Nr 4/2014 Amplifikacja in vitro wybranych odcinków DNA i RNA metodą Loop-mediated isothermal AMPlification (LAMP)

Transkrypt

1 Nr 4/2014 Amplifikacja in vitro wybranych odcinków DNA i RNA metodą Loop-mediated isothermal AMPlification (LAMP) Opracowanie: Adam Burzyński Novazym Polska Marta Jankowska Katedra Biotechnologii i Mikrobiologii Żywności Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu

2 SPIS TREŚCI WSTĘP... 3 LAMP (ang. Loop-mediated isothermal AMPlification)... 3 Historia... 3 Publikacje naukowe na temat LAMP... 4 Zakres wykorzystywania LAMP... 4 WIRUSY... 4 BAKTERIE... 5 GRZYBY... 6 PIERWOTNIAKI... 7 GMO... 7 LAMP Zasada działania reakcji... 8 Zasada działania reakcji (dla 2 par starterów)... 8 Warunki reakcji LAMP Projektowanie starterów do LAMP Zasady projektowania starterów do LAMP Parametry starterów Programy do projektowania starterów Detekcja i wizualizacja produktów LAMP Charakterystyka produktów (amplikonów) reakcji LAMP ( LAMPlikons ) Metody detekcji Elektroforeza w żelu agarozowym Analiza turbidymetryczna Analiza turbidymetryczna w czasie rzeczywistym Analiza fluorymetryczna Fluorescencja w czasie rzeczywistym Diagnostyczne wskaźniki wydajności reakcji LAMP Badanie SNP technika LAMP Multiplex LAMP (ang. Detection of Amplification by Release of Quenching, DARQ) Oprzyrządowanie, odczynniki i akcesoria dla izotermalnej amplifikacji DNA firmy OptiGene Genie II zintegrowana elastyczna platforma Genie III mała zintegrowana elastyczna platforma do reakcji LAMP Enzymy stosowane w reakcji izotermalnej amplifikacji DNA GspSSD Polimeraza GspSSD 2.0 Polimeraza GspF Polimeraza DNA Tin Polimeraza DNA GspM Polimeraza DNA GspM 2.0 Polimeraza DNA GspM 3.0 Polimeraza DNA BstI Polimeraza DNA Odwrotna Transkryptaza do RT-LAMP Master Mix-y do reakcji LAMP zawierające zoptymalizowany skład niezbędnych do reakcji odczynników, poza matrycą DNA i starterami Isothermal Master Mix (ISO-001) Isothermal Master Mix (ISO-001t) Isothermal Master Mix (ISO-004) Zalety i wady techniki LAMP Podsumowanie Bibliografia Strona2 strona2

3 Strona3 strona3 WSTĘP LAMP (ang. Loop-mediated isothermal AMPlification) Nowatorska metoda amplifikacji kwasów nukleinowych, która pozwala na szybką identyfikację patogenów ludzkich, zwierzęcych i roślinnych. Metoda polega na syntezie nowych nici DNA na matrycy (DNA lub RNA) w kolejnych cyklach reakcji oraz zastępowaniu (wymianie) łańcuchów DNA przez łańcuchy nowo zsyntetyzowane. Polimeraza wykorzystywana w reakcji posiada aktywność syntezy nici DNA w kierunku 5 3 oraz wymiany nici i nie posiada aktywności egzonuklotydowej. Powstałe amplifikowane produkty posiadają strukturę składającą się z na przemian odwróconych powtórzeń sekwencji matrycowej na tym samym łańcuchu DNA. Produkt LAMP jest mieszaniną łańcuchów DNA, tworzących struktury typu łodyga-pętla i różniących się wielkością. Uzyskany produkt posiada wysoką specyficzność do matrycy poprzez zastosowanie 2 par starterów komplementarnych do 6 niezależnych miejsc na matrycy w początkowym etapie reakcji oraz 4 niezależnych miejsc w kolejnych etapach LAMP. Amplifikacja przebiega w warunkach izotermicznych. Historia 1998 Opracowanie techniki LAMP przez japońską firmę Eiken Chemical Co., Ltd Pierwsza publikacja naukowa nt. LAMP (Loop-mediated isothermal amplification of DNA, Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N, Hase T) Pojawienie się na rynku komercyjnych zestawów do prowadzenia reakcji LAMP Pojawienie się zestawów do wykrywania patogenów w żywności i w środowisku (Cryptosporidium, Salmonella, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, itd.) Założenie w UK firmy OptiGene Ltd Umowa licencyjna pomiędzy OptiGene Ltd. i Eiken Chemical Co., Ltd. zezwalająca OptiGene na rozwijanie i sprzedaż urządzeń i produktów do prowadzenia LAMP Wprowadzenie na rynek przez OptiGene Ltd. w pełni zintegrowanej platformy Genie II do prowadzenia reakcji LAMP w czasie rzeczywistym Umowa pomiędzy Novazym Polska s.c., a OptiGene Ltd. o wyłączność dystrybucji na terenie Polski Szybki wzrost ilości publikacji naukowych na temat LAMP. Opracowanie pierwszych komercyjnych zestawów do identyfikacji patogenów bakteryjnych i wirusowych w Novazym Polska Wprowadzenie nowego enzymu do reakcji LAMP polimerazy GspSSD 2.0, intensywny rozwój Reverse Transcription Loop-mediated amplification (RT-LAMP).

4 Strona4 strona4 Publikacje naukowe na temat LAMP Wykorzystywanie reakcji LAMP (liczba publikacji na przestrzeni lat, na podstawie PubMED) Rysunek 1. Liczba publikacji w latach Obecnie jest ponad 600 publikacji, (w 2012: 16 publikacji). Zakres wykorzystywania LAMP Wykrywanie obecności patogenów ludzkich, zwierzęcych i roślinnych. Technika jest wykorzystywana w badaniach weterynaryjnych, środowiskowych, rolnictwie, badaniach żywności czy diagnostyce laboratoryjnej. Techniką LAMP zamplifikowano ponad 200 genów. Szeroki zakres zastosowań z przykładami: WIRUSY Influenza A Detection of human influenza A viruses by Loop-mediated Isothermal AMPlification. Poon LL, Leung CS, Chan KH, Lee JH, Yuen KY, Guan Y, Peiris JS. J Clin Microbiol Jan; 43(1): Herpes simplex Rapid diagnosis of herpes simplex virus infection by a loop-mediated isothermal amplification method. Enomoto Y, Yoshikawa T, Ihira M, Akimoto S, Miyake F, Usui C, Suga S, Suzuki K, Kawana T, Nishiyama Y, Asano Y. Clin Microbiol Feb; 43(2):951-5 Ebola virus Rapid and simple detection of Ebola virus by reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification. Kurosaki Y, Takada A, Ebihara H, Grolla A, Kamo N, Feldmann H, Kawaoka Y, Yasuda J. J Virol Methods Apr; 141(1): Epub 2006 Dec 27 Porcine parvovirus Detection of porcine parvovirus by loop-mediated isothermal amplification. Chen CM, Cui SJ. J Virol Methods 2009 Feb; 155(2): Epub 2008 Nov 20 Epidemic diarrhea virus Development of reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of porcine epidemic diarrhea virus. Ren X, Li P. Virus Genes Apr; 42(2): Epub 2011 Feb 1

