Beztlenowy metabolizm sacharydów - fermentacja Fermentacja etanolowa (alkoholowa) stanowi szereg reakcji enzymatycznych polegających na przekształceniu sacharydów do etanolu, dwutlenku węgla oraz wytwarzaniu energii niezbędnej do procesów życiowych komórki drożdży. Przemiany składające się na fermentację tworzą szlak amfiboliczny (powstające metabolity pośrednie są wykorzystywane jako substraty do produkcji biomasy oraz donory i akceptory atomów wodoru i elektronów). Większość drożdży fermentujących może wykorzystywać glukozę, fruktozę, mannozę i galaktozę. Głównym szlakiem fermentacji jest ciąg przemian cukrów zwany szlakiem Embdena-Meyerhofa- Parnasa (EMP) (rys. poniżej) Fermentowany cukier po wniknięciu do komórki drożdży jest przekształcany do D-glukozy, która ulega fosforylacji do glukozo-6-fosforanu, a następnie w wyniku kolejnych przemian enzymatycznych szlaku EMP do 2 cząsteczek pirogronianu. Po ich dekarboksylacji (do aldehydu octowego i CO 2) aldehyd octowy jest redukowany, przy udziale dehydrogenazy alkoholowej, do etanolu. Wytworzona energia zostaje zmagazynowana w postaci 2 cząsteczek ATP. C 6H 12O 6 -» 2CO 2 + 2CH 3CH 2OH + 118,43 kj/mol Zaledwie 26% energii wytworzonej z 1 mola glukozy jest magazynowane w postaci ATP. 74% energii zostaje uwolnione w postaci ciepła. Ponieważ podczas fermentacji temperatura powinna być stale kontrolowana i utrzymywana na poziomie 24-28 o C, konieczne jest chłodzenie kadzi z brzeczką fermentacyjną. W rzeczywistości około 95% glukozy jest fermentowane na drodze EMP, a oprócz głównych produktów fermentacji powstają niewielkie ilości glicerolu, kwasów organicznych, alkoholi fuzlowych i mieszaniny wyższych alkoholi, głównie pentanolu, butanolu i propanolu. W warunkach limitowanego dostępu azotu, do etanolu i CO 2 przekształcane jest jedynie 70% glukozy, natomiast jej pozostała część jest magazynowana w postaci glikogenu. Glikoliza jest procesem amfibolicznym, gdyż wiele metabolitów pośrednich tego szlaku jest wykorzystywane do biosyntezy składników komórkowych: glukozo-6-fosforan w syntezie glukanu (sacharyd ściany komórkowej), triozofosforany w syntezie lipidów, pirogronian jako prekursor aminokwasów. Jednak rosnące komórki drożdży wymagają do procesów biosyntezy znacznie więcej związków niż szlak EMP jest w stanie dostarczyć. Są one tworzone w obecności tlenu, w cyklu Krebsa oraz na drodze tlenowych przemian glukozo-6-fosforanu w obecności NADP + w szlaku heksozomonofosforanowym (HMP, szlak pentozofosforanowy), nazywanym też szlakiem pentozowym. Głównym celem jest dostarczenie komórce NADPH niezbędnego do przeprowadzenia reakcji redukcji w cytoplazmie oraz synteza pentoz. Reakcje zachodzą w cytozolu. W przebiegu szlaku pentozofosforanowego można wyróżnić dwie fazy. Pierwsza - faza oksydacyjna, podczas której powstaje NADPH oraz druga - faza nieoksydacyjna podczas której powstają pentozy oraz cukry o 3, 4 i 7 atomach węgla. W fazie oksydacyjnej następuje przekształcenie glukozo-6-fosforanu w rybulozo-5-fosforan z wytworzeniem dwóch cząsteczek NADPH. W fazie nieoksydacyjnej natomiast rybulozo-5-fosforanu zostaje przekształcony w rybozo-5-fosforan lub ulega wieloetapowym przekształceniom w metabolity glikolizy. Tlenowy metabolizm węglowodanów Drożdże fermentujące w obecności tlenu przekształcają sacharydy, wykorzystując tlen cząsteczkowy jako akceptor protonów. Drożdże niefermentujące