Ampli-LAMP Goose Parvovirus

Transkrypt

1 Novazym Products Zestaw do identyfikacji materiału genetycznego parwowirusa GPV u gęsi techniką Loop-mediated Isothermal AMPlification (LAMP) Numery katalogowe produktu: AML-GPV-200 AML-GPV-400 Wydanie 1 (czerwiec 2013)

2 1. Przeznaczenie testu Choroba Derzsy ego wywoływana przez parwowirus gęsi (GPV) należy do jednych z najgroźniejszych i najpoważniejszych z ekonomicznego punktu widzenia chorób wirusowych drobiu wodnego. Choroba ta występuje we wszystkich krajach o przemysłowej hodowli drobiu wodnego. Największą wrażliwość na zakażenie wykazują jednodniowe ptaki i utrzymuje się ona do 2-3 tygodnia życia. Śmiertelność może sięgać do 90% stada. Po przechorowaniu ptaki wykazują zahamowanie wzrostu, braki w upierzeniu i kulawizny. Zakażenie wirusem następuje drogą horyzontalną i transowarialną przez skorupę jaja. W zależności od wieku gęsi choroba może wystąpić w formie ostrej, podostrej albo przewlekłej. Parwowirus gęsi (GPV) jest bardzo odporny na czynniki fizyczne i chemiczne, dlatego jego szybka i skuteczna diagnostyka jest ważnym czynnikiem pozwalającym na izolowanie ptaków chorych wykazujących objawy kliniczne. Test pozwala na jakościową detekcję DNA wirusa parwowirozy GPV u gęsi. W zależności od wielkości, zestaw pozwala na przeprowadzenie 200 i 400 testów. Zestaw zawiera: - Isothermal Master Mix fluorescent dye, OptiGene (bufor reakcyjny, MgCl 2, dntps, pirofosfataza, polimeraza GspSSD, barwnik fluorescencyjny pochodna 6-FAM) - Primers (F3, B3, FIP, BIP, LF, LB każdy w stężeniu 10 µm) - kontrolę pozytywną DNA (sekwencja DNA amplikonu w wektorze plazmidowym) - sterylną wodę MiliQ do reakcji. 2. Zasada działania testu Test oparty jest na technice LAMP (ang. Loop-mediated Isothermal Amplification) i zapewnia bardzo szybką oraz wysoce specyficzną identyfikację materiału genetycznego parwowirusa GPV u drobiu wodnego. Zoptymalizowane mieszaniny i specjalnie zaprojektowane startery umożliwiają specyficzną amplifikację konserwatywnego regionu DNA genu VP3, kodującego białko płaszcza wirusa GPV. Wysoka czułość testu pozwala na detekcję wirusa już na poziomie 0.1 TCID (1) 50. Czas potrzebny na przeprowadzenie reakcji to ok. 30 minut w przypadku wykorzystania standardowego termocyklera oraz minut w przypadku termocyklera do Real-time PCR lub platformy Genie II. Test oparty o metodę amplifikacji LAMP jest co najmniej dwukrotnie szybszy od testu opartego o standardową amplifikację PCR. (1) TCID 50 - jest to jednostka miana wirusa stosowana w wirusologii - dawka wirusa dająca efekt cytopatyczny na 50% zakażonej hodowli komórkowej. Jest to forma dokładnego wyrażania dawki wirusa użytej np. do określania czułości metody. 2

3 W zależności od urządzenia wykorzystanego do przeprowadzenia testu, różni się sposób analizy wyników testu: PLATFORMA SPOSÓB ANALIZY WYNIKÓW Łaźnia wodna Blok grzewczy Termocykler do PCR Termocykler do Real-time PCR Platforma Genie II do LAMP Rozdział elektroforetyczny w 2% żelu agarozowym Obserwacja fluorescencji w probówce w świetle UV Analiza przyrostu ilości produktu w czasie rzeczywistym, na podstawie pomiaru fluorescencji (odczyt przez kanał FAM) Analiza profilu topnienia produktu po reakcji LAMP Produkt reakcji wybarwiony bromkiem etydyny w żelu agarozowym ma postać tzw. drabinki (ang. Ladder-pattern structure), ponieważ w wyniku reakcji LAMP powstają różnej długości konkatamery złożone z powtórzeń sekwencji matrycowej. Wynik pozytywny reakcji można również zaobserwować w postaci silnej fluorescencji produktów reakcji w świetle UV. Wynik pozytywny reakcji przeprowadzonej w termocyklerze do Real-time PCR oraz na platformie Genie II umożliwia analizę przyrostu ilości produktu w czasie rzeczywistym (proporcjonalnie do wzrostu emisji fluorescencji, odczytywanej przez kanał FAM). Możliwa jest również analiza specyficzności reakcji na podstawie profilu topnienia produktów amplifikacji (ang. Melt Curve Analysis). W analizie Melt Peak widoczny jest jeden specyficzny produkt reakcji. Zaleca się prowadzenie analizy wyników testu w układzie zamkniętym (wizualizacja w świetle UV lub na podstawie analizy profilu topnienia produktów reakcji). 3. Zawartość zestawu Lp. Oznaczenie Element zestawu [1] [2] [3] [4] Isothermal Master Mix Primers Positive Control MiliQ Water AML-GPV- 200 AML-GPV Warunki przechowywania: przechowywanie długoterminowe -20 C przy częstym, rutynowym użyciu +4 C chronić przed światłem unikać częstego zamrażania i rozmrażania. 3