5 Strona5 strona5 Porcine circovirus type 2 Specific, simple and rapid detection of porcine circovirus type 2 using the loop-mediated isothermal amplification method. Zhao K, Shi W, Han F, Xu Y, Zhu L, Zou Y, Wu X, Zhu H, Tan F, Tao S, Tang X. Virol J Mar 18; 8:126 Human papillomavirus Rapid detection of the most common high-risk human papillomaviruses by loop-mediated isothermal amplification Saetiew C, Limpaiboon T, Jearanaikoon P, Daduang S, Pientong C, Kerdsin A, Daduang J. J Virol Methods Dec; 178(1-2):22-30 Visual detection of high-risk human papillomavirus genotypes 16, 18, 45, 52, and 58 by loopmediated isothermal amplification with hydroxynaphthol blue dye.luo L, Nie K, Yang MJ, Wang M, Li J, Zhang C, Liu HT, Ma XJ. J ClinMicrobiol Oct; 49(10): Colorimetric detection of HPV6 and HPV16 by loop mediated isothermal amplification.lu CB, Luo L, Yang MJ, Nie K, Wang M, Ma XJ. Bing Du XueBao Jan; 27(1):64-70 Loop-mediated isothermal amplification method for detection of human papillomavirus type 6, 11, 16 and 18 Hagiwara M, Sasaki H, Matsuo K, Honda M, Kawase M, Nakagawa H. J Med Virol May; 79(5): BAKTERIE Mycobacterium tuberculosis Loop-mediated isothermal amplification for direct detection of Mycobacterium tuberculosis complex, M. avium, and M. intracellulare in sputum sample Iwamoto T, Sonobe T, Hayashi K. J ClinMicrobiol Jun; 41(6): Use of visual loop-mediated isotheral amplification of rimm sequence for rapid detection of Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis Zhu RY, Zhang KX, Zhao MQ, Liu YH, Xu YY, Ju CM, Li B, Chen JD. J Microbiol Methods Sep; 78(3): Epub 2009 Jul 17. Erratum in: J Microbiol Methods Nov; 79(2):250 Streptococcus pneumoniae Loop-mediated isothermal amplification method targeting the lyta gene for detection of Streptococcus pneumoniae Seki M, Yamashita Y, Torigoe H, Tsuda H, Sato S, Maeno M. J Clin Microbiol Apr; 43(4): Clostridium difficile Rapid and simple method for detecting the toxin B gene of Clostridium difficile in stool specimens by loop-mediated isothermal amplification Kato H, Yokoyama T, Kato H, Arakawa Y. J Clin Microbiol 2005 Dec; 43(12): Campylobacter jejuni Development and evaluation of a loop-mediated isothermal amplification assay for rapid and simple detection of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli Yamazaki W, Taguchi M, Ishibashi M, Kitazato M, Nukina M, Misawa N, Inoue K. J Med Microbiol Apr; 57(Pt 4): Clostridium botulinum Rapid and simple detection of Clostridium botulinum types A and B by loop-mediated isothermal amplification Sakuma T, Kurosaki Y, Fujinami Y, Takizawa T, Yasuda J. J ApplMicrobiol Apr; 106(4): Epub 2009 Jan 30 Salmonella A loop-mediated isothermal amplification method targets the phop gene for the detection of Salmonella in food samples Li X, Zhang S, Zhang H, Zhang L, Tao H, Yu J, Zheng W, Liu C, Lü D, Xiang R, Liu Y. Int J Food Microbiol Aug 15; 133(3): Epub 2009 Jun 1

6 Strona6 strona6 The rapid detection of Salmonella from food samples by loop-mediated isothermal amplification (LAMP) Ueda S, Kuwabara Y. Biocontrol Sci Jun; 14(2):73-6 Rapid, sensitive, and specific detection of the O4 group of Salmonella enterica by loop-mediated isothermal amplification Okamura M, Ohba Y, Kikuchi S, Takehara K, Ikedo M, Kojima T, Nakamura M. Avian Dis Jun; 53(2): Escherichia coli O157 Development and application of a loop-mediated isothermal amplification method on rapid detection Escherichia coli O157 strains from food samples.zhao X, Li Y, Wang L, You L, Xu Z, Li L, He X, Liu Y, Wang J, Yang L. Mol Biol Rep Jun; 37(5): Epub 2009 Aug 15 Staphylococcus aureus Loop-mediated isothermal amplification assays for identification of antiseptic and methicillin-resistant Staphylococcus aureus Hanaki K, Sekiguchi J, Shimada K, Sato A, Watari H, Kojima T, Miyoshi-Akiyama T, Kirikae T. J Microbiol Methods Feb; 84(2): Epub 2010 Dec 16 Listeria monocytogenes Rapid and sensitive detection of Listeria monocytogenes by loopmediated isothermal amplification Tang MJ, Zhou S, Zhang XY, Pu JH, Ge QL, Tang XJ, Gao YS. Curr Microbiol 2011 Dec; 63(6): Epub 2011 Sep 21 Clostridium perfringens Detection of enterotoxigenic Clostridium perfringens in meat samples by using molecular methods Kaneko I, Miyamoto K, Mimura K, Yumine N, Utsunomiya H, Akimoto S, McClane BA. Appl Environ Microbiol Nov; 77(21): Epub 2011 Sep 2 Vibrio cholerae Sensitive and rapid detection of cholera toxin-producing Vibrio cholerae using a loop-mediated isothermal amplification Yamazaki W, Seto K, Taguchi M, Ishibashi M, Inoue K. BMC Microbiol 2008 Jun 12; 8:94 A rapid, simple, and sensitive loop-mediated isothermal amplification method to detect toxigenic Vibrio cholerae in rectal swab samples Okada K, Chantaroj S, Taniguchi T, Suzuki Y, Roobthaisong A, Puiprom O, Honda T, Sawanpanyalert P. Diagn Microbiol Infect Dis Feb; 66(2): Epub 2009 Oct 7 Establishment and application of a loop-mediated isothermal amplification method for rapid diagnosis of Vibrio cholerae Ke XM, Chen YY, Gao LL, DU ZP, Feng XM, Liao RY, Chen ZY, Cao YC, Chen Q. Nan Fang Yi Ke Da XueXueBao Oct; 29(10): GRZYBY Paracoccidiodes brasiliensis Detection of gp43 of Paracoccidioides brasiliensis by the loopmediated isothermal amplification (LAMP) method Endo S, Komori T, Ricci G, Sano A, Yokoyama K, Ohori A, Kamei K, Franco M, Miyaji M, Nishimura K. FEMS MicrobiolLett May 1; 234(1):93-7 Candida Efficient identification of clinically relevant Candida yeast species by use of an assay combining panfungal loop-mediatedisothermal DNA amplification with hybridization to speciesspecific oligonucleotide probes Inácio J, Flores O, Spencer-Martins I. J. Clin Microbiol Feb; 46(2):713-20, Epub 2007 Dec 12