metabolizują węglowodany tylko na drodze tlenowej. Podstawowymi szlakami metabolizmu tlenowego są cykl Krebsa (zwany też cyklem kwasów trójkarboksylowych lub cyklem TCA) oraz cykl glioksalowy, natomiast zmagazynowanie energii w postaci ATP zachodzi w cytochromach zlokalizowanych w mitochondriach. Powstały w procesie glikolizy pirogronian, na drodze dekarboksylacji oksydatywnej, przy udziale koenzymu A i w obecności dehydrogenazy pirogronianowej zostaje przekształcony do acetylokoenzymu A. Zaktywowany acetyl zostaje całkowicie
utleniony do dwutlenku węgla w szeregu cyklu kwasów trójkarboksylowych. Cykl Krebsa jest szlakiem amfibolicznym, dostarczającym wielu substratów wykorzystywanych w procesach biosyntezy w komórce, np. w syntezie aminokwasów. W przypadku wyczerpania zasobów cukru w pożywce hodowlanej, cykl Krebsa zostaje zahamowany na poziomie izocytrynianu, a metabolizm sacharydów jest prowadzony na drodze cyklu glioksalowego. Wówczas, jako źródło węgla komórki wykorzystują inne metabolity np. aldehyd octowy, etanol, glicerol, które są przekształcane w acetylo-coa. Dalej w szlaku TCA do izotiocytrynianu, kwasu glioksalowego i jabłczanu. Końcowymi etapami metabolizmu tlenowego drożdży są reakcje zachodzące w łańcuchu oddechowym, polegające na przenoszeniu elektronów i protonów. Końcowym akceptorem elektronów jest tlen cząsteczkowy. Na regulację cyklu ma wpływ kilka parametrów: dostępność substratów, hamujące działanie nagromadzonych produktów i oparte na mechanizmach sprzężenia zwrotnego allosteryczne hamowanie przez następne intermediaty cyklu. Najbardziej prawdopodobnymi miejscami regulacji są reakcje nieodwracalne katalizowane przez następujące enzymy: - syntazę cytrynianową (hamowana przez cytrynian, a także przez ATP) - dehydrogenazę izocytrynianową (hamowana przez NADH i ATP, a aktywowana przez ADP) - dehydrogenazę α-ketoglutaranową (hamowana przez NADH i bursztynylo-coa) - dehydrogenazę pirogronianową (hamowana przez NADH i acetylo-coa). Cykl Krebsa przebiega szybciej, gdy poziom energii w komórce jest niski (duże stężenie ADP, a małe stężenie ATP i NADH), a zwalnia swój przebieg, gdy dochodzi do akumulacji ATP (jak i również NADH, byrsztynylo-coa oraz cytrynianu). Sumaryczny zysk cyklu to 12 cząsteczek ATP z jednej cząsteczki acetylo-coa. C 6H 12O 6 + 6O 2 -» 6CO 2 + 2H 2O + 2824 kj/mol Cykl Krebsa poza utlenianiem spełnia także inne role metaboliczne. Uczestniczy w glukoneogenezie, transaminacjach, deaminacjach i syntezie kwasów tłuszczowych. Intermediaty cyklu dostarczają prekursorów do wielu szlaków biosyntez: synteza aminokwasów następuje po transaminacji α-ketoglutaranu synteza nukleotydów purynowych i pirymidynowych z α-ketoglutaranu i szczawiooctanu szczawiooctan może być przekształcany w glukozę w procesie glukoneogenezy bursztynylo-coa jest najważniejszym intermediatem w syntezie pierścienia porfirynowego grup hemowych cytrynian przenosi grupy acylowe, potrzebne do syntezy kwasów tłuszczowych, z mitochondriów do cytosolu. Łańcuch oddechowy. Utworzone m.in. podczas glikolizy czy cyklu kwasu cytrynowego NADH i FADH 2 są bogate energetycznie, ponieważ zawierają pary elektronów o wysokim potencjale przenoszenia. Energia swobodna uwalniana w znacznej ilości podczas przenoszenia tych elektronów na tlen cząsteczkowy jest wykorzystywana do syntezy ATP. Elektrony są przenoszone z NADH do O 2 z udziałem trzech wielkich kompleksów