4 4. Zalecana procedura przed analizą LAMP Ekstrakcja DNA z zainfekowanej wirusem GPV tkanki wątrobowej gęsi. 5. Przeprowadzenie testu Warunki reakcji STANDARD PCR Etap Temperatura Czas Ilość cykli Amplifikacja 60 C 30 min 1 Chłodzenie 4 C 1 min REAL-TIME PCR Etap Temperatura Czas Ilość cykli Amplifikacja 60 C 30 sek 70 Pomiar fluorescencyjny ilości produktu amplifikacji po każdym cyklu reakcji, w czasie rzeczywistym Topnienie produktu C 0,5 C / 5 sek Pomiar fluorescencji po każdorazowej zmianie temp. o 0,5 C Chłodzenie 40 C 30 sek Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej Lp. [1] [2] [3] [4] Oznaczenie probówki Element zestawu Objętość na 1 reakcję 15 µl Isothermal Master Mix Primer F3/B3 10 µm 0,5 µl 7 µl Primer FIP/BIP 10 µm 2 µl Primer LF/LB 10 µm 1 µl Positive Control 1 µl lub inna matryca DNA 2 µl MiliQ Water RAZEM 25 µl 4

5 Obligatoryjne kontrole testu Dla prawidłowej interpretacji wyników testu należy obok próbek badanych zastosować trzy kontrole reakcji: kontrolę pozytywną reakcji (Positive Control), która pozwala ocenić poprawność przebiegu amplifikacji docelowego produktu matrycę stanowi próbka zawierająca amplifikowaną sekwencję DNA [3]. kontrolę negatywną reakcji, która pozwala ocenić poprawność przebiegu amplifikacji matrycę stanowi izolat z tkanki wątrobowej zdrowej gęsi kontrolę negatywną reakcji bez matrycy DNA, która pozwala ocenić czystość odczynników używanych do reakcji amplifikacji LAMP zamiast matrycy, woda MiliQ [4]. Fakultatywnie kontrole testu Okresowo zaleca się przeprowadzić: kontrolę negatywną izolacji DNA pozwala ocenić czystość odczynników do izolacji. Należy wykonać jedną taką kontrolę w każdej serii izolacji lub okresowo w krótkich odstępach czasu, izolując z wody (zamiast z zainfekowanej tkanki). kontrolę pozytywną izolacji pozwala potwierdzić skuteczność procesu izolacji. Należy stosować okresowo np. dla nowej partii odczynników do izolacji DNA (do izolacji należy podać tkankę naturalnie lub sztucznie zainfekowaną wirusem). 5

6 6. Analiza wyników testu Rozdział elektroforetyczny produktów reakcji amplifikacji LAMP w 2% żelu agarozowym 1, 2 kontrola negatywna (bez matrycy GPV) 3, 4 kontrola pozytywna (na matrycy GPV) Obserwacja fluorescencji produktów reakcji amplifikacji LAMP z dodatkiem barwnika SYBR Green Obserwacja gołym okiem 1, 2 kontrola negatywna (bez matrycy GPV) 3, 4 kontrola pozytywna (na matrycy GPV) Obserwcaja w świetle UV 1, 2 kontrola negatywna (bez matrycy GPV) 3, 4 kontrola pozytywna (na matrycy GPV) 6

7 7. Analiza specyficzności i czułości testu Specyficzność testu Kontrola testem LAMP 1 kontrola pozytywna matryca GPV 2 matryca FadV 3 matryca GCV 4 matryca GHPV 5 kontrola negatywna DNA izolowany z tkanki wątrobowej zdrowej gęsi Kontrola testem PCR (na starterach zewnętrznych F3/B3) 1 kontrola pozytywna matryca GPV 2 matryca FadV 3 matryca GCV 4 matryca GHPV 5 kontrola negatywna DNA izolowany z tkanki wątrobowej zdrowej gęsi Czułość testu Kontrola testem LAMP TCID TCID TCID TCID TCID 50 Kontrola testem PCR (na starterach zewnętrznych F3/B3) TCID TCID TCID TCID TCID

8 UWAGA! Wysokie ryzyko kontaminacji miejsca pracy! Aby zapobiegać kontaminacji laboratorium produktami amplifikacji LAMP, należy zwrócić szczególną uwagę, aby nie otwierać probówek z produktami amplifikacji w tym samym pomieszczeniu, gdzie jest wykonywany proces izolacji DNA z zainfekowanego materiału oraz przygotowywanie mieszaniny reakcyjnej do testu. Reakcję LAMP charakteryzuje bardzo wysoka wydajność - powstaje nawet do 25 µg DNA, zawierającego bardzo dużą liczbę kopii amplikonu! Zalecamy wykonywanie izolacji DNA i przygotowywanie pomieszczeniu, niż rozdział elektroforetyczny produktów amplifikacji. mieszaniny reakcyjnej w innym Pomimo możliwości analizy wyników reakcji w żelu agarozowym, zalecamy korzystanie z możliwości wykonania reakcji i analizy wyników w układzie zamkniętym, bez konieczności otwierania probówek z produktami reakcji LAMP (obserwacja fluorescencji produktów amplifikacji w probówce w świetle UV oraz wykorzystanie do wykonania testu aparatu do Real-time PCR lub platformy Genie II). Technologia LAMP została wynaleziona i jest własnością firmy Eiken Chemical Co., Ltd. Dane empiryczne dotyczące optymalnych warunków reakcji oraz czułości i specyficzności testu Ampli-LAMP Goose Parvovirus zostały zamieszczone w powyższym protokole na podstawie publikacji: Tarasiuk K, Woźniakowski G, Samorek-Salamonowicz E. (PIWet-PIB) pt. Loop-mediated isothermal amplification as a simple molecular method for the detection of Derzsy's disease virus, Bull Vet Inst Pulawy 57, 19-23, Lot nr: Data ważności: 8