(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 1622648 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 24.03.2004 0474942.7 (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: 30.06.20 Europejski Biuletyn Patentowy 20/26 EP 1622648 B1 (13) T3 (1) Int. Cl. A61K48/00 C07H21/00 C12N1/20 (2006.01) (2006.01) (2006.01) (4) Tytuł wynalazku: Szczepionki DNA przeciwko wzrostowi nowotworów i sposoby ich stosowania (30) Pierwszeństwo: US2003047009P 24.03.2003 (43) Zgłoszenie ogłoszono: 08.02.2006 Europejski Biuletyn Patentowy 2006/06 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: 30.11.20 Wiadomości Urzędu Patentowego 11/20 (73) Uprawniony z patentu: THE SCRIPPS RESEARCH INSTITUTE, La Jolla, US (72) Twórca (y) wynalazku: PL/EP 1622648 T3 XIANG Rong, San Diego, US ZHOU He, San Diego, US REISFELD Ralph A., La Jolla, US (74) Pełnomocnik: Polservice Kancelaria Rzeczników Patentowych Sp. z o.o. rzecz. pat. Bartnik Urszula 00-90 Warszawa skr. poczt. 33 Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 1 20 2 30 14/2637 EP 1 622 648 B1 Opis Odniesienie do zgłoszeń pokrewnych [0001] Niniejsze zgłoszenie zastrzega korzyści tymczasowego zgłoszenia Stanów Zjednoczonych o numerze seryjnym 60/47,009, złożonego 24 marca 2003, którego treść włącza się do niniejszego opisu przez przywołanie. PRAWA RZĄDU [0002] Niniejszego wynalazku dokonano przy wsparciu rządu, z wykorzystaniem grantów o nr. 1R01CA8386-01 i CA8386 z National Institutes of Health (Narodowych Instytutów Zdrowia), grantu nr 9RT00-17 z Tobacco Related Disease Research gram (gramu Badań Naukowych nad Chorobami Związanymi z Paleniem Tytoniu) i grantów nr DAMD17-02-1-0137 i DAMD17-02-1-062 z Department of Defense (Departamentu Obrony). Rząd ma pewne prawa do niniejszego wynalazku. DZIEDZINA WYNALAZKU [0003] Niniejszy wynalazek dotyczy szczepionek z kwasu deoksyrybonukleinowego (DNA), kodujących odpowiednie cząsteczki skutecznie wywołujące odpowiedź immunologiczną przeciwko komórkom nowotworowym. Bardziej szczegółowo, przedmiotem niniejszego wynalazku są szczepionki DNA kodujące związane z nowotworami białko z rodziny inhibitorów apoptozy (ang. Inhibitor of Apoptosis IAP) i immunoaktywny produkt genowy. Przedmiotem niniejszego wynalazku są również sposoby zastosowania szczepionek DNA do zahamowania wzrostu guza.

3 1 20 2 30 STAN TECHNIKI [0004] Szczepionki stosuje się do zapewnienia długotrwałej ochrony przeciwko wielu chorobom poprzez podanie bardzo ograniczonej ilości środka profilaktycznego, który stymuluje układ immunologiczny organizmu do niszczenia patogenów chorobowych, zanim będą one w stanie proliferować i wywołać efekt patologiczny. Różne podejścia do szczepionek i szczepień opisano w Bernard R. Glick i Jack J. Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA, wydanie drugie, ASM Press, str. 23-276 (1998). [000] Szczepienie jest to sposób indukowania własnego układu immunologicznego organizmu do wyszukiwania i niszczenia czynnika zakaźnego, zanim wywoła on odpowiedź patologiczną. Typowo, szczepionki są albo żywymi, lecz atenuowanymi, czynnikami zakaźnymi (wirusami lub bakteriami), albo zabitą postacią czynnika zakaźnego. Szczepionka zawierająca żywe bakterie lub wirusy musi być niepatogenna. Typowo, hodowlę bakteryjną lub wirusową poddaje się atenuacji (osłabieniu) przez obróbkę fizyczną lub chemiczną. Mimo, że czynnik jest niewirulentny, może jednak wywoływać odpowiedź immunologiczną u pacjenta leczonego szczepionką. [0006] Odpowiedź immunologiczna jest wywoływana przez antygeny, które mogą stanowić albo swoiste makrocząsteczki, albo czynnik zakaźny. Te antygeny są zwykle białkami, polisacharydami, lipidami lub glikolipidami, rozpoznawanymi jako obce przez limfocyty znane jako limfocyty B i limfocyty T.

4 1 20 2 30 Ekspozycja obu typów limfocytów na antygen wywołuje szybką odpowiedź pod postacią dzielenia i różnicowania się komórek, powodując tworzenie się klonów eksponowanych limfocytów. Limfocyty B wytwarzają komórki plazmatyczne, które z kolei wytwarzają białka zwane przeciwciałami (ang. antibody Ab), wybiórczo wiążące się z antygenami obecnymi na czynniku zakaźnym, neutralizując przez to lub unieczynniając patogen (odporność humoralna). W niektórych przypadkach odpowiedź limfocytu B wymaga wsparcia limfocytów T CD4 pomocniczych (ang. helper). [0007] Wyspecjalizowany klon limfocytów T, tworzący się w odpowiedzi na ekspozycję na antygen, należy do cytotoksycznych limfocytów T (CTL), zdolnych do wiązania się z patogenami i tkankami prezentującymi antygen i do eliminowania ich (odporność komórkowa). W niektórych przypadkach komórka prezentująca antygen (APC), taka jak komórka dendrytyczna, będzie zamykać patogen lub inną obcą komórkę w otoczkę poprzez endocytozę. APC poddaje następnie obróbce antygeny z komórek i prezentuje te antygeny w postaci kompleksu cząsteczka układu zgodności tkankowej:peptyd receptorowi limfocytu T (TCR) na cytotoksycznych limfocytach T, stymulując przez to odpowiedź immunologiczną. [0008] Odporność humoralna cechująca się tworzeniem swoistych przeciwciał jest zwykle najskuteczniejsza przeciwko ostrym zakażeniom bakteryjnym i nawracającym zakażeniom wirusowym, natomiast odporność komórkowa jest najskuteczniejsza przeciwko zakażeniom wirusowym, przewlekłym wewnątrzkomórkowym zakażeniom bakteryjnym i

