dttp) Bufor reakcyjny zapewniający odpowiednie warunki reakcji

Mieszanina trójfosforanów deoksyrybonukleotydów (dntp: datp, dgtp, dctp, dttp) Bufor reakcyjny zapewniający odpowiednie warunki reakcji Uniwersytet Gdański, Wydział Biologii Biologia i Biologia medyczna II rok Katedra Biologii Molekularnej Przedmiot: Biologia Molekularna z Biotechnologią =================================================================

Bardziej szczegółowo

Klub Młodego Wynalazcy - Laboratoria i wyposażenie. Pracownia genetyki

Klub Młodego Wynalazcy - Laboratoria i wyposażenie. Pracownia genetyki Klub Młodego Wynalazcy - Laboratoria i wyposażenie Zadbaliśmy o to, żeby wyposażenie w Klubie Młodego Wynalazcy było w pełni profesjonalne. Ważne jest, aby dzieci i młodzież, wykonując doświadczenia korzystały

Bardziej szczegółowo

Polimeraza Taq (1U/ l) 1-2 U 1 polimeraza Taq jako ostatni składniki mieszaniny końcowa objętość

Polimeraza Taq (1U/ l) 1-2 U 1 polimeraza Taq jako ostatni składniki mieszaniny końcowa objętość Ćwiczenie 6 Technika PCR Celem ćwiczenia jest zastosowanie techniki PCR do amplifikacji fragmentu DNA z bakterii R. leguminosarum bv. trifolii TA1 (RtTA1). Studenci przygotowują reakcję PCR wykorzystując

Bardziej szczegółowo

Techniki molekularne w mikrobiologii SYLABUS A. Informacje ogólne

Techniki molekularne w mikrobiologii SYLABUS A. Informacje ogólne Techniki molekularne w mikrobiologii A. Informacje ogólne Elementy sylabusu Nazwa jednostki prowadzącej kierunek Nazwa kierunku studiów Poziom kształcenia Profil studiów Forma studiów Rodzaj Rok studiów

Bardziej szczegółowo

Definicje. Białka rekombinowane (ang. recombinant proteins, r-proteins) Ukierunkowana mutageneza (ang. site-directed/site-specific mutagenesis)

Definicje. Białka rekombinowane (ang. recombinant proteins, r-proteins) Ukierunkowana mutageneza (ang. site-directed/site-specific mutagenesis) Definicje Białka rekombinowane (ang. recombinant proteins, r-proteins) Białka, które powstały w żywych organizmach (lub liniach komórkowych) w wyniku ekspresji rekombinowanego DNA. Rekombinowany DNA jest

Bardziej szczegółowo

AmpliQ 5x HOT EvaGreen qpcr Mix Plus (ROX)

AmpliQ 5x HOT EvaGreen qpcr Mix Plus (ROX) Novazym Products Novazym Polska ul. Żywokostowa 23, 61-680 Poznań, tel. +48 0 61 610 39 10, fax +48 0 61 610 39 11, email info@novazym.com AmpliQ 5x HOT EvaGreen qpcr Mix Plus (ROX) Gotowy premix zawierający

Bardziej szczegółowo

Zastosowanie transferu energii rezonansu fluorescencji (FRET) w ilościowej metodzie oznaczania ekspresji genów na przykładzie sondy TaqMan

Zastosowanie transferu energii rezonansu fluorescencji (FRET) w ilościowej metodzie oznaczania ekspresji genów na przykładzie sondy TaqMan Anna KOZIOROWSKA, Maria ROMEROWICZ-MISIELAK Uniwersytet Rzeszowski, Polska Zastosowanie transferu energii rezonansu fluorescencji (FRET) w ilościowej metodzie oznaczania ekspresji genów na przykładzie

Bardziej szczegółowo

Diagnostyka molekularna w OIT

Diagnostyka molekularna w OIT Diagnostyka molekularna w OIT B A R B A R A A D A M I K K A T E D R A I K L I N I K A A N E S T E Z J O L O G I I I I N T E N S Y W N E J T E R A P I I U N I W E R S Y T E T M E D Y C Z N Y W E W R O C

Bardziej szczegółowo

Polska-Łódź: Maszyny i aparatura badawcza i pomiarowa 2013/S

Polska-Łódź: Maszyny i aparatura badawcza i pomiarowa 2013/S 1/5 Niniejsze ogłoszenie w witrynie TED: http://ted.europa.eu/udl?uri=ted:notice:387751-2013:text:pl:html Polska-Łódź: Maszyny i aparatura badawcza i pomiarowa 2013/S 223-387751 Instytut Medycyny Pracy

Bardziej szczegółowo

Parametr Wymagany parametr Oferowany parametr 1. 2. 3. a) z wbudowaną pompą membranową PTEE, b) kondensorem par, System

