Zestaw do oczyszczania DNA po reakcjach enzymatycznych

Podobne dokumenty
Zestaw do oczyszczania DNA po reakcjach enzymatycznych. Nr kat. EM03 Wersja zestawu:

Zestaw do oczyszczania DNA po reakcjach enzymatycznych

Zestaw do izolacji DNA z żeli agarozowych. Nr kat. EM08 Wersja zestawu:

Zestaw do izolacji DNA z żeli agarozowych. Nr kat. EM08 Wersja zestawu:

Gel-Out. 50 izolacji, 250 izolacji. Nr kat , Zestaw do izolacji DNA z żelu agarozowego. wersja 0617

Zestaw do izolacji DNA z krwi świeżej i mrożonej

Zestaw do izolacji genomowego DNA z drożdży

Zestaw do izolacji DNA z krwi świeżej i mrożonej

Zestaw do izolacji DNA z wymazów oraz nasienia. Nr kat. EM06 Wersja zestawu:

Zestaw do izolacji plazmidowego DNA

Zestaw do izolacji DNA z wymazów oraz nasienia

Zestaw do izolacji totalnego DNA z drożdży

Zestaw do izolacji genomowego DNA z bakterii

Zestaw do izolacji plazmidowego DNA. Nr kat. EM01 Wersja zestawu:

Zestaw do izolacji DNA z wymazów oraz nasienia

Zestaw do izolacji genomowego DNA z drożdży

Zestaw do izolacji totalnego DNA z bakterii. Nr kat. EM02 Wersja zestawu:

Zestaw do izolacji genomowego DNA z drożdży

Total RNA Zol-Out. 25 izolacji, 100 izolacji

Genomic Mini AX Plant Spin

Zestaw przeznaczony jest do całkowitej izolacji RNA z bakterii, drożdży, hodowli komórkowych, tkanek oraz krwi świeżej (nie mrożonej).

Genomic Mini AX Milk Spin

Genomic Maxi AX zestaw do izolacji genomowego DNA wersja 0616

GeneMATRIX Agarose-Out DNA Purification Kit

Genomic Midi AX. 20 izolacji

Genomic Mini AX Bacteria+ Spin

GeneMATRIX Cell Culture DNA Purification Kit

Genomic Mini. 50 izolacji, 250 izolacji. Uniwersalny zestaw do izolacji genomowego DNA z różnych materiałów. wersja Nr kat.

PathogenFree DNA Isolation Kit Zestaw do izolacji DNA Instrukcja użytkownika

bi ~ Zestaw dydal<tyczny umożliwiający przeprowadzenie izolacji genomowego DNA z bakterii EasyLation Genomie DNA INSTRUI<CJA DLA STUDENTÓW

Sherlock AX. 25 izolacji, 100 izolacji

Plasmid Mini. 50 izolacji, 250 izolacji. Zestaw do izolacji plazmidów wysokokopijnych wersja Nr kat ,

GeneMATRIX Swab-Extract DNA Purification Kit

Genomic Midi AX Direct zestaw do izolacji genomowego DNA (procedura bez precypitacji) wersja 1215

Genomic Maxi AX Direct

RT31-020, RT , MgCl 2. , random heksamerów X 6

umożliwiający wyl<rywanie oporności na HIV przy użyciu

Odczynnik do izolacji RNA z tkanek zwierzęcych, roślinnych oraz linii komórkowych

Genomic Mini AX Body Fluids zestaw do izolacji DNA z płynów ustrojowych wersja 1115

Zestaw o zwiększonej wydajności do izolacji plazmidów niskoi wysokokopijnych. Procedura z precypitacją DNA. wersja 0117

GeneMATRIX Short DNA Clean-Up Purification Kit

Novabeads Food DNA Kit

Saccharomyces Transformer Kit zestaw do przygotowywania i transformacji komórek kompetentnych Saccharomyces cerevisiae. Metoda chemiczna.