7 Strona7 strona7 Pneumocystis pneumonia Development of a loop-mediated isothermal amplification method for diagnosing Pneumocystis pneumonia Uemura N, Makimura K, Onozaki M, Otsuka Y, Shibuya Y, Yazaki H, Kikuchi Y, Abe S, Kudoh S. J. Med Microbiol Jan; 57(Pt 1):50-7 PIERWOTNIAKI Toxoplasma gondii Toxoplasma gondii: sensitive and rapid detection of infection by loopmediated isothermal amplification (LAMP) method Zhang H, Thekisoe OM, Aboge GO, Kyan H, Yamagishi J, Inoue N, Nishikawa Y, Zakimi S, Xuan X. ExpParasitol May; 122(1):47-50, Epub 2009 Feb 1 Wuchereria bancrofti Development of loop-mediated isothermal amplification method for detecting Wuchereriabancrofti DNA in human blood and vector mosquitoes Takagi H, Itoh M, Kasai S, Yahathugoda TC, Weerasooriya MV, Kimura E. Parasitol Int Dec; 60(4): Epub 2011 Sep 10 Plasmodium falciparum Development of a reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) for clinical detection of Plasmodium falciparum gametocytes Buates S, Bantuchai S, Sattabongkot J, Han ET, Tsuboi T, Udomsangpetch R, Sirichaisinthop J, Tan-ariya P. Parasitol Int Sep; 59(3):414-20, Epub 2010 Jun 10 GMO Detection of genetically modified organisms (GMOs) using isothermal amplification of target DNA sequences Lee D, La Mura M, Allnutt TR, Powell W. BMC Biotechnol Feb 2; 9:7 Sensitive and rapid detection of genetic modified soybean (Roundup Ready) by loop-mediated isothermal amplification Liu M, Luo Y, Tao R, He R, Jiang K, Wang B, Wang L. Biosci Biotechnol Biochem 2009 Nov; 73(11): Epub 2009 Nov 7

8 Strona8 strona8 LAMP Zasada działania reakcji Kolejne cykle wydłużania i zastępowania nici prowadzone są przy użyciu odpowiedniej polimerazy oraz 2 lub 3 par starterów rozpoznających odpowiednio 6 lub 8 miejsc matrycy. Startery wewnętrzne to FIP (ang. Forward Inner Primer) oraz BIP (ang. Backward Inner Primer), sekwencje ich są komplementarne do dwóch różnych odległych miejsc w sekwencji matrycy (nici sensownej i antysensownej). Startery zewnętrzne F3 (ang. Forward Primer) i B3 (ang. Backward Primer) komplementarne są do zewnętrznych końców matrycy. Startery zewnętrzne są krótsze od starterów wewnętrznych i ich końcowe stężenie w reakcji jest niższe, dlatego wolniej hybrydyzują do matrycy inicjując reakcję zastępowania nici (ang. Strand Displacement). Dodatkowo dla wzmocnienia reakcji można zastosować startery zapętlające LoopF (ang. Loop Forward Primer) i LoopR (ang. Loop Backward Primer). Zastosowanie tej trzeciej pary starterów zwiększa ilość punktów startowych do reakcji LAMP, tym samym zwiększając wydajność oraz czułość reakcji. Zastosowana polimeraza DNA posiada aktywność zastępowania nici DNA (ang. Strand Displacement Activity), dzięki czemu nie potrzebna jest dodatkowa denaturacja matrycy i reakcję można prowadzić w warunkach izotermicznych (w stałej temperaturze). Kluczową cechą LAMP jest utworzenie w pierwszym etapie reakcji sztucznej matrycy (ssdna) o strukturze typu łodyga-pętla (ang. Stem-Loop), przez tzw. self-priming końców matrycy. Matryca w następnych etapach jest amplifikowana, co prowadzi do powstania mieszaniny dwuniciowego DNA o strukturach podobnych do kalafiora. Proces można podzielić na etapy: 1. Tworzenie materiału startowego do LAMP. 2. Cykliczna amplifikacja. 3. Elongacja i recyklizacja. Zasada działania reakcji (dla 2 par starterów) Gdy dsdna osiągnie stan równowagi (65 C) wówczas pierwszy ze starterów wewnętrznych może przyłączyć się do komplementarnej sekwencji matrycy inicjując syntezę nowej nici DNA. Polimeraza DNA o aktywności zastępującej wydłuża starter w kierunku 5 3.

9 Strona9 strona9 Następnie starter zewnętrzny F3 hybrydyzuje do miejsca F3c matrycy i następuje jego wydłużanie. Zachodzi wydłużanie startera F3 w kierunku 5 3 oraz odsunięcie nici oflankowanej starterem FIP. Nowo powstały dsdna (powyżej) uwolniony ssdna (poniżej). Uwolniona nić ssdna oflankowana starterem FIP tworzy na końcu 5 strukturę pętli z powodu komplementarności sekwencji F1c z końca 5 do sekwencji F1 wewnątrz sekwencji. Nić ta jest matrycą dla kolejnego startera wewnętrznego BIP, po czym następuje wydłużenie i powstanie nowej nici, zaś struktura pętli powraca do formy liniowej. Następnie starter B3 przyłącza się na zewnątrz od BIP i zachodzi wydłużanie nowej nici i uwolnienie ssdna. Uwolniona nić ssdna tworzy strukturę pętli na obydwu końcach (struktura przypominająca hantlę, ang. Dumbell-like Structure). Tak powstała struktura stanowi matrycę dla rozpoczęcia kolejnego etapu reakcji: cyklicznej amplifikacji.

