Biologia molekularna ćwiczenia Zakład Wirusologii

Transkrypt

1 Biologia molekularna ćwiczenia Zakład Wirusologii

2 Zakład Wirusologii Instytut Mikrobiologii p. 440 A tel lub Prowadzący: ćwiczenie 1 dr hab. Monika Radlińska ćwiczenie 2 dr Agnieszka Kwiatek ćwiczenie 3 dr hab. Monika Radlińska, dr hab. Monika Adamczyk- Popławska ćwiczenie 4 dr hab. Monika Adamczyk-Popławska 2

3 Część teoretyczna ĆWICZENIE 1 Enzymy restrykcyjne i rekombinacja DNA in vitro Zjawisko restrykcji modyfikacji Zjawisko restrykcji i modyfikacji (RM) zostało po raz pierwszy opisane w latach pięćdziesiątych zeszłego wieku (Luria i Human, 1952; Bertani i Weigle, 1953). Zaobserwowano, że namnażanie się bakteriofagów bywa w pewnym stopniu hamowane w zależności od rodzaju szczepu bakteryjnego podlegającego infekcji. Biochemiczne podłoże i enzymy odpowiedzialne za to zjawisko scharakteryzowali Arber i Dussoix (1962). W 1978 r. Werner Arber, Hamilton O. Smith i Daniel Nathans otrzymali Nagrodę Nobla w dziedzinie medycyna za odkrycie enzymów restrykcyjnych, które doprowadziło do rozkwitu technologii rekombinacji DNA. MTaza MTaza CH 3 CH 3 REaza REaza Chromosom prokariotyczny CH 3 REaza MTaza fragmenty zdegradowanego fagowego DNA CH 3 MTaza Ryc. 1.1 Zjawisko restrykcji-modyfikacji. W systemie RM wyróżnia się dwie aktywności enzymatyczne: endonukleolityczną (endonukleaza restrykcyjna, ang. restriction endonuclease, REaza) oraz modyfikującą (metylotransferaza DNA, metylaza DNA, ang. methyltransferase, MTaza), które rozpoznają w DNA tę samą, specyficzną sekwencję. MTaza modyfikuje określoną zasadę w sekwencji rozpoznawanej. Jeśli sekwencja docelowa nie jest zmetylowana, REaza przeprowadza cięcie endonukleolityczne DNA (Ryc. 1.1 i 1.2). Zmodyfikowany genomowy DNA, w komórce posiadającej system RM, nie jest substratem dla REazy z tego systemu. Natomiast obcy DNA (np. infekującego faga) zostaje rozpoznany przez REazę i strawiony. Mechanizm obronny komórek bakteryjnych przed obcym DNA np. bakteriofagowym jest główną postulowaną funkcją systemów RM (Arber i Dussoix, 1962). Według innej hipotezy są one samolubnymi elementami genetycznymi, których utrzymanie w genomie jest warunkiem przetrwania - rodzaj systemu trucizna-odtrutka (Kobayashi, 2001). Sugeruje się też ich udział w utrzymywaniu tożsamości gatunkowej bakterii (Jeltsch, 2003) oraz, to, że przez indukowanie rearanżacji genomowych przyczyniają się do zróżnicowania genetycznego (Arber, 2000). 3

4 5 G AATTC 3 3 CTTAA G 5 REaza MTaza CH 3 CH 3 Ryc. 1.2 Ta sama substratowa sekwencja w DNA dla endonukleazy restrykcyjnej i metylotransferazy DNA różne produkty reakcji przeprowadzanych przez te enzymy. Ze względu na różnorodność i mnogość przedstawicieli REaz oraz towarzyszących im MTaz, systemy RM zostały podzielone na cztery typy (Roberts i wsp., 2003; Tabela 1). Do Typu I zaliczono kompleksy białkowe złożone z trzech rodzajów podjednostek: rozpoznających specyficzną sekwencję (S), endonukleolitycznych (R) i modyfikacyjnych (M). Enzym do cięcia wymaga obecności ATP. Sekwencja rozpoznawana jest asymetryczna i składa się z dwóch krótkich odcinków zasad o określonej specyficzności, przedzielonych kilkoma niespecyficznymi parami nukleotydów (np. EcoKI AACN 6 GTGC). Systemy Typu II stanowi najliczniejszą grupę, składającą się najczęściej z dwóch oddzielnych białek: monomerycznej MTazy i dimerycznej ENazy. Sekwencja docelowa jest krótka (4 do 8 par zasad) i często palindromiczna. Systemy Typu III RM składając się z dwóch rodzajów podjednostek: modyfikacyjnej (Mod) i endonukleolitycznej (Res). Miejsce rozpoznawane przez te enzymy, o długości 5-6 par zasad, jest niepalindromiczne (do cięcia wymagane są jego dwie kopie), a także ATP. Natomiast do Typu IV zaliczono REazy, które trawią tylko zmetylowany DNA. Tabela 1. Najważniejsze charakterystyczne cechy różnych typów enzymów restrykcyjnych i metylaz DNA. Cecha Typ I Typ II Typ III Typ IV Podjednostki Trzy Dwie Dwie Dwie (lub jedna) strukturalne Aktywność enzymatyczna Kofaktory niezbędne do cięcia Kofaktory niezbędne do metylacji DNA Rozpoznawana sekwencja Miejsce cięcia Zdolność do translokacji DNA Endonukleaza Metylotransferaza ATPaza ATP AdoMet Mg 2+ ATP AdoMet Mg 2+ Endonukleaza Metylotransferaza Mg 2+ AdoMet Endonukleaza Metylotransferaza ATPaza ATP Mg 2+ Endonukleaza GTPaza GTP AdoMet Mg 2+ AdoMet Mg 2+ - Asymetryczna dwuczęściowa Zwykle symetryczna Asymetryczna Dwuczęściowa zmetylowana Losowe, co W obrębie, albo pz od W różnych najmniej 1000 pz tuż obok miejsca miejscach pomiędzy od sekwencji sekwencji rozpoznawanego zmodyfikowanymi rozpoznawanej rozpoznawanej zasadami Tak Nie Tak Tak 4

5 Typ I i III charakteryzuje brak ścisłej kontroli nad położeniem miejsca cięcia względem rozpoznawanej sekwencji. Natomiast enzymy Typu II przecinają DNA w sekwencji rozpoznawanej albo blisko niej. Wynikiem trawienia określonej sekwencji DNA jest powtarzalny zestaw fragmentów o przewidywanej długości. Właściwość ta spowodowała szerokie wykorzystanie enzymów restrykcyjnych Typu II jako narzędzi w manipulacjach DNA. Endonukleazy restrykcyjnye typu II Obecnie w bazie danych REBASE ( katalogującej enzymy restrykcyjne, metylotransferazy DNA i pokrewne białka, znajduje się ponad 3890 ENaz Typu II rozpoznających 305 rodzajów specyficznych sekwencji (dane z ). Komercyjnie dostępnych jest 241 różnych specyficzności REaz. Enzymy należące do tej grupy są najczęściej homodimerami lub tetramerami, wymagającymi tylko jonów Mg 2+ jako kofaktora. Nić DNA jest cięta wewnątrz krótkiej sekwencji rozpoznawanej lub w pewnej stałej odległości od niej. Mimo wspólnych cech, przedstawiciele tego typu są dość różnorodną grupą endonukleaz i dlatego wprowadzono podział na podtypy, uwzględniając przy tym budowę białek, rodzaj sekwencji docelowej, sposób cięcia DNA i inne cechy (Tabela 2). To samo białko może należeć do różnych podtypów, gdyż nie wykluczają się one wzajemnie (Roberts i wsp., 2003). Tabela 2. Podział enzymów restrykcyjnych Typu II na podtypy. Podtyp Opis Przykładowe enzymy A niepalindromiczna sekwencja rozpoznawana; często jeden gen koduje REazę a dwa geny kodują MTazy FokI, HphI B dwuniciowe cięcia po obu stronach sekwencji docelowej AloI, HaeIV C E obie domeny, endonukleolityczna i metylująca, w jednym polipeptydzie do cięcia potrzebne dwie kopie sekwencji docelowej, jedna cięta, druga działa jako efektor allosteryczny GsuI, HaeIV FokI, Sau3AI F interakcja z dwiema kopiami sekwencji rozpoznawanej i obie cięte BspMI, Cfr10I G obie domeny, endonukleolityczna i metylująca, w jednym polipeptydzie; AdoMet działa stymulująco na aktywność AloI, Eco57I H podobna struktura genów do Typu I AhdI, BcgI M sekwencja rozpoznawana cięta gdy zmetylowana BisI, DpnI P palindromiczna sekwencja rozpoznawana EcoRI, NgoPII S cięcie poza niepalindromiczną sekwencją rozpoznawaną FokI, Eco57MI T heterodimery Bpu10I, MlyI Nazewnictwo enzymów restrykcyjnych: stosowane są literowe skróty (np. HindIII, EcoRI). Pierwsza litera oznacza rodzaj bakterii, z której wyizolowano enzym, druga i trzecia - gatunek, a kolejna z nich pochodzi od szczepu lub typu bakterii. Następujące po niej cyfry rzymskie odpowiadają kolejnym enzymom wyizolowanym z określonego szczepu. HindIII - Haemophilus influenzae Rd Mph1103I - Moraxella phenylpyruvica RFL1103 Izoschizomery enzymy restrykcyjne izolowane z różnych bakterii rozpoznające tę samą sekwencję w DNA i wprowadzające identyczny typ cięcia. Przykład: HaeIII, BsuRI, BshFI, PhoI, BsnI - GG CC CC GG 5

