Inżynieria genetyczna- 6 ECTS

Transkrypt

1 Inżynieria genetyczna- 6 ECTS Część I Badanie ekspresji genów Kolokwium (14pkt) Część II Podstawy klonowania i różnicowania transformantów Klonowanie ekspresyjne Od genu do białka Kolokwium (26pkt) EGZAMIN 55pkt bonus: 5pkt DNA mrna białko Informacje o ekspresji genów Informacje o odpowiedzi komórkowej na zadany czynnik Informacje o produkcji białka (nie zawsze) Dokładna liczba kopii genu Wykrywanie kopii wirusów i patogenów Wykrywanie metylacji DNA Wykrywanie mutacji Rodzaje reakcji ABSOLUTE QUANTIFICATION Krzywa standardowa Standardem musi być dobrze mianowany roztwór patogenu Reakcja najczęściej stosowana do obliczania ilości kopii wirusów W przypadku posiadania krzywych uniwersalnych również bakterii RELATIVE QUANTIFICATION Krzywa standardowa Standardem jest wielokrotnie rozcieńczana matryca Reakcja najczęściej stosowana do badania ekspresji genów 1

2 RQ-ANALIZA EKSPRESJI Izolacja RNA Odwrotna transkrypcja Reakcja Real-Time PCR Analiza wyników ODWROTNA TRANSKRYPCJA- RT PCR Reakcja amplifikacji DNA na matrycy RNA- odwrotna transkrypcja (Reverse Transcription) enzym używany w reakcji RT-PCR to odwrotna transkryptaza powstały DNA jest komplementarny do RNA i nazywany jest cdna (complementary DNA) w badaniu ekspresji genów cdna powinien powstawać na matrycy mrna cząsteczki mrna (w przeciwieństwie do rrna) są w naturalny sposób zakończone ogonkami poliadeninowymi AAAAAAAA dołączanymi w czasie transkrypcji za kodonem STOP ODWROTNA TRANSKRYPCJA- RT PCR Obecność ogonków poliadeninowych (poli-a) jest wykorzystana jako naturalne miejsce wiązania ze starterami oligo dt (dttp) <TTTTTTTT> 2

3 ODWROTNA TRANSKRYPCJA- RT PCR w reakcji RT- PCR na jednej kopii RNA powstaje jedna kopia cdna! Startery typu Oligo dt to: o oligonukleotydy składające się zazwyczaj z 24 nukleozydów zawierających tyminę. Przyłączają się one do ogonków poli-a w mrna LUB o oligonukleotydy składające się z 23 reszt tyminowych i dodatkowego nukleotydu kotwiczącego A, C lub G, w ten sposób ich przyłączenie następuje przy fragmencie łączącym ogonek poli-a z 3 UTR ODWROTNA TRANSKRYPCJA- RT PCR Startery typu random hexamer to: o mieszanina oligonukleotydów reprezentująca wszystkie możliwe kombinacje sześcionukleotydowe Oligo dt Stosowane jedynie dla organizmów eukariotycznych i retrowirusów zawierających ogonki Poli-A Tylko dla mrna Przydatne przy krótkich fragmentach, zwłaszcza zlokalizowanych przy 3 końcu mrna Random Hexamer Stosowane dla wszystkich organizmów Dla wszystkich rodzajów RNA Przydatne przy długich fragmentach RNA (>2000pz) oraz przy RNA o słabej jakości ODWROTNA TRANSKRYPCJA- RT PCR 3

4 ODWROTNA TRANSKRYPCJA- RT PCR Czy można stosować proteinazę K podczas izolacji RNA? Czy izolując RNA można wyizolować DNA? Kiedy? Dlaczego? Jak można pozbyć się DNA z izolatu RNA? Na jakim etapie? Czy wyizolowany podczas ekstrakcji DNA może mieć wpływ na wydajność reakcji RT PCR? Czy można sprawdzić wydajność reakcji RT PCR przy pomocy elektroforezy? Rodzaje technik wyzwalania świecenia Rodzaje technik wyzwalania świecenia wydłużanie 3 ID ID Taq 5 Taq ID ID ID 5 3 Wzbudzenie świecenia λ λ λ 3 ID ID ID ID ID ID Taq ID ID ID Taq 5 3 λ λ Brak świecenia po denaturacji 4

5 Rodzaje technik wyzwalania świecenia Q R 5 3 Q R Wydłużanie Taq 5 3 R Hydroliza sondy Q Taq Taq R λ R Wzbudzenie świecenia Taq SPEKTRA Filtr Fluorochrom FAM SYBR Green JOE VIC TAMRA NED Cy3 ROX Texas Red Cy5 Fazy reakcji PCR Wykładnicza Jeżeli wydajność reakcji wynosi 100% to każda z dwóch nici matrycy jest podstawą do replikacji; najwyższa precyzja i specyficzność powielania Liniowa Zmienna. Matryca zaczyna ulegać rozpadowi i wydajność reakcji zaczyna się pogarszać Plateau Reakcja zatrzymuje się, a przeprowadzana dalej będzie degradować wytworzone produkty 5