Zestaw do izolacji RNA z tkanek zwierzęcych oraz linii komórkowych

E.coli Transformer Kit

Genomic Micro AX Swab Gravity Plus

Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA

Nr kat. EM09 Wersja zestawu: Zestaw do izolacji RNA z tkanek zwierzęcych oraz linii komórkowych

Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA

Genomic Micro AX Blood Gravity 96-well

Zestaw do izolacji mirna z tkanek zwierzęcych oraz linii komórkowych

GeneMATRIX Bacterial & Yeast Genomic DNA Purification Kit

GeneMATRIX Basic DNA Purification Kit

Zestaw o zwiększonej wydajności do izolacji plazmidów niskoi wysokokopijnych. Procedura z precypitacją DNA. wersja 0217

GeneMATRIX Bacterial & Yeast Genomic DNA Purification Kit

Syngen Gel/PCR Mini Kit

Syngen Gel/PCR Mini Kit

GeneMATRIX Bio-Trace DNA Purification Kit

fix RNA Roztwór do przechowywania i ochrony przed degradacją próbek przeznaczonych do izolacji RNA kat. nr. E0280 Sierpień 2018

Zestaw do izolacji DNA z tkanek zwierzęcych oraz linii komórkowych

PathogenFree RNA Isolation Kit Zestaw do izolacji RNA

Plasmid Mini AX Gravity

Zestaw do izolacji DNA z tkanek zwierzęcych oraz linii komórkowych

AmpliTest Babesia spp. (PCR)

Uniwersalny zestaw do izolacji DNA (GeDI)

TaqNova-RED. Polimeraza DNA RP20R, RP100R

GeneMATRIX Environmental DNA & RNA Purification Kit

Zestaw do wykrywania Anaplasma phagocytophilum w kleszczach, krwi i hodowlach komórkowych

Zestaw do wykrywania Babesia spp. i Theileria spp. w kleszczach, krwi i hodowlach komórkowych

E.coli Transformer Zestaw do przygotowywania i transformacji komórek kompetentnych Escherichia coli

Zestaw do wykrywania Chlamydia trachomatis w moczu lub w kulturach komórkowych

Polimeraza Taq (1U/ l) 1-2 U 1 polimeraza Taq jako ostatni składniki mieszaniny końcowa objętość

Techniki molekularne ćw. 1 1 z 6

KWAS 1,2-DIBROMO-2-FENYLOPROPIONOWY

1 ekwiwalent 1 ekwiwalent

AmpliTest GMO screening-nos (Real Time PCR)

Zakład Chemii Organicznej, Wydział Chemii UMCS Strona 1

Zestawy do izolacji DNA i RNA

TaqNovaHS. Polimeraza DNA RP902A, RP905A, RP910A, RP925A RP902, RP905, RP910, RP925

1 ekwiwalent 2 ekwiwalenty 2 krople

Syngen Fungi DNA Mini Kit

AmpliTest Chlamydia/Chlamydophila (Real Time PCR)

Adres strony internetowej, na której Zamawiający udostępnia Specyfikację Istotnych Warunków Zamówienia:

Syngen Viral Mini Kit. Syngen Viral

Instrukcja dla kleju TL-T50

GeneMATRIX Tissue DNA Purification Kit

Syngen Plasmid Mini Kit

AmpliTest Salmonella spp. (Real Time PCR)

Instrukcja dla klejów TL-PVC oraz TL-W

Instrukcja dla kleju TL-T70 TRI-FREE Bez Trichloroetenu

1 ekwiwalent 0,85 ekwiwalentu 1,5 ekwiwalentu

Izolacja RNA metodą kolumienkową protokół

Syngen Plant DNA Mini & Maxi Kit

MATERIAŁY SZKOLENIOWE DLA ZAKŁADÓW HIGIENY WETERYNARYJNEJ W ZAKRESIE LABORATORYJNEJ DIAGNOSTYKI AFRYKAŃSKIEGO POMORU ŚWIŃ

Zakład Chemii Organicznej, Wydział Chemii UMCS Strona 1

Syngen Blood/Cell DNA Mini Kit

1 ekwiwalent 1,45 ekwiwalenta 0,6 ekwiwalenta

Zestaw do izolacji DNA z różnych próbek

Zestaw do izolacji DNA z różnych próbek w płytkach 96-dołkowych

Transkrypt:

Nr kat. EM07 Wersja zestawu: 1.2014 Zestaw do oczyszczania DNA po reakcjach enzymatycznych EXTRACTME jest zastrzeżonym znakiem towarowym firmy BLIRT S.A.

