Analiza jakościowa wybranych aminokwasów

Transkrypt

1 Ćwiczenie 14 Analiza jakościowa wybranych aminokwasów I. Aminokwasy Aminokwasy są jednostkami strukturalnymi peptydów i białek. W swojej cząsteczce mają co najmniej 2 grupy funkcyjne: grupę aminową NH 2 i grupę karboksylową COOH. Wzór ogólny aminokwasów to: grupa karboksylowa łańcuch boczny grupa aminowa W obrębie ugrupowania R mogą występować inne grupy funkcyjne jak: OH, SH, Ar, NH 2, COOH albo ugrupowania heterocykliczne. Wszystkie grupy funkcyjne, związane z węglem alfa oraz obecne w łańcuchu bocznym wykazują specyficzne reakcje. Służą one do identyfikacji zarówno wolnych aminokwasów, jak i związanych w postaci biopolimerów (peptydy, polipeptydy, białka).

2 II. Reakcje charakterystyczne wybranych aminokwasów 1. Reakcja ninhydrynowa. Aminokwasy pod wpływem ninhydryny ulegają utlenieniu do aldehydów. W pierwszym etapie zachodzi dekarboksylacja, a w następnym deaminacja. Jednym z produktów reakcji jest amoniak, który w reakcji z ninhydryną tworzy barwny związek - purpurę Ruhemanna charakteryzujący się fioletowoniebieskim kolorem Natężenie barwy jest proporcjonalne do ilości wolnych grup aminowych obecnych w cząsteczce aminokwasu. Reakcja ninhydrynowa może służyć zarówno do jakościowego, jak i ilościowego oznaczania aminokwasów. Reakcja ta nie jest specyficzna dla aminokwasów. Barwne związki z ninhydryną powstają także w reakcji z innymi związkami zawierającymi wolne grupy alfa-aminowe. Najważniejsze z nich, to: peptydy, białka, aminocukry, aminy I- rzędowe, sole amoniowe. Wśród alfa-aminokwasów białkowych reakcji z ninhydryną, z utworzeniem purpury Ruhemanna nie daje prolina, która jest aminą II-rzędową. Produktem reakcji proliny z ninhydryna jest związek o żółtym zabarwieniu. 1% wodne roztwory aminokwasów: glicyny, proliny 0,1% roztwór ninhydryny w 50% etanolu 1. Do probówek odmierzyć po 1 cm 3 roztworów aminokwasów: glicyny i proliny (do każdej probówki tylko jeden roztwór). 2. Do probówek dodać po 0,5 cm 3 etanolowego roztworu ninhydryny. 3. Próby ogrzać do wrzenia we wrzącej łaźni wodnej. 4. Zaobserwować pojawienie się charakterystycznego zabarwienia.

3 2. Reakcja ksantoproteinowa. Zasada: Związki zawierające ugrupowanie aromatyczne ulegają reakcji nitrowania. Zachodzi ona zgodnie z mechanizmem podstawienia elektrofilowego. Czynnikiem elektrofilowym jest jon nitroniowy NO 2 +. Powstaje on w wyniku reakcji zachodzącej między stężonymi kwasami: siarkowym(vi) i azotowym(v), będącymi składnikami mieszaniny nitrującej (stosunek wagowy 2:1). Aminokwasy zawierające ugrupowanie aromatyczne (tryptofan, tyrozyna, fenyloalanina) oraz białka, w skład których wchodzą te aminokwasy ulegają reakcji ksantoproteinowej, zwanej reakcją Muldera. W jej efekcie powstaje żółty produkt (gr. ksantos żółty), którego barwa ulega pogłębieniu pod wpływem dodanej zasady litowców. W przypadku tryptofanu oraz tyrozyny do zajścia reakcji nitrowania wystarczy tylko obecność stężonego kwasu azotowego(v). 1% roztwory aminokwasów: tyrozyny, tryptofanu, glicyny stężony kwas azotowy (V) 10% roztwór NaOH 1. Do probówek odmierzyć po 1 cm 3 roztworów: tyrozyny, tryptofanu, glicyny i białka albuminy (do każdej probówki tylko jeden roztwór). 2. Do wszystkich probówek dodać po 1 cm 3 stężonego kwasu azotowego (V) (dozować za pomocą pipety pasterowskiej; reakcję przeprowadzać pod dygestorium). 3. Probówki ogrzewać przez 5 minut we wrzącej łaźni wodnej.

4 4. Probówki ochłodzić pod bieżącą wodą i dodać po 4 cm 3 20% roztworu NaOH Uwaga! reakcja silnie egzotermiczna!!! 5. Zaobserwować, w których probówkach nastąpi zmiana zabarwienia roztworu. 3. Wykrywanie grup tiolowych. Cysteina, aminokwas zawierający w swojej cząsteczce grupę tiolową SH, oraz białka, w skład których wchodzi cysteina reagują z nitroprusydkiem sodu. Reakcja zachodzi w środowisku amoniakalnym, a otrzymany związek kompleksowy charakteryzuje się barwą czerwono-fioletową. 0,1% świeże roztwory aminokwasów: cysteiny i cystyny stężony roztwór amoniaku 1% wodny roztwór nitroprusydku sodu Na 2 [Fe(CN) 5 NO] siarczan amonu in subst. 1. Do 3 probówek odmierzyć po 1 cm 3 roztworów: cysteiny, cystyny i albuminy (do każdej probówki tylko jeden roztwór). 2. Do wszystkich probówek dodać po 1 ml 1% roztworu nitroprusydku sodu, a następnie dodawać siarczanu amonu in subst. tak długo, aż przestanie się rozpuszczać. 3. Zalkalizować próby, dodać ok. 1-2 ml amoniaku (dozować za pomocą pipety pasterowskiej; reakcję przeprowadzać pod dygestorium). 4. Obserwować pojawienie się na granicy roztworów czerwono-fioletowego zabarwienia świadczącego o obecności grup tiolowych.