6 Neoschizomery - restrykcyjne izolowane z różnych bakterii rozpoznające identyczną sekwencję w DNA, ale wprowadzające odmienny typ cięcia. Przykład: SmaI Cfr9I Acc65I KpnI CCC GGG C CCGGG G GTACC GGTAC C GGG CCC GGGCC C CCATG G C CATGG Jedna jednostka enzymu restrykcyjnego oznacza taką jego ilość, która katalizuje kompletną hydrolizę wiązań w markerowego DNA o masie 1 g w czasie 1 godziny i w temperaturze i warunkach właściwych dla danego enzymu. REazy pozostawiają w rozciętej cząsteczce DNA dwa rodzaje końców (Ryc. 1.3): tępe końce - obie nici rozcięte są naprzeciwko siebie - nukleotydy znajdujące się na końcach są sparowane z komplementarnymi nukleotydami na przeciwnej nici; 5 -GG CC-3 5 -GG 3 5 -CC-3 3 -CC GG-5 3 -CC 5 3 -GG-5 lepkie końce - 3` lub 5` - jednoniciowe odcinki występujące na obu końcach przeciętej niesymetrycznie cząsteczki (Rys. 3). HindIII A AGCTT TTCGA A Mph1103I ATGCA T T ACGTA 5 -A 3 5 -AGCTT-3 5 -ATGCA T-3 3 -TTCGA-5 3 -A-5 3 -T ACGTA 5 Ryc. 1.3 Enzym restrykcyjny HindIII generuje jednoniciowe wystające (lepkie) końce 5 a enzym Mph1103I jednoniciowe wystające (lepkie) końce 3. Rodzaj pozostawianych końców ma znaczenie przy manipulacjach przeprowadzanych przy klonowaniu: warunkuje połączenie końców zgodnych (kompatybilnych) wymusza konieczność przekształcenia lepkich końców w tępe, np. przez zastosowaniu polimerazy DNA Sekwencja palindromiczna sekwencja czytana w kierunku od 5 do 3 końca jest taka sama jak na nici komplementarnej. 5 - AAGCTT TTCGAA -5 Czynniki wpływające na aktywność enzymu restrykcyjnego 1. Bakterie, z których izolowane są enzymy restrykcyjne bytują w różnych, często ekstremalnych, środowiskach. Stąd wynikają różne preferencje warunków reakcji związane np. z temperaturą inkubacji. Inne elementy, które różnią bufory wykorzystywane do przeprowadzenia reakcji z danym enzymem to: siła jonowa (stężenie soli), główny kation (sód lub potas) i ph. Każdy enzym restrykcyjny wymaga obecności kofaktora Mg 2+! 2. Czasami w buforach do reakcji dostarczane są dodatkowe związki chemiczne, które wspomagają działanie niektórych enzymów restrykcyjnych - np. detergent (Triton-X-100 do 6

7 redukcji napięcia powierzchniowego), BSA (ang. bovine serum albumin, albumina z grasicy cielęcej) zwiększa ogólne stężenie białka. 3. Obecność zanieczyszczeń pozostałych po preparatyce izolacji DNA (EDTA, fenol, etanol, proteinazy itd.) może inaktywować enzym restrykcyjny. 4. W wyniku zastosowania nieodpowiednich warunków reakcji może pojawić się niespecyficzna aktywność enzymu - tzw. star activity. Czynniki sprzyjające: zbyt długi czas reakcji (zmiana stężenia buforu w wyniku odparowywania wody z mieszaniny reakcyjnej) nieoptymalna temperatura reakcji, zbyt wysokie stężenie enzymu, nieoptymalne stężenie soli, nieoptymalne ph, obecność w mieszaninie reakcyjnej jonów Mn 2+, zamiast Mg 2+ (jony Mg 2+ są niezbędne dla aktywności endonukleaz); obecność rozpuszczalników organicznych, zbyt wysokie stężenie glicerolu (enzymy przechowuje się w temp -20 C w 50% glicerolu jednak, aby enzym działał prawidłowo końcowe stężenie glicerolu nie powinno przekraczać 5%). Endonukleazy restrykcyjne są wrażliwe na obecność zmetylowanej zasady w obrębie sekwencji DNA przez nie rozpoznawanej, co wyraża się nie rozpoznaniem jako substratu sekwencji docelowej. Zmetylowane zasady występujące w DNA to: N6-metyloadenina, N6mA, m 6 A), N4-metylocytozyna (N4mC, m 4 C) i 5-metylocytozyna (5mC, m 5 C) (Ryc. 1.4) AdoMet adenina cytozyna N6-metyloadenina N4-metylocytozyna 5mC -metylocytozyna Ryc. 1.4 Zmetylowane zasady w DNA oraz kofaktor grup metylowych S-adenozylometionina (AdoMet). 7

8 Nieomal wszystkie szczepy Escherichia coli używane w laboratoriach zawierają, co najmniej dwie metylotransferazy DNA: Dam metylazę (M.Dam), która dodaje grupę metylową do adeniny w sekwencji GATC (produkt Gm 6 ATC) Dcm metylazę (M.Dcm), która modyfikuje wewnętrzną cytozynę w sekwencji CCWGG (W=A lub T) CC(A/T)GG do Cm 5 C(A/T)GG Praktyczną konsekwencją tego zjawiska jest fakt, że wiele endonukleaz nie będzie trawić DNA zmetylowanego przez w/w metylazy DNA. Poniżej kilka przykładów. Metylaza Dam E.coli, modyfikując w DNA adeninę w sekwencjach GATC, czyni je nie wrażliwymi na trawienie enzymem MboI, natomiast tak zmetylowany DNA pozostanie wciąż substratem dla enzymu Sau3AI. Metylaza Dcm E.coli, modyfikując w DNA drugą cytozynę w sekwencjach CCWGG, czyni je nie wrażliwymi na trawienie enzymem EcoRII, natomiast tak zmetylowany DNA pozostanie wciąż substratem dla enzymu MvaI. Miejsca rozpoznawane przez niektóre enzymy mogą zawierać się lub pokrywać się częściowo z sekwencją GATC np TCGA (TaqI), ATCGA (ClaI). Gdy sekwencje te zostaną zmetylowane przez M.Dam, staną się niewrażliwe na trawienie w/w enzymami. Podobna sytuacja ma miejsce w przypadku nakładania się sekwencji docelowej danego enzymu z sekwencją CCWGG modyfikowaną przez M.Dcm np AGGCCT (StuI); TGGCCA (MscI). Gdy sekwencje te zostaną zmetylowane przez M.Dcm, staną się niewrażliwe na trawienie w/w enzymami. nntgatcann nnactagtnn nntcgatcnn nnagctagnn nnatcgatcnn nntagctagnn nnaggcctggnn nntccggaccnn nntggccaggnn nnaccggtccnn Jeśli (nieoczekiwanie) DNA nie został pocięty przez użyty przez Ciebie enzym restrykcyjny lub trawienie jest tylko częściowe, sprawdź, czy ten enzym nie jest wrażliwy na metylację! 8

9 Inaktywacja enzymów restrykcyjnych po reakcji enzymatycznej Nieodwracalna: inaktywacja termiczna (zwykle w temperaturze 65 C lub 80 C); denaturacja białek poprzez dodanie mieszaniny fenol:chloroform lub każdego z nich oddzielnie (po odbiałczeniu preparatu należy poddać go precypitacji); denaturacja białek poprzez dodanie HCl Odwracalna: dodanie EDTA do stężenia końcowego 12,5 mm (następuje wymiareczkowanie jonów Mg 2+ ) Połączenie fragmentów DNA w reakcja ligacji Ligacja jest przeprowadzana przez enzymy ligazy, które łączą dwa fragmenty DNA poprzez wytworzenie wiązania kowalencyjnego - fosfodiestrowego między końcem hydroksylowym 3' jednego nukleotydu a końcem 5' z grupą fosforanową drugiego nukleotydu przy wykorzystaniu energii z hydrolizy ATP (adenozynotrifosforanu). np ligaza faga T4 lub NAD + np ligaza E.coli. Dezaktywację ligazy przeprowadza się w temperaturze 65 o C przez 20 minut. Analiza zrekombinowaneo DNA - elektroforeza Elektroforeza jest techniką, w której wymusza się ruch cząsteczek za pomocą pola elektrycznego. W przypadku DNA służy do identyfikacji, rozdziału i izolacji. Cząsteczki kwasów nukleinowych posiadają ładunek negatywny wynikający z ich szkieletu fosforanowego i migrują w kierunku anody (+). Agaroza - polisacharyd będący polimerem pochodnych galaktozy otrzymywany z glonów. Agaroza zawieszona w wodzie w temperaturze pokojowej tworzy koloid - żel. Służy do rozdziału nawet bardzo dużych cząsteczek, ale posiada relatywnie małą rozdzielczość. Typowe stężenia do rozdziału DNA to 0,5-2%. W standardowych warunkach poprzez użycie różnych stężeń agarozy mogą być rozdzielone fragmenty DNA między 50 a pz (Tabela 3). Tabela 3. Zależność pomiędzy stężeniem żelu agarozowego a zakresem długości rozdzielanego liniowego DNA. Stężenie agarozy (%) Zakres długości rozdzielanego liniowego DNA (kpz) 0, , ,7 0,8-10 0,9 0,5-7 1,2 0,4-6 1,5 0,2-3 2,0 0,1-2 Elektroforeza w żelach agarozowych prowadzona jest w aparatach ustawionych poziomo, a rozdział elektroforetyczny prowadzony jest w buforze: TBE 1 (90 mm Tris-base, 90 mm kwas borowy, 2 mm EDTA, ph 8) lub TAE 1 (40 mm Tris-base, 40 mm lodowy kwas octowy, 1 mm EDTA, ph 8. Akryloamid - polimer z grupy poliakrylanów otrzymywany przez polimeryzację akryloamidu. Ma niską zdolność rozdziału (fragmenty DNA do ok. 500 pz), ale bardzo wysoką rozdzielczość. Do uwidaczniania DNA po lub w trakcie elektroforezy stosowany jest rutynowo bromek etydyny (EtBr), który interkaluje pomiędzy sąsiednie pary dwuniciowego DNA (powinowactwo EtBr do jednoniciowego DNA jest znacznie słabsze). Obecność związku interkalującego w żelu agarozowym zmniejsza ruchliwość elektroforetyczną DNA o około 15%. EtBr to bardzo silny 9