10 Strona10 strona10 STRUKTURA STARTOWA DLA REAKCJI LAMPRozpoczyna się etap cyklicznej amplifikacji, starter FIP przyłącza się do ssdna i zaczyna się synteza nowej kolejnej nici w kierunku 5 3, uwalniając wcześniej zsyntetyzowaną nić. Następnie na końcu 3 regionu B1 zachodzi wydłużenie nici i uwolnienie nici oflankowanej starterem FIP (9). Uwolniona nić tworzy strukturę hantli z pętlami na obydwu końcach (11). Powstała nić jest odwróceniem nici z etapu (8). Podobnie jak w etapach (8) do (11) następuje self-priming matrycy (11), dodatkowo starter BIP hybrydyzuje do regionu B2c i zachodzi wydłużanie starterów i zastępowanie i uwalnianie kolejnej nici DNA. W trakcie reakcji wydłużania starterów, self-priming matrycy oraz zastępowania nici powstają produkty składające się z na przemian odwróconych powtórzeń sekwencji matrycowej na tym samym łańcuchu. Animacja reakcji LAMP: Warunki reakcji LAMP Temperatura: C (~63 C) warunki izotermiczne. Objętość reakcji: 25 l. Enzym: polimeraza DNA GspSSD, 8 U/reakcję. Startery: wewnętrzne (FIP, BIP): 0,8 M zewnętrzne (F3, B3): 0,2 M zapętlające (LF, LB): 0,4 M Trójfosforany deoksyrybonukleotydów (dntps): 1,4 mm każdego.

11 Strona11 strona11 Matryca: 0,5-5 l/reakcję. Czas reakcji: do 1 godziny. Projektowanie starterów do LAMP Odpowiednie zaprojektowanie starterów jest kluczowym etapem poprawnego przeprowadzenia reakcji LAMP. FIP Starter wewnętrzny Forward, zawiera na końcu 3 region F2 komplementarny do F2c matrycy oraz na końcu 5 region F1c. BIP Starter wewnętrzny Reverse, zawiera na końcu 3 region B2 komplementarny do B2c matrycy oraz na końcu 5 region B1c. F3 Starter zewnętrzny Forward, zawiera w swojej sekwencji region F3 matrycy komplementarny do F3c. B3 Starter zewnętrzny Reverse, zawiera w swojej sekwencji region B3 matrycy komplementarny do B3c. Loop F Starter zapętlający Forward, sekwencja komplementarna do jednoniciowej pętli pomiędzy regionami F2 i F1 na końcu 5 nici ssdna o strukturze przypominającej hantlę. Loop B Starter zapętlający Reverse, sekwencja komplementarna do jednoniciowej pętli pomiędzy regionami B2 i B1 na końcu 5 nici ssdna o strukturze przypominającej hantlę. Rysunek 2. Sekwencje starterów wykorzystywane w reakcji LAMP. Zasady projektowania starterów do LAMP Odpowiednie i poprawne zaprojektowanie starterów wymaga postępowania krok po kroku zgodnie z poniższymi wskazówkami: Określenie wymagań (celu) badań: Matryca: wybór odpowiednich szczepów / rodzajów mikroorganizmów, których geny mają być amplifikowane (pozytywny wynik reakcji). Określenie odpowiednich szczepów / rodzajów mikroorganizmów, których geny nie mogą być amplifikowane (negatywny wynik reakcji). Zebranie dostępnych sekwencji genów dla wszystkich szczepów / rodzajów mikroorganizmów, które mają dawać pozytywny i negatywny wynik reakcji.

12 Strona12 strona12 Dopasowanie i określenie regionów konserwatywnych w genomie szczepów / rodzajów mikroorganizmów, których geny mają być amplifikowane czułość LAMP. Określenie regionów unikalnych (specyficznych) w genomie szczepów / rodzajów mikroorganizmów, których geny mają być amplifikowane (regiony niewystępujące w genomach mikroorganizmów negatywny wynik reakcji) specyficzność LAMP. Wykorzystanie dostępnych programów komputerowych do projektowania starterów. W przypadku, gdy zaprojektowane startery nie dają satysfakcjonującego rezultatu (brak produktu, obecność niespecyficznych sekwencji, itd.) należy ponownie zaprojektować startery. Parametry starterów Odległość pomiędzy regionami starterów Odległość pomiędzy końcami regionu F2 i B2 (region amplifikowany przez LAMP) powinna wynosić pz, natomiast zarówno pomiędzy F2 i F3 oraz B2 i B3 powinna wynosić 0-20 pz. Odległość dla regionów tworzących strukturę pętli (pomiędzy 5' końcem F2 i 5' końcem F1 oraz 5' końcem B2 i 3' końcem B1) powinna wynosić pz. Odległość pomiędzy regionami F2 i F3 oraz B2 i B3 powinna wynosić 0-60 pz. 5 F3 F2 B1c 3 <40~60>pz F1c B2 B3 5 <40~60>pz <0~60>pz <120~160>pz <0~60>pz Temperatura topnienia (Tm) Około C dla regionów bogatych w pary GC i ok C dla regionów bogatych w pary AT. Tm dla każdego regionu powinna wynosić odpowiednio: ok. 65 C (64-66 C) dla F1c i B1c, ok. 60 C (59-61 C) dla F2, B2, F3, i B3 oraz ok. 65 C (64-66 C) dla starterów LoopF i LoopB. Stabilność końców Końce starterów stanowią początkowy punkt dla syntezy DNA i tym samym muszą być odpowiednio stabilne. Końce 3 regionów F2/B2, F3/B3, i LF/LB oraz koniec 5 regionów F1c/B1c powinny być zaprojektowane tak, by energia swobodna wynosiła 4 kcal/mol lub mniej (dla 6 pz końca). Koniec 5 regionu F1c po amplifikacji łączy się z końcem 3 regionu F1, dlatego stabilność w tym przypadku jest bardzo istotna (zmiana energii swobodnej (ΔG) jest różnicą pomiędzy energią swobodną produktu i energią swobodną materiału początkowego). Im niższa wartość ΔG, tym z większym prawdopodobieństwem startery hybrydyzują do matrycy. Zawartość par GC Powinna wynosić %, w przypadku matryc bogatych w pary GC, oraz %, dla matryc bogatych w pary AT.