1 20 2 30 zakażeniom grzybiczym. Wiadomo również, że odporność komórkowa chroni przed nowotworami i odpowiada za odrzucanie przeszczepionych narządów. [0009] Przeciwciała przeciwko antygenom, powstałe wskutek uprzednich zakażeń, pozostają wykrywalne we krwi przez bardzo długi czas, umożliwiając ustalenie, czy organizm był uprzednio eksponowany na dany patogen. Po ponownej ekspozycji na ten sam patogen, układ immunologiczny skutecznie zapobiega ponownemu zakażeniu przez eliminację czynnika patogennego, zanim zdąży on proliferować i wywołać odpowiedź patogenną. [00] Niekiedy taką samą odpowiedź immunologiczną, jaka byłaby wywołana przez patogen, można wywołać również czynnikiem niepatogennym, prezentującym ten sam antygen jako patogen. W ten sposób można chronić pacjenta przed późniejszą ekspozycją na patogen, mimo że jego organizm nie zwalczył uprzednio zakażenia. [0011] Nie wszystkie czynniki zakaźne można jednak łatwo hodować i unieczynniać, co jest niezbędne do uzyskania szczepionki. Współczesne techniki rekombinacji DNA umożliwiają wytwarzanie nowych szczepionek, przezwyciężając to ograniczenie. Można wytworzyć czynniki zakaźne pozbawione genów patogennych, co pozwala na wykorzystanie jako szczepionki żywej, niewirulentnej postaci drobnoustroju. Można również wytworzyć drobnoustrój względnie niepatogenny, taki jak E. coli, prezentujący antygeny powierzchni komórkowej patogennego nośnika. Układ immunologiczny pacjenta zaszczepionego takim transformowanym nośnikiem jest oszukiwany i tworzy przeciwciała przeciwko

6 1 20 2 30 patogenowi. Białka antygenowe czynnika patogennego można wytwarzać i uzyskiwać ich ekspresję u gatunku niepatogennego; białka antygenowe można izolować i oczyszczać z wytworzeniem szczepionki podjednostkowej. Korzystnymi cechami szczepionek podjednostkowych jest ich stabilność, bezpieczeństwo i to, że są chemicznie dobrze zdefiniowane; koszt ich wytwarzania może być jednak czynnikiem ograniczającym. [0012] W ostatnich latach pojawiło się nowe podejście do szczepionek, określane szerokim terminem immunizacji genetycznej. W tej metodzie do komórek immunizowanego pacjenta wprowadza się w sposób umożliwiający działanie gen kodujący antygen czynnika patogennego. Poddawane obróbce komórki, korzystnie komórki prezentujące antygen (APC), takie jak komórki dendrytyczne, ulegają transformacji i wytwarzają białka antygenowe patogenu. Te wytworzone in vivo antygeny wyzwalają następnie pożądaną odpowiedź immunologiczną u gospodarza. Materiałem genetycznym wykorzystywanym w takich szczepionkach genetycznych może być konstrukt DNA lub RNA. Często polinukleotyd kodujący antygen wprowadza się wraz z innymi promotorowymi sekwencjami polinukleotydowymi celem nasilenia insercji, replikacji lub ekspresji genu. [0013] Szczepionki DNA kodujące geny antygenu można wprowadzać do komórek gospodarza (pacjenta) z użyciem różnych układów podawania. Do tych układów podawania należą układy prokariotyczne i wirusowe. W jednej z metod do inokulacji komórek gospodarza wykorzystuje się na przykład wektor wirusowy, taki jak wirus krowianki, do którego wprowadza się nowy materiał genetyczny.

7 1 20 2 30 Zamiast tego materiał genetyczny można włączać do wektora plazmidowego lub można go dostarczać bezpośrednio do komórek gospodarza jako nagi polinukleotyd, to znaczy po prostu jako oczyszczone DNA. Dodatkowo DNA można stabilnie transfekować do atenuowanych bakterii, takich jak Salmonella typhimurium. Po doustnym zaszczepieniu pacjenta transformowaną Salmonella, bakterie są transportowane do kępek Peyera w jelitach (to znaczy do wtórnych tkanek limfoidalnych), które następnie stymulują odpowiedź immunologiczną. [0014] Szczepionki DNA umożliwiają immunizację przeciwko stanom chorobowym niewywoływanym przez tradycyjne patogeny, a mianowicie przeciwko chorobom genetycznym i nowotworowym. Typowo genetyczna szczepionka przeciwnowotworowa wprowadza do APC gen kodujący antygen i tak transformowane APC wytwarzają antygeny przeciwko swoistemu typowi komórek nowotworowych. Skuteczna szczepionka ogólna przeciwko wielu typom nowotworów może zatem zawierać liczne indywidualne szczepionki przeciwko każdemu typowi komórek nowotworowych, przeciwko którym organizm ma być immunizowany. [001] Białka inhibitory apoptozy (to znaczy białka z rodziny IAP) są klasą naturalnych antygenów, ulegających ekspresji w wielu różnych komórkach nowotworowych. Jak sugeruje nazwa, te białka, w swej naturalnej postaci, hamują apoptozę (to znaczy zaprogramowaną śmierć komórek), co z kolei może prowadzić do oporności komórek nowotworowych na indukujące apoptozę środki chemioterapeutyczne, takie

8 1 20 2 30 jak etopozyd. Do przykładów białek z rodziny IAP należy IAP związane z chromosomem X (XIAP), NAIP, ciapi (znane również jako BIRC2), ciap2 (znane również jako BIRC3), BRUCE (znane również jako BIRC6), surwiwina (znana również jako BIRC) i liwina (znana również jako BIRC7, KIAP i ML-IAP). Do rodziny białek IAP ssaków należą białka z trzema domenami BIR (na przykład XIAP, ciapi, ciap2 i NAIP), jak również białka z jedną domeną BIR (na przykład surwiwina i liwina). [0016] Tamm i wsp., Cancer Res. 1998; 8(23):31-20, opisali ekspresję ludzkiej surwiwiny w 60 ludzkich liniach komórek nowotworowych. Tamm i wsp. donieśli także, że zarówno surwiwina, jak i XIAP skutecznie hamują zaprogramowaną śmierć komórek (apoptozę), indukowaną przez poddanie komórek nowotworowych działaniu środków indukujących apoptozę, takich jak Bax lub Fas (CD9). Opisuje się, że surwiwina i inne białka z rodziny IAP hamują apoptozę przez wiązanie się z proteazami śmierci komórek efektorowych, na przykład z kaspazą 3 i kaspazą 7. Mutacje białek z rodziny IAP mogą prowadzić do redukcji aktywności hamowania apoptozy lub nawet do aktywności indukującej apoptozę w porównaniu z aktywnością białka typu dzikiego z rodziny IAP. Uważa się, że aktywność antyapoptotyczna białek z rodziny IAP jest związana z domeną BIR. [0017] Opisuje się, że surwiwina jest obecna w komórkach najczęściej występujących nowotworów człowieka, w tym w rakach płuca, prostaty, sutka i trzustki. Surwiwinę zidentyfikowano również w chłoniakach nieziarniczych o wysokim stopniu złośliwości, lecz nie w chłoniakach nieziarniczych o

