Przynieść kalkulator, jeden na osobę (nie w telefonie!)

Transkrypt

1 Uniwersytet Gdański, Wydział Biologii Katedra Biologii Molekularnej Przedmiot: Biologia Molekularna z Biotechnologią Biologia II rok ======================================================== Ćwiczenie 2 Izolacja plazmidowego DNA i rozdział w żelu agarozowym Prowadzący: mgr Sylwia Zielińska i mgr Aleksandra Dydecka Przynieść kalkulator, jeden na osobę (nie w telefonie!) Istnieje wiele metod izolacji DNA. Różnią się one w zależności od rodzaju DNA (jednoniciowy, dwuniciowy, chromosomalny, plazmidowy, fagowy) oraz od rodzaju materiału biologicznego, z którego DNA izolujemy (komórki roślinne, zwierzęce, bakteryjne). Zastosowana metoda izolacji powinna zapewniać uzyskanie preparatu DNA o wysokiej czystości i niskim stopniu degradacji. Wszystkie metody cechują dwa podstawowe etapy: lizę komórek i oczyszczanie DNA. W przypadku komórek roślinnych, głównym utrudnieniem podczas izolacji DNA chromosomalnego jest obecność polisacharydów, będących inhibitorami wielu enzymów stosowanych w pracach z DNA. Standardowe metody oczyszczania, takie jak: ekstrakcja fenolem, wytrącanie alkoholem, nie usuwają polisacharydów z roztworu DNA. Dlatego dla tkanek roślinnych opracowano specjalne procedury izolacji DNA oparte na działaniu CTAB (ang. cetyltrimethylammonium bromide) - bromku cetylotrimetyloaminowego. CTAB jest detergentem, który degraduje białka i błony komórkowe, a ponadto umożliwia oddzielenie DNA od polisacharydów. W obecności wysokiego stężenie NaCl (ponad 0,7M) CTAB tworzy kompleksy z DNA, które utrzymują się w roztworze. Po obniżeniu stężenia NaCl (poniżej 0,4 M) kompleksy CTAB/DNA ulegają wytrąceniu tworząc zawiesinę. Jej odwirowanie umożliwia oddzielenie kompleksów DNA/CTAB (osad) od polisacharydów (roztwór). W przypadku izolacji DNA z komórek zwierzęcych, głównym problemem jest obecność znacznej ilości białek. W celu ich usunięcia często wykorzystuje się trawienie proteinazą K (enzym proteolityczny) oraz ekstrakcję fenolem i chloroformem. W wielu badaniach diagnostycznych, DNA izolowane jest z krwi pacjentów. W tym przypadku, w celu zwiększenia wydajności izolacji, we wstępnym etapie z preparatu często usuwa się erytrocyty, które pozbawione są jąder komórkowych. Jeżeli chcemy wyizolować DNA z konkretnej struktury subkomórkowej (np. jądra komórkowe, mitochondria, chloroplasty), konieczny jest dodatkowy etap wstępny, podczas którego wykonujemy frakcjonowanie materiału biologicznego w celu rozdzielenia poszczególnych organelli.. Ponadto bufory o odpowiednio dobranym składzie mogą być wykorzystane do specyficznej lizy poszczególnych organelli np. detergent Triton X-100 w niektórych buforach umożliwia lizę mitochondriów i chloroplastów nie niszcząc jąder komórkowych. Izolacja plazmidowego DNA z komórek prokariotycznych. Plazmid występujący u prokariotów jest niewielką, kolistą pozachromosomową cząsteczką DNA, która replikuje się niezależnie od chromosomu, a którego geny nie są obligatoryjne do życia komórki, ale mogą być przydatne, np. geny odporności na antybiotyki lub umożliwiające rozkład i asymilację różnych związków odżywczych. Plazmidy mogą być przekazywane pomiędzy komórkami bakteryjnymi na trzy różne sposoby, za pomocą koniugacji, transdukcji i transformacji. Plazmidowe cząsteczki są zazwyczaj kowalencyjnie zamknięte, koliste i superzwinięte. U pewnych bakterii i drożdży stwierdzono również plazmidy liniowe.