10 mutagen prawdopodobnie także karcynogen i teratogen! Dzięki właściwościom fluorescencyjnym EtBr możliwa jest wizualizacja DNA w świetle UV (300 nm). Innym odczynnikiem stosowanym do wizualizacji DNA jest np. SYBR Green, którego czułość jest 25 większa niż EtBr. Z reguły nakładając próbkę DNA na żel agarozowy mieszamy ją uprzednio z tzw. barwnikiem do nakładania na żel, lub krótko barwnikiem (ang. loading dye). Przyczyn jego użycia jest kilka: próbka DNA, która ma kolor jest wygodna w nakładaniu (łatwość wizualizacji), glicerol (lub sacharoza, ficoll 400) będący składnikiem tego barwnika zwiększa gęstość próbki i zapewnia, że znajdzie się ona na dnie dołka, negatywnie naładowany barwnik migruje przez żel w tym samym kierunku co DNA i stąd ułatwia śledzenie postępu rozdziału elektroforetycznego (Tabela 4). Najpopularniejsze barwniki: błękit bromofenolowy (ang. bromophenol blue) cyjanian ksylenu (ang. xylene cyanol) orange G Różnią się kolorem, tempem migracji w danym żelu (stężenie agarozy, rodzaj buforu). Tabela 4. Przykładowe tempo migracji w żelu z buforem1 TAE. Stężenie agarozy % Xylene cyanol Bromophenol blue 0, , , , , , Literatura: Arber W. Genetic variation: molecular mechanisms and impact on microbial evolution. FEMS Microbiol Rev :1-7 Arber W, Dussoix D. Host specificity of DNA produced by Escherichia coli. I. Host controlled modification of bacteriophage lambda. J Mol Biol :18-36 Bertani G, Weigle JJ. Host controlled variation in bacterial viruses. J Bacteriol : Ishikawa, K., Fukuda, E., Kobayashi, I. Conflicts targeting epigenetic systems and their resolution by cell death: novel concepts for methyl-specific and other restriction systems DNA Res. 17: Jeltsch A. Maintenance of species identity and controlling speciation of bacteria: a new function for restriction/modification systems? Gene :3-6 Luria SE, Human ML. A nonhereditary, host-induced variation of bacterial viruses. J Bacteriol : Kobayashi I.Behavior of restriction-modification systems as selfish mobile elements and their impact on genome evolution. Nucleic Acids Res : Orlowski, J., Bujnicki, J.M. Structural and evolutionary classification of Type II restriction enzymes based on theoretical and experimental analyses Nucleic Acids Res. 36: Roberts RJ et. al. A nomenclature for restriction enzymes, DNA methyltransferases, homing endonucleases and their genes. Nucleic Acids Res :

11 Część eksperymentalna Materiały: DNA faga (stężenie 0,3 g/ l) enzymy restrykcyjne HindIII (10 U/ l), Mph1103I (10 U/ l) bufor do trawienia enzymami restrykcyjnymi (10 stężony): 10 mm TrisCl (ph 8,5 w 37 C), 10 mm MgCl 2, 100 mm KCl, 0,1mg/ml BSA bufor TBE (10 stężony): 1M Tris, 0,9 M kwas borowy, 0,01 M EDTA bufor do nakładania na żel (6 stężony): 15% glicerol, 0,25% błękit bromofenolowy, 0,25% xylene cyanol FF bromek etydyny 10 mg/ml ATP 10 mm. Wykonanie: Mapę restrykcyjną faga z zaznaczonymi pozycjami miejsc dla enzymów Mph1103I oraz HindIII prezentuje Ryc Kolejne etapy prowadzonego eksperymentu zostały przedstawione w formie schematu (Ryc. 1.6). 1. Nastawienie trawienia DNA faga enzymem HindIII Wykonanie: zmieszać 12,5 l mieszaniny H (zawiera bufor i enzym HindIII) z 12,5 l mieszaniny 1 (zawiera DNA faga ). Inkubacja w temperaturze 37 C, 10 min. Skład mieszaniny reakcyjnej (trawienie enzymem HindIII): 2,5 l buforu do trawienia 2,5 l (0,9 g) DNA faga 19,5 l H 2 O 0,5 l enzymu restrykcyjnego HindIII 2. Nastawienie trawienia DNA faga enzymem Mph1103I Wykonanie: zmieszać 5 l mieszaniny M (zawiera bufor i enzym Mph1103I) z 5 l mieszaniny 2 (zawiera DNA faga ). Inkubacja w temperaturze 37 C, 40 min. Skład mieszaniny reakcyjnej (trawienie enzymem Mph1103I): 1 l buforu do trawienia 0,5 l (0,15 g) DNA faga 8,3 l H 2 O 0,2 l enzymu restrykcyjnego Mph1103I 3. Inaktywacja termiczna enzymu restrykcyjnego HindIII Inkubacja próbki w temperaturze 65 C, 20 min. 4. Przygotowanie reakcji ligacji pobrać 20 l pociętego enzymem HindIII DNA faga (4/5 reakcji trawienia z pkt.1) dodać 10 l mieszaniny ligacyjnej Reakcję inkubować w temperaturze pokojowej 15 min. Skład mieszaniny ligacyjnej: bufor do trawienia 1 l, 10 mm ATP - 1 l, H 2 O 7,7 l, ligaza 0,3 l. 11

12 5. Inaktywacja termiczna ligazy Inkubacja próbek w temperaturze 65 C, 20 min. 6. Trawienie mieszaniny ligacyjnej (z pkt. 4) enzymem restrykcyjnym HindIII i Mph1103I (oddzielnie). Wykonanie: zmieszać 10 l reakcji ligacji z pk.4 z 5 l mieszaniny z enzymem HindIII zmieszać 10 l reakcji ligacji z pk.4 z 5 l mieszaniny z enzymem Mph1103I Inkubacja próbek w temperaturze 37 o C, 10 min. Skład mieszaniny reakcyjnej: 10 l reakcji ligacji 0,5 l buforu do trawienia 4,2 l H 2 O 0,3 l enzymu restrykcyjnego HindIII lub Mph1103I 7. Elektroforeza DNA w żelu agarozowym przygotowanie żelu agarozowego (0,7% w buforze 1 TBE) przygotowanie próbek DNA do naniesienia na żel (pobrać 10 l mieszaniny reakcyjnej i dodać 2 l barwnika; nanieść na żel) rozwijać elektroforezę przez 1 h, a następnie barwić żel w roztworze bromku etydyny wizualizacja żelu w świetle UV (dł. fal 300 nm) Próbki na żel: N.C = Nie trawiony DNA faga L = Próbka z ligacją (zligowane fragmenty DNA faga po cięciu enzymem HindIII) LH = HindIII lig = Próbka z ligacją strawiona enzymem HindIII H = HindIII = Próbka strawionego DNA faga enzymem HindIII (z pkt. 1) M = Mph1103I = Próbka strawionego DNA faga enzymem Mph1103I (z pkt. 1) LM = Mph1103I lig = Próbka z ligacją strawiona enzymem Mph1103I Ryc. 1.5 Mapa restrykcyjna faga z zaznaczonymi pozycjami miejsc dla enzymów Mph1103I oraz HindIII. 12

13 Trawienie DNA enzymem HindIII 25 μl Trawienie enzymem Mph1103I 10 μl M Dezaktywacja termiczna 65 o C 20 min 5μl zachować H 10 μl zachować L 20 μl +10 μl Ligacja =30 μl 20 μl Dezaktywacja termiczna 65 o C 20 min nc L H LH m M LM 10 μl +5 μl HindIII LH 10 μl +5 μl Mph1103 LM Próbki DNA na żel Ryc. 1.6 Schemat doświadczeń przeprowadzanych w trakcie ćwiczenia 1. m - marker wielkości; nc - nie cięty DNA faga ; L produkty ligacji fragmentów DNA po cięciu HindIII; H - DNA faga strawiony enzymem HindIII; LH - produkty ligacji fragmentów DNA (po cięciu HindIII) strawione enzymem HindIII; M - DNA faga strawiony enzymem Mph1103I; LM - produkty ligacji fragmentów DNA (po cięciu HindIII) strawione enzymem Mph1103I. 13

14 N.C L. HindIII NdeI BamHI Eco130I BglII MphI1103I H LigH M Lig Lig Lig Lig Lig Ryc. 1.7 Obraz rozdziału DNA w żelu agarozowym 0,7%. N.C nie cięty DNA faga ; L produkty ligacji fragmentów DNA po cięciu HindIII; - DNA faga strawiony określonym enzymem (nazwa użytego enzymu znajduje się nad symbolem ); Lig - produkty ligacji fragmentów DNA po cięciu HindIII (patrz tor L), które strawiono określonym enzymem (nazwa użytego enzymu znajduje się nad symbolem ). Zwróć uwagę, że wzór restrykcyjny zrekombinowanego DNA faga (tory L) jest inny niż wzór restrykcyjny natywnych cząsteczek DNA faga. (tory ). Wyjątkiem jest trawienie enzymem HindIII (tor LigH), który wygenerował substratowe fragmenty restrykcyjne do ligacji (tor H). M marker wielkości 14

15 Przygotowanie do Ćwiczenia 2 1. Nastawienie trawienie DNA wektora puc19 Wykonanie: zmieszać 10 l mieszaniny HindIII_pUC (zawiera bufor i enzym HindIII) z 10 l mieszaniny puc (zawiera DNA wektora puc19). Inkubacja w temperaturze 37 C, 60 min. Skład mieszaniny reakcyjnej (objętość końcowa 20 l): 2 l buforu 1 l DNA puc19 (stężenie 50 ng/ l) 0,2 l enzymu HindIII 16,8 l H 2 O 2. Nastawienie trawienia DNA bakteriofaga Wykonanie: zmieszać 10 l mieszaniny HindIII_ (zawiera bufor i enzym HindIII) z 10 l mieszaniny (zawiera DNA faga ). Inkubacja w temperaturze 37 C, 60 min. Skład mieszaniny reakcyjnej (objętość końcowa 20 l): 1 l buforu 2 l DNA faga (stężenie 0,3 g/ l) 0,3 l enzymu HindIII 16,8 l H 2 O 15