6 Fazy reakcji PCR PCR phases in linear view Plateau Liniowa [DNA] Wykładnicza Cykl # Fazy reakcji PCR liniowo logarytmicznie NUMER CYKLU LICZBA KOPII DNA AMOUNT OF DNA PCR CYCLE NUMBER 6

7 Wydajność reakcji PCR Z założenia replikacji semikonserwatywnej = 2 Przy założeniu powstawania niespecyficznej długości amplikonów w pierwszych cyklach lub obecności inhibitorów reakcji < 2 Przy uwzględnieniu produktów nieprzewidzianych (niespecyficzne wiązanie starterów, primer-dimer) >2 Zoptymalizowanie reakcji wymaga wykonania krzywej standardowej Wydajność reakcji PCR Krzywa standardowa pokazuje zależność pomiędzy początkową ilością (liczbą kopii) lub koncentracją matrycy a ilością otrzymanego produktu reakcji Najczęściej jest to regresja liniowa (na danych zlogarytmowanych) Y=bX+a, której współczynnik (b) określa wydajność reakcji b- współczynnik regresji (określa poziom nachylenia krzywej) a- stała (określa punkt przecięcia z osią y stężenie lub liczbę kopii matrycy która jest niewystarczająca do otrzymania produktu PCR Wydajność reakcji PCR Cykl Moja Wasza

8 Wydajność reakcji PCR Wydajność reakcji PCR Cykl Moja Ich Wydajność reakcji PCR

9 Wydajność reakcji PCR CT (threshold cycle)= CP (crossing point)= Cq (quantification cycle) CT values: 23; 25; , Treshold line Krzywa standardowa reakcji PCR 1mln 10tys tys 1tys 10 threshold CT WZGLĘDNA (RELATYWNA) ANALIZA EKSPRESJI GENÓW- wydajność reakcji Wzrost rozcieńczenia próbek powtórzenie Quantity Log Cq MCq Diff , , , , , ,83 21,78 3, , , , , , ,89 18,24 3, , , , , , ,22 14,85 2, , , , , , ,32 12, E=10 (-1/nachylenie krzywej) Cq y = -3,2705x + 24,897 R² = 0, Cq Liniowa (Cq) 9

10 WZGLĘDNA (RELATYWNA) ANALIZA EKSPRESJI GENÓW- wydajność reakcji Maksymalna wydajność = 2 wydajność 2,13 2,11 2,09 2,07 2,05 2,03 2,01 1,99 E=10 (-1/nachylenie krzywej) Maksymalna wydajność reakcji odpowiada wartości nachylenia krzywej z przedziału 3,1-3,6 1,97 1,95 1,93 1,91-3,70-3,60-3,50-3,40-3,30-3,20-3,10-3,00 nachylenie krzywej 1, (2,84) (3,39) (3,54) 3,32 Krzywa Współczynnik nachylenia (informuje o wydajności reakcji) Intercept punkt przecięcia z osią y R 2 współczynnik determinacji (miara dopasowania oszacowanego modelu liniowego do zmiennej) WYDAJNOŚĆ REAKCJI PCR Ef=10 (-1/nachylenie krzywej) 1,89 2,09 10

11 WYDAJNOŚĆ REAKCJI PCR Ef=10 (-1/nachylenie krzywej) 2,21 2,17 WZGLĘDNA (RELATYWNA) ANALIZA EKSPRESJI GENÓW- co jest potrzebne? UDANE DOŚWIADCZENIE: specyficzne startery do genu badanego specyficzne startery do genu referencyjnego cdna o znanej i określonej koncentracji odrobina RNA/DNA bardzo czysta woda zoptymalizowane warunki pracy: miejsce/ pipety/ plastiki/ czas APARAT do RealTime-PCR UDANA ANALIZA: zoptymalizowane warunki reakcji duża liczba powtórzeń reakcji- wszystkie obliczenia mają charakter statystyczny!!! znana wydajność reakcji dla wszystkich genów 11