9 1 20 2 30 niskim stopniu złośliwości. Donosi się, że surwiwina jest obecna w komórkach prawidłowych w czasie rozwoju płodowego, lecz w odróżnieniu od większości innych białek z rodziny IAP, surwiwina jest niewykrywalna w prawidłowych tkankach człowieka dorosłego. Zob. Ambrosini i wsp., Nat. Med. 1997; 3(8):917-21. [0018] Liwinę wykrywa się w niektórych tkankach organizmów dorosłych i w tkankach zarodkowych. Opisywano podwyższenie poziomu ekspresji liwiny w czerniakach, komórkach raka okrężnicy, komórkach raka pęcherza moczowego i komórkach raka płuca. Opisuje się dwa warianty splicingowe liwiny; oba zawierają pojedynczą domenę BIR. Wariant alfa o pełnej długości zawiera 298 reszt aminokwasowych, natomiast wariant beta 280 reszt aminokwasowych. [0019] Białka z rodziny IAP zidentyfikowano również u pewnej liczby gatunków innych niż człowiek, w tym u ssaków, takich jak mysz, płazów, takich jak gatunek Xenopus (afrykańska platana szponiasta), owadów, takich jak gatunki Drosophila i bakulowirusów. [0020] Powszechność i wysoka selektywność ekspresji surwiwiny w komórkach nowotworowych czyni zeń potencjalnie użyteczny marker diagnostyczny chorób nowotworowych. Na przykład, Rohayem i wsp. Cancer Res. 2000; 60:181-17 jakoby zidentyfikowali autoprzeciwciała przeciwko surwiwinie u ludzi z rakiem płuca i z rakiem jelita grubego. [0021] Surwiwinę identyfikuje się także jako cel terapii przeciwnowotworowej. Hamujący wpływ surwiwiny na kaspazę 3 i kaspazę 7 odgrywa rolę w oporności komórek nowotworowych na różne chemioterapeutyki

1 20 2 30 stymulujące apoptozę. Opisywano, że oligonukleotyd antysensowny, ukierunkowany na ekspresję surwiwiny, powoduje regulację w dół ekspresji surwiwiny w komórkach gruczolakoraka i uwrażliwia komórki nowotworowe na środek chemioterapeutyczny etopozyd. Zob. Olie i wsp. Cancer Res. 2000; 60:280-9 oraz Mesri i wsp. J. Clinical Res., 2001; 8:981-990. [0022] Cytokiny są to białka i polipeptydy wytwarzane przez komórki, mogące wpływać na zachowanie innych komórek, na przykład na proliferację komórek, różnicowanie komórek, regulację odpowiedzi immunologicznej, hematopoezę i odpowiedź zapalną. Cytokiny dzieli się na rodziny, takie jak chemokiny, hematopoetyny, immunoglobuliny, czynniki martwicy nowotworów oraz różne cząsteczki nieprzypisane do żadnej z grup. Zob. ogólnie Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, wydanie poprawione, Oxford University Press, 2000 i C. A. Janeway, P. Travers, M. Walport i M. Schlomchik, Immunobiology, wydanie piąte, Garland Publishing, 2001 (określane w dalszym ciągu niniejszego zgłoszenia jako Janeway i Travers ). W załączniku III, str. 677-679 Janeway i Travers przedstawiono zwięzłą klasyfikację cytokin, którą włącza się do niniejszego opisu przez przywołanie. [0023] Do hematopoetyn należą na przykład erytropoetyna, interleukina 2 (IL-2, 133-aminokwasowe białko wytwarzane przez limfocyty T, zaangażowane w proliferację limfocytów T), IL-3, IL-4, IL-, IL-6, IL- 7, IL-9, IL-11, IL-13, IL-1 (114-aminokwasowe białko IL-2-podobne, stymulujące wzrost nabłonka jelitowego,

11 1 20 2 30 limfocytów T i komórek NK), czynnik stymulujący wzrost kolonii granulocytów (G-CSF), czynnik stymulujący wzrost kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF), onkostatyna M (OSM) i czynnik hamujący białaczkę (ang. leukemia inhibitory factor LIF). [0024] Do interferonów należą na przykład IFN-α, IFN-β i IFN-γ (143-aminokwasowe homodimeryczne białko wytwarzane przez limfocyty T i komórki NK, odgrywające rolę w aktywacji makrofagów, zwiększonej ekspresji cząsteczek MHC i komponent obróbki antygenów, zmian klas IG i supresji T H 2). [002] Do immunoglobulin należą na przykład B7.1 (CD80) i B7.2 (CD86); obie te immunoglobuliny wspólnie stymulują odpowiedź limfocytów T. [0026] Do rodziny czynników martwicy nowotworów (TNF) należy na przykład TNF-a, TNF-β (limfotoksyna), limfotoksyna β (LT-β), ligand CD40, ligand Fas, ligand CD27, ligand CD30, ligand 4-1BB, ligand TRAIL i ligand OPG. [0027] Spośród różnych cytokin nieprzypisanych do żadnej konkretnej rodziny można wymienić na przykład czynnik wzrostu nowotworów β (TGF-β), IL-1α, IL-1β, IL- 1 RA, IL-, IL-12 (czynnik stymulujący komórki NK; heterodimer o łańcuchu 197-aminokwasowym i łańcuchu 306-aminokwasowym, odgrywający rolę w aktywacji komórek NK i indukcji różnicowania limfocytów T do komórek T H 1- podobnych), czynnik hamujący makrofagi (MIF), IL-16, IL-17 (czynnik indukujący wytwarzanie cytokin, indukujący wytwarzanie cytokin w nabłonkach, śródbłonkach i fibroblastach) i IL-18.

12 1 20 2 30 [0028] Chemokiny są rodziną cytokin, obejmującą względnie drobnocząsteczkowe białka i polipeptydy o typie chemoatraktantów, stymulujące migrację i aktywację różnych komórek, na przykład migrację leukocytów (na przykład fagocytów i limfocytów). Chemokiny odgrywają rolę w zapaleniu i innych typach odpowiedzi immunologicznej. Chemokiny klasyfikuje się na rodziny, takie jak chemokiny C, chemokiny CC, chemokiny CXC i chemokiny CX 3 C. Nazwy odnoszą się do liczby i rozmieszczenia reszt cysteinowych w cząsteczkach; C chemokiny zawierające jedną cysteinę, CC chemokiny zawierające dwie ciągłe cysteiny, CXC chemokiny zawierające dwie cysteiny rozdzielone pojedynczą resztą aminokwasową i CX 3 C chemokiny zawierające dwie cysteiny rozdzielone trzema resztami aminokwasowymi. Chemokiny wchodzą w interakcję z pewnymi receptorami chemokin, obecnymi na powierzchni komórki. Zob. Janeway i Travers, Appendix IV, str. 680; publikację tę włącza się do niniejszego opisu przez przywołanie. [0029] Dodatkowo chemokiny mogą wykazywać aktywność immunomodulującą i odgrywają rolę w przeciwnowotworowej odpowiedzi immunologicznej. Na przykład opisywano, że mysia 6Ckina/SLC, mysi analog ludzkiej chemokiny wtórnej tkanki limfoidalnej (SLC), obecnie powszechnie zwana CCL21, indukuje odpowiedź przeciwnowotworową w linii komórek nowotworowych raka okrężnicy C-26. Zob. Vicari i wsp. J. Immunol. 2000; 16(4):1992-2000. Ludzka CCL21 i jej mysi odpowiednik 6Ckina/SLC są klasyfikowane jako chemokiny CC, wchodzące w interakcję z receptorem chemokiny CCR7. Vicari i wsp. opisują