2 Wielkość plazmidów, to 2 100kbp (kilo par zasad z ang. kilo base pairs) i większe (dla porównania chromosom, to 1,8 2,5 Mbp) Istnieje kilkanaście metod oczyszczania plazmidowego DNA z komórek bakteryjnych. Wszystkie złożone są z podobnych etapów: 1. hodowli komórek bakteryjnych (i ewentualnej amplifikacji plazmidu) 2. lizy komórek bakteryjnych 3. oczyszczenia plazmidowego DNA (kluczowym momentem jest tu oddzielenie DNA plazmidowego od chromosomalnego) Najbardziej popularnymi metodami jest liza alkaliczna i liza termiczna. Obecnie coraz częściej stosuje się gotowe zestawy do izolacji sprzedawane przez firmy biotechnologiczne, które zapewniają łatwy i wydajny proces izolacji. 1. Hodowla komórek bakteryjnych. Do izolacji DNA plazmidowego z komórek bakteryjnych, najczęściej wykorzystuje się hodowle płynne, w których podłoże uzupełnione jest odpowiednim antybiotykiem gen oporności na antybiotyk znajduje się na plazmidzie. Wysokokopijne wektory plazmidowe (np. z serii puc) otrzymywane są z hodowli znajdującej się w późnej fazie logarytmicznej wzrostu, podczas gdy wektory nisko- i średniokopijne (np. pbr322) powinny być przed izolacją amplifikowane. 2. Liza komórek bakteryjnych. Liza komórek bakteryjnych zachodzi pod wpływem działania takich czynników jak detergenty (dodecylosiarczan sodu - SDS, sarkozyl, Triton X-100), które niszczą błonę komórkową, rozpuszczalniki organiczne (fenol, chloroform), które powodują denaturację białek, roztwory alkaliczne lub wysoka temperatura. Często stosuje się też lizozym - enzym trawiący mureinę ściany komórkowej bakterii (nie działa w ph < 8.0). Podczas oczyszczania DNA należy zapobiegać jego degradacji przez nukleazy. Osiąga się to poprzez dodanie związków chelatujących dwuwartościowe kationy (np. EDTA), będące kofaktorami nukleaz. Również praca w warunkach jałowych oraz używanie jednorazowych rękawiczek znacznie minimalizują niebezpieczeństwo degradacji DNA przez nukleazy. 3. Oczyszczanie plazmidowego DNA Większość plazmidów bakteryjnych występuje w formie superzwinietej (CCC- ang. covalently closed circle). Wiele metod oczyszczania wykorzystuje właśnie tę cechę DNA plazmidowego podczas oddzielanie plazmidu od DNA chromosomalnego. Chromosom bakteryjny od DNA plazmidowego nie różni się pod względem składu chemicznego, stąd do oddzielenia ich od siebie wykorzystuje się różnice w topologii tych cząsteczek oraz ich rozmiarze. W metodzie lizy alkalicznej bufor o wysokim ph ( ) zawierający NaOH powoduje całkowitą denaturację chromosomalnego DNA, natomiast plazmidowy DNA zostaje zdenaturowany jedynie na niewielkich odcinkach. Fragmenty chromosomalnego DNA po neutralizacji ph i w obecności wysokiego stężenia soli (np. octanu amonu) tworzą nierozpuszczalną sieć, dzięki czemu można usunąć je przez wirowanie; natomiast DNA plazmidowe ulega specyficznej renaturacji i pozostaje w supernatancie. W przypadku lizy termicznej, czynnikiem denaturującym jest wysoka temperatura, w której DNA chromosomalny i plazmidowy zachowują się podobnie jak w wysokim ph. Następny etap polega na oddzieleniu DNA od białek. Zwykle stosuje się do tego celu roztwór fenolu lub jego mieszaninę z chloroformem. Białka można też usunąć poprzez