13 Strona13 strona13 Tworzenie struktur dwurzędowych Ważne jest, szczególnie dla wewnętrznych, aby startery nie tworzyły struktur drugorzędowych typu primer-dimer. Końce 3 starterów nie mogą być komplementarne względem siebie. Inne Jeżeli w sekwencji występują miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne, z wyjątkiem regionów dla starterów, mogą być one użyte dla potwierdzenia zamplifikowanego produktu. Programy do projektowania starterów Primer Explorer V4 Automatyczne oprogramowanie stworzone przez Fujitsu Ltd. i Eiken Chemical Co., Ltd. Wersja V4. Pracuje w środowisku Windows, Internet Explorer 5+. Dostępne na stronie internetowej LAMP Designer (OptiGene Ltd.) Automatyczne oprogramowanie stworzone przez OptiGene Ltd. Posiada wbudowany algorytm wyszukiwania najlepszych sekwencji starterowych. Startery przeszukiwane są pod kątem tworzenia struktur drugorzędowych, dimerów, homologii właściwości fizycznych zgodnie z zadanymi warunkami. Sekwencje matrycowe mogą być pobierane z baz danych (przy pomocy numeru dostępu, ang. accession number), z pliku w formacie tekstowym oraz wklejane bezpośrednio w okienko programu. Pracuje w środowisku Windows. Wersja demo dostępna na stronie internetowej Detekcja i wizualizacja produktów LAMP Charakterystyka produktów (amplikonów) reakcji LAMP ( LAMPlikons ) Tabela 1. Porównanie produktów reakcji LAMP i PCR. LAMP PCR Struktura pętla-łodyga dsdna dsdna Rozmiar różny jednakowy Kształt przypominający kalafior liniowy Liczba kopii genu wiele kopii/1 amplikon 1 kopia/1 amplikon Stężenie µg/ml kopii/reakcję, 4-40 µg/ml Metody detekcji 1. Elektroforeza w żelu agarozowym Po raz pierwszy dla LAMP w 2000 roku (Notomi T et al.). Produkty reakcji wybarwiane bromkiem etydyny i rozdzielane w 2 % żelu agarozowym. Końcowy punkt analizy (po zakończeniu reakcji).

14 Strona14 strona14 Produkt na żelu widoczny w postaci smearu. Wynik tylko jakościowy. Wizualizacja w świetle UV. Pozwala obserwować produkt reakcji LAMP po trawieniu restrykcyjnym. A B Rysunek 3A. Rozdział elektroforetyczny produktu amplifikacji na matrycy HBV techniką LAMP (amplifikacja w temp. 60 C przez 60 min). Linia 1: Marker masy DNA, Linia 2-4: Amplifikowane produkty z matrycy HBV, Linia 5: Kontrola ujemna, Linia 6: Kontrola pozytywna (produkt amplifikacji trawiony Sau3AI). Rysunek 3B. Rozdział elektroforetyczny produktu amplifikacji na matrycy PSA mrna (amplifikacja w temp. 65 C przez 60 min). Linia 1: Marker masy DNA, Linia 2: Kontrola ujemna, Linia 3-4: Amplifikowane produkty z matrycy PSA mrna, Linia 5-6: Kontrola pozytywna (produkt amplifikacji trawiony Sau3AI). 2. Analiza turbidymetryczna Po raz pierwszy dla LAMP w 2001 roku (Mori et al.). Powstający w trakcie reakcji produkt uboczny, pirofosforan magnezu, pozwala na ocenę wyniku poprzez analizę zmętnienia. Końcowy punkt analizy (po zakończeniu reakcji). Produkt reakcji widoczny gołym okiem. Wynik jakościowy. W trakcie reakcji przyłączania kolejnych nukleotydów do wydłużanego łańcucha DNA podczas polimeryzacji uwalniany jest z dntp ów pirofosforan. Duża ilość powstającego piroforsforanu reaguje z jonami magnezu obecnymi w buforze reakcyjnym powstaje biały osad (zgodnie z równaniem poniżej): (DNA) n-1 + dntp = (DNA) n + P 2O 7 4- / P 2O Mg 2+ = Mg 2P 2O 7 Zmętnienie w probówce widoczne jest, kiedy stężenie pirofosforanu magnezu przekracza 0,5 mm. Do powstania pirofosforanu magnezu w stężeniu powyżej 0,5 mm potrzeba wytworzenia 4 µg DNA w 25 µl objętości reakcji. W reakcji LAMP uzyskuje się 10 µg DNA / 25 µl, dla porównania w reakcji PCR otrzymuje się ok. 0,2 µg DNA / 25 µl, a stężenie pirofosforanu magnezu wynosi wówczas 0,02 mm, co nie pozwala na zaobserwowanie białego osadu. Dodatkowo warunki termiczne (podgrzewanie) w reakcji PCR powodują, że jony pirofosforanowe są hydrolizowane do jonów fosforanowych.

15 Strona15 strona15 Rysunek 4. Analiza turbidymetryczna produktów reakcji LAMP. Probówka 1: K(-), Probówka 2: amplikon LAMP. 3. Analiza turbidymetryczna w czasie rzeczywistym Po raz pierwszy dla LAMP w 2003 roku (Mori et al.). Pomiar w czasie rzeczywistym (ang. real-time) pozwala wyeliminować etap szacowania ilości produktu po zakończeniu reakcji. Pomiar podobny do analizy spektrofotometrycznej. Analiza jakościowa i ilościowa produktu reakcji. Analiza turbidymetryczna jest pomiarem pośrednim ilości DNA, gdyż opiera się na pomiarze stężenia produktu ubocznego reakcji pirofosforanu magnezu. Określana jest zależność pomiędzy ilością powstającego pirofosforanu magnezu, a ilością powstającego DNA. Rysunek 5. Pomiar zmętnienia produktów reakcji LAMP w czasie rzeczywistym. 4. Analiza fluorymetryczna Po raz pierwszy dla LAMP w 2000 roku (Notomi T. et al.). Detekcja produktu przez fluorescencję. Detektorami są cząsteczki fluorochromu emitujące światło o określonej długości po związaniu się z dwuniciowym DNA, takie jak: bromek etydyny, SYBR Green I, kalceina, itd. Końcowy punkt analizy (po zakończeniu reakcji). Analiza jakościowa. Wizualizacja w świetle UV, ale produkt reakcji można obserwować gołym okiem.

