Dr hab. n. med. Janusz Kraczkowski Katedra i Klinika Położnictwa i Patologii Ciąży Uniwersytetu Medycznego w Lublinie 20-081 Lublin Podpis (J A~... u':t.~~~ l0~...... Ul. Staszica 16 Recenzja rozprawy doktorskiej mgr Beaty Bielec pt. "Parametry optymalizujące dawców komórek macierzystych krwi pępowinowej", przygotowanej pod kierunkiem Pana dr hab.n. med. Rafała Stojko, Prof. nadzw. SUM. Recenzję opracowano na zlecenie Rady Wydziału Nauk o Zdrowiu Śląskiego Uniwersytetu Medycznego Katowicach. Uzasadnienie ważności tematu Z prawdziwą przyjemnością i zaciekawieniem podjąłem Się recenzji rozprawy doktorskiej, w której autorka przedmiotem badan i rozważań teoretycznych i empirycznych uczyniła parametry optymalizujące dawców komórek macierzystych krwi pępowinowej. Komórki macierzyste są pierwotnymi, nisko zorganizowanymi komórkami, które mają olbrzymi potencjał do namnażania się oraz wyjątkowe zdolności do prze k ształcania w komórki wysoko wyspecjalizowane. Posiadają wysoki potencjał proliferacyjny, ich genom nie wykazuje cech starzenia się, a ryzyko akumulacji mutacji DNA jest dużo mniejsze w porównaniu z komórkami dorosłych. Dzięki wysokiej aktywności telomerazy cechują się szybszym tempem podziałów i mniejszą dojrzałością. Istotna jest obecność we krwi pępow i nowej w dużej ilości niedojrzałych, naiwnych limfocytów T, co powoduje mniejsze ryzyko rozwoju reakcji "przeszczep przeciw gospodarzowi" po transplantacji. Z kolei mniejsze wymogi dotyczące zgodności w zakresie antygenów układu HLA zwiększają szansę na znalezienie niespokrewnionego dawcy. 1
Jedynym nieinwazyjnym sposobem pozyskania komórek macierzystych jest pobranie krwi pępowinowej, która zawiera zarówno krwiotwórcze komórki macierzyste jak i komórki mezenchymy. Pozyskanie komórek macierzystych krwi pępowinowej nie stanowi zagrożenia dla matki i noworodka oraz nie powoduje problemów natury etycznej. Udany przeszczep komórek macierzystych pochodzących z krwi pępowinowej spowodował na świecie gwałtowny wzrost zdeponowanej ilości krwi pępowinowej dla celów terapeutycznych. Niewątpliwie największą troską badaczy jest pozyskanie krwi pępowinowej o jak największej wartości transplantacyjnej. Z tego właśnie względu terapie komórkowe są obecnie jednym z najbardziej rozwijających się obszarów wiedzy a poznane właściwości komórek macierzystych oraz możliwość ich klinicznego stosowania powodują zainteresowanie hematologów i transplantologów. W wielu krajach krew pępowinowa stanowi główne żródło komórek macierzystych do transplantacji zatem istotnym problemem jest zwiększenie zasobów komórek macierzystych i wykorzystanie ich do transplantacji u niespokrewnionych pacjentów w modelu allogenicznym. Pewne ograniczenie do pobierania krwi pępowinowej stanowią wady płodu, zakażenia wirusowe, choroba nowotworowa zarówno u matki jak i dziecka oraz choroby współistniejące z ciążą, których leczenie niekorzystnie wpływa na parametry krwi płodu. Ponad to przeciwwskazaniem do pobierania krwi są ciężkie powikłania ciąży, w tym poród przedwczesny z masą urodzeniową dziecka poniżej 1500 g oraz okołoporodowe niedotlenienie płodu, gdyż czynniki te mogą wpływać na jakość i ilość krwi pępowinowej. Głównym problemem w procesie bankowania krwi pępowinowej jest pozyskanie materiału tkankowego o jak największej wartości transplantacyjnej. Zatem podejmuje się próby opracowania optymalnych warunków pobrania krwi pępowinowej, poprzez wybranie odpowiedniego antykoagulantu czy pożywki hodowlanej, ustalenie właściwej temperatury i czasu przechowywania krwi a także ustalenie wpływu sposobu ukończenia ciąży zapewniając w ten sposób najwyższą żywotność obecnych w niej komórek macierzystych. Interesującym zagadnieniem jest również wpływ wieku kobiety rodzącej oraz innych czynników położniczych na wartość transplantacyjną krwi pępowinowej. Dlatego wybór tematu pracy doktorskiej zasługuje na uznanie jest godny podkreślenia ze względu na potencjalne możliwości zastosowania w przyszłości komórek macierzystych z krwi pępowinowej w wielu chorobach układowych. 