www.dnagdansk.com

Nr kat. EM07 I. PRZEZNACZENIE ZESTAWU Zestaw EXTRACTME DNA CLEAN-UP przeznaczony jest do szybkiego i wydajnego oczyszczania fragmentów DNA po reakcjach enzymatycznych. Oczyszczone DNA wolne jest od nukleaz, inhibitorów enzymów, detergentów, polimeraz, enzymów restrykcyjnych, kationów dwuwartościowych, soli itp., gwarantując wysoką użyteczność w technikach biologii molekularnej. Zestaw umożliwia oczyszczanie fragmentów DNA o wielkościach od 50 pz do 30.000 pz, a także g enomoweg o i pl a zmidoweg o D N A. Ek s t rakc ja c z ąs tec zek D N A mniejsz ych od 10 0 pz oraz większych od 10.000 pz zachodzi jednak z obniżoną wydajnością. Protokół izolacji i składy buforów zostały zoptymalizowane w celu osiągnięcia zarówno wysokiego odzysku, jak i czystości oczyszczanego DNA. Produkt przeznaczony jest wyłącznie do użytku w celach badawczych. II. SKŁAD I PRZECHOWYWANIE ZESTAWU LICZBA IZOLACJI 50 IZOLACJI 150 IZOLACJI 250 IZOLACJI 3 IZOLACJE (DEMO) Nr katalogowy EM07-050 EM07-150 EM07-250 EM07-D CB Buffer (Binding Buffer) 25 ml 75 ml 125 ml 1,5 ml CW Buffer (conc.)* (Wash Buffer) 11 ml 33 ml 55 ml 3 ml** Elution Buffer 10 ml 3 x 10 ml 5 x 10 ml 0,6 ml DNA Purification Columns 50 szt. 3 x 50 szt. 5 x 50 szt. 3 szt. Collection Tubes (2 ml) 50 szt. 3 x 50 szt. 5 x 50 szt. 3 szt. **Uwaga: w zestawie DEMO (EM07-D) CW Buffer zawiera już etanol. * Przed pierwszym użyciem do roztworu CW Buffer n a l e ż y d o d a ć o d p o w i e d n i ą i l o ś ć 96 100% etanolu (informacja na etykietach oraz w poniższej tabeli). Po dodaniu etanolu zalecane jest oznaczenie butelki. LICZBA IZOLACJI 50 IZOLACJI 150 IZOLACJI 250 IZOLACJI Nr katalogowy EM07-050 EM07-150 EM07-250 CW Buffer 11 ml 33 ml 55 ml Etanol 96-100% 44 ml 132 ml 220 ml Całkowita objętość 55 ml 165 ml 275 ml 3

Wszystkie składniki zestawu należy przechowywać w temp. pokojowej (15 25 C). Wszystkie roztwory z zestawu należy przechowywać szczelnie zamknięte, aby uniknąć zmiany stężeń w wyniku parowania. Odpowiednio przechowywany zestaw zachowuje stabilność przez okres minimum 12 miesięcy. III. WYMAGANE MATERIAŁY I SPRZĘT etanol 96 100% cz.d.a. jałowe próbówki wirownicze typu Eendorf (1,5 2 ml) pipety automatyczne oraz odpowiednie końcówki do pipet rękawiczki jednorazowe mikrowirówka z rotorem na probówki o poj. 1,5 2 ml (> 11 tys. x g) termoblok lub łaźnia wodna (do 70 C) 3 M octan sodu, ph 5,2 (w nielicznych przypadkach) IV. ZASADA IZOLACJI Procedura oczyszczania DNA przeprowadzana jest z wykorzystaniem minikolumn wirowniczych, zawierających odpowiednie złoże krzemionkowe wydajnie i selektywnie wiążące kwasy nukleinowe. W pierwszym etapie do p r ó b k i D N A d o d a w a n y j e s t C B B u ff e r, k t ó r y p o w o d u j e d e n a t u r a c j ę b i a ł e k oraz umożliwia efektywne wiązanie DNA do złoża w minikolumnie. Dodatkowo bufor ten zawiera barwnik, który pozwala na kontrolowanie ph roztworu odpowiedniego dla efektywnego wiązania DNA do złoża. Dwuetapowe przemywanie DNA związanego do złoża ma na celu usunięcie pozostałych zanieczyszczeń i/lub inhibitorów reakcji enzymatycznych. Oczyszczone DNA eluowane jest ze złoża buforem o niskiej sile jonowej (Elution Buffer) lub wodą (ph 7,0 9,0) i gotowe jest do bezpośredniego wykorzystania w technikach biologii molekularnej (takich jak PCR, qpcr, Southern blotting, sekwencjonowanie, ligacja DNA, trawienie enzymami restrykcyjnymi itp.) lub może być przechowywane do późniejszego użycia. V. KONTROLA JAKOŚCI Każda partia produkcyjna (LOT) zestawu EXTRACTME DNA CLEAN-UP testowana jest według opracowanych procedur. Wydajność, czystość oraz stabilność wyizolowanego DNA analizowane są metodami spektrofotometrycznymi www.dnagdansk.com 4