Parametr Wymagany parametr Oferowany parametr 1. 2. 3. a) z wbudowaną pompą membranową PTEE, b) kondensorem par, System Załącznik nr 1A do SIWZ. PARAMETRY TECHNICZNE PRZEDMIOTU ZAMÓWIENIA Zadanie nr 1. TERMOSTAT CYRKULACYJNY Termostat cyrkulacyjny Z grzaniem i chłodzeniem Zakres temperatury roboczej 25 o C do + 200 o C

Bardziej szczegółowo

umożliwiający wyl<rywanie oporności na HIV przy użyciu

umożliwiający wyl<rywanie oporności na HIV przy użyciu Zestaw dydaktyczny Nr kat. OY255 Wersja zestawu: 1.2015 Zestaw dydaktyczny umożliwiający wyl

Bardziej szczegółowo

Kontrola i zapewnienie jakości wyników

Kontrola i zapewnienie jakości wyników Kontrola i zapewnienie jakości wyników Kontrola i zapewnienie jakości wyników QA : Quality Assurance QC : Quality Control Dobór systemu zapewnienia jakości wyników dla danego zadania fit for purpose Kontrola

Bardziej szczegółowo

Rocz. Nauk. Zoot., T. 37, z. 2 (2010) 145 149. Identyfikacja sekwencji genu kodującego dehydrogenazę NADH 1 u sarny

Rocz. Nauk. Zoot., T. 37, z. 2 (2010) 145 149. Identyfikacja sekwencji genu kodującego dehydrogenazę NADH 1 u sarny Rocz. Nauk. Zoot., T. 37, z. 2 (2010) 145 149 Identyfikacja sekwencji genu kodującego dehydrogenazę NADH 1 u sarny M a ł g o r z a t a N a t o n e k - W i ś n i e w s k a, E w a S ł o t a Instytut Zootechniki

Bardziej szczegółowo

Kurs pt. " MOLEKULARNE METODY BADAŃ W MIKROBIOLOGII I WIRUSOLOGII "

Kurs pt.  MOLEKULARNE METODY BADAŃ W MIKROBIOLOGII I WIRUSOLOGII Warszawa, 6 lutego 2011 r. Szanowna Pani! Szanowny Panie! Niniejszym uprzejmie informuję, że organizowany jest Kurs pt. " MOLEKULARNE METODY BADAŃ W MIKROBIOLOGII I WIRUSOLOGII " Kurs odbędzie się w dniach

Bardziej szczegółowo

Ocena ekspresji genów proangiogennych w komórkach nowotworowych OVP-10 oraz transfektantach OVP-10/SHH i OVP-10/VEGF

Ocena ekspresji genów proangiogennych w komórkach nowotworowych OVP-10 oraz transfektantach OVP-10/SHH i OVP-10/VEGF Agnieszka Gładysz Ocena ekspresji genów proangiogennych w komórkach nowotworowych OVP-10 oraz transfektantach OVP-10/SHH i OVP-10/VEGF Katedra i Zakład Biochemii i Chemii Klinicznej Akademia Medyczna Prof.

Bardziej szczegółowo

Ćwiczenia 1 Wirtualne Klonowanie. Prowadzący: mgr Anna Pawlik i mgr Maciej Dylewski. Część teoretyczna:

Ćwiczenia 1 Wirtualne Klonowanie. Prowadzący: mgr Anna Pawlik i mgr Maciej Dylewski. Część teoretyczna: Uniwersytet Gdański, Wydział Biologii Biologia i Biologia Medyczna II rok Katedra Biologii Molekularnej Przedmiot: Biologia Molekularna z Biotechnologią ===============================================================================================

Bardziej szczegółowo

Laboratorium Wirusologiczne

Laboratorium Wirusologiczne Laboratorium Wirusologiczne Krzysztof Pyrd Pracownia wirusologiczna: Powstanie i wyposażenie całkowicie nowego laboratorium w ramach Zakładu Mikrobiologii WBBiB Profil: laboratorium molekularno-komórkowe

Bardziej szczegółowo

WYJAŚNIENIA DO TREŚCI SPECYFIKACJI ISTOTNYCH WARUNKÓW ZAMÓWIENIA

WYJAŚNIENIA DO TREŚCI SPECYFIKACJI ISTOTNYCH WARUNKÓW ZAMÓWIENIA Katowice, dn. 04.05.2016r. WYJAŚNIENIA DO TREŚCI SPECYFIKACJI ISTOTNYCH WARUNKÓW ZAMÓWIENIA Dotyczy: postępowania o udzielenie zamówienia publicznego prowadzonego w trybie przetargu nieograniczonego na

Bardziej szczegółowo

Walidacja metod wykrywania, identyfikacji i ilościowego oznaczania GMO. Magdalena Żurawska-Zajfert Laboratorium Kontroli GMO IHAR-PIB

Walidacja metod wykrywania, identyfikacji i ilościowego oznaczania GMO. Magdalena Żurawska-Zajfert Laboratorium Kontroli GMO IHAR-PIB Walidacja metod wykrywania, identyfikacji i ilościowego oznaczania GMO Magdalena Żurawska-Zajfert Laboratorium Kontroli GMO IHAR-PIB Walidacja Walidacja jest potwierdzeniem przez zbadanie i przedstawienie