białkowych: reduktazy NADH-Q (ubichinon) reduktazy cytochromowej oksydazy cytochromowej. Grupami przenoszącymi elektrony są: flawiny, centra żelazo-siarkowe, hemy i jony miedzi. Elektrony czy wodory przepływają przez łańcuch oddechowy od składników bardziej elektroujemnych do bardziej elektrododatniego tlenu. Podczas wędrówki protonów i elektronów z jednej cząsteczki NADPH na tlen, powstają 3 ATP, natomiast w przypadku FADH2 2 ATP. Oddychanie i fermentacja - efekty regulacyjne Procesy oddychania tlenowego i beztlenowego są w komórkach drożdży nierozerwalne. Rodzaj prowadzonego metabolizmu zależy nie tylko od dostępu tlenu, ale również wielu czynników. U niektórych gatunków drożdży oddychanie i fermentacja przebiegają prawie w tych samych proporcjach, u innych obserwuje się przewagę jednego z tych procesów. Browarnicze drożdże dolnej fermentacji Saccharomyces uvarum charakteryzują się najmniejszym udziałem oddychania w procesach metabolicznych, natomiast drożdże browarnicze górnej fermentacji Saccharomyces cerevisiae wykazują metabolizm tlenowy na poziomie zbliżonym do ras drożdży piekarskich S. cerevisiae.
Na podstawie aktywności oddechowej drożdże mogą być podzielone na 3 grupy: - wykazujące metabolizm tlenowy - drożdże niefermentujące, u których zachodzi jedynie oddychanie - prowadzące procesy tlenowe i beztlenowe w proporcjach równowagowych - oddychanie stanowi 40-50% przemian metabolicznych, np. drożdże browarnicze górnej fermentacji, piekarskie, większość drożdży patogennych - wykazujące głównie metabolizm beztlenowy - (udział oddychania nie przekracza 10-15%), np. drożdże gorzelnicze, winiarskie oraz drożdże browarnicze dolnej fermentacji U niektórych gatunków drożdży można prawie całkowicie stłumić fermentację przez silne napowietrzanie, jak to ma miejsce w drożdżownictwie, gdzie chodzi o możliwie największe nagromadzenie ich masy komórkowej. Są też przypadki, gdy drożdże w warunkach beztlenowych prawie wcale się nie rozwijają gdyż nie mają zdolności fermentacyjnych, co wykorzystuje się w produkcji drożdży paszowych. Drożdże dzikie (w przemyśle piekarskim Candida, Torulopsis, Mycoderma) to typowe tlenowce. Szlachetne szczepy, jak S. cerevisiae, mają zdolność fermentacji lub oddychania tlenowego w zależności od warunków, co wykorzystuje się do oceny ich jakości - określania biologicznej aktywności, czyli zdolności wytwarzania CO 2 spulchniającego ciasto w czasie fermentacji. Zmiana warunków hodowli z beztlenowych na tlenowe u S. cerevisiae prowadzi do 5-do 10-krotnego zwiększenia wydajności biomasy, przy czym tlen musi być rozpuszczony w pożywce. Wzrost stężenia tlenu w pożywce: - nieznacznie hamuje aktywność glikolizy poprzez inhibicję aktywności fosfofruktokinazy - zwiększa aktywność liazy cytrynianowej i dehydrogenazy jabłczanowej - wzrost intensywności cyklu Krebsa - uruchamia proces fosforylacji oksydatywnej w mitochondriach - hamuje transport aktywny glukozy przez błony plazmatyczne - intensyfikuje cykl glioksalowy - wykorzystanie etanolu, wyprodukowanego w czasie fermentacji Hamowanie fermentacji w komórkach drożdży w obecności tlenu nosi nazwę efektu Pasteura. Obserwowany jest u wszystkich drożdży z wyjątkiem browarniczych, u których wystąpiło zjawisko adaptacji do anaerobiozy i różnica pomiędzy fermentacją w warunkach beztlenowych a metabolizmem tlenowym jest nieznaczna. Również u wielu ras drożdży winiarskich