2
Przedstawiona praca została zredagowana z zachowaniem klasycznego podziału i zawarta jest na 91 stronach maszynopisu obejmujących spis treści, wykaz skrótów, wykaz tabel, wykaz rycin oraz wstęp, założenia i cel pracy, materiał i metody, wyniki, dyskusję, wnioski piśmiennictwo Ponadto praca zawiera streszczenie w języku polskim angielskim. Rozprawa napisana jest komunikatywnym językiem w oparciu o 100 pozycji piśmiennictwa, głównie z ostatnich lat i jest dobrze opracowana graficznie. Układ treści jest logiczny, tworzy spójną całość i odzwierciedla główne wątki dyskursu naukowego. Wstęp stanowi ciekawy fragment rozprawy i jest świadectwem rzetelnej wiedzy Autorki i jej dobrego przygotowania do podjęcia badań. Doktorantka w interesujący sposób, w oparciu o literaturę przedstawia najważniejsze informacje dotyczące definicji, rodzajów, epidemiologii komórek macierzystych oraz opisuje w sposób syntetyczny zagadnienia związane z ich rolą, występowaniem, sposobem pobierania i zastosowaniem. Świadczy to o przemyślanej i głębokiej wiedzy Autorki na temat komórek macierzystych oraz o umiejętności syntetycznego przedstawienia aktualnych problemów w badaniach nad komórkami macierzystymi. Cel pracy został trafnie wybrany a jego założenia w sposób jasny i precyzyjny omówione. Podjęto w pracy próbę określenia zależności między wiekiem kobiety rodzącej, a wybranymi właściwościami komórek macierzystych krwi pępowinowej. Ponieważ krew pępowinową pozyskiwano w przebiegu porodu fizjologicznego lub podczas elektywnego cięcia cesarskiego, ocenie poddano korelację pomiędzy sposobem rozwiązania ciąży a wiekiem rodzącej i wartością transplantacyjną komórek macierzystych krwi pępowinowej. Podjęto również próbę ustalenia związku pomiędzy wiekiem ciążowym, rodnością rodzącej i masą urodzeniową dziecka, a wybranymi właściwościami komórek macierzystych krwi pępowinowej. Tak zaplanowane badanie posłużyło ustaleniu optymalnego wieku kobiety dla pobrania materiału o najwyższej "jakości". Uważam wybranie takiego celu przeprowadzenia badan za ważne i potrzebne. W rozdziale Materiał i Metody Autorka dokonuje wnikliwej analizy grupy badanej oraz przedstawia zastosowane narzędzia badawcze. Metodyka badań dokładnie określa tok prowadzonych dociekań naukowych. Do badania zakwalifikowano 50 ciężarnych, bez objawów patologii ciążowej. Wiek ciężarnych zawierał sie w 3
przedziale od 18 do 38 lat i ciężarne podzielono na 4 grupy wiekowe. 34 kobiety urodziły drogami i siłami natury a u 16 wykonano elektywne cięcia cesarskie. Materiał do badań stanowiła krew pępowinowa pobrana od ciężarnych przebywających w Oddziale Ginekologiczno-Położniczym z Pododdziałem Ginekologii Onkologicznej Szpitala Zakonu Bonifratrów w Katowicach. Żywotność komórek macierzystych oraz zawartość komórek CD34+ oznaczono przy pomocy cystometrii przepływowej, natomiast zawartość komórek jądrzastych oznaczono przy użyciu analizatora hematologicznego. W rozdziale Wyniki na uznanie zasługuje sposób opracowania