Bardziej szczegółowo

Elektroforeza kwasów nukleinowych

Elektroforeza kwasów nukleinowych Elektroforeza kwasów nukleinowych Elektroforeza jest podstawową techniką wizualizacji kwasów nukleinowych pozwala bezpośrednio identyfikować cząsteczki DNA i jest stosunkowo czuła (po odpowiednim wybarwieniu

Bardziej szczegółowo

GENOMIKA FUNKCJONALNA. Jak działają geny i genomy? Poziom I: Analizy transkryptomu

GENOMIKA FUNKCJONALNA. Jak działają geny i genomy? Poziom I: Analizy transkryptomu GENOMIKA FUNKCJONALNA Jak działają geny i genomy? Poziom I: Analizy transkryptomu Adnotacja (ang. annotation) pierwszy etap po uzyskaniu kompletnej sekwencji nukleotydyowej genomu analiza bioinformatyczna

Bardziej szczegółowo

ŁAŃCUCHOWA REAKCJA POLIMERAZY Z ANALIZĄ W CZASIE RZECZYWISTYM (RT-PCR) REAL-TIME POLYMERASE CHAIN REACTION (RT-PCR)

ŁAŃCUCHOWA REAKCJA POLIMERAZY Z ANALIZĄ W CZASIE RZECZYWISTYM (RT-PCR) REAL-TIME POLYMERASE CHAIN REACTION (RT-PCR) A N N A L E S A C A D E M I A E M E D I C A E S T E T I N E N S I S R O C Z N I K I P O M O R S K I E J A K A D E M I I M E D Y C Z N E J W S Z C Z E C I N I E 2007, 53, 3, 5 9 KATARZYNA WIEDRO, EWA STACHOWSKA,

Bardziej szczegółowo

Załącznik nr 1A do siwz Część I - Zestaw testowy do szybkiej identyfikacji Escherichia coli

Załącznik nr 1A do siwz Część I - Zestaw testowy do szybkiej identyfikacji Escherichia coli Część I - Zestaw testowy do szybkiej identyfikacji Escherichia coli 1. Zestaw testowy do szybkiej identyfikacji Escherichia coli zestaw zawiera: - 50 pasków testowych, - 50 pojemników z tworzywa sztucznego,

Bardziej szczegółowo

Zadanie 19. Wyposażenie stanowiska do namnażania fragmentów DNA w czasie rzeczywistym

Zadanie 19. Wyposażenie stanowiska do namnażania fragmentów DNA w czasie rzeczywistym Zadanie 19. Wyposażenie stanowiska do namnażania fragmentów DNA w czasie rzeczywistym Termin realizacji 12 tygodni od daty podpisania (zawarcia) umowy. Koszty transportu, instalacji oraz instruktażu, trwającego

Bardziej szczegółowo

Mikrosatelitarne sekwencje DNA

Mikrosatelitarne sekwencje DNA Mikrosatelitarne sekwencje DNA Małgorzata Pałucka Wykorzystanie sekwencji mikrosatelitarnych w jądrowym DNA drzew leśnych do udowodnienia pochodzenia materiału dowodowego w postępowaniu sądowym 27.09.2012

Bardziej szczegółowo

OFERTA. dot. nr Sprawy WDB/ Uniwersytet Śląski w Katowicach ul. Bankowa Katowice. Zamawiający:

OFERTA. dot. nr Sprawy WDB/ Uniwersytet Śląski w Katowicach ul. Bankowa Katowice. Zamawiający: dot. nr Sprawy WDB/1000086799 OFERTA Zamawiający: Uniwersytet Śląski w Katowicach ul. Bankowa 12 40-007 Katowice Nazwa (firma) / imię i nazwisko Wykonawcy / Wykonawców wspólnie ubiegających się o zamówienie:

Bardziej szczegółowo

Elektroforeza kwasów nukleinowych

Elektroforeza kwasów nukleinowych Elektroforeza kwasów nukleinowych Elektroforeza jest podstawową techniką wizualizacji kwasów nukleinowych pozwala bezpośrednio identyfikować cząsteczki DNA ze stosunkowo wysoką czułością (po odpowiednim

Bardziej szczegółowo

Kit for rapid detection Legionella pneumophilla

Kit for rapid detection Legionella pneumophilla Kit for rapid detection Legionella pneumophilla Zestaw do szybkiej detekcji bakterii Legionella w próbkach wody opiera się na wykorzystaniu immunomagnetycznych kulek. Są to cząsteczki superparamagnetyczne,

Bardziej szczegółowo

Dr hab.n.med. Renata Jacewicz

Dr hab.n.med. Renata Jacewicz GENOM CZŁOWIEKA >99,999% 0,0005% 65% Dr hab.n.med. Renata Jacewicz Kierownik Pracowni Genetyki Medycznej i Sądowej 3% 32% 2013 Pracownia Genetyki Medycznej i Sądowej ZMS Dojrzałe erytrocyty, trzony włosów

Bardziej szczegółowo