16 Strona16 strona16 R y s u n e k 6 A. W i z u A B Rysunek 6A wizualizacja fluorymetryczna reakcji LAMP (fluorochrom: kalceina). Jony pirofosforanowe usuwają jony manganu z kalceiny, a fluorescencja wzrasta, im więcej kalceiny łączy się z uwolnionymi z dntps jonami magnezu. Probówka 1-K(-), Probówka 2- amplikon LAMP. Rysunek 6B. Wizualizacja fluorymetryczna reakcji LAMP (fluorochrom: bromek etydyny) obraz w świetle UV. Probówka 1-K-, Probówka 2-amplikon LAMP. 5. Fluorescencja w czasie rzeczywistym Pomiar zachodzi w czasie rzeczywistym, co pozwala wyeliminować etap szacowania produktu po zakończeniu reakcji. Analiza jakościowa i ilościowa produktu reakcji. Monitorowanie przyrostu liczby kopii badanej sekwencji w czasie przez pomiar fluorescencji. Specyficzność reakcji analiza temperatury annealingu produktu. A B Rysunek 7A. Pomiar fluorescencji produktu reakcji LAMP w czasie rzeczywistym. Rysunek 7B. Krzywa annealingu produktu reakcji LAMP.

17 Strona17 strona17 Diagnostyczne wskaźniki wydajności reakcji LAMP Przed przystąpieniem do obliczania wskaźników wydajności LAMP należy: 1. Określić, które z badanych prób mają dać wynik pozytywny, a które negatywny. 2. Zebrać jak największą liczbę prób, które będą stanowiły odniesienie (tzw. próby referencyjne) faktycznie dające wynik pozytywny oraz faktycznie dające wynik negatywny. 3. Zbadać każdą próbę i określić, które w reakcji LAMP dają wynik pozytywny, a które wynik negatywny. 4. Zebrane dane liczbowe umieścić w tabeli tzw. tablicy 2x2: P. odniesienia (+) P. odniesienia (-) Test (+) Prawdziwie dodatnie (PD) Fałszywie dodatnie (FD) suma (PD+FD) Test (-) Fałszywie ujemne (FN) Prawdziwie ujemne (PN) suma (FN+PN) SUMA suma (PD+FN) suma (FD+PN) SUMA Wskaźniki: Czułość zdolność do wykrycia badanej cechy, stosunek wyników prawdziwie dodatnich do faktycznie posiadających daną cechę. Cz = PD / (PD+FN) [%] Specyficzność część negatywnych prób odniesienia, która w reakcji dała wynik negatywny, stosunek wyników prawdziwie ujemnych do faktycznie nieposiadających danej cechy. Sp = PN / FD+PN [%] Predykcja dodatnia iloraz wyników prawdziwie dodatnich oraz sumy wyników prawdziwie dodatnich i fałszywie dodatnich (czyli wszystkich dodatnich wyników testu). Pd = PD / (PD+FD) [%] Predykcja ujemna iloraz wyników prawdziwie ujemnych oraz sumy wyników prawdziwie ujemnych i fałszywie ujemnych (czyli wszystkich ujemnych wyników testu). Pn = PN / (PN+FN) [%] Wydajność określa jak często w reakcji otrzymujemy poprawny wynik. W = (PD+PN) / SUMA [%]

18 Strona18 strona18 Badanie SNP technika LAMP Polimorfizm pojedynczego nukleotydu (ang. Single Nucleotide Polymorphism, SNP) jest to zmienność sekwencji DNA, która polega na zmianie pojedynczego nukleotydu pomiędzy osobnikami danego gatunku lub drugim, odpowiadającym chromosomem danemu osobnikowi. Wysoka specyficzność reakcji LAMP powoduje, że tylko docelowa dzika sekwencja (ang. Wild Type allele, WT allele, tj. nie zawierająca SNP) zostanie zamplifikowana spośród sekwencji homologicznych. Występowanie polimorfizmu pojedynczego nukleotydu można potwierdzić przez brak amplifikowanego produktu w reakcji. Możliwe to jest dzięki odpowiedniemu zaprojektowaniu starterów do reakcji. Startery FIP i BIP do reakcji SNP-LAMP projektowane są w taki sposób, że na końcach 5 zawierają nukleotyd SNP. Kiedy matrycą w reakcji jest sekwencja bez polimorfizmu, wówczas w trakcie reakcji powstaje struktura startowa i reakcja jest kontynuowana. W przypadku, gdy matrycą jest zmutowana sekwencja genu zawierająca polimorfizm (ang. MUT allele), nie otrzymujemy produktu w reakcji. Rysunek 8. Przebieg reakcji LAMP ukierunkowanej na identyfikację polimorfizmu SNP w sekwencji. Animacja reakcji LAMP:

19 Strona19 strona19 Multiplex LAMP (ang. Detection of Amplification by Release of Quenching, DARQ) Metoda multiplex LAMP polega na znakowaniu starterów reakcji LAMP różnymi barwnikami fluorescencyjnymi, które umożliwiają detekcję kilku produktów reakcji w jednej probówce. Możliwość dostosowania do każdej reakcji LAMP. Nie wymaga projektowania dodatkowych starterów. Koniec 5 FIP znakuje się barwnikiem wygaszającym fluorescencję (Iowa Black FQ, Iowa Black RQ). Koniec 3 Fd posiada znacznik fluorescencyjny (FAM, HEX, ROX, Cy5, Cy5.5). Przygotowanie wstępne wymaga ogrzania mieszaniny 50 µm Q-FIP + 50 µm Fd do temperatury 98 C, a następnie powolnego schłodzenia do temperatury pokojowej. Rysunek 9. Zasada znakowania startera FIP i Fd w reakcjach multiplex LAMP. Rysunek 10. Schemat reakcji multiplex LAMP.