tlen tylko nieznacznie hamuje fermentację. Wysokie stężenie glukozy lub innych fermentowanych cukrów powoduje zahamowanie syntezy mitochondriów i reprodukcji komórek drożdży w populacji, w której następuje zmiana metabolizmu tlenowego na fermentacyjny. Hamowanie oddychania na zasadzie katabolicznej represji glukozowej nosi nazwę negatywnego efektu Pasteura i efektu Crabtree. Oba te efekty regulacyjne są ze sobą powiązane, wywołując fermentację w obecności tlenu cząsteczkowego. Istota negatywnego efektu Pasteura polega na hamowaniu biosyntezy enzymów oddechowych, podczas gdy mianem efektu Crabtree określa się hamowanie ich aktywności. W obecności wysokich stężeń glukozy następuje obniżenie stężenia cytochromów, spadek ilości syntetyzowanych enzymów cyklu Krebsa, zahamowanie aktywności dehydrogenaz i ATP-azy. Katabolicznej represji glukozowej podlega także synteza podstawowych składników, takich jak: ubichinon, fosfolipidy i kwas palmitynowy. Najniższe stężenie glukozy, które hamuje syntezę enzymów oddechowych u drożdży S. cerevisiae wynosi 6mM. Stężenie 12mM hamuje syntezę oksydazy cytochromu c i dehydrogenazy jabłczanowej, a stężenie 30mM glukozy hamuje syntezę oksydoreduktazy NADPH-cytochromu c. Oznaczanie ilościowe białek porównanie metod. Metoda Bradforda Metoda Melanii M. Bradford jest obecnie stosowana coraz częściej, głównie ze względu na prostotę oraz wysoką czułość. Barwnik Coomasie Brillant Blue (CBB) rozpuszczony w roztworze o ph poniżej 1 ma kolor czerwono-brązowy. Kiedy jednak wiąże się z białkiem uzyskuje kolor niebieski. Ilość białka może być dzięki temu mierzona przy długości fali 595 nm. CBB w znacznej mierze przyłącza się do zasadowych, aromatycznych aminokwasów. Białka zawierają różną ich ilość, stąd wskazane jest utworzenie krzywej standardowej dla każdego badanego białka. Wadą tej metody jest to, że reagenty pozostają na szkle oraz plastikach laboratoryjnych. Można je stamtąd usunąć za pomocą SDS. Metodę stosuje się do detekcji białka w zakresie 20-1200μg białka/ml. Czułość metody wynosi 20 μg białka/ml Metoda biuretowa Metoda ta wykorzystuje obecność wiązań peptydowych w rozmaitych związkach organicznych, głównie w białkach i peptydach. Warunkiem koniecznym jest występowanie co najmniej dwóch wiązań peptydowych bezpośrednio obok siebie lub przedzielonych nie więcej niż jednym atomem węgla. Test biuretowy polega na dodaniu do analizowanej mieszaniny roztworu silnej zasady oraz siarczanu miedzi(ii). Jeżeli w roztworze obecne są związki zawierające bliskie wiązania peptydowe, to roztwór zmienia barwę z niebieskiej na fioletową (λ=540nm). Jest to spowodowane powstawaniem anionowych związków kompleksowych, w których jon Cu 2+ jest kompleksowany przez minimum dwie grupy peptydowe (Rysunek 1). W przypadku występowania dimerów aminokwasów, w których występuje tylko jedno wiązanie peptydowe układ zabarwia się na różowo. Wolne aminokwasy nie zmieniają barwy roztworu. Test może być stosowany zarówno w analizie jakościowej, jak i ilościowej. W tym drugim przypadku wykorzystuje się liniową zależność zmiany barwy od stężenia protein, a w rzeczywistości od liczby podwójnych wiązań peptydowych. Czułość metody 0,1 mg/cm 3, zakres 0,1 15 mg/cm 3 Oznaczeniu przeszkadzają: sole amonowe (dają barwne kompleksy z jonami miedzi) oraz siarczan (VI) magnezu (przechodzi w nierozpuszczalny wodorotlenek magnezu, który maskuje właściwą barwę).