16 ĆWICZENIE 2 Enzymy służące do modyfikacji DNA Część teoretyczna Obecnie stosuje się wiele różnorodnych, komercyjnie dostępnych enzymów służących do modyfikacji i rekombinacji DNA. Są to m.in.: enzymy restrykcyjne (ćwiczenie 1), alkaliczna fosfataza (AP, ang. alkaline phosphatase), kinaza polinukleotydowa, ligaza DNA, polimeraza DNA I, fragment Klenowa, nukleaza S1, odwrotna transkryptaza, terminalna transferaza, RNaza, DNaza, egzonukleazy (I, III), endonukleazy (IV, V), polimeraza DNA (Taq, Pfu), topoizomeraza. Alkaliczna fosfataza (EC ) jest hydrolitycznym enzymem odpowiedzialnym za usuwanie reszt 5 fosforanowych z DNA, RNA oraz nukleotydów. Wszystkie alkaliczne fosfatazy są metaloenzymami (Zn(II)). Proces usuwania grup fosforanowych nazywany jest defosforylacją i przebiega z wytworzeniem produktu pośredniego zawierającego ufosforylowaną serynę. Enzym ten wykazuje najwyższą aktywność w środowisku alkalicznym stąd jego nazwa. Możemy wyróżnić kilka rodzajów alkalicznej fosfatazy, pochodzących z różnych źródeł, które odróżnia między innymi możliwość inaktywacji: bakteryjna alkaliczna fosfataza (BAP bacterial alkaline phosphatase) wykazuje najwyższą aktywność i jest najbardziej trwała (najtrudniej ją inaktywować po zakończeniu reakcji defosforylacji). BAP jest wydzielana w postaci monomeru (M r = 47 kda) do przestrzeni peryplazmatycznej Escherichia coli, gdzie dimeryzuje i staje się katalitycznie aktywna. W obojętnym lub alkalicznym ph, dimer BAP zawiera do 6 jonów Zn 2+, z których dwa są niezbędne dla aktywności enzymu. Tylko jedno z dwóch miejsc katalitycznych dimeru jest aktywne przy niskim stężeniu sztucznego substratu, podczas gdy oba stają się aktywne przy wysokim stężeniu. alkaliczna fosfataza z jelita cielęcego (CIAP - calf intestinal alkaline phosphatase) najczęściej używana w laboratoriach biologii molekularnej. Wykazuje niewiele niższą aktywność w stosunku do BAP, a można ją efektywnie inaktywować termicznie lub poprzez trawienie proteolityczne. CIAP jest glikoproteiną zbudowaną z dwóch 514- aminokwasowych monomerów. Aktywność enzymu zależy od stężenia jonów Mg 2+ i Zn 2+. Zn 2+ wiąże się w centrum katalitycznym i jest wymagany do aktywności katalitycznej. Mg 2+ wiąże się do różnych miejsc enzymu i jest allosterycznym aktywatorem. alkaliczna fosfataza z krewetek (SAP - shrimp alkaline phosphatase) izolowana z krewetek Pandalus borealis, jest stosunkowo łatwa do inaktywacji termicznej. Przy manipulacjach DNA alkaliczna fosfataza używana jest głównie do: usuwania grupy 5 fosforanowej z plazmidów i wektorów bakteriofagowych, które uprzednio zostały strawione enzymami restrykcyjnymi (Ryc. 2.1). Zapobiega to ponownej cyrkularyzacji wektora, a tym samym wydajność klonowania jest większa (Ryc. 2.2). usuwania grupy 5 fosforanowej z fragmentów DNA poprzedzającego radioaktywne znakowanie 32 P (przygotowanie DNA do radioaktywnego znakowania w reakcji z wykorzystaniem polinukleotydowej kinazy faga T4) (Ryc. 2.1). usuwania grupy 5 fosforanowej z RNA, rntps i dntps. jako enzym reporterowy w nieradioaktywnych systemach do wykrywania i lokalizacji kwasów nukleinowych i białek. AP jest skoniugowana z ligandem, który specyficznie oddziałuje z cząsteczką docelową. 16

17 (A) (B) (C) alkaliczna fosfataza 5 p DNA lub 5 p RNA 5 OH DNA lub 5 OH RNA Ryc. 2.1 Usuwanie grupy 5 fosforanowej DNA/RNA. (A) struktura nukleotydu, zaznaczono usuwaną grupę fosforanową; (B) i (C) reakcja defosforylacji. wektor nie poddany działaniu alkalicznej fosfatazy może ulegać ponownej cyrkularyzacji, co prowadzi do otrzymania dużej ilości pustych wektorów defosforylowany wektor nie może ulec cyrkularyzacji, bez insertu 3 OH 5 P 3 OH 3 OH 5 P 3 OH Ryc. 2.2 Schemat klonowania insertu (powstałego po trawieniu enzymem restrykcyjnym) do defosforylowanego wektora. 17

18 Kinaza polinukleotydowa bakteriofaga T4 (T4 PNK) katalizuje przeniesienie -fosforanu z ATP (Ryc. 4.3) na (patrz struktura nukleotydu po defosforylacji) koniec 5 OH jedno- lub dwuniciowego DNA, RNA lub oligonukleotydów. Ryc. 2.3 Struktura ATP (ang. adenosine triphosphate) i ADP (ang. adenosine diphosphate). Aktywność T4 PNK wykorzystywana jest głównie w dwóch typach reakcji: reakcji podstawienia (ang. forward reaction) i reakcji wymiany (ang. exchange reaction) (Ryc. 2.4). W reakcji podstawienia -fosforan przenoszony jest z ATP na DNA/RNA. Docelowy nukleotyd nie posiada reszty fosforanowej na końcu 5 (została ona usunięta w reakcji defosforylacji lub w takiej postaci została zsyntetyzowana chemicznie). Reakcja ta jest odwracalna. W reakcji wymiany, nadmiar ADP powoduje, że T4 PNK najpierw przenosi 5 -fosforan z ufosforylowanego DNA, a następnie DNA jest ponownie fosforylowany przez przeniesienie - fosforanu z ATP (np. [ - 32 P]ATP). W reakcji katalizowanej przez T4 PNK stężenie ATP powinno wynosić 1 M (reakcja podstawienia) lub 2 M (reakcja wymiany). Ponadto enzym posiada aktywność 3 fosfatazy. Ryc. 2.4 Aktywność enzymatyczna T4 PNK. Oczyszczenie kinazy polinukleotydowej bakteriofaga T4 z zainfekowanych komórek gospodarza jest niewydajne i trudne, dlatego też źródłem T4 PNK są komórki Escherichia coli z wklonowanym genem pset bakteriofaga T4. T4 PNK jest homotetramerem zbudowanym z podjednostek o masie 28,9 kda każda. T4 PNK jest głównie wykorzystywana do: radioaktywnego znakowania na końcu 5 kwasów nukleinowych (reakcja podstawienia lub wymiany), które następnie wykorzystywane są: (i) jako sonda hybrydyzacji; (ii) do mapowania transkryptu; (iii) jako markery do elektroforezy żelowej; (iv) jako startery w reakcji sekwencjonowania DNA; (v) jako startery do reakcji PCR lub w innych metodach wymagających terminalnie wyznakowanego DNA. 5'-fosforylacji oligonukleotydowych łączników i DNA/RNA przed ligacją. 18

19 Termostabilne polimerazy DNA przeprowadzają zależną od matrycy syntezę DNA w kierunku 5 3 (Ryc. 2.5). Proces ten polega na dodawaniu deoksyrybonukleotydów do końca 3 nowosyntetyzowanej nici. Do rozpoczęcia reakcji wymagany jest starter z wolną grupą 3 -OH oraz jony Mg 2+. Maksymalną aktywność katalityczną enzymy te wykazują w temperaturze C. W temp. 37 C osiągają jedynie około 10% aktywności maksymalnej. 5 DNA OH termostabilna polimeraza DNA 5 DNA ( p dn) n + npp i Mg 2+ datp, dttp, dgtp, dctp Ryc. 2.5 Reakcja katalizowana przez termostabilną polimerazę DNA. Tabela 5. Właściwości wybranych termostabilnych polimeraz DNA* (wg Sambrook, J. i Russell, D.; 2001). Enzym Organizm Optymalna temperatura ( C) Aktywność egzonukleolityczna Częstość błędów 10-6 Stabilność Inne uwagi Taq Thermus aquaticus min w 97,5 C produkt PCR posiada na końcu 3 da** 94 kda monomer Pwo Pyrococcus woesei ,2 > 120 min w 100 C Pfu Pyrococcus furiosus ,6 240 min w 95 C produkt PCR posiada tępe końce 90 kda monomer *poszczególne wartości mogą odbiegać od podanych w tabeli i różnić się w zależności od producenta **polimeraza DNA Taq wykazuje aktywność transferazy nukleotydowej, ale nie ma aktywności proofreading (egzonukleolitycznej 3 5 ), co powoduje dodanie dodatkowej reszt/y adeninowych na końcu 3 produktu PCR Dostępne są również mieszaniny kilku termostabilnych polimeraz DNA np. High Fidelity PCR Enzyme Mix czy Long PCR Enzyme Mix. Umożliwiają one amplifikację fragmentów DNA o wielkości: (i) do 47 kpz z wirusowym DNA jako matrycą lub (ii) do 21 kpz z genomowym DNA jako matrycą. Zastosowanie termostabilnych polimeraz DNA: amplifikacja fragmentów DNA w reakcji PCR; znakowanie DNA; sekwencjonowanie DNA; wbudowywanie zmodyfikowanych nukleotydów (np. nukleotydów znakowanych biotyną, digoksygeniną lub fluorescencyjnie); mutageneza specyficzna wobec miejsca; 19

20 Polimeraza DNA I (holoenzym) (PolI, polimeraza Kornberga) syntetyzowana przez E. coli zbudowana jest z pojedynczego łańcucha polipeptydowego o masie cząsteczkowej 109 kda, kodowanego przez gen pola. Enzym ten posiada następujące aktywności: (i) polimerazy DNA 5 3 ; (ii) egzonukleazy 3 5 ; (iii) egzonukleazy 5 3 oraz (iv) RNazy H. Aktywność RNazy H nie jest powszechnie wykorzystywana w biologii molekularnej. Poszczególne aktywności katalizowane są przez odrębne domeny enzymu (Tabela 6). Tabela 6. Domeny polimerazy DNA I kodowanej przez Escherichia coli. Domena Aktywność Karboksylowa, aminokwasy , ~46 kda Centralna, aminokwasy , ~22 kda* Aminowa, aminokwasy 1-325* *karboksylowa i centralna domena stanowią fragment Klenowa polimeryzacyjna 5 3 egzonukleolityczna 3 5 egzonukleolityczna 5 3 Fragment Klenowa jest dużym fragmentem polimerazy DNA I kodowanej przez E. coli. Posiada aktywność polimeryzacyjną 5 3 oraz aktywność egzonukleolityczną 3 5 (aktywność naprawcza). W porównaniu z PolI nie posiada aktywności egzonukleolitycznej 5 3. Do przeprowadzenia syntezy DNA w kierunku 5 3 wymagana jest obecność jednoniciowej matrycy oraz startera. Niezbędnym kofaktorem reakcji katalizowanych przez enzym są jony Mg 2+. Fragment Klenowa jest monomerem o wielkości 76 kda. Enzym ten można otrzymać poprzez proteolizę polimerazy Kornberga subtylizyną lub też poprzez sklonowanie odpowiedniego fragmentu genu pola w komórkach E. coli. Fragment Klenowa jest wykorzystywany w biologii molekularnej m.in. do: wypełniania lepkich końców 5 (Ryc. 2.6), powstałych po trawieniu enzymami restrykcyjnymi pozostawiającymi tego typu końce. Enzym ten katalizuje w sposób zależny od matrycy dodawanie trifosforanów nukleotydów do cofniętej reszty hydroksylowej 3. Synteza zachodzi w kierunku 5 3 do momentu, aż wystający lepki koniec zostanie całkowicie wypełniony. 5...GTCCA 3 OH fragment Klenowa 5...GTCCAAGCT 3 OH 3...CAGGTTCGA p CAGGTTCGA p 5 datp, dttp, dgtp, dctp Mg 2+ Ryc. 2.6 Wypełnianie wystających lepkich końców 5 przez fragment Klenowa. wytępiania lepkich końców 3, które powstały po trawieniu enzymami restrykcyjnymi zostawiającymi wystające końce 3. Jednak wytępianie lepkich końców 3 jest wydajniej katalizowane przez polimerazę DNA faga T4, która ma większą aktywność egzonukleolityczną. W niektórych przypadkach aktywność egzonukleolityczna 3 5 fragmentu Klenowa jest niepotrzebna lub szkodliwa. Należy wtedy zastosować fragment Klenowa exo -. Enzym ten zachowuje aktywność polimeryzacyjną, nie posiada natomiast aktywności egzonukleolitycznej 3 5. Fragment Klenowa exo - uzyskuje się poprzez wprowadzenie odpowiedniej mutacji w genie kodującym fragment Klenowa. 20