12 Real Time PCR Real Time PCR Przebieg reakcji 50 C, 2 min - 1x 95 C, 10 min - 1x 95 C, 15 s 60 C, 1 min - 40x 12

13 NORMALIZACJA W BADANIU EKSPRESJI GENÓW 1. Normalizacja jakości izolatu RNA- w wyizolowanych próbach brak DNA 2. Normalizacja ilości (i jakości) RNA przepisywanego na cdna do przepisania należy wziąć tyle samo RNA z każdej próby jakość (integralność) RNA wszystkich przepisywanych prób powinna być taka sama ta sama ilość przy różnej jakości będzie fałszować wynik reakcji RT PCR 3. Normalizacja ilości cdna- każda próba analizowana w reakcji Real Time PCR powinna zawierać tę samą ilość matrycy optymalna koncentracja dobierana jest w krzywej standardowej 4. Normalizacja wyniku reakcji PCR- każdą reakcję PCR należy powtórzyć minimum trzykrotnie z tą samą matrycą na tej samej płytce! KONTROLE W BADANIU EKSPRESJI GENÓW 1. NTC wszystkie reagenty oprócz matrycy 2. -RT- wszystkie reagenty, matrycą jest RNA nieprzepisany na cdna 3. Pasywna referencja (tylko dla wybranych termocyklerów)- substancja dodana do KAŻDEJ próbki, która wykazuje stały poziom świecenia np. ROX 4. NAC- wszystkie reagenty z inhibitorem reakcji zamiast matrycy pasywna referencja 13

14 spektra Początek reakcji Koniec reakcji FAM ROX FAM ROX wykres amplifikacji wykres amplifikacji 14

15 WZGLĘDNA (RELATYWNA) ANALIZA EKSPRESJI GENÓW- powtórki reakcji! NAJCZĘSTSZE PROBLEMY W BADANIU EKSPRESJI GENÓW Zła matryca + niespecyficzne startery= katastrofa! Krzywa topnienia- denaturacja produktu reakcji PCR- pokazuje specyficzność starterów i zoptymalizowanie przebiegu reakcji- tylko dla reakcji z SYBR green! Reakcja OK- startery o tej samej temperaturze topnienia- brak niespecyficzności Problem - startery o tej samej temperaturze topnienia + primer-dimer Problem - startery o różnej temperaturze topnieniabrak niespecyficzności Problem - startery o tej samej temperaturze topnienia + primer-dimer + produkt niespecyficzny WZGLĘDNA (RELATYWNA) ANALIZA EKSPRESJI GENÓW Względna różnica poziomu ekspresji badanego genu (T-target) i genu kontrolnego, referencyjnego (R-reference), znormalizowana względem kalibratora. Wynik to wielokrotność ekspresji kalibratora. 15

16 referencja WZGLĘDNA (RELATYWNA) ANALIZA EKSPRESJI GENÓW-ΔΔCq Tkanka traktowana HKG Tkanka nietraktowana Gen badany 16

17 Geny kontroli endogennej- referencyjnej Prezentowane są we wszystkich badanych tkankach Powinny mieć zawsze stały poziom ekspresji Kalibratory Geny, z których ekspresją będzie bezpośrednio porównywany badany gen Kontrola endogenna może być również kalibratorem! Wybór kontroli endogennej 17

18 Wybór kontroli endogennej WZGLĘDNA (RELATYWNA) ANALIZA EKSPRESJI GENÓW KALIBRATOR GEN REFERENCYJNY Tkanka nietraktowana Tkanka na początku eksperymentu Inny gen Uśredniona ekspresja genu badanego lub innego Gen referencyjny lub uśredniona ekspresja wielu Uniwersalna krzywa kalibracyjna GAPDH βaktyna Cyklofilina RPLPO 18sRNA Wiele innych ANALIZA EKSPRESJI- jeden gen/ jedna tkanka*/ różne rodzaje traktowania Tkanka traktowana 1 Tkanka traktowana 2 Tkanka traktowana n T T T Tkanka nietraktowana K OBSZAR BADANEGO GENU Tkanka traktowana 1 R Tkanka nietraktowana R Tkanka traktowana 2 Tkanka traktowana n R R OBSZAR GENU REFERENCYJNEGO- HKG housekeeping gene 18

19 ANALIZA EKSPRESJI- wiele genów/ jedna tkanka/ różne rodzaje traktowania Tkanka traktowana 1 -G1 Tkanka traktowana 2 -G1 Tkanka traktowana n -G1 Tkanka traktowana 1 -G2 Tkanka traktowana 2 -G2 Tkanka traktowana n -G2 Tkanka nietraktowana-g1 Tkanka nietraktowana-g2 OBSZAR BADANYCH GENÓW Tkanka traktowana 1 Tkanka nietraktowana Tkanka traktowana 2 Tkanka traktowana n OBSZAR GENU REFERENCYJNEGO- HKG ANALIZA EKSPRESJI- jeden gen/ wiele tkanek/ Tkanka 1 Tkanka 2 Tkanka n OBSZAR BADANEGO GENU Tkanka 1 Tkanka 2 Tkanka n OBSZAR GENU REFERENCYJNEGO- HKG ANALIZA EKSPRESJI- wiele genów/ wiele tkanek/ Tkanka 1 -G1 Tkanka 1 -G2 Tkanka 2 -G1 Tkanka 2 -G2 Tkanka n -G1 Tkanka n -G2 OBSZAR BADANYCH GENÓW Tkanka 1 Tkanka 2 Tkanka n OBSZAR GENU REFERENCYJNEGO- HKG 19