20 Rysunek 11. Schemat reakcji multiplex LAMP na przykładzie równoległej amplifikacji wielu matryc DNA: faga lambda (λ), C. elegans, E. coli, hbrca1. Strona20 strona20

21 Strona21 strona21 Oprzyrządowanie, odczynniki i akcesoria do izotermalnej amplifikacji DNA firmy OptiGene Genie II zintegrowana elastyczna platforma Genie II to zaawansowane narzędzie, które pozwala na prowadzenie izotermalnej reakcji w czasie rzeczywistym w przenośnej platformie o niskim poborze mocy. System zamknięty prowadzenia reakcji zapobiega kontaminacji amplifikowanym produktem. Genie II jest urządzeniem wyposażonym w dwa niezależne bloki grzejne, każdy mieszczący 8 mikroprobówek (0,2 ml) odpowiednich dla urządzenia. Genie II posiada funkcję gradientową oraz umożliwia zaprogramowanie dodatkowego annealingu dla potwierdzenia obecności amplifikowanego produktu. Najważniejsze funkcje Genie II: Szybka izotermiczna amplifikacja. Potwierdzenie poprawności wyniku poprzez analizę krzywej annealingu (podobna do analizy krzywej topnienia produktu). Niskie koszty i łatwość obsługi. Kompaktowe, przenośne i wytrzymałe urządzenie. Zasilanie sieciowe lub bateryjne pozwalające na 10-godzinne podtrzymanie pracy urządzenia. Łatwy dostęp do danych przez urządzenie USB. Obsługa za pomocą komputera lub niezależnie przez ekran dotykowy. Rysunek 12. Genie II urządzenie do prowadzenia reakcji LAMP i detekcji produktu w czasie rzeczywistym.

22 Strona22 strona22 Genie III mała zintegrowana elastyczna platforma do reakcji LAMP Genie III to zaawansowane narzędzie, które pozwala na prowadzenie izotermalnej reakcji w czasie rzeczywistym w przenośnej platformie o niskim poborze mocy. System zamknięty prowadzenia reakcji zapobiega kontaminacji amplifikowanym produktem. Genie II jest urządzeniem wyposażonym w jeden blok grzejny mieszczący 8 mikroprobówek (0,2 ml Genie III posiada funkcję gradientową oraz umożliwia zaprogramowanie dodatkowego annealingu dla potwierdzenia obecności amplifikowanego produktu). Najważniejsze funkcje Genie III: Wielkość dużego kalkulatora (kompaktowy). Wysoka jakość układu optycznego. Potwierdzenie poprawności wyniku poprzez analizę krzywej annealingu (podobna do analizy krzywej topnienia produktu). Wbudowany moduł GPS. Panel dotykowy. Łatwy dostęp do danych przez urządzenie USB. Rysunek 13. Genie III urządzenie do prowadzenia reakcji LAMP i detekcji produktu w czasie rzeczywistym.

23 Strona23 strona23 Enzymy stosowane w reakcji izotermalnej amplifikacji DNA 1. GspSSD Polimeraza Najczęściej wykorzystywana w reakcji LAMP polimeraza z Geobacillus sp. pozwala na uzyskanie z niewielkiej ilości matrycy aż 10 9 kopii DNA w czasie krótszym, niż 30 minut. Pozwala na amplifikację matrycy w znacznie krótszym czasie w porównaniu do polimerazy BstI. Pozwala na uzyskanie produktu o wysokiej specyficzności. Ze względu na aktywność zastępowania nici pozwala na prowadzenie reakcji w warunkach izotermicznych bez konieczności wykorzystywania specjalistycznej aparatury, jak w przypadku reakcji amplifikacji in vitro metodą PCR. Nie wymaga wstępnej denaturacji matrycy. Posiada niewielką aktywność odwrotnej transkryptazy, która jednak nie pozwala na amplifikowanie RNA bez dodatkowego uzupełnienia mieszaniny reakcyjnej odwrotną transkryptazą. Enzym nie jest odporny na denaturację, ale utrzymuje wysoką aktywność w czasie powyżej 10 godzin w temp. 75 C. 2. GspSSD 2.0 Polimeraza Nowa zmutowana polimeraza z Geobacillus sp. posiada najwyższą ze wszystkich enzymów aktywność zastępowania nici. Pozwala na amplifikację matrycy w czasie o ~30 % krótszym w porównaniu do Polimerazy GspSSD. Pozwala na uzyskanie produktu o wysokiej specyficzności. Nie wymaga wstępnej denaturacji matrycy. Posiada wyższą aktywność odwrotnej transkryptazy, która jednak nie pozwala na amplifikowanie RNA bez dodatkowego uzupełnienia mieszaniny reakcyjnej odwrotną transkryptazą. 3. GspF Polimeraza DNA Enzym przeznaczony do diagnostyki, charakteryzuje się wysoką aktywnością zastępowania nici. Posiada wysoką aktywność odwrotnej transkryptazy. 4. Tin Polimeraza DNA Enzym jako jedyny z enzymów do reakcji LAMP wykazujący termostabilność i wymagający denaturacji wstępnej do prawidłowej pracy. Charakteryzuje się niewielką, w stosunku do innych enzymów, aktywnością zastępowania nici. Posiada aktywność odwrotnej transkryptazy. 5. GspM Polimeraza DNA Charakteryzuje się niewielką, w stosunku do innych enzymów, aktywnością zastępowania nici. Podobny do polimerazy BstI.

24 Strona24 strona24 Brak aktywności odwrotnej transkryptazy. 6. GspM 2.0 Polimeraza DNA Charakteryzuje się dwukrotnie wyższą, w stosunku do do GspM, aktywnością zastępowania nici. Niewielka aktywność odwrotnej transkryptazy. 7. GspM 3.0 Polimeraza DNA Charakteryzuje się czterokrotnie wyższą, w stosunku do do GspM, aktywnością zastępowania nici. Niewielka aktywność odwrotnej transkryptazy. Enzym stosowany w turbidymetrii. 8. BstI Polimeraza DNA Pierwszy z enzymów zastosowany do reakcji izotermalnej amplifikacji DNA charakteryzujący się relatywnie niską, w stosunku do innych enzymów, aktywnością zastępowania nici. Nie posiada aktywności odwrotnej transkrypcji. 9. Odwrotna Transkryptaza do RT-LAMP Odwrotna transkryptaza o wysokiej termostabilności, dedykowana reakcji LAMP. Pozwala na zachowanie stało-temperaturowego charakteru procesu reakcji. Stężenie: 1 U/µl. Zalecana temperatura do prowadzenia jednoetapowej stałotemperaturowej reakcji RT-LAMP: 63 C. Zalecana ilość enzymu do uzupełnienia aktywności w reakcji 1 rxn RT-LAMP: 0,0125-0,25 U. Master Mix-y do reakcji LAMP zawierające zoptymalizowany skład niezbędnych do reakcji odczynników, poza matrycą DNA i starterami 1. Isothermal Master Mix (ISO-001) Izotermalna mieszanina do amplifikacji techniką LAMP zawierająca polimerazę GspSSD, pozwala na fluorescencyjną detekcję produktu na platformie Genie II oraz innych urządzeniach fluorymetrycznych ustawionych na wzbudzenie przy długości fali 488 nm i emisję przy 520 nm. Może być także wykorzystywana w aparatach do qpcr lub real-time PCR ustawionych na kanał FAM. Krzywa annealingu jest generowana dla potwierdzenia obecności produktu. Eliminuje to konieczność prowadzenia dodatkowej detekcji w żelach agarozowych i analizy turbidymetrycznej oraz pozwala na prowadzenie reakcji w systemie zamkniętym (ang. closetube system). Typowe warunki reakcji dla Isothermal Master Mix to: Amplifikacja: 30 minut w temp. 65 C. Annealing: co 0,05 C w przedziale 98 C 80 C.