Nr kat. EM07 oraz elektroforetycznymi. Dodatkowo funkcjonalna jakość oczyszczonego DNA sprawdzana jest w reakcji PCR, qpcr oraz reakcji trawienia enzymami restrykcyjnymi. VI. SPECYFIKACJA PRODUKTU MATERIAŁ WYJŚCIOWY Próbka DNA o objętości do 100 µl ODZYSK 90 99% w zależności od wielkości fragmentu DNA (w zakresie 100 10.000 pz) WIELKOŚĆ IZOLOWANYCH FRAGMENTÓW DNA 100 10.000 pz Możliwe jest również oczyszczanie fragmentów DNA w zakresach 50 100 pz i 10 30 kpz, a także genomowego i plazmidowego DNA, lecz z obniżoną wydajnością. POJEMNOŚĆ ZŁOŻA ok. 25 µg DNA CZAS IZOLACJI 5 10 minut CZYSTOŚĆ DNA A 260/A280 = 1,7 1,9 VII. ŚRODKI OSTROŻNOŚCI Należy unikać dotykania ścianek minikolumn pipetą, aby nie przenosić śladowych ilości DNA pomiędzy kolejnymi minikolumnami. Zalecane jest używanie jałowych końcówek z filtrami do pipet. Odpady zawierające sole guanidyny mogą tworzyć wysoce reaktywne związki w połączeniu z substancjami utleniającymi. W przypadku rozlania buforu, powierzchnię zmyć wodą z detergentem. 5

VIII. SZCZEGÓLNE ZALECENIA I UWAGI Elucja DNA ze złoża Optymalną objętość buforu elucyjnego (Elution Buffer) należy dobrać w zależności od ilości DNA zawartego w próbce oraz od wymaganego poziomu stężenia DNA w eluacie. Zaleca się stosowanie 30 100 μl Elution Buffer. Jeśli pożądane jest otrzymanie DNA o wysokim stężeniu, objętość buforu elucyjnego można zmniejszyć do 20 μl. Należy mieć jednak na uwadze, że może to obniżyć wydajność odzysku DNA. Istotne w tym przypadku jest dodanie buforu elucyjnego centralnie na powierzchnię złoża. W celu uzyskania maksymalnej wydajności elucji DNA, bufor elucyjny należy podgrzać do temp. 80 C i wydłużyć czas inkubacji złoża z buforem do 10 minut. Jeśli istotne jest odzyskanie całkowitego DNA z minikolumny można przeprowadzić dodatkową elucję (200 μl). W tym przypadku należy powtórzyć pkt. 10-13 Protokołu izolacji DNA (sekcja XI), umieszczając minikolumnę w nowej probówce 1,5 ml typu Eendorf. Elution Buffer nie zawiera EDTA, którego obecność może przeszkadzać w niektórych reakcjach enzymatycznych. Kontrolowanie poziomu ph CB Buffer zawiera wskaźnik ph, pozwalający na sprawdzenie, czy ph mieszaniny j e s t m n i e j s z e n i ż 7, 5 ( k o l o r ż ó ł t y ), c o g w a r a n t u j e w y d a j n ą a d s o r p c j ę D N A d o z ł o ż a m i n i k o l u m n y. G d y p H j e s t w y ż s z e n i ż 7, 5, r o z t w ó r z m i e n i b a r w ę na różową. Może się tak zdarzyć w nielicznych przypadkach, np. gdy wartość ph próbki DNA bardzo odbiega od standardowych warunków wykorzystywanych przy operacjach z DNA (ph >9,0). Konieczne jest wtedy dodanie 10 µl 3 M octanu sodu (ph 5,2), który obniżając ph próbki zapewni wydajne wiązanie DNA do złoża. Wzrost ph CB Buffer powyżej wartości 7,5 powoduje diametralny spadek adsorpcji DNA do złoża w minikolumnie. www.dnagdansk.com 6