3 trawienie proteazami (zwykle proteinazą K). Usunięcie RNA przeprowadza się enzymatycznie, inkubując próbki z RNazą (wolną od DNazy), bądź przez sączenie molekularne lub wirowanie w gradiencie gęstości chlorku cezu. Z odbiałczonych próbek DNA jest precypitowany (wytrącany) alkoholem etylowym lub izopropanolem w obecności octanu potasowego, sodowego lub amonowego, następnie pozostałości soli usuwa się poprzez przemycie osadu 70% etanolem. Podsumowując, izolacja plazmidowego DNA z komórek bakteryjnych obejmuje kilka podstawowych etapów: 1. Zawieszenie komórek w roztworze, który obniża wytrzymałość ścian komórkowych bakterii, hamuje DNazy przez chelatację jonów biwalencyjnych. 2. Degradacja komórek bakteryjnych plazmid oraz pozostała składniki komórki są uwalniane do roztworu. Jednocześnie zachodzi odwracalna denaturacja kwasów nukleinowych oraz nieodwracalna denaturacja białek. 3. Renaturacja plazmidowego DNA. Oddzielenie plazmidowego DNA od białek, resztek błon i chromosomu bakteryjnego. W celu ułatwienia prac związanych z badaniem kwasów nukleinowych, firmy biotechnologiczne sprzedają specjalne kolumny do izolacji i oczyszczania DNA i RNA. Systemy te na ogół oparte są na zdolności złóż krzemionkowych do wiązania kwasów nukleinowych w obecności wysokich stężeń soli chaotropowych, takich jak chlorowodorek guanidyny lub izotiocyjanian guanidyny. Sole chaotropowe, powodują również rozpad błon komórkowych i denaturację białek, co sprzyja izolacji kwasów nukleinowych. Chaotropy (ang. chaotropes, czyli,,czyniące chaos'') są to substancje, które w roztworach wodnych wprowadzają silne zaburzenia w sieci wiązań wodorowych. W oparciu o tę zasadę opracowano systemy wykorzystywane do następujących celów: - izolacja plazmidowego DNA, - izolacja całkowitego DNA - izolacja całkowitego RNA - elucja DNA z żeli agarozowych i poliakryloamidowych -oczyszczanie kwasów nukleinowych po reakcjach enzymatycznych, takich jak: PCR, restrykcja, znakowanie. Do sprzedawanych zestawów firmy dołączają szczegółowe opisy odpowiednich procedur. Zestaw używany na ćwiczeniach przeznaczony jest do izolacji plazmidowego DNA 1,5-3 ml hodowli bakteryjnej. W pierwszych etapach bakterie poddawane są lizie alkalicznej(l2). Następnie lizat zobojętniany zostaje odpowiednim buforem (GL3), który powoduje precypitację DNA chromosomalnego oraz białek, pozostawiając plazmidowe DNA w roztworze. Po wirowaniu supernatant zawierający plazmidowe DNA nanoszony jest na kolumienkę. Zanieczyszczenia są wypłukiwane natomiast DNA pozostaje osadzone na złożu. Kolejne etapy przepłukiwania kolumienki służą wypłukaniu wszystkich zanieczyszczeń. Ostatnie przepłukiwanie roztworem TE wymywa DNA i pozwala na zawieszenie go w roztworze. Szczepy i plazmidy: DH5α (fhua2 Δ(argF-lacZ)U169 phoa glnv44 Φ80 Δ(lacZ)M15 gyra96 reca1 rela1 enda1 thi-1 hsdr17) puc18 Odczynniki: pożywka LB antybiotyk (ampicylina)

4 roztwór L1 (0,2 M NaOH, > 1% SDS) Bufor GL3 (> 3M CH3COOH, >3M CH3COOK, >7 M chlorowodorku guanidyny) Roztwór A1 (izopropanol 70%) Bufor TE (1M Tris-HCl (ph 7,5), 0,5M EDTA (ph 8)) Odczynniki do elektroforezy agarozowej: 1% agaroza roztwór bromku etydyny (0,5 µg/ml) bufor TAE 0,5x stężony ( 20mM Tris-octan, 1mM EDTA ph 8.0) 6x stężony bufor obciążający ( 30% glicerol, 0,25% błękit bromofenolowy, 0,25% cyjanoksylen) Aparatura: wytrząsarka wodna, łaźnia wodna, worteks, mikrowirówka, aparat do poziomej elektroforezy agarozowej IZOLACJA PLAZMIDOWEGO DNA wykonanie: 1. Bakterie z wybranych kolonii bakteryjnych zaszczepić w 10 ml pożywki płynnej LB uzupełnionej odpowiednim antybiotykiem i hodować przez noc w 37 C z wytrząsaniem. 2. Hodowlę bakteryjną (1,5ml) wirować 5 minut przy 6000 RPM. 3. Odrzucić supernatant, osad zawiesić w 200 µl roztworu L1. 4. Dodać 200 µl roztworu lizującego L2 i po wymieszaniu przez 5-6-cio krotne odwracanie probówki (aby nie doprowadzić do fragmentacji chromosomalnego DNA) inkubować 3 min. w temperaturze pokojowej. Jeżeli po tej czynności lizat nie jest całkowicie klarowny należy ponownie odwrócić próbkę kilka razy i wydłużyć czas inkubacji o kolejne 3 min. 5. Dodać 400 µl roztworu zobojętniającego (GL3) i wymieszać kilkukrotnie odwracając próbkę. 6. Wirować10 minut przy tys. RPM. 7. Ostrożnie wlać supernatant do kolumienki do oczyszczania plazmidowego DNA. 8. Wirować 1 minutę przy tys. RPM. 9. Wyjąć kolumienkę z probówki, wylać przesącz i ponownie umieścić kolumienkę w probówce. 10. Nanieść na kolumienkę 500 µl pierwszego roztworu płuczącego (W). 11. Wirować 1 minutę przy tys. RPM. 12. Wyjąć kolumienkę z probówki, wylać przesącz i ponownie umieścić kolumienkę w probówce. 13. Nanieść na kolumienkę 600 µl drugiego roztworu płuczącego A Wirować 2 minuty przy tys. RPM 15. Osuszoną kolumienkę umieścić w nowej probówce 1,5 ml, a na złoże nanieść 60 µl roztworu TE. 16. Inkubować 3 minuty w temperaturze pokojowej. 17. Wirować 1 minutę przy tys. RPM 18. Kolumnę usunąć a oczyszczone plazmidowe DNA znajdujące się w probówce może być przechowywane krótkoterminowo w lodówce lub długoterminowo w temp.-20 C do czasu dalszych analiz.