13 1 20 2 30 także, że mysia 6Ckina/SLC (muccl21) jest ligandem receptora chemokiny CXCR3. Ludzka CCL21, mysia muccl21 i wiele innych chemokin odgrywa rolę w regulowaniu różnych komórek układu immunologicznego, takich jak komórki dendrytyczne, limfocyty T i komórki NK. [0030] Mig i IP- są chemokinami CXC, wchodzącymi w interakcje z receptorem CXCR3, związanym z aktywowanymi limfocytami T. Limfotaktyna jest to chemokina C, wchodząca w interakcje z receptorem XCR1 związanym z limfocytami T i komórkami NK. Fraktalkina jest to chemokina CX 3 C, wchodząca w interakcje z receptorem CX 3 CR1 związanym z limfocytami T, monocytami i neutrofilami. [0031] Komórki NK są to duże, zawierające ziarnistości limfocyty, rozpoznające i niszczące komórki zakażone wirusem. Komórki NK podlegają regulacji na drodze interakcji immunomodulujących ligandów polipeptydowych z receptorami na powierzchni komórki NK. Na przykład do ligandów receptora NKG2D, które mogą regulować aktywność komórek NK, należą chemokiny, takie jak muccl21, i indukowalne przez stres ligandy polipeptydowe, takie jak antygeny związane z łańcuchem MHC klasy I i białka wiążące UL16. Opisuje się, że mysi H60 peptyd antygenu mniejszego układu zgodności tkankowej wiąże także receptor NKG2D. Zob. na przykład Robertson i wsp. Cell Immunol. 2000; 199(1):8-14; Choi i wsp., Immunity 2002, 17():93-603 i Farag i wsp., Blood, 2002; 0(6): 193-1947. [0032] Niniejszy wynalazek spełnia istniejące zapotrzebowanie na szczepionki, które mogą stymulować ogólną odpowiedź immunologiczną przeciwko komórkom

14 1 20 2 30 nowotworowym przez zapewnienie szczepionki DNA kodującej związane z nowotworami białko z rodziny IAP i immunoaktywny produkt genowy w pojedynczym wektorze. KRÓTKI OPIS WYNALAZKU [0033] Szczepionka DNA skutecznie wywołująca odpowiedź immunologiczną przeciwko komórkom nowotworowym zawiera konstrukt DNA, zdolny do kodowania białka surwiwiny i immunoaktywnego produktu genowego w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku. Konstrukt DNA jest włączony w sposób umożliwiający działanie do wektora, takiego jak atenuowana bakteria (na przykład atenuowany wektor Salmonella typhimurium). Szczepionka DNA zawiera polinukleotyd kodujący co najmniej białko surwiwinę wraz z polinukleotydem kodującym immunoaktywny produkt genowy. Korzystnie immunoreaktywnym produktem genowym kodowanym przez konstrukt DNA jest cytokina, ligand receptora powierzchni komórek NK lub podobna cząsteczka immunoreaktywna. [0034] W jednym z wykonań szczepionka DNA korzystnie zawiera DNA zdolne do kodowania białka surwiwiny dobranego z grupy obejmującej (a) surwiwinę ludzką typu dzikiego o sekwencji reszt aminokwasowych według SEQ ID nr 2, (b) immunogenny homolog surwiwiny ludzkiej typu dzikiego o sekwencji reszt aminokwasowych w co najmniej 80% identycznej z SEQ ID nr 2 (c) wariant splicingowy surwiwiny ludzkiej o sekwencji reszt aminokwasowych według SEQ ID nr 23 (d) wariant splicingowy surwiwiny ludzkiej o sekwencji reszt aminokwasowych według SEQ ID nr 24 i (e) fragment białka surwiwiny wiążący się z cząsteczką MHC klasy I i rozpoznawany przez cytotoksyczne limfocyty T.

1 1 20 2 30 [003] Do korzystnych cytokin należą chemokiny, takie jak ludzka CCL21, mysia CCL21, limfotaktyna, fraktalkina, IP- i tym podobne, hematopoetyny, takie jak IL-2, IL-1 i tym podobne, interferony, takie jak IFN-γ i tym podobne, jak również inne cytokiny związane z migracją lub proliferacją limfocytów T i komórek NK, takie jak IL-12, IL-17 i tym podobne. [0036] Korzystnymi ligandami receptorów powierzchni komórek NK są indukowalne przez stres białka, takie jak ludzkie MICA, ludzkie MICB, ludzkie ULBP1, ludzkie ULBP2, ludzkie ULBP3 i tym podobne, wiążące się z receptorem powierzchni komórek NKG2D. Szczególnie korzystnymi ligandami NKG2D są MICA i MICB. [0037] W szczepionkach mogą być również obecne konwencjonalne adiuwanty, takie jak ałun, emulsje typu olej w wodzie, środki konserwujące i tym podobne. Szczepionki DNA według niniejszego wynalazku stymulują odpowiedź immunologiczną przeciwko komórkom nowotworowym, w tym stymulują apoptozę komórek nowotworowych, hamując przez to wzrost guza i powstawanie przerzutów. [0038] W sposobie stanowiącym aspekt niniejszego wynalazku stosuje się szczepionkę DNA do zapewnienia długotrwałego hamowania wzrostu guza u zaszczepionego pacjenta. Pacjentowi wymagającemu hamowania wzrostu guza podaje się (korzystnie doustnie) szczepionkę DNA, zawierającą konstrukt polinukleotydowy zdolny do kodowania białka surwiwiny i immunoaktywnego produktu genowego w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku w ilości wystarczającej do wywołania odpowiedzi immunologicznej przeciwko komórkom nowotworowym.

16 1 20 2 30 [0039] Szczepionki według niniejszego wynalazku są korzystne w leczeniu różnych typów nowotworów. Stosowanie szczepionek według niniejszego wynalazku może być korzystne na przykład u pacjentów cierpiących na raka płuca, raka jelita grubego, czerniaka i tym podobne. KRÓTKI OPIS RYSUNKÓW [0040] Na rysunkach Fig. 1 przedstawia sekwencję kwasu nukleinowego kodującego surwiwinę ludzką, SEQ ID nr 1; Fig. 2 przedstawia sekwencję reszt aminokwasowych surwiwiny ludzkiej, SEQ ID nr 2; Fig. 3 przedstawia sekwencję kwasu nukleinowego kodującego mysie TIAP, SEQ ID nr 3; Fig. 4 przedstawia sekwencję reszt aminokwasowych mysiego TIAP, SEQ ID nr 4; Fig. przedstawia homologię białka między surwiwiną ludzką a mysim TIAP; Fig. 6 przedstawia sekwencję kwasu nukleinowego kodującego ludzkie SLC (CCL21), SEQ ID nr ; Fig. 7 przedstawia sekwencję reszt aminokwasowych ludzkiego SLC (CCL21), SEQ ID nr 6; Fig. 8 przedstawia sekwencję kwasu nukleinowego kodującego mysią 6Ckinę/SLC (muccl21), SEQ ID nr 7; Fig. 9 przedstawia sekwencję reszt aminokwasowych mysiej 6Ckiny/SLC (muccl21), SEQ ID nr 8; Fig. przedstawia homologię białka między ludzkim SLC (CCL21) a mysią 6Ckiną/SLC (muccl21); Fig. 11 przedstawia częściową sekwencję kwasu nukleinowego kodującego mysi peptyd antygenu mniejszego układu zgodności tkankowej H60, SEQ ID nr 9;