Nr kat. EM07 IX. PRZYGOTOWANIE PRÓBKI Przenieść odpowiednią objętość próbki DNA (nie więcej niż 100 µl) do jałowej probówki 1,5 2ml typu Eendorf. Próbki DNA przed oczyszczaniem można przechowywać w warunkach wolnych od deoksyrybonukleaz (DNaz) w temp. +4 C przez krótki okres czasu, lub w postaci zamrożonej (preferowana temp. -80 C) przez dłuższy okres czasu. Należy unikać częstego rozmrażania i zamrażania próbek DNA. X. PRZED PRZYSTĄPIENIEM DO IZOLACJI 1. Każdy z odczynników zestawu należy wymieszać. 2. Należy upewnić się, czy do CW Buffer został dodany etanol. Jeśli nie, należy dodać odpowiednią ilość 96 100% etanolu (ilości podane są na etykietach oraz w tabeli w sekcji II). 3. W przypadku wytrącenia osadu w buforach, butelkę z roztworem należy ogrzać do temp. 37 C (CW Buffer) lub temp. 50 60 C (pozostałe bufory) i inkubować, aż do całkowitego rozpuszczenia osadu, mieszając co kilka minut, a następnie schłodzić do temp. pokojowej. 4. Ogrzać odpowiednią ilość buforu elucyjnego do temp. 70 C. 5. Należy pamiętać, aby wszystkie etapy izolacji przeprowadzać w temp. pokojowej. 6. Wszystkie etapy wirowania zostały zoptymalizowane z wykorzystaniem mikrowirówki Eendorf 5417C. Prędkości wirowania podane w jednostkach rpm odnoszą się do tej mikrowirówki. 7

1. XI. PROTOKÓŁ IZOLACJI 1. Do 1 obj. próbki DNA dodać 5 obj. CB Buffer (n p. d o 5 0 µ l mieszaniny po reakcji PCR dodać 250 µl CB Buffer), worteksować 3 s. Sposób przygotowania próbki opisano w sekcji IX. Przygotowanie próbki. Kolor mieszaniny powinien być żółty. Jeżeli roztwór zmienił barwę na purpurową, należy dodać 10 µl 3 M roztworu octanu sodu o ph 5,2 i wymieszać (patrz sekcja VIII. Szczególne zalecenia i uwagi). 2. Krótko odwirować próbkę w celu odzyskania resztek roztworu z wieczka probówki, a następnie przenieść całą objętość mieszaniny na złoże minikolumny umieszczonej w probówce odbierającej i wirować 1 min przy 10 12 tys. rpm (11 15 tys. x g). 3. Przenieść minikolumnę do nowej probówki odbierającej (2 ml). 4. Dodać do minikolumny 600 μl CW Buffer i wirować 30 s przy 10 12 tys. rpm (11 15 tys. x g). 5. Wylać przesącz z probówki odbierającej i umieścić w niej z powrotem minikolumnę. 6. Dodać do minikolumny 400 μl CW Buffer i wirować 30 s przy 10 12 tys. rpm (11 15 tys. x g). 7. Wylać przesącz z probówki odbierającej i umieścić w niej z powrotem minikolumnę. www.dnagdansk.com 8