i prezentacji wyników badań. Warto w tym miejscu podkreślić skrupulatność Doktorantki i olbrzymi nakład pracy, jaki włożyła w uzyskanie wyników badań i ich analizę. Opisując wyniki badań Doktorantka przejrzyście przedstawiła uzyskane dane, zamieszczając je zarówno w formie opisowej jak i formie graficznej w VI tabelach i 38 rycinach. Zaobserwowano statystycznie istotny wzrost liczby WBC we krwi pępowinowej i stwierdzono najwyższą ich średnią wartość od rodzących w wieku co najmniej 35 lat. Stwierdzono również wyższy średni poziom WBC u rodzących drogami i siłami natury w porównaniu z ciężarnymi u których wykonano elektywne cięcie cesarskie. Zaobserwowano wyższą średnią zawartość WBC w zależności od długości czasu trwania ciąży. Oceniane parametry nie wpłynęły w sposób istotny statystycznie na żywotność komórek oraz zawartość komórek CD34+ we krwi pępowinowej. Wyniki badań pozwoliły Autorce na stwierdzenie, że, że najlepszy materiał tkankowy stanowi krew pępowinowa pobrana okołoporodowo od pacjentek w wieku co najmniej 35 lat, rodzących siłami natury w 40 tygodniu ciąży i później. W rozdziale Dyskusja Doktorantka wykazuje dużą rzeczowość i dojrzałość badacza. Autorka porównuje uzyskane wyniki badań własnych z danymi z piśmiennictwa obejmującego 100 pozycji. Jest to interesujący o dużej wartości merytorycznej rozdział pracy, oparty na wystarczającej liczbie pozycji piśmiennictwa pochodzącego w większości z ostatnich lat. Tą część całej rozprawy czyta się z wielkim zainteresowaniem. Doktorantka dobrze zna zagadnienie, o którym pisze. Świadczy o tym swoboda w prowadzeniu dyskusji oraz konfrontowanie własnych wyników z licznie cytowanymi pracami innych autorów. Warto podkreślić, iż Doktorantka zgromadziła i wykorzystała dużą liczbę 4
danych doświadczalnych i klinicznych, dotyczących omawianego tematu. Ta część rozprawy wskazuje na dojrzałość naukową mgr Beaty Bielec Doktorantka z dużym krytycyzmem i ostrożnością interpretuje własne wyniki porównując je z rezultatami badań innych autorów i dokonuje krytycznej analizy przyjętych na wstępie hipotez badawczych w oparciu o wyniki badań własnych. Zamierzony cel badań został osiągnięty. Doktorantka odpowiedziała na postawione pytania weryfikując wysunięte hipotezy. Przeprowadzone pracochłonne szczegółowe badania zaowocowały sformułowaniem cztery wniosków, które odpowiadają celom pracy. Sugeruję we wnioskach zmianę słowa zawartość na słowo ilość. Z obowiązku recenzenta muszę stwierdzić, iż zauważyłem w tekście pojedyncze błędy maszynowe i stylistyczne łatwe do usunięcia przy przygotowywaniu manuskryptu do publikacji, które nie wpływają na całościową ocenę dysertacji. Podsumowując stwierdzam, że praca będąca przedmiotem niniejszej recenzji jest oryginalną w odniesieniu i co do problematyki podjętych badań. Duży wkład pracy, rzeczowy charakter dyskusji oraz zdolność właściwego wnioskowania skłania do pozytywnej oceny przedstawionej pracy. Z obowiązku recenzenta chciałabym zauważyć, że Doktorantka nie ustrzegła się błędów stylistycznych i interpunkcyjnych oraz tzw. literówek. Powyższe uwagi mają jednak jedynie charakter edytorski i w żaden sposób nie umniejszają wysokiej, merytorycznej wartości pracy. Przedstawiona mi do recenzji praca spełnia wymagania stawiane rozprawom doktorskim w ustawie o stopniach i tytułach naukowych i dlatego wnoszę do Wysokiej Rady Wydziału Nauk o Zdrowiu Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach o dopuszczenie mgr Beaty Bielec do dalszych etapów przewody doktorskiego. 5