21 Polimeraza DNA bakteriofaga T4 jest białkiem o wielkości 114 kda kodowanym przez gen 43 colifaga T4. Otrzymywany jest z komórek E. coli niosących plazmid zawierających gen 43. Enzym ten posiada aktywności zbliżone do aktywności fragmentu Klenowa, tj. aktywność polimeryzacyjną 5 3 oraz aktywność egzonukleolityczną 3 5. Nie posiada aktywności egzonukleolitycznej 5 3. Polimeraza DNA bakteriofaga T4 jest wykorzystywana w biologii molekularnej m.in do: wytępiania lepkich końców 3, które powstały po trawieniu enzymami restrykcyjnymi zostawiającymi wystające końce 3 (Ryc. 2.7). Aktywność egzonukleolityczna w stosunku do dwuniciowego DNA blokowana jest przez aktywność polimeryzacyjną 5 3. polimeraza DNA 5... p C p G p C p A p T p C p T 3 bakteriofaga T4... p C p G p C OH G p C p G p 5... G p C p G p 5 Mg 2+ + pa + 5 pc + 5 pt Ryc. 2.7 Wytępianie lepkich końców 3 przez polimerazę DNA bakteriofaga T4. wypełniania lepkich końców 5. Aktywność polimeryzacyjna 5 3 wymaga obecności matrycy, startera, jonów Mg 2+ oraz dntp. Aktywność egzonukleolityczną 3 5 polimerazy DNA bakteriofaga T4 jest ok. 200 razy silniejsza niż fragmentu Klenowa. Powoduje to, że enzym ten jest wydajniejszy w wytępianiu lepkich końców 3. Literatura: Sambrook,J. and Russell,D. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York 21

22 Część eksperymentalna Materiały: DNA faga trawiony enzymem restrykcyjnym HindIII plazmid puc19 trawiony enzymem restrykcyjnym HindIII enzymy: CIAP (calf intestine alkaline phosphatase), ligaza DNA faga T4, Fragment Klenowa bufor do trawienia R 1 stężony (10 mm Tris-HCl ph 8,5; 10 mm MgCl 2 ; 100 mm KCl; 0,1 mg/ml BSA) ATP 10 mm 2 mm dntp Mix Wykonanie: Część I Defosforylacja wektora plazmidowego strawionego enzymem restrykcyjnym 1. Usuwanie reszt fosforanowych z DNA wektora Próbkę puc19 strawionego HindIII podzielić na cztery części. Jedną część poddać działaniu alkalicznej fosfatazy mieszając ze sobą: 2 l DNA puc19/hindiii 8 µl mieszaniny reakcyjnej (bufor do trawienia R 0,8 l, alkaliczna fosfataza (CIAP) 0,5 l, H 2 O 6,7 l) Inkubować w temperaturze 37 C, 30 min. Pozostałą cześć próbki puc19/hindiii zostawić w temperaturze 4 C. 2. Termiczna inaktywacja alkalicznej fosfatazy Próbkę z pkt. 1 inkubować 15 min w temperaturze 85 C. 3. Ligacja Przygotować równolegle dwie mieszaniny ligacyjne (Tabela 7) Tabela 7. Przygotowanie mieszanin ligacyjnych nr 1 i nr 2 w trakcie ćwiczenia 2. Składnik Mieszanina ligacyjna nr 1 (wektor poddany działaniu CIAP) Mieszanina ligacyjna nr 2 (wektor NIE poddany działaniu CIAP) wektor 10 µl 2 µl (puc19/hindiii) wstawka ( /HindIII) 4 µl 4 µl mieszanina reakcyjna mieszanina reakcyjna nr 1 (6 l) mieszanina reakcyjna nr 2 (14 l) mieszanina reakcyjna nr 1: bufor do trawienia R (0,6 l), ATP (1 l końcowe stężenie 0,5 mm), ligaza DNA faga T4 (0,6 l), H 2 O (3,8 l) mieszanina reakcyjna nr 2: bufor do trawienia R (1,4 l), ATP (1 l końcowe stężenie 0,5 mm), ligaza DNA faga T4 (0,6 l), H 2 O (11 l) Mieszaniny ligacyjne inkubować w temperaturze pokojowej 1-16 h. 22

23 Część II Wytępianie wektora strawionego enzymem pozostawiającym lepkie końce 5 1. Wytępianie wektora Próbkę puc19 strawionego HindIII poddać działaniu Fragmentu Klenowa mieszając ze sobą: 2 l DNA puc19/hindiii 8 µl mieszaniny reakcyjnej (bufor do trawienia R 0,8 l, Fragment Klenowa 0,2 l (2 u), 0,25 l dntp Mix (stężenie końcowe 0,05 mm), H 2 O 6,75 l) Inkubować w temperaturze 37 C, 15 min. 2. Termiczna inaktywacja Fragmentu Klenowa Próbkę z pkt. 1 inkubować 15 min w temperaturze 75 C. 3. Ligacja Przygotować równolegle dwie mieszaniny ligacyjne (Tabela 8) Tabela 8. Przygotowanie mieszanin ligacyjnych nr 3 i nr 4 w trakcie ćwiczenia 2. Składnik Mieszanina ligacyjna nr 3 (wektor poddany działaniu Fragmentu Klenowa) Mieszanina ligacyjna nr 4 (wektor NIE poddany działaniu Fragmentu Klenowa) wektor (puc19/hindiii) 10 µl 2 µl mieszanina reakcyjna mieszanina reakcyjna nr 3 (10 l) mieszanina reakcyjna nr 4 (18 l) mieszanina reakcyjna nr 3: bufor do trawienia R (1 l), ATP (1 l końcowe stężenie 0,5 mm), ligaza DNA faga T4 (0,6 l), H 2 O (7,4 l) mieszanina reakcyjna nr 4: bufor do trawienia R (1,8 l), ATP (1 l końcowe stężenie 0,5 mm), ligaza DNA faga T4 (0,6 l), H 2 O (14,6 l) Mieszaniny ligacyjne inkubować w temperaturze pokojowej 1-16 h. 23

24 Część teoretyczna ĆWICZENIE 3 Transformacja kompetentych komórek Escherichia coli Transformacja komórek bakteryjnych Transformacja komórek bakteryjnych, obok koniugacji i transdukcji, jest jednym z mechanizmów horyzontalnego transferu genów. Transformacja bakterii polega na pobraniu wolnego egzogennego DNA ze środowiska. Dalszym etapem jest ustabilizowanie pobranego DNA w komórce (w formie plazmidu lub poprzez rekombinację z chromosomem) oraz zmiana w genotypie biorcy. Zdolność komórek bakteryjnych do pobierania DNA w procesie transformacji nazywana jest stanem kompetencji. Niektóre gatunki bakterii są naturalnie/spontanicznie zdolne do pobrania DNA ze środowiska. Większość tych bakterii wchodzi w stan kompetencji w określonych (najczęściej nieprzychylnych) warunkach wzrostu, np. kompetencję komórek wzmaga wysoki poziom camp. Bacillus subtilis czy Haemophilus influenzae są bakteriami fakultatywnie kompetentnymi. Tylko Neisseria gonorrhoeae jest bakterią konstytutywnie (zawsze) kompetentną. U niektórych bakterii warunkiem zajścia transformacji jest obecność sygnałowych sekwencji pobierania (ang. uptake-signal sequences) w substratowym DNA i/lub obecność receptorów na powierzchni komórki. Gęstość populacji bakteryjnej przez wyczuwanie liczebności (ang. Quorum sensing) wpływa na stan kompetencji bakterii. U Streptococcus pneumoniae kompetencja jest związana z procesem transbłonowego transportu wapnia. Wiele bakterii w naturalnych warunkach nie ulega transformacji. Stan kompetencji może zostać wywołany w laboratorium poprzez działania czynników chemicznych lub fizycznych w niskiej temperaturze. Metody te są szeroko wykorzystywane w inżynierii genetycznej, np. do klonowania genów. W ten sposób transformowana jest E. coli. Uzyskanie stanu kompetencji ma miejsce dzięki płukaniu komórek buforami zawierającymi dwuwartościowe kationy (np. Ca 2+, Mn 2+, Rb 2+ ), które destabilizują błonę komórkową (mechanizm nie jest dobrze poznany). Kluczowy jest stan fizjologiczny komórek bakteryjnych. Komórki muszą być młode w wykładniczej fazie wzrostu. Komórek w fazie stacjonarnej NIE da się wydajnie wprowadzić w stan kompetencji! Wejście DNA do komórek, bezpośrednio z otaczającego je roztworu, ma miejsce dzięki szokowi termicznemu. Wprowadzany DNA jest w formie dwuniciowego i koliście zamkniętego plazmidu (zrekombinowanego plazmidu). Liniowy DNA nie utrzymuje się w komórce i jest szybko degradowany. Etapy transformacji chemicznej (Ryc. 3.1): 1. Komórki kompetentne muszą być stale inkubowane w lodzie. 2. Do komórek kompetentnych dodać DNA. Kontynuować inkubację w lodzie (do 30 min). 3. Przenieść próbki z łaźni lodowej do bloku grzejnego z temp. 42 C (szok termiczny) 1-2 min. 4. Przenieść próbki z bloku grzejnego do łaźni lodowej na 2 min. 5. Dodać podłoże płynne (ok.1 ml) i inkubować w termostacie z temp 37 C przez min. DNA może także zostać wprowadzony do elektrokompetentnych komórek poprzez elektroporację. Proces ten także polega na destabilizacji błony komórkowej: silne pole elektryczne (krótki impuls prądu elektrycznego o napięciu ok. 1,6-2,5 kv) powoduje powstanie przejściowych porów w błonie, przez które mogą przenikać cząsteczki DNA. Komórki elektrokompetentne uzyskuje się poprzez wielokrotne ich przemywanie ultraczystą wodą w celu usunięcia śladów soli. Im wyższe stężenie DNA tym wydajniejszy jest proces transformacji. 24