Nr kat. EM07 8. Wirować 1-2 min przy 12 14 tys. rpm (15 21 tys. x g). Bufor płuczący zawiera alkohol, który może powodować inhibicję niektórych reakcji enzymatycznych, a także obniżenie wydajności elucji, dlatego istotne jest jego całkowite usunięcie przed etapem elucji. 9. Ostrożnie wyjąć suchą minikolumnę z probówki odbierającej i umieścić ją w jałowej probówce 1,5 ml typu Eendorf. 10. Nanieść 50-100 μl Elution Buffer uprzednio ogrzanego do temp. 70 C centralnie na złoże w minikolumnie. Możliwa jest zmiana objętości buforu elucyjnego w zakresie 20 200 µl. Więcej wskazówek do tego etapu znajduje się w sekcji VIII. Szczególne zalecenia i uwagi. 11. Inkubować minikolumnę z buforem elucyjnym przez 2 min. 12. Wirować 1 min przy 10 12 tys. rpm (11 15 tys. x g). 13. Minikolumnę usunąć, a wyizolowane DNA przechowywać w temp. +4 C lub -20 C do czasu dalszych analiz. 9

XII. MOŻLIWE PROBLEMY I ICH ROZWIĄZYWANIE Problem Niska wydajność izolacji DNA. Inhibicja enzymatycznej obróbki wyizolowanego DNA. Nieostre prążki w obrazie elektroforetycznym. DNA wypływa ze studzienek w żelu agarozowym. Prawdopodobna przyczyna Nieefektywne wiązanie DNA do złoża. Niedodany etanol do buforu płuczącego. Niecałkowita elucja DNA. Niewłaściwe ph buforu elucyjnego lub wody (ph <7,0). Obecność etanolu w próbce. Obecność soli w próbce. Obecność nukleaz w buforze elucyjnym. Obecność etanolu w próbce. Rozwiązanie Upewnić się, że po dodaniu CB Buffer mieszanina posiada żółte zabarwienie. W przypadku zmiany barwy na różową, należy dodać 10 µl 3 M octanu sodu o ph 5,2. Upewnić się, że 96 100% etanol został dodany w odpowiedniej ilości do CW Buffer. Przed naniesieniem na złoże podgrzać Elution Buffer do temp. 80 C. Nanieść Elution Buffer centralnie na powierzchnię złoża. Wydłużyć czas inkubacji z Elution Buffer do 10 minut. Przeprowadzić powtórną elucję. Zwiększyć objętość Elution Buffer do 200 μl. Do elucji użyć Elution Buffer. Po każdym etapie płukania usuwać przesącz z probówki odbierającej. Upewnić się, że po etapie wirowania (pkt. 9 Protokołu izolacji) nie pozostały w minikolumnie resztki buforu płuczącego, w przeciwnym wypadku należy powtórzyć wirowanie. Wszystkie etapy wirowania przeprowadzać w temp. pokojowej. Upewnić się, że w CW Buffer nie wytrącił się osad. Wymienić zanieczyszczony bufor elucyjny na nowy. Gdy do elucji zamiast Elution Buffer używa się wody, upewnić się, że jest ona wolna od DNaz. Po każdym etapie płukania usuwać przesącz z probówki odbierającej. Upewnić się, że po etapie wirowania (pkt. 9 Protokołu izolacji) nie pozostały w minikolumnie resztki buforu płuczącego, w przeciwnym wypadku należy powtórzyć wirowanie. www.dnagdansk.com 10

Nr kat. EM07 XIII. BEZPIECZEŃSTWO I POSTĘPOWANIE Z PRODUKTEM CB BUFFER Niebezpieczeństwo H225, H302, H315, H319, H335, H336, P210, P261, P305+P351+P338 H225 Wysoce łatwopalna ciecz i pary. H302 Działa szkodliwie po połknięciu. H315 Działa drażniąco na skórę. H319 Działa drażniąco na oczy. H335 Może powodować podrażnienie dróg oddechowych. H336 Może wywoływać uczucie senności lub zawroty głowy. P210 Przechowywać z dala od źródeł ciepła/ iskrzenia/otwartego ognia/gorących powierzchni. Palenie wzbronione. P261 Unikać wdychania pyłu/ dymu/ gazu/ mgły/ par/ rozpylonej cieczy.. P305 + P351 + P338 W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO OCZU: Ostrożnie płukać wodą przez kilka minut. Wyjąć soczewki kontaktowe, jeżeli są i można je łatwo usunąć. Nadal płukać. 11

www.dnagdansk.com