5 Elektroforeza agarozowa DNA: Elektroforeza w żelu agarozowym służy do fizycznego rozdziału kwasów nukleinowych w polu elektrycznym. Wykorzystuje fakt, że naładowane ujemnie cząsteczki DNA pod wpływem przyłożonego zewnętrznego pola elektrycznego, migrują w żelu agarozowym w kierunku bieguna dodatniego. Elektroforezą nazywamy ruch naładowanych cząsteczek w zewnętrznym polu elektrycznym. Ruchliwość elektroforetyczna liniowego dwuniciowego DNA jest w przybliżeniu odwrotnie proporcjonalna do logarytmu dziesiętnego z liczby par zasad. Należy jednak pamiętać, że cząsteczki DNA o tych samych masach, różniące się konformacją migrują w innym tempie. Szybkość wędrówki DNA w żelu zależy więc od: konformacji przestrzennej DNA (forma liniowa L, kolista nacięta OC, superzwinięta CCC) wielkości DNA im większe, tym wolniej migruje w żelu; stężenia agarozy; przyłożonego napięcia; rodzaju buforu użytego do elektroforezy. wartości elektroendoosmotycznej (EEO) agarozy (jest to miara ilości związanych anionów siarczanowych i pirogronianowych, a jej wartość jest odwrotnie proporcjonalna do prędkości migracji ujemnie naładowanych cząsteczek w żelu). DNA jest polianionem, zatem migruje w stronę dodatniej elektrody. Elektroforeza agarozowa, w zależności od stężenia żelu, pozwala na rozdział cząsteczek DNA o długości od 100 bp do 50 kbp. Kierunek przepływu prądu Prędkość migracji różnych form topologicznych plazmidowego DNA w żelu agarozowym.

6 WYKONANIE Przygotowanie żelu agarozowego: Zawiesić 1 g agarozy w 100ml buforu TAE 0,5 x stężonego. Agarozę rozpuścić przez zagotowanie mieszaniny w kuchence mikrofalowej. Po schłodzeniu płynnej agarozy do temp. ok C, wylać ją na płytkę aparatu do elektroforezy na grubość 3-5mm. Po całkowitym zastygnięciu ostrożnie wyjąć grzebień. Do aparatu wlać 0,5x stężony bufor TAE tak, aby żel był nim przykryty na grubość ok. 1mm. Elektroforeza agarozowa DNA: Roztwór zawierający DNA wymieszać z barwnikiem elektroforetycznym w proporcji: 2 µl barwnika na 10µl roztworu DNA. Przygotowane próby nanosić do studzienek żelu (10µl). Rozdział elektroforetyczny prowadzić w polu elektrycznym o napięciu 5V na 1 cm długości żelu Po zakończeniu rozdziału barwić żel w roztworze bromku etydyny przez 15 min. Żel oglądać w świetle UV o długości fali 320nm. Dokumentacja w postaci zdjęcia. Zagadnienia do nauczenia : 1. Budowa i cechy DNA plazmidowego oraz zastosowanie w inżynierii genetycznej. 2. Pojęcia: marker selekcyjny, precypitacja, chelatacja jonów dwuwartościowych, denaturacja i renaturacja DNA, ori replikacji, MCS (miejsce wielokrotnego klonowania), promotor,przykłady wektorów genetycznych 3. Rodzaje topologicznych form plazmidu i ich migracja w żelu agarozowym. 4. Metody izolacji plazmidowego DNA bakterii (liza alkaliczna, liza termiczna, izolacja z użyciem kolumienek - różnice). 5. Elektroforeza agarozowa DNA i metoda obserwacja cząsteczek DNA w żelu. Literatura: 1. Turner P.C., Mclennan A.G., Krótkie wykłady- biologia molekularna 2. Sęktas M., Zastosowanie inżynierii genetycznej w biotechnologii 3. Sambrock J., Russell D.W., Molecular cloning 4. Włodarczyk M.(2002), Co to jest plasmid? Kosmos 51: Włodarczyk M. (2002), Różnorodność cech genotypowych bakterii kodowanych przez plazmidy. Kosmos 51: Kłyszejko-Stefanowicz L., Ćwiczenia z biochemii