25 Uwaga: komórki kompetentne E. coli są niezwykle wrażliwe w tych warunkach, dlatego cały proces należy przeprowadzić inkubując komórki w łaźni lodowej. Wszystkie pipetowania należy przeprowadzać bardzo delikatnie. Wydajność transformacji z wykorzystaniem chemokompetentnych komórek E. coli wynosi ok transformantów/μg DNA. Wydajność elektroporacji wynosi ok transformantów/μg DNA. Do komórek bakteryjnych wnika najczęściej tylko jedna cząsteczka DNA, kotransformacja E. coli dwoma plazmidami możliwa jest tylko w przypadku dwóch różnych ori plazmidowych (grupy zgodności). Ryc. 3.1 Schemat transformacji chemicznej. Plazmidy i wektory plazmidowe Termin plazmid wprowadził Joshua Lederberg w roku Plazmid to pozachromosomowa cząsteczka DNA, występująca autonomicznie w cytoplazmie wielu organizmów prokariotycznych, zdolna do samodzielnej replikacji niezależnie od chromosomu bakteryjnego. Tworzą ją dwuniciowe, najczęściej koliście zamknięte, cząsteczki DNA, rzadziej liniowe. Najbardziej charakterystyczną cechą plazmidów jest ich fizyczna odrębność od chromosomu gospodarza oraz zdolność do trwałego utrzymywania się w komórce i replikowania się w niej w kontrolowany sposób. Cechą charakterystyczną każdego plazmidu jest liczba kopii jego cząsteczek w komórce, która jest ściśle zdefiniowana im mniejszy plazmid, tym liczba kopii jest większa. Replikacja plazmidowego DNA jest regulowana na etapie inicjacji replikacji. Wyróżnia się rozluźnioną (ang. relaxed) i zaostrzoną/ścisłą (ang. stringent) kontrolę replikacji. Cząsteczki plazmidów stały się podstawą konstrukcji wektorów, które, tak jak plazmidy, posiadają zdolność do autonomicznej replikacji w danym typie komórek. Wektory plazmidowe wykorzystywane są do klonowania genów, a czasem także do nadprodukcji białka kodowanego przez sklonowany gen. Elementy funkcjonalne wektora Systemy replikacyjne zawierające ori (ang. origin) miejsce inicjacji replikacji oraz w większości wektorów gen rep kodujący białko inicjujące replikację. Sposób regulacji inicjacji 25

26 replikacji decyduje o liczbie kopii plazmidu w komórce, dlatego wyróżniamy wektory wysoko- i niskokopijne. Geny markerowe, czyli geny kodujące białka odpowiedzialne za łatwo wyróżnialne cechy fenotypowe, które umożliwiają identyfikacje komórek zawierających dany wektor. Wektor powinien zawierać co najmniej jeden marker selekcyjny (gen oporności na antybiotyk), który pozwala na wyselekcjonowanie komórek zawierających wektor, bowiem uniemożliwia wzrost lub uśmierca komórki, które go nie mają. Szczep użyty do transformacji musi być wrażliwy na ten antybiotyk! Dodatkowy marker może pozwolić na odróżnienie wektora zrekombinowanego (zawierającego wklonowaną wstawkę) od takiego, który jest pusty tj. nie zligował się z żadnym fragmentem DNA. Unikalne miejsca restrykcyjne, które służą do wprowadzania obcego DNA. W najnowszych wektorach taką funkcję pełni tzw. polilinker, nazywany też MCS (ang. multicloning site). jest to syntetyczny odcinek DNA, w którym znajduje się zwykle kilkanaście miejsc rozpoznawanych przez różne endonukleazy restrykcyjne. Polilinker jest z reguły wstawiany w obrębie drugiego markera. Co najmniej jeden silny promotor pozwalający na ekspresję danego genu. Antybiotyki jako markery selekcyjne stosowane w biologii molekularnej Antybiotyki to substancje chemiczne mające właściwości bakteriostatyczne i bakteriobójcze produkowane przez organizmy żywe. Najszersza definicja mówi, że antybiotykami są także związki syntetyczne, które wywierają negatywny wpływ na mikroorganizmy, a nie mają swoich pierwowzorów wśród naturalnie produkowanych substancji Mechanizmy oporności na antybiotyki mogą być różne, niżej wymieniono te, które są wykorzystywane w biologii molekularnej. Najpopularniejszymi antybiotykami wykorzystywanymi w biologii molekularnej są: Ampicylina antybiotyk -laktamowy hamujący biosyntezę ściany komórkowej przez wiązanie z białkami PBP (ang. penicilin-binding proteins). Zasadniczo działa bakteriostatycznie, gdyż zabija wyłącznie rosnące komórki, poprzez zaburzenie syntezy mureiny, co prowadzi do rozerwania ściany komórkowej i lizy. Mechanizm oporności na ampicylinę polega na enzymatycznej degradacji cząsteczki antybiotyku poprzez enzym z grupy -laktamaz (np. kodowany przez gen bla). Tetracyklina antybiotyk poliketydowy. Działa na translację poprzez wiązanie się z miejscem akceptorowym dla aminoacylo-trna w podjednostce 16S rrna. Mechanizm oporności na tetracyklinę polega na aktywnym usuwaniu antybiotyku z komórki poprzez wyspecjalizowany transporter błonowy (kodowany przez gen tet). Chloramfenikol antybiotyk o działaniu bakteriostatycznym. Hamuje aktywność peptydylotransferazy, wiążąc się z 23S rrna. Mechanizm oporności na chloramfenikol polega na enzymatycznej modyfikacji cząsteczki antybiotyku poprzez acetylotransferazę chloramfenikolową (kodowaną przez gen cat). Kanamycyna antybiotyk z grupy aminoglikozydów. Działa na podjednostkę 30S rrna, hamując translację. Mechanizm oporności na kanamycynę polega na enzymatycznej modyfikacji cząsteczki antybiotyku, którą przeprowadza aminofosfotransferaza (kodowana przez gen aph). 26

27 Wektory komercyjne używane do klonowania Wektory pierwszej generacji pbr322 długość 4361 par zasad (pz), geny oporności na dwa antybiotyki (ampicylinę i tetracyklinę), na obszarze których znajdują się pojedyncze miejsca restrykcyjne, system replikacyjny (pochodzi z plazmidu pmb1). Średnia liczba kopii związana jest z białkiem Rop (kodowanym przez gen rop), który stabilizuje kompleksu RNAI-RNAII (Ryc. 3.2). Wektory drugiej generacji puc19 mniejszy niż pbr322 (2868 pz), jeden gen oporności na antybiotyk (ampicylinę). Ma ten sam ori replikacji co pbr322, ale zawiera punktową mutację w RNAII i nie występuje w nim gen rop, stąd liczba kopii znacznie większa (nawet 700). Natomiast posiada dodatkowo krótki segment DNA, na obszarze którego znajduje się też polilinker (54 pz, miejsca restrykcyjne dla 21 enzymów restrykcyjnych). Ponadto wektor ten zawiera elementy regulatorowe (promotor P lac, miejsce wiązania represora Lac, miejsce wiązania białka CAP) oraz sekwencję kodującą pierwsze 146 aminokwasów -galaktozydazy (tzw. fragment ) z genu lacz E. coli (Ryc. 3.2). Polipeptyd kodowany przez ten fragment lacz znalazł zastosowanie w prostym teście określającym czy obcy DNA został wstawiony w polilinker (selekcja na tzw. białe-niebieskie, patrz ćwiczenie 4). Ryc. 3.2 Schematy wektorów plazmidowych pbr322 i puc19. Plazmidy zawierające systemy replikacyjne pmb1 i ColE1 są niezgodne (ang. incompatible), tzn. nie mogą stabilnie występować w jednej komórce bakteryjnej, lecz są w pełni zgodne z replikonami zawierającymi system replikacyjny p15a (pacyc177, pacyc184). Ilość otrzymywanego DNA po izolacji: plazmid wysokokopiowy 2-5 g DNA na 1 ml hodowli, plazmid niskokopiowy 0,2-1 g DNA na ml hodowli. Literatura: Tabor S, Richardson CC. A bacteriophage T7 RNA polymerase/promoter system for controlled exclusive expression of specific genes. Proc Natl Acad Sci U S A : Studier FW, Moffatt BA.Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression_ of cloned genes. J Mol Biol : Lee N, Francklyn C, Hamilton EP. Arabinose-induced binding of AraC protein to arai2 activates the arabad operon promoter. Proc Natl Acad Sci U S A :

28 Część eksperymentalna Materiały: DNA: mieszaniny ligacyjne nr 1-4 z ćwiczenia 2 Szczep bakteryjny: E. coli Top10F {laciq Tn10 (Tc r )} mcra Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZΔM15 ΔlacX74 reca1arad139 Δ(ara-leu)7697 galu galk rpsl enda1 nupg Odczynniki: bufor TFB1 (ph 5,8; JAŁOWY!!): 30 mm octan potasu; 100 mm RbCl; 10 mm CaCl 2 ; 50 mm MnCl 2 ; 15% (v/v) glicerol bufor TFB2 (ph 6,5; JAŁOWY!!): 10 mm MOPS; 75 mm CaCl 2 ; 10 mm RbCl; 15% (v/v) glicerol Uzupełnienia podłoży: tetracyklina roztwór w etanolu10 mg/ml ampicylina roztwór wodny 100 mg/ml X-gal roztwór w dimetyloformamidzie (40 mg/ml) roztwór wodny IPTG (1 M) Podłoża: LB płynne LB stałe uzupełnione chloramfenikolem (34 µg/ml) LB stałe uzupełnione ampicyliną (100 g/ml), tetracykliną (10 µg/ml) X-gal (40 g/ml) i IPTG (1mM) Wykonanie: Przygotowanie komórek kompetentnych: 1. Do dwóch kolb zawierających po 100 ml płynnego podłoża LB dodać 0,5 ml nocnej hodowli E. coli TOP Inkubować 2 h w temperaturze 37 C w wytrząsarce. 3. W dwóch eppendorfach odwirować 2 razy po 1,5 ml hodowli (1,5 min 6000 rpm w temperaturze 4ºC). 4. Usunąć dokładnie pipetą supernatant i umieścić probówki w łaźni lodowej. 5. Zawiesić każdy osad w 1 ml buforu TFB1 (nie wyjmując probówek z lodu!!!). 6. Inkubować min w łaźni lodowej. 7. Próbki odwirować (2 min 6000 rpm w temperaturze 4ºC). 8. Usunąć pipetą supernatant i zawiesić każdą próbkę w 200 l buforu TFB2 (nie wyjmując probówek z lodu!!!). 9. Inkubować w łaźni lodowej przez min. Transformacja mieszaninami ligacyjnymi otrzymanymi w trakcie ćwiczenia 2: 1. Rozdzielić przygotowane komórki kompetentne do 4 probówek eppendorf po 100 l. 2. Dodać po 10 l odpowiedniej mieszaniny ligacyjnej do każdej porcji komórek kompetentnych. 3. Utrzymywać komórki kompetentne w łaźni lodowej przez 30 min. 4. Przenieść probówki do temperatury 42ºC na 1,5 min. 5. Przenieść probówki z powrotem do łaźni lodowej na 2 min. 6. Dodać do każdej z probówek 900 l płynnego podłoża LB bez antybiotyku. 7. Mieszaniny komórek kompetentnych inkubować w temperaturze 37ºC przez 1 h. 8. Zagęścić inkubowane mieszaniny poprzez wirowanie 6000 rpm, 1 min. 9. Pobrać pipetą automatyczną 100 l podłoża, resztę podłoża zlać. Zawiesić komórki przez pipetowanie w pobranych 100 l podłoża, a następnie wysiać na szalkę z LB z uzupełnieniami (Amp, Tet, X-gal, IPTG). Powtórzyć dla 4 mieszanin ligacyjnych. 10. Inkubować szalki w temperaturze 37ºC h. 28