17 1 20 2 30 Fig. 12 przedstawia częściową sekwencję reszt aminokwasowych peptydu antygenu mniejszego układu zgodności tkankowej H60, SEQ ID nr ; Fig. 13 przedstawia schematycznie konstrukty DNA kodujące białko surwiwinę (surwiwina mysia, znana również jako TIAP) i immunomodulującą chemokinę (CCL21, znana również jako SLC) w wektorze pbudce4.1; Fig. 14A graficznie przedstawia średnią objętość nowotworu w przypadku przerzutów do płuc raka płuca Lewisa u myszy otrzymujących kontrolny bufor (E), szczepionkę kontrolną, zawierającą pusty wektor (D), szczepionkę DNA zawierającą chemokinę (C), szczepionkę zawierającą białko surwiwinę (B) i szczepionkę według wynalazku (A); Fig. 14B obejmuje obrazy typowych przerzutów guza płuca, wyciętych u myszy zaszczepionych w sposób opisany na Fig.14A; Fig. 1 przedstawia cytotoksyczność zależną od limfocytów T, indukowaną przez opisane na Fig. 14A szczepionki DNA przeciwko komórkom raka płuca D121; wykres przedstawia odsetek lizy (oś Y) dla trzech różnych stosunków komórek efektorowych do komórek docelowych (E/T) dla każdego szczepienia (to znaczy pierwszy punkt danych: 0:1; drugi punkt danych: 0:1, trzeci punkt danych: 2:1); Fig. 16 ilustruje graficznie regulowaną w górę ekspresję cząsteczek aktywacji limfocytów T u myszy zaszczepionych szczepionką według wynalazku, określoną przez analizę metodą cytometrii przepływowej; Fig. 17 ilustruje graficznie zwiększenie ekspresji cząsteczek kostymulujących przez komórki dendrytyczne

18 1 20 2 30 po szczepieniach myszy szczepionką według wynalazku i różnymi szczepionkami kontrolnymi; Fig. 18 ilustruje indukcję wewnątrzkomórkowego uwalniania cytokin po szczepieniach myszy szczepionką według wynalazku i różnymi szczepionkami kontrolnymi, określoną przez analizę metodą cytometrii przepływowej; Fig. 19 ilustruje wykresy FACS, dowodzące zwiększenia apoptozy w komórkach guza płuca D 121 po szczepieniu myszy szczepionką według wynalazku i różnymi szczepionkami kontrolnymi (A) 3 godziny po szczepieniu i (B) 24 godziny po szczepieniu; Fig. 20 przedstawia schematycznie ekspresję konstruktów zawierających TIAP i peptyd antygenu mniejszego układu zgodności tkankowej H60; Fig. 21 ilustruje graficznie dane z testów cytotoksyczności splenocytów izolowanych od myszy zaszczepionych szczepionką według wynalazku; Fig. 22 przedstawia płuca usunięte myszom zaszczepionym w sposób opisany w przykładzie (na górze) i wykres słupkowy (na dole) średniej masy płuca myszy z grup terapeutycznych; Fig. 23 stanowi wykres odsetka przeżycia myszy zaszczepionych i eksponowanych następnie na komórki guza CT-26; Fig. 24 ilustruje ekspresję peptydu H60 (A) i musurwiwiny (B); Fig. 2 ilustruje sekwencję kwasu nukleinowego kodującą wariant CCL21b 6CKiny/SLC, SEQ ID nr 11; Fig. 26 ilustruje sekwencję reszt aminokwasowych wariantu CCL21b 6CKiny/SLC, SEQ ID nr 12;

19 1 20 2 30 Fig. 27 ilustruje sekwencję kwasu nukleinowego kodującą ludzki MICA, SEQ ID nr 13; Fig. 28 ilustruje sekwencję reszt aminokwasowych ludzkiego MICA, SEQ ID nr 14; Fig. 29 ilustruje sekwencję kwasu nukleinowego kodującą ludzki MICB, SEQ ID nr 1; Fig. 30 ilustruje sekwencję reszt aminokwasowych ludzkiego MICB, SEQ ID nr 16; Fig. 31 ilustruje sekwencję kwasu nukleinowego kodującą ludzki ULBP1, SEQ ID nr 17; Fig. 32 ilustruje sekwencję reszt aminokwasowych ludzkiego ULBP1, SEQ ID nr 18; Fig. 33 ilustruje sekwencję kwasu nukleinowego kodującą ludzki ULBP2, SEQ ID nr 19; Fig. 34 ilustruje sekwencję reszt aminokwasowych ludzkiego ULBP2, SEQ ID nr 20; Fig. 3 ilustruje sekwencję kwasu nukleinowego kodującą ludzki ULBP3, SEQ ID nr 21; Fig. 36 ilustruje sekwencję reszt aminokwasowych ludzkiego ULBP3, SEQ ID nr 22; Fig. 37 ilustruje sekwencję reszt aminokwasowych ludzkiego wariantu splicingowego surwiwiny surwiwiny 2B (SEQ ID nr 23) i wariantu splicingowego surwiwiny AEx3 (SEQ ID nr 24); Fig. 38 stanowi reprodukcję zapisu w GENBANK dla nr. akcesyjnego NP 00922, dotyczącego wariantów allelicznych MICB; Fig. 39 przedstawia sekwencję kwasu nukleinowego kodującego pełnej długości wariant splicingowy ludzkiej liwiny alfa, SEQ ID nr 26;

20 1 20 2 30 Fig. 40 przedstawia sekwencję reszt aminokwasowych wariantu splicingowego ludzkiej liwiny alfa, SEQ ID nr 27; Fig. 41 przedstawia sekwencję kwasu nukleinowego kodującego wariant splicingowy ludzkiej liwiny beta, SEQ ID nr 28; Fig. 42 przedstawia sekwencję reszt aminokwasowych wariantu splicingowego ludzkiej liwiny beta, SEQ ID nr 29. SZCZEGÓŁOWY OPIS KORZYSTNYCH WYKONAŃ [0041] Szczepionka DNA skutecznie wywołująca odpowiedź immunologiczną przeciwko komórkom nowotworowym zawiera konstrukt DNA, kodujący w sposób umożliwiający działanie białko surwiwinę i immunoaktywny produkt genowy. Termin konstrukt DNA w rozumieniu niniejszego opisu i w załączonych zastrzeżeniach oznacza syntetyczną strukturę DNA, która może ulegać transkrypcji w komórkach docelowych. Konstrukt może zawierać liniowy kwas nukleinowy, na przykład oczyszczone DNA, DNA włączone do wektora plazmidowego lub DNA włączone do dowolnego innego wektora nadającego się do wprowadzania DNA do komórek gospodarza. Korzystnie, DNA włącza się do wektora wirusowego lub bakteryjnego, korzystniej atenuowanego wektora wirusowego lub bakteryjnego, które są niepatogenne, najkorzystniej do atenuowanego wektora bakteryjnego. [0042] W rozumieniu niniejszego opisu, termin odporność odnosi się do długotrwałej ochrony immunologicznej przeciwko wirulentnej postaci czynnika zakaźnego lub antygenu nowotworowego. Termin immunizacja odnosi się do profilaktycznej ekspozycji