Metoda Lowry ego W metodzie tej wykorzystuje się dwie odrębne reakcje: reakcje aminokwasów aromatycznych z odczynnikiem Folina oraz reakcję jonów miedzi(ii) z wiązaniami peptydowymi (reakcja biuretowa). W pierwszym etapie metody Lowry`ego zachodzi reakcja pomiędzy białkiem (dokładnie atomami azotu wiązania peptydowego) a siarczanem miedzi i cytrynianem sodu w środowisku zasadowym, co prowadzi do powstania kompleksu miedzi (Cu2+) i białka. Skutkiem tego jest redukcja jonów miedzi do jonów Cu +. W kolejnym etapie, po dodaniu do mieszaniny reakcyjnej odczynnika Folina-Ciocalteu (kompleksu kwasów fosfomolibdenowego (Mo 6+ ) i fosfowolframowego (W 6+ ). Aminokwasy aromatyczne redukują te jony do tzw. Błękitu molibdenowo-wolframowego, co przejawia się zmianą barwy roztworu na niebieską. Zmiana barwy jest proporcjonalna do ilości kompleksów miedziowobiałkowych. Zalety metody: niskie koszty, łatwość wykonania pomiaru. Metoda ta od wielu lat jest najczęściej spotykaną procedurą określania zawartości protein w nieznanej próbce. Pomiar wykonuje się przy λ=750nm, aby otrzymać wiarygodny wynik należy stworzyć krzywa kalibracyjną. Metoda z kwasem bicinchoninowym Metoda ta jest kolejną modyfikacją reakcji biuretowej. Kwas bicinchoninowy tworzy z jonami miedziowymi stabilny kompleks, który maksimum absorbancji posiada przy 562 nm. Metoda ta jest czulsza od metody biuretowej i metody Lowr ego oraz mniej wrażliwa na warunki zewnętrzne. Podobnie jak pozostałe metody oparte na reakcji biuretowej metoda ta wrażliwa jest na obecność związków redukujących np. kwasu askorbinowego. Zasadniczo polega na reakcji redukcji jonów Cu 2+ do Cu + w alkalicznym środowisku poprzez składniki białek (cysteina, tryptofan i inne). Absorbancja w UV Absorbancja jest chyba najprostszą metodą do mierzenia koncentracji białka w roztworze. Białka absorbują najlepiej przy długości fali - 280 nm. Dzieje się tak z powodu zawartości aromatycznych aminokwasów, takich jak tryptofan czy tyrozyna. Natomiast przy 185 nm znajduje się szczyt absorbancji białek, który wynika z obecności wiązań peptydowych. Ekstynkcja białek przy 280 nm jest różna z powodu różnej zawartości aminokwasów aromatycznych, natomiast poniżej 220 nm w przypadku obecności różnych białek nie pozwala na ich rozróżnienie. Poza tym trudno jest zmierzyć absorbancję białka w obszarze około 185 nm ponieważ różne formy tlenu również absorbują na tym obszarze. Współczynniki ekstynkcji białek są różne, zatem absorbancję w UV należy raczej traktować jako metodę jakościową, oczywiście z wyjątkiem oczyszczonych już białek, dla których współczynniki ekstynkcji są już znane. Jedną z wad tej metody jest to, że wiele innych związków chemicznych obecnych w próbce powoduje zafałszowanie wyników. Dzieje się tak np. w przypadku kwasów nukleinowych. Wprawdzie maksimum absorpcji tych związków znajduje się przy 260 nm, ale po części również zafałszowują wynik przy 280 nm. Wykonanie ćwiczenia 1. Analiza tlenowej hodowli drożdży 1.1. Oznaczyć masę kolby i poziom cieczy (porównać z masą wyjściową). 