29 ĆWICZENIE 4 Zastosowanie elementów operonu laktozowego Escherichia coli w klonowaniu genów Cześć teoretyczna 1. Kontrola ekspresji genów na przykładzie operonu lac Escherichia coli Preferencyjnym źródłem węgla dla bakterii jest glukoza i w jej obecności zahamowana jest ekspresja wielu genów kodujących białka biorące udział w katabolizmie innych cukrów, np. laktozy, arabinozy lub maltozy. Operon to zespół sąsiadujących genów prokariotycznych, zwykle powiązanych ze sobą funkcjonalnie (np. genów jednego szlaku metabolicznego). Ekspresja tych genów jest regulowana (indukowana lub hamowana) przez wspólne elementy kontroli (sekwencje operatorowe, promotory, regulatory, efektory, itp.) Najlepiej poznanym przykładem operonu indukowanego jest operon kodujący enzymy niezbędne do hydrolizy laktozy u Escherichia coli. W skład operonu laktozowego 1 E. coli wchodzą trzy geny strukturalne: lacz (β-galaktozydaza), lacy (permeaza β-galaktozydazy) i laca (transacetylaza β-galaktozydowa), których ekspresja jest możliwa ze wspólnego promotora umiejscowionego przed genem lacz (Ryc. 4.1). Ekspresja operonu laktozowego regulowana jest na poziomie transkrypcji poprzez białko represorowe (produkt genu laci), które rozpoznaje sekwencję operatorową. Gen kodujący białko represorowe ulega konstytutywnej ekspresji. Ekspresja genów strukturalnych wchodzących w skład operonu laktozowego jest indukowana poprzez pojawienie się substratu: laktozy. Naturalnym induktorem operonu lac u E.coli jest laktoza, a dokładniej allolaktoza, która powstaje w wyniku aktywności -galaktozydazy lub spontanicznej izomeryzacji laktozy. Zatem -galaktozydaza indukuje i utrzymuje ekspresję operonu lac (w tym własnego genu lacz), jest to tzw. sprzężenie zwrotne dodatnie. Ryc. 4.1 Operon laktozowy E. coli. Laktoza i allolaktoza ulegają enzymatycznemu rozłożeniu (katalizowanemu przez - galaktozydazę), na dwa cukry składowe: glukozę i galaktozę (Ryc. 4.2)

30 Ryc. 4.2 Hydroliza laktozy przez -galaktozydazę. Mutacje konstytutywne, elementy działające in cis i in trans François Jacob opracował system tzw. częściowych diploidów w celu zidentyfikowania elementów genetycznych mających wpływ/kontrolujących ekspresję genów strukturalnych w operonie laktozowym. W tym celu, do komórek E. coli wprowadził na plazmidzie F drugą kopię operonu laktozowego (laci ze swoim promotorem oraz geny laczya z promotorem i sekwencjami operatorowymi). Jacob odkrył, że istnieją dwie klasy mutacji konstytutywnych (tzn. takich, których występowanie pozwala na konstytutywną ekspresję genów strukturalnych operonu laktozowego). Pierwsza klasa to mutacje dotyczące sekwencji operatorowej (mutacja o c ). Te mutanty są cis-dominujące, ponieważ kontrolują tylko operon usytuowany na tej samej cząsteczce DNA (nie mają wpływu na operon występujący w plazmidzie). W tym przypadku zawsze ma miejsce ekspresja aktywnej formy -galaktozydazy, ponieważ wprowadzenie dzikiej kopii operatora nie zmienia fenotypu bakterii: Druga klasa mutacji konstytutywnych to mutacje w genie kodującym białko represorowe (i - ). W tym przypadku, monomery represora nie mogą utworzyć aktywnego tetrameru, wiec nie są w stanie połączyć się z dzikim operatorem. Takie mutacje są trans-recesywne, ponieważ monomer represora nie połączy się ani z operatorem występującym w plazmidzie ani w chromosomie, efekt tej mutacji może być zniesiony poprzez wprowadzenie do komórki dzikiej kopii genu laci (Tabela. 9.). 30

31 Tabela 9. Wpływ mutacji w operonie lac na fenotyp E. coli 2 -galaktozydaza Genotyp brak laktozy laktoza Komentarz i + o + z + y + (dziki) brak aktywna ekspresja indukowana i + o c z + y + (mutant o c ) aktywna aktywna ekspresja konstytutywna i + o c z + y + (mutant o c ) i + o + z + y + (w plazmidzie) i + o c z - y + (podwójny mutant) brak brak aktywna aktywna mutacja cis-dominująca -galaktozydaza eksprymowana, ale nieaktywna i + o c z - y + (podwójny mutant) i + o + z + y + (w plazmidzie) brak aktywna mutacja cis-dominująca i - o + z + y + aktywna aktywna ekspresja konstytutywna i - o + z + y + i + o + z + y + (w plazmidzie) brak aktywna mutacja trans-recesywna Trzy poziomy ekspresji genów operonu laktozowego: Gdy w środowisku obecna jest glukoza, a brak jest laktozy, białko represorowe łączy się z operatorem i blokuje w ten sposób polimerazę RNA, zasłaniając część sekwencji promotorowej. Nie dochodzi wtedy do transkrypcji genów strukturalnych. W przypadku braku glukozy i obecności laktozy, jej niewielka ilość dyfunduje do wnętrza komórki i łączy się białkiem represorowym, zmieniając jego konformację. Białko represorowe nie może wtedy przyłączyć się do sekwencji operatorowej i możliwa jest ekspresja genów strukturalnych. Permeaza odpowiedzialna jest za transport laktozy do wnętrza komórki, zaś -galaktozydaza (EC ) za hydrolizę wiązań O-glikozydowych w -D-galaktozydach. Produkt genu laca odpowiedzialny jest za acetylację tiogalaktozydów, lecz nie odgrywa żadnej roli w katabolizmie laktozy. Co się dzieje gdy komórka ma do wyboru dwa źródła węgla? Dla bakterii korzystniejsze jest wykorzystanie glukozy niż laktozy, ponieważ glukoza może być natychmiast zużyta w metabolizmie (glikoliza), a laktoza musi zostać najpierw zhydrolizowana. Ekspresja operonu laktozowego jest hamowana w obecności glukozy: jest to tak zwana represja kataboliczna. W wielu operonach uczestniczących w metabolizmie cukrów sekwencje promotorowe odbiegają od sekwencji kanonicznej i są słabo rozpoznawane przez bakteryjną polimerazę RNA. Mechanizm represji katabolicznej pozwala na aktywację transkrypcji z takich promotorów. Polimeraza RNA łączy się wydajniej z promotorem obecnym w operonie laktozowym w obecności specyficznego białka zwanego CAP (ang. catabolite gene activator protein) lub CRP (ang. cyclic AMP receptor protein), które musi być związane ze specyficznym miejscem DNA położonym w pobliżu sekwencji promotorowej, tzw. CBS (ang. CAP binding site). Białko CAP wiąże się z CBS, jeśli do niego przyłączą się cząsteczki cyklicznego AMP (efekt allosteryczny). Transport glukozy (w postaci glukozofosforanu) do komórki bakteryjnej wiąże się ze spadkiem stężenia aktywnej (fosforylowanej) formy cyklazy adenylanowej odpowiedzialnej za syntezę camp z ATP. Jeżeli w pożywce znajduje się glukoza, poziom camp obniża się, a konformacja białka CAP uniemożliwia wiązanie sekwencji CBS, polimeraza RNA słabo wiąże się z promotorem i synteza enzymów szlaku laktozowego zostaje spowolniona. W efekcie, jeśli w podłożu obecna jest glukoza i laktoza, metabolizowana będzie w pierwszym rzędzie glukoza, aż do wyczerpania 2 Uwaga: mutacje mogą także dotyczyć promotorów i/lub genu permeazy. 31