5 4. Deaminacja aminokwasów kwasem azotowym (III). Grupa aminowa aminokwasów może ulec odszczepieniu z wytworzeniem azotu cząsteczkowego. Reakcja zachodzi pod wpływem kwasu azotowego (III). W pierwszym etapie reakcji, z azotyny sodu i kwasu octowego, otrzymywany jest kwas azotowy (III). Następnie kwas ten reaguje z wolną grupą aminową aminokwasów tworząc związek diazoniowy, który rozkłada w podwyższonej temperaturze. W rezultacie ciągu reakcji, z aminokwasów zawierających wolną grupę aminowa powstaje hydroksykwas i wydziela się w postaci gazowej azot cząsteczkowy. Ilość wydzielonego azotu jest proporcjonalna do ilości wolnych grup aminowych. Reakcja aminokwasów z kwasem azotowym(iii), zwana metodą van Slyke`a służy do ilościowego, gazometrycznego oznaczania ilości aminokwasów. 10 % roztwór NaNO 2 2M roztwór CH 3 COOH 1% wodny roztwór glicyny 1. W probówce zmieszać 1ml NaNO 2 z 1 ml roztworu CH 3 COOH minutę ogrzewać w łaźni wodnej, odczekać, aż zmniejszy się wydzielanie gazu o żółtej barwie (tlenki azotu), po czym dopiero dodać do probówki 2 ml roztworu glicyny. 3. Trzymając probówkę w drewnianej łapie wytrząsać i obserwować wydzielanie się azotu produktu gazowej reakcji deaminacji.

6 5. Wykrywanie pierścienia indolowego w tryptofanie. Pierścień indolowy wchodzący w skład tryptofanu reaguje z aldehydami tworząc barwne produkty. Jest to reakcja kondensacji zachodząca między dwoma pierścieniami indolowymi a grupą aldehydową. Najczęściej przeprowadza się reakcję z aldehydem mrówkowym (reakcja Voisoneta) lub z glioksalem (reakcja Adamkiewicza-Hopkinsa). Obie te reakcje mogą służyć do ilościowego oznaczania tryptofanu. Reakcja zachodzi w środowisku kwaśnym. 1% roztwór tryptofanu 1% wodny roztwór glicyny 40% roztwór aldehydu mrówkowego (formalina) stężony H 2 SO 4 1. Do trzech probówek odmierzyć po 1 ml roztworów: tryptofanu, glicyny, albuminy (do każdej probówki tylko jeden roztwór). 2. Do wszystkich probówek dodać 0,5 ml formaliny i wymieszać. 3. Do każdej probówki dodać powoli pipetą pasterowską po ściance lekko pochylonej probówki 1cm 3 stężonego H 2 SO 4. Uwaga! Nie należy wstrząsać probówki. 4. Ogrzać we wrzącej łaźni wodnej. 5. Obserwować pojawienie się czerwono-brunatnego pierścienia na granicy faz.

7 6. Reakcja biuretowa. Związki zawierające przynajmniej dwa wiązania peptydowe w cząsteczce reagują z zasadowymi roztworami siarczanu miedzi CuSO 4 (odczynnik biuretowy) z wytworzeniem związku kompleksowego o niebiesko-fioletowym zabarwieniu. Reakcja ta jest stosowana do ilościowego i jakościowego oznaczania peptydów oraz białek. Dipeptydy, zawierające tylko jedno wiązanie peptydowe, tworzą związek o zabarwieniu różowym. Wolne aminokwasy nie reagują z odczynnikiem biuretowym. Nazwa odczynnika i reakcji wywodzi się od dimocznika (biuretu), najprostszego związku, który tworzy z zasadowymi roztworami siarczanu miedzi kompleks o fioletowej barwie. biuret, dimocznik. związek kompleksowy miedzi palnik gazowy 1% wodny roztwór glicyny 20% roztwór NaOH 0,25 M roztwór CuSO 4 mocznik 1. Otrzymywanie biuretu. Do suchej probówki wsypać szczyptę mocznika, ogrzać nad palnikiem gazowym. Po skrzepnięciu otrzymanej masy probówkę należy ochłodzić i dodać około 1 ml wody destylowanej. Poczekać aż skrzepnięta masa się rozpuści. 2. Do kolejnych dwóch probówek dodać po 1 ml roztworów: albuminy oraz glicyny 3. Do roztworów: biuretu, albuminy i glicyny dodać po 1 ml roztworu NaOH, wymieszać starannie. 4. Wkraplać wodny roztwór siarczanu miedzi (II), w wyniku czego powstaje związek kompleksowy o fioletowym zabarwieniu.