25 Strona25 strona25 2. Isothermal Master Mix (ISO-001t) Izotermalna mieszanina do amplifikacji techniką LAMP zawierająca GspM 3.0 Polimerazę DNA. Pozwala na turbidymetryczną detekcję produktu (analiza zmętnienia w probówce) na specjalnie dostosowanych do tego typu urządzeniach, turbidymetrach, lub gołym okiem. Umożliwia więc prowadzenie reakcji w systemie zamkniętym. Amplifikacja: minut w temp. 65 C. 3. Isothermal Master Mix (ISO-004) Izotermalna mieszanina do amplifikacji techniką LAMP zawierająca nową polimerazę GspSSD 2.0, pozwala na fluorescencyjną detekcję produktu na platformie Genie II, III oraz innych urządzeniach fluorymetrycznych ustawionych na wzbudzenie przy długości fali 488 nm i emisję przy 520 nm np. aparatach do qpcr z kanałem FAM. Polimerazę GspSSD 2.0 charakteryzuje najwyższa ze wszystkich enzymów aktywność zastępowania nici, która pozwala na skrócenie o ok. 30 % czasu reakcji LAMP w stosunku do innych mastermiksów zawierających Polimerazę GspSSD. Krzywa annealingu jest generowana dla potwierdzenia obecności produktu. Eliminuje to konieczność prowadzenia dodatkowej detekcji w żelach agarozowych i analizy turbidymetrycznej oraz umożliwia prowadzenie reakcji w systemie zamkniętym. Zawiera zoptymalizowany skład niezbędnych do reakcji odczynników, poza matrycą DNA i starterami. Typowe warunki reakcji dla Isothermal Master Mix to: Amplifikacja: 20 minut w temp. 65 C. Annealing: co 0,05 C w przedziale 98 C 80 C. Zalety i wady techniki LAMP Zalety: Szybka, krótki czas reakcji (produkt można zaobserwować po 20 min). Czuła i specyficzna, dzięki zastosowaniu starterów rozpoznających 6-8 miejsc na matrycy. Izotermalna, możliwość prowadzenia reakcji w stałej temperaturze. Prostsze i tańsze urządzenia, niż w real-time PCR, przy porównywalnej czułości. Nie wymaga wstępnej denaturacji matrycy. Produkt reakcji można zaobserwować gołym okiem. Wady: Trudniejsze i bardziej czasochłonne projektowanie starterów do reakcji w porównaniu do PCR. Ryzyko kontaminacji w systemach otwartych. Nie wszystkie badania DNA są specyficzne dla sekwencji. Biorąc pod uwagę powyższe zalety i wady, można stwierdzić, że metoda LAMP jest odpowiednia tam, gdzie mamy do czynienia z ograniczonymi zasobami, gdzie wyniki potrzebne są w krótkim

26 Strona26 strona26 czasie oraz prowadzone analizy są specyficzne w przypadku sekwencji. Technika nie nadaje się natomiast do analizy nieznanych sekwencji DNA i RNA. Podsumowanie LAMP jest nową, innowacyjną i szybko rozwijającą się techniką amplifikacji kwasów nukleinowych. LAMP doskonale nadaje się w sytuacjach, gdy mamy do czynienia z ograniczonymi zasobami sprzętowymi, a prowadzone analizy wymagają bardzo szybkich wyników. LAMP umożliwia specyficzną amplifikację matrycy (startery rozpoznają 6-8 różnych sekwencji matrycy). Projektowanie starterów dla reakcji LAMP jest bardziej złożone, niż w przypadku PCR, ale udogodnienie stanowią specjalne oprogramowania do projektowania. Nie wymaga denaturacji matrycy, zaś całość reakcji przebiega w stałych warunkach temperaturowych. Wydajność amplifikacji jest bardzo wysoka, wyższa niż real-time PCR. LAMP pozwala na znaczne skrócenie czasu analizy (do 1h). LAMP jest mniej wrażliwy na obecność inhibitorów, nie zawsze wymagana jest izolacja DNA. Pozwala na amplifikację RNA bez dodawania odwrotnej transkryptazy. Produkt uboczny powstający w reakcji LAMP, pirofosforan magnezu, pozwala na obserwację wyniku w świetle UV i widzialnym (analiza turbidymetryczna). Możliwy pomiar ilościowy produktu w czasie rzeczywistym. Umożliwia prowadzenie reakcji w systemie zamkniętym, co pozwala uniknąć zanieczyszczeń w próbie. Zastosowanie zintegrowanej platformy Genie II umożliwia prowadzenie reakcji w czasie rzeczywistym i ilościowe oznaczenie produktu. Bibliografia Kaneko H, Kawana T, Fukushima E, Suzutani T. Tolerance of loop-mediated isothermal amplification to a culture medium and biological substances. J BiochemBiophys Methods Apr 10; 70(3): Epub 2006 Aug 30 Mori Y, Nagamine K, Tomita N, Notomi T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. BiochemBiophys Res Commun Nov 23; 289(1):150-4 Mori Y, Kitao M, Tomita N, Notomi T. Real-time turbidimetry of LAMP reaction for quantifying template DNA. J BiochemBiophys Methods May 31; 59(2): Nagamine K, Hase T, Notomi T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Mol Cell Probes Jun; 16(3):223-9 Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, YonekawaT, Watanabe K, Amino N, Hase T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res Jun 15; 28(12):E63

27 Strona27 strona27 Parida M, Sannarangaiah S, Dash PK, Rao PV, Morita K. Loop mediated isothermal amplification (LAMP): a new generation of innovative gene amplification technique; perspectives in clinical diagnosis of infectious diseases. Rev Med Virol Nov-Dec; 18(6): Strony www: Novazym Polska S.C. ul. Rubież 46H, Poznań tel.: (+48) ; fax: (+48) info@novazym.com;