32 się tego źródła węgla. Następnie zostaje uruchomiony operon laktozowy, dzięki kompleksowi camp-cap (oraz laktozie, która zmienia konformację represora LacI). Kompleksy camp-crp regulują (aktywują lub hamują) w ten sposób ekspresję genów kodujących wiele szlaków metabolicznych oraz innych operonów, np. odpowiedzialnych za syntezę rzęsek, produkcję antybiotyków, wirulencję itp. (regulony). 2. Operon laktozowy w biologii molekularnej Gen lacz wykorzystywany jest jako gen reporterowy, ponieważ aktywność - galaktozydazy można łatwo wykryć, używając substratów chemicznych, które po hydrolizie zmieniane są w barwne produkty reakcji. Struktura enzymu pozwoliła na wykorzystanie go w wielu technikach biologii molekularnej, np. w klonowaniu genów, badaniu interakcji białko/białko, badaniu ekspresji genów, badaniach zmienności fazowej bakterii, itp. Substraty: Istnieją chromogenne analogi strukturalne laktozy hydrolizowane przez -galaktozydazę (Ryc. 4.3). Najczęściej stosowane są ONPG (o-nitrofenylo- -D-galaktopiranozyd) w podłożach płynnych oraz X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolilo- -D-galaktopiranozyd) w podłożach stałych. Żaden z tych związków nie indukuje jednak operonu laktozowego, do indukcji stosuje się IPTG (izopropylo- -D-tiogalaktopiranozyd). Jest to mała cząsteczka, która dyfunduje do wnętrza komórki, ale nie jest metabolizowana przez bakterie. IPTG X-Gal Ryc. 4.3 Wzory strukturalne substratów -galaktozydazy i induktora operonu lac ONPG -komplemetacja Aktywna -galaktozydaza z E. coli działa jako oligomer, zbudowany z 4 identycznych łańcuchów polipeptydowych, każdy o długości 1023 aminokwasów. Każdy polipeptyd może być podzielony na 2 nieaktywne fragmenty: (N-koniec) i (C-koniec polipeptydu). Wykazano, że ekspresja końców karboksylowych ( ) pozwala na uzyskanie nieaktywnych dimerów. Aktywny enzym, w formie tetrameru, może być otrzymany, jeżeli w komórce jednocześnie z fragmentem będzie syntetyzowany peptyd, kodowany przez gen lacz (Ryc. 4.4). 32

33 Ryc.4.4 -komplemetacji: a. dzika -galaktozydaza z E. coli b. dimer oraz tetramer uformowany przez peptydy α oraz. Selekcja na białe-niebieskie (ang. blue-white screening) Aby móc przeprowadzić selekcję kolonii transformantów E. coli na białe-niebieskie należy mieć do dyspozycji okreslony szczep bakterii, który: nie może wyrażać genu lacz, zazwyczaj zawiera mutację Δ(lac)X74 (delecja całego operonu laktozowego wraz z otaczającym go DNA) 3 ; musi syntetyzować fragment : zazwyczaj zawiera mutację laczδm15 (gen lacz z delecją nukleotydów kodujących aminokwasy 11 do 41). Ponadto wektor musi posiadać gen lacz (Ryc. 4.5 i 4.6), kodujący fragment, zazwyczaj są to 92 kodony z końca 5 genu lacz (Ryc. 4.6). W wektorach puc18/19 sześć kodonów zastąpiono w zgodnej ramce odczytu unikatowymi miejscami rozpoznawanymi przez enzymy restrykcyjne (MCS: ang. multicloning site). Ryc. 4.5 α-komplemetacja pomiędzy fragmentami -galaktozydazy kodowanymi przez komórki E. coli laczδm15 oraz gen lacz, obecny w wektorze. Wklonowanie obcego fragmentu DNA w MCS przerywa gen lacz i nie dochodzi do -komplementacji w komórkach E. coli (lacz M15). Na szalkach Petriego z X-Gal niebieskie kolonie E. coli zawierają pusty wektor (dochodzi do -komplementacji), a kolonie białe-wektor z klonowanym obcym fragmentem DNA. 3 Uwaga: komórki lacy nie kodują permeazy laktozowej 33

34 Ryc. 4.6 Mapa plazmidu pbluescript II KS+/-: sekwencja CAP, promotor P lac, operator rozpoznawany przez represor LacI i koniec 5` genu lacz kodujący fragment - galaktozydazy z wklonowaną sekwencją MCS ( Inne elementy operonu laktozowego używane w biologii molekularnej Promotor P lac i jego pochodne, np. promotor P lacuv5, w którym trzy mutacje punktowe zmniejszają jego czułość w stosunku do stężenia camp. Promotor taki trudniej unika derepresji w przypadku wyczerpania się glukozy w pożywce (co może mieć znaczenie w przypadku gęstej hodowli); o takim promotorze mówi się, że mniej przecieka. Represor LacI lub jego pochodna kodowana przez gen laci q. Mutacja dotyczy promotora genu laci (w pozycji -35 z GCGCAA na GTGCAA: promotor jest lepiej rozpoznawany przez bakteryjną polimerazę RNA). Mutacja laci q1, dzięki delecji 15 pz w regionie promotora, pozwala na otrzymanie optymalnego promotora powyżej genu laci. Dzięki mutacjom możliwa jest wydajniejsza ekspresja represora operonu laktozowego. Zastosowanie represora pozwala natomiast na ściślejszą kontrolę ekspresji genów sklonowanych w plazmidzie, który posiada sekwencję operatorową rozpoznawaną przez LacI. Systemy dwuhybrydowe: Jest to jedna z najpowszechniej stosowanych metod identyfikacji oddziaływań między białkami. Dostępne są bardzo różne systemy dwuhybrydowe: te przedstawione poniżej (Ryc. 4.7 i Ryc. 4.8.) wykorzystują elementy operonu laktozowego. 34

35 Ryc. 4.7 Bakteryjny system dwuhybrydowy. Badane białka są w fuzji z fragmentami i -galaktozydazy; jeżeli białka A i B oddziałują ze sobą, - komplementacja ma miejsce i -galaktozydaza jest aktywna. Ryc. 4.8 Bakteryjny system dwuhybrydowy. Badane białka są w fuzji z fragmentami T25 i T18 cyklazy adenylowej odpowiedzialnej za syntezę camp; jeżeli białka X i Y oddziałują ze sobą, aktywny kompleks camp-crp aktywuje transkrypcję -galaktozydazy. 3. Izolacja plazmidowego DNA metodą minilizy alkalicznej W metodzie służącej do do izolacji DNA plazmidowego z komórek bakteryjnych wykorzystuje sie różnice w zdolności do renaturacji plazmidów oraz chromosomu bakteryjnego. Opracowana została przez Birnboima i Doly`ego w DNA plazmidowy izoluje się z nocnej hodowli płynnej pochodzącej, z jednej kolonii bakteryjnej (pojedynczy klon), co zapewnia jednolitość genetyczną hodowli. Pożywka płynna pozwala na uzyskanie dużej masy bakterii. Bakterie, które utraciły plazmid podczas podziałów, giną (presja selekcyjna). Możliwe jest wyizolowanie DNA z kolonii bakteryjnej rosnącej na szalce, jednakże otrzymamy wtedy bardzo mało DNA. Całonocna hodowla zawierająca około komórek/ml, a kolonia z szalki tylko ok Etapy procesu: Zawieszenie komórek w roztworze I (glukoza, Tris, EDTA), który rozlużnia struktury błony zewnętrznej bakterii przez chelatację jonów dwuwartościowych (np. Ca 2+, Mg 2+ ). oraz hamuje DNazy. Obecność glukozy ma na celu zapewnienie odpowiedniego ciśnienia osmotycznego, aby komórka nie pobierała wody (zapobiega przedwczesnemu pęknięciu komórek), Tris-Cl zapewnia kontrolę ph. Liza komórek bakteryjnych ma miejsce dzięki dodaniu silnie alkalicznego roztworu II (NaOH/SDS). SDS (dodecylosiarczan sodu) rozpuszcza fosfolipidowe i białkowe komponenty błon komórkowych, uwalniając zawartość komórek. W tych warunkach (alkaliczne ph) zachodzi odwracalna denaturacja kwasów nukleinowych, a RNA ulega częściowej hydrolizie. Preparat staje się przejrzysty i zwiększa się jego lepkość. Oddzielenie plazmidowego DNA od białek, resztek błon i chromosomu bakteryjnego, ma miejsce dzięki neutralizacji ph (dodanie octanu potasu w roztworze III): tylko mały kolisty 35

36 plazmidowy DNA renaturuje. Białka, zdenaturowany chromosomalny DNA oraz błony komórkowe wytrącają się dzięki SDS i solom: powstaje nierozpuszczalny dodecylosiarczan potasu (KDS) w postaci wytrąconego serowatego osadu, który jest usuwany poprzez wirowanie. Po tym etapie, otrzymany preparat może być dodatkowo odbiałczany, np. mieszaniną fenol/chloroform, lub oczyszczany na minikolumnach. Te czynności nie są uwzględnione w przedstawionym niżej, przykładowym protokole. Otrzymany, oczyszczony DNA plazmidowy można zagęszczać poprzez wytrącanie w etanolu lub izopropanolu w obecności soli, a następnie zawiesić w odpowiednim buforze (TE lub w H 2 O) z RNAzą. Jakość wyizolowanego DNA może być sprawdzona poprzez: (i) pomiar spektrofotometryczny (w ten sposób można określić także jakość uzyskanego DNA, czyli stopień zanieczyszczenia białkami i/lub RNA), (ii) rozdział elektroforetyczny lub też (iii) poddanie DNA trawieniom enzymami restrykcyjnymi. Szybkość migracji DNA w żelu niedenaturującym zależy od gęstości żelu, wielkości fragmentów DNA oraz konformacji kolistego DNA. Ryc. 4.9 Obraz rozdziału elektroforetycznego (na żelu agarozowym) plazmidowego DNA pbr322 wyizolowanego metodą minilizy alkalicznej (Birnboim i Doly, 1979) 1. chromosomalny DNA 2. dimer pbr forma oc (ang. open circular) 4. forma ccc (ang. covalently closed circular) 5. nieodwracalnie zdenaturowana forma ccc 6. niskocząsteczkowy RNA (Uwaga: formy oc, ccc i liniowa mają taką samą wielkość: 4361 pz) 36

37 Ryc Obraz rozdziału elektroforetycznego (na żelu agarozowym) plazmidowego DNA pbluescript KS(+) wyizolowanego metodą minilizy alkalicznej 1. prawidłowa izolacja pbluescript KS II (+) z E. coli XL1-Blue 2. jak 1, ale worteksowane po roztworze III 3. jak 1, ale worteksowane po roztworze II 4. jak 1,ale do roztworu II dodano 50 μl NaOH 5 mm 5. jak 1, ale po trawieniu EcoRI (forma liniowa plazmidu) 6. marker wielkości DNA Literatura Birnboim, Doly A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA, Nucleic Acids Res. 7, Lewis M The lac repressor. C R Biol., 328(6): Lewis, M., Chang G., i wsp., Crystal structure of the Lactose Operon Repressor and Its Complexes with DNA and Inducer. Science 271: Matthews The structure of E. coli -galactosidase. C R Biol. 328(6): Oehler S, Amouyal M, Kolkhof P, i wsp., Quality and position of the three lac operators of E. coli define efficiency of repression. EMBO Journal 13: Sambrook, J., Fritsch, E. F. i T, M Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd edn. Cold Spring Harbor, NY Szeberenyi J camp Regulation of the Lactose Operon. Biochemistry and Molecular Biology Education 32 (3): Ullmann A Jacques Monod, : his life, his work and his commitments. Res Microbiol. 161(2):