21 1 20 2 30 na antygen czynnika patogennego pochodzącego ze źródła niewirulentnego, powodującej odporność na patogen u leczonego pacjenta. [0043] Termin przeciwciało w rozumieniu niniejszego opisu odnosi się do cząsteczki stanowiącej glikozylowane białko, immunoglobulinę, swoiście łączącą się z antygenem. [0044] Termin antygen w rozumieniu niniejszego opisu oznacza jednostkę, która po wprowadzeniu do organizmu zwierzęcia immunokompetentnego stymuluje wytwarzanie swoistego przeciwciała lub przeciwciał, które mogą łączyć się z antygenem. Termin immunogen w rozumieniu niniejszego opisu oznacza jednostkę, która sama nie jest zdolna do stymulowania wytwarzania przeciwciała, lecz może stać się do tego zdolna po połączeniu z nośnikiem. [004] Termin substytucja konserwatywna w rozumieniu niniejszego opisu oznacza zastąpienie jednej reszty aminokwasowej inną, biologicznie podobną resztą. Do przykładów substytucji konserwatywnych należy substytucja jednej reszty hydrofobowej, takiej jak izoleucyna, walina, leucyna lub metionina, za inną lub substytucja jednej reszty hydrofilowej, takiej jak arginina, lizyną i odwrotnie, kwasu glutaminowego za kwas asparaginowy lub odwrotnie lub glutaminy za asparaginę lub odwrotnie i tym podobne. [0046] Termin w zasadzie odpowiada w swych różnych formach gramatycznych, w rozumieniu niniejszego opisu, odnoszący się do sekwencji peptydowych, oznacza opisywaną sekwencję peptydową plus lub minus do trzech reszt aminokwasowych na końcu aminowym, karboksylowym

22 1 20 2 30 lub na obu końcach, zawierającą wzdłuż sekwencji polipeptydowej jedynie substytucje konserwatywne. [0047] Termin immunoaktywny produkt genowy i jego inne formy gramatyczne w rozumieniu niniejszego opisu i w załączonych zastrzeżeniach obejmuje białka i polipeptydy wykazujące aktywność immunomodulującą, takie jak białka i polipeptydy wchodzące w interakcję z limfocytami T i komórkami NK i modulujące ich aktywność. [0048] Termin białko z rodziny IAP w rozumieniu niniejszego opisu i w załączonych zastrzeżeniach obejmuje dowolne białko z klasy naturalnych antygenów ulegających ekspresji w komórkach nowotworowych, hamujących apoptozę w swej postaci naturalnej. Do białek z rodziny IAP należą na przykład surwiwina ludzka, ludzkie IAP sprzężone z chromosomem X (XIAP), mysie TIAP (mysi analog surwiwiny), liwina ludzka, ludzkie c-iap-1, ludzkie c-iap-2, ludzkie NAIP, wszelkie inne białka, zawierające co najmniej jedną domenę bakulowirusowego powtórzenia IAP (BIR) lub jej homolog. Domena BIR jest obecna we wszystkich białkach typu dzikiego z rodziny IAP. Obejmuje ona cztery względnie krótkie helisy alfa i region trójniciowych struktur antyrównoległych arkuszy. Domena wiąże Zn z wykorzystaniem trzech reszt cysteinowych i reszt histydynowych, które są zachowane we wszystkich białkach z rodziny IAP. Termin białko z rodziny IAP w rozumieniu niniejszego opisu i w załączonych zastrzeżeniach obejmuje także warianty białek IAP typu dzikiego, takie jak warianty splicingowe, warianty substytucyjne i tym podobne, jak również ich

23 1 20 2 30 immunogenne fragmenty i homologi, wiążące się z cząsteczkami głównego układu zgodności tkankowej (MHC) klasy I i rozpoznawane przez cytotoksyczne limfocyty T (to znaczy epitopy białka surwiwiny). [0049] Termin związany z nowotworami w rozumieniu niniejszego opisu i w załączonych zastrzeżeniach, w odniesieniu do białek z rodziny IAP, oznacza białko z rodziny IAP, ulegające ekspresji na podwyższonym poziomie w komórkach nowotworowych w porównaniu z komórkami prawidłowymi, nienowotworowymi. Do przykładów związanych z nowotworami białek z rodziny IAP należą między innymi surwiwina ludzka i liwina ludzka. [000] Termin białko surwiwina w rozumieniu niniejszego opisu i w załączonych zastrzeżeniach obejmuje cząsteczkę surwiwiny ludzkiej o pełnej długości (SEQ ID nr 2), jej mysi analog o pełnej długości (to znaczy opisywane tu TIAP), warianty surwiwiny ludzkiej lub surwiwiny mysiej, takie jak warianty splicingowe i warianty substytucyjne, jak również fragmenty (na przykład epitopy) surwiwiny ludzkiej i homologi immunogenne surwiwiny ludzkiej, wiążące się z cząsteczką głównego układu zgodności tkankowej (MHC) klasy I i rozpoznawane przez cytotoksyczne limfocyty T. Do znanych wariantów substytucyjnych surwiwiny ludzkiej należy białko zawierające substytucję T34A w sekwencji reszt aminokwasowych SEQ ID nr 2, białko zawierające substytucję D3A w sekwencji reszt aminokwasowych SEQ ID nr 2 i białko zawierające substytucję C84A w sekwencji reszt aminokwasowych SEQ ID nr 2 (zob. Song i wsp., Mol. Biol. Cell, 2004; 1(3):1287-1296, E-

24 1 20 2 30 publikacja, 29 grudnia 2003). Każdy z tych znanych wariantów wykazuje aktywność apoptotyczną, w przeciwieństwie do surwiwiny typu dzikiego, która wykazuje aktywność antyapoptotyczną. [001] W korzystnym wykonaniu szczepionka DNA według niniejszego wynalazku zawiera konstrukt DNA, kodujący w sposób umożliwiający działanie białko surwiwinę, takie jak surwiwina ludzka typu dzikiego, o sekwencji reszt aminokwasowych według SEQ ID nr 2, immunogenny homolog surwiwiny ludzkiej typu dzikiego o sekwencji reszt aminokwasowych w co najmniej 80% identycznej z SEQ ID nr 2, wariant splicingowy surwiwiny ludzkiej o sekwencji reszt aminokwasowych według SEQ ID nr 23, wariant splicingowy surwiwiny ludzkiej o sekwencji reszt aminokwasowych według SEQ ID nr 24 i fragment białka surwiwiny, wiążący się z cząsteczką MHC klasy I i rozpoznawany przez cytotoksyczne limfocyty T. [002] Termin białko liwina w rozumieniu niniejszego opisu i w załączonych zastrzeżeniach obejmuje wariant splicingowy alfa liwiny ludzkiej o pełnej długości (SEQ ID nr 27), wariant splicingowy beta liwiny ludzkiej (SEQ ID nr 29), warianty substytucyjne wariantów splicingowych alfa i beta liwiny ludzkiej, jak również ich fragmenty i immunogenne homologi, wiążące się z cząsteczką MHC klasy I i rozpoznawane przez cytotoksyczne limfocyty T. [003] W rozumieniu niniejszego opisu i w załączonych zastrzeżeniach, termin homolog immunogenny i jego różne formy gramatyczne, stosowane w odniesieniu do związanych z nowotworami białek z rodziny IAP, takich jak surwiwina i liwina, oznacza białko o dużym stopniu