1.2. Oznaczyć zawartość sacharozy w płynie pohodowlanym. Pobrać 50 ml hodowli do kolbki miarowej o pojemności 100cm 3, dodać kolejno po 10ml płynów Herlesa I i II, mieszając próbę po każdej dawce, zawartość kolby dopełnić do kreski wodą destylowaną. Wymieszać starannie otrzymany roztwór i przesączyć przez suchy sączek z bibuły filtracyjnej. W przesączu oznaczyć stężenie sacharozy refraktometrem lunetowym MASTER-TA z automatyczną kompensacją temperatury. W tym celu należy podnieść osłonę pryzmatu, pipetą nanieść ok. 1 ml roztworu sacharozy tak, aby zamykając osłonę ciecz równomiernie, bez pęcherzyków powietrza pokryła cały pryzmat. Następnie patrząc przez lunetkę odczytać wynik (skala po lewej stronie w 0 Brix, 1 o Brix = 1% sacharozy.) Po wykonaniu pomiaru refraktometr dokładnie opłukać pod bieżącą wodą i wytrzeć delikatnie do sucha papierowym ręcznikiem. 2. Oznaczanie zawartości białka białko oznaczyć metodą wskazaną przez prowadzącego 2.1. Hodowle tlenową drożdży dokładnie wymieszać i ok. 25 cm 3 przefiltrować w zestawie do filtracji próżniowej. W tym celu należy zmontować zestaw. Filtrować używając sączka z bibuły filtracyjnej (w razie potrzeby sączek przyciąć do odpowiedniego rozmiaru). Zamontować lejek i podłączyć wężem kolbę filtracyjną z pompą próżniową. Przy otwartym przepływie wlać 25cm 3 hodowli i włączyć pompę. Po zakończeniu filtracji cały zestaw należy dokładnie umyć!!! 2.2. Pobrać ok. 0,2g biomasy drożdży z sączka, rozetrzeć z niewielką ilością odtłuszczonego piasku w moździerzu (w celu rozerwania ścian komórkowych i uwolnienia cytoplazmy). Następnie moździerz dokładnie przepłukać 5ml wody destylowanej. Całość przenieść ilościowo do probówki wirówkowej i odwirować (6000 obr/min, 5 min.). W celu odwirowania próby należy: - otworzyć pokrywę wirówki - umieścić w niej probówkę z zawiesiną roztartych drożdży, jako przeciwwagi użyć drugiej probówki wypełnionej 5 ml wody destylowanej - zamknąć pokrywę wirówki - ustawić czas wirowania 5 minut - ustawić obroty 6000 obr/min - po upływie wyznaczonego czasu wirówka sama się wyłączy 2.3. Po zakończeniu wirowania ostrożnie pobrać do probówki 1ml płynu znad odwirowanego osadu drożdży (supernatant). Do drugiej probówki wprowadzić 1ml wody destylowanej próba kontrolna. 2.4. Oznaczenie białka metodą Lowry ego.
Do 1ml supernatantu, oraz 1 ml próby kontrolnej dodać po: - 0,3ml 1M NaOH, - 3ml odczynnika miedziowego, Odczynnik miedziowy przygotować bezpośrednio przed oznaczeniem mieszając ze sobą w probówce: 10ml odczynnika A, 0,1ml odczynnika B 1 i 0,1ml odczynnika B 2 - po wymieszaniu odstawić na 10 min. - 0,3ml odczynnika Folina Energicznie wymieszać probówki (vortex) i po 20 minut dokonać pomiaru absorbancji w spektrofotometrze, przy długości fali 660 nm, wobec próby kontrolnej, a następnie odczytać stężenie białka z krzywej wzorcowej albuminy. 2.5. Oznaczanie białka metodą Bradforda Do 1ml supernatantu, oraz 1 ml próby kontrolnej dodać po 2ml odczynnika Bradforda. Po wymieszaniu i upływie 10 minut dokonać pomiaru absorbancji w spektrofotometrze, przy długości fali 595 nm, wobec próby kontrolnej, a następnie odczytać stężenie białka z krzywej wzorcowej albuminy w mg/dm 3. Krzywa wzorcowa albuminy: y= 335,21x 10,014 R 2 = 0,99 3. Opracowanie wyników Opis wykonanych doświadczeń oraz uzyskane wyniki należy zamieścić w sprawozdaniu. Wyciągnąć wnioski. Można skorzystać z tabeli: Waga kolbek [g] Zawartość sacharozy [%] Stężenie białka [µg/ml] - Przed hodowlą Po hodowli 4. Literatura: - Chmiel A., Biotechnologia. Podstawy mikrobiologiczne i biochemiczne; Wyd. PWN, Warszawa; 1998. - Kunicki-Goldfinger W.; Życie bakterii; Wyd. PWN; Warszawa; 1998 - Libudzisz Z. Kowal K.; Mikrobiologia techniczna; Wyd. Politechniki Łódzkiej; 2000