2 1 20 2 30 homologii do związanego z nowotworami białka typu dzikiego z rodziny IAP, wiążące się z cząsteczką MHC klasy I i rozpoznawane przez cytotoksyczne limfocyty T, aktywne przeciwko odpowiadającemu mu białku typu dzikiego z rodziny IAP. Korzystnie, sekwencja reszt aminokwasowych homologów immunogennych jest w co najmniej około 80% identyczna z sekwencją aminokwasową związanego z nowotworami białka typu dzikiego z rodziny IAP, korzystniej w co najmniej około 90% identyczna, najkorzystniej w co najmniej około 9% identyczna. [004] Bez wiązania się teorią, uważa się, że szczepienie pacjenta, na przykład człowieka, szczepionką według wynalazku prowadzi do wybiórczej prezentacji antygenów pochodzących ze związanego z nowotworami białka z rodziny IAP na powierzchni komórek immunologicznych, takich jak komórki prezentujące antygen, i dodatkowo do wybiórczej ekspresji immunoaktywnego produktu genowego w tych komórkach. Zwiększenie prezentacji związanego z nowotworami białka z rodziny IAP, takiego jak białko surwiwina lub białko liwina, na powierzchni komórki prezentującej antygen, w skojarzeniu z ekspresją immunoaktywnego produktu genowego, takiego jak cytokina lub ligand receptora powierzchniowego komórki NK, prowadzi do nasilenia odpowiedzi immunologicznej przeciwko komórkom nowotworowym, wykazującym ekspresję związanych z nowotworami białek z rodziny IAP, takich jak białko surwiwina lub białko liwina. U osób dorosłych surwiwina ulega ekspresji niemal wyłącznie w komórkach nowotworowych. Podobnie opisuje się zwiększenie

26 1 20 2 30 ekspresji liwiny w niektórych liniach komórek nowotworowych, szczególnie liniach komórek czerniaka. [00] W korzystnym wykonaniu szczepionka DNA zawiera sekwencję polinukleotydową, kodującą w sposób umożliwiający działanie białko surwiwinę i cytokinę. Korzystnie, białko surwiwinę stanowi surwiwina ludzka, surwiwina mysia lub ich epitop. Korzystnie, cytokina moduluje aktywność limfocytu T lub komórki NK. Do korzystnych cytokin należą chemokiny, hematopoetyny i interferony. Do innych korzystnych cytokin należą cytokiny aktywujące komórki NK, takie jak IL-12 i czynniki stymulujące wytwarzanie cytokin, takie jak IL- 17. [006] Do korzystnych chemokin należą chemokiny CC, szczególnie te, które są ligandami receptora chemokiny CCR7, takie jak CCL21 (SLC) i tym podobne, chemokiny C, które są ligandami receptora CR1, takie jak limfotaktyna i tym podobne, chemokiny CX 3 C które są ligandami receptora CX 3 CR1, takie jak fraktalkina i tym podobne, chemokiny CXC, szczególnie te, które są ligandami receptora CXCR3, takie jak IP- i tym podobne. Najkorzystniej chemokiną jest ludzka CCL21 lub jej mysi analog (CCL21 mysia). [007] Do korzystnych hematopoetyn należą czynniki wzrostu limfocytów T, takie jak IL-2, IL-1 i tym podobne. Do korzystnych interferonów należą interferony wytwarzane przez limfocyty T i komórki NK, takie jak IFN-γ i tym podobne. Do innych korzystnych cytokin należą cytokiny aktywujące komórki NK, takie jak IL-12 i tym podobne, oraz cytokiny indukujące wytwarzanie

27 1 20 2 30 cytokin w komórkach takich jak nabłonki, śródbłonki i fibroblasty, w tym IL-17 i tym podobne. [008] W innym korzystnym wykonaniu szczepionka DNA zawiera sekwencję polinukleotydową, kodującą w sposób umożliwiający działanie białko surwiwinę i ligand receptora powierzchniowego komórki NK. Korzystnie, białkiem surwiwiną jest surwiwina ludzka, surwiwina mysia lub epitop surwiwiny ludzkiej. Korzystnie ligandem receptora powierzchniowego komórki NK jest ligand receptora powierzchniowego komórki NKG2D. Korzystnie ligandem receptora powierzchniowego komórki NKG2D jest związany z łańcuchem antygen MHC klasy I (MIC), taki jak MICA i MICB, białko wiążące UL16 (ULBP), takie jak ULBP1, ULBP2 i ULBP3 i tym podobne. Do mysich ligandów NKG2D należą na przykład peptyd Rae1 i antygen mniejszego układu zgodności tkankowej H60. Najkorzystniej, ligandem receptora powierzchni komórki NKG2D jest MICA lub MICB. [009] Korzystnie, konstrukt DNA według niniejszego wynalazku, kodujący w sposób umożliwiający działanie białko surwiwinę i immunoaktywny produkt genowy, jest również połączony w sposób umożliwiający działanie z elementami regulacyjnymi niezbędnymi do ekspresji genu, dobrze znanymi ze stanu techniki. [0060] Korzystnie konstrukt DNA włącza się w sposób umożliwiający działanie do wektora ekspresji, takiego jak wektor ekspresji BUDCE4.1, dostępny w firmie Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA, USA. Na rynku dostępne są inne odpowiednie wektory ekspresji, na przykład w firmie BD Biosciences Clonetech, Palo Alto, CA, USA. Po włączeniu do wektora ekspresji konstrukt DNA można

28 1 20 2 30 wprowadzać do wektora gospodarza, takiego jak żywy, atenuowany wektor bakteryjny, przez transfekowanie komórki gospodarza wektorem ekspresji celem uzyskania szczepionki według niniejszego wynalazku. [0061] W skład konstruktów DNA korzystnie wchodzą elementy regulacyjne, niezbędne do ekspresji nukleotydów. Do takich elementów należą na przykład promotor, kodon inicjujący, kodon stop i sygnał poliadenylacji. Dodatkowo do ekspresji sekwencji kodującej immunogenne białko docelowe często niezbędne są wzmacniacze. Jak wiadomo ze stanu techniki, elementy te są, korzystnie, sprzężone w sposób umożliwiający działanie z sekwencją kodującą pożądane białko. Korzystnie dobiera się elementy regulacyjne wykazujące zgodność z gatunkiem, który będzie je otrzymywał. [0062] Kodony inicjujące i kodony stop korzystnie stanowią część sekwencji nukleotydowej, kodującej białko surwiwinę i polipeptyd immunomodulujący w szczepionce genetycznej według niniejszego wynalazku. Kodon inicjujący i kodon terminacyjny muszą oczywiście znajdować się w ramce z sekwencjami kodującymi białko surwiwinę i polipeptyd immunomodulujący. [0063] motory i sygnały poliadenylacji wchodzące w skład szczepionki według niniejszego wynalazku korzystnie dobiera się tak, żeby były funkcjonalne w komórkach immunizowanego pacjenta. [0064] Do przykładów promotorów użytecznych w szczepionkach według niniejszego wynalazku, zwłaszcza przy wytwarzaniu szczepionki genetycznej dla ludzi, należą między innymi promotor małpiego wirusa nr 40 (SV40), promotor mysiego wirusa raka sutka (MMTV),

29 1 20 2 30 ludzkiego wirusa braku odporności (HIV), na przykład promotor długich terminalnych powtórzeń HIV (LTR), promotor wirusa Moloney, cytomegalowirusa (CMV), na przykład bezpośredni wczesny promotor CMV, promotor wirusa Epsteina-Barr (EBV), wirusa mięsaka Rousa (RSV), jak również promotory z genów ludzkich, takich jak gen ludzkiej aktyny, ludzkiej miozyny, ludzkiej hemoglobiny, ludzkiej kreatyny mięśniowej i ludzkiej metalotioneiny. [006] Do przykładów sygnałów poliadenylacji użytecznych w szczepionkach według niniejszego wynalazku, zwłaszcza przy wytwarzaniu szczepionki genetycznej dla ludzi, należą między innymi sygnały poliadenylacji SV40 i sygnały poliadenylacji LTR. [0066] Oprócz elementów regulacyjnych niezbędnych do ekspresji DNA, cząsteczka DNA może również zawierać inne elementy. Do takich dodatkowych elementów należą wzmacniacze. Wzmacniaczem może być na przykład ludzka aktyna, ludzka miozyna, ludzka hemoglobina, ludzka kreatyna mięśniowa i wzmacniacze wirusowe, takie jak wzmacniacze z CMV, RSV i EBV. [0067] Sekwencje i kodony regulacyjne są zwykle swoiste dla gatunku. W celu maksymalizacji wytwarzania białka dobiera się sekwencje i kodony regulacyjne skuteczne u gatunku, który ma być immunizowany. Specjalista może bez trudu wytworzyć konstrukty DNA funkcjonalne u danego gatunku (do którego należy pacjent). [0068] Konstrukty DNA szczepionek według niniejszego wynalazku mogą być nagim DNA, jak zdefiniowano w Restifo i wsp. Gene Therapy 2000; 7:89-92 istotne części tej publikacji włącza się do niniejszego opisu

30 1 20 2 30 przez przywołanie. Korzystnie, DNA włącza się w sposób umożliwiający działanie do wektora. Do użytecznych wektorów do podawania należą ulegające rozpadowi biologicznemu mikrokapsułki, kompleksy immunostymulujące (ISCOM) lub liposomy oraz wytworzone technikami inżynierii genetycznej atenuowane, żywe wektory, takie jak wirusy lub bakterie. [0069] Do przykładów odpowiednich atenuowanych, żywych wektorów bakteryjnych należą Salmonella typhimurium, Salmonella typhi, gatunki Shigella, Bacillus, Lactobacillus, Bacille Calmette-Guerin (BCG), Escherichia coli, Vibrio cholerae, gatunki Campylobacter, Listeria lub dowolny inny odpowiedni wektor bakteryjny, znany ze stanu techniki. Korzystnie wektorem jest atenuowana, żywa Salmonella typhimurium. Do korzystnych atenuowanych, żywych Salmonella typhimurium należą szczepy AroA -, takie jak SL7207 lub podwójnie atenuowane szczepy AroA - dam -, takie jak RE88. Szczególnie korzystnym wektorem jest podwójnie atenuowana Salmonella typhimurium AroA -, dam -. [0070] Sposoby transformowania żywych wektorów bakteryjnych egzogennym konstruktem DNA są dobrze opisane w piśmiennictwie. Zob. na przykład Joseph Sambrook i David W. Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, wydanie 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2001) (Sambrook i Russell). [0071] Do korzystnych wektorów wirusowych należą bakteriofagi, wirus opryszczki, adenowirus, wirus polio, wirus krowianki i Avi-pox. Sposoby transformowania wektora wirusowego egzogennym

31 1 20 2 30 konstruktem DNA są również dobrze znane ze stanu techniki i opisane - zob. Sambrook i Russell, jak wyżej. [0072] Użyteczne wektory liposomowe są jedno- lub wielolamelarnymi pęcherzykami, których część błonowa jest utworzona z materiału lipofilowego i wewnętrznej części wodnej. Część wodną stosuje się w niniejszym wynalazku po to, żeby znalazł się w niej materiał polinukleotydowy, który ma być dostarczony do komórki docelowej. Zwykle korzystne jest, żeby materiały tworzące liposom zawierały grupę kationową, taką jak czwartorzędowa grupa amonowa i jedną lub więcej niż jedną grupę lipofilową, taką jak nasycone lub nienasycone grupy alkilowe, zawierające od około 6 do około 30 atomów węgla. Jedną z grup odpowiednich materiałów opisano w europejskiej publikacji patentowej nr 0187702 i omówiono dokładniej w patencie Stanów Zjednoczonych nr 6,228,844, wydanym na nazwisko Wolff i wsp.; istotne fragmenty tych publikacji włącza się do niniejszego opisu przez przywołanie. W piśmiennictwie opisano wiele innych odpowiednich, tworzących liposomy, kationowych związków lipidowych. Zob. na przykład L. Stamatatos i wsp., Biochemistry 1988; 27:3917-392 i H. Eibl, i wsp., Biophysical Chemistry 1979; :261-271. Zamiast tego można stosować mikrosferę, taką jak ulegająca rozpadowi biologicznemu mikrosfera polilaktydowo-koglikolidowa: konstrukt kwasu nukleinowego zamyka się w kapsule lub w inny sposób łączy w kompleks z liposomem lub mikrosferą celem dostarczenia kwasu nukleinowego do tkanki, jak wiadomo ze stanu techniki.

32 1 20 2 30 [0073] Do innych użytecznych wektorów należą polimeryczne mikrosfery, zawierające ulegające rozpadowi biologicznemu materiały poli(ortoestrowe), opisane przez Wang i wsp., Nat. Mater., 2004; 3(3):190-6. E-publikacja 1 lutego 2004; istotne fragmenty tej publikacji włącza się do niniejszego opisu przez przywołanie. [0074] Jedna z metod, stanowiąca aspekt niniejszego wynalazku, obejmuje podawanie szczepionki DNA kodującej w sposób umożliwiający działanie białko surwiwinę i immunoreaktywny produkt genowy do tkanki ssaka, na przykład człowieka. W niektórych korzystnych wykonaniach szczepionki DNA podaje się doustnie, domięśniowo, donosowo, dootrzewnowo, podskórnie, śródskórnie lub miejscowo. Korzystnie szczepionkę DNA podaje się doustnie. [007] W korzystnym sposobie, szczepionkę DNA według niniejszego wynalazku można stosować do zapewnienia długotrwałego hamowania wzrostu guza u pacjenta leczonego szczepionką. Szczepionka DNA zawiera konstrukt polinukleotydowy DNA, kodujący w sposób umożliwiający działanie białko surwiwinę, immunoaktywny produkt genowy, taki jak cytokinę lub ligand receptora powierzchni komórki NK i ich farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. Szczepionkę podaje się ssakowi wymagającemu zahamowania wzrostu guza w ilości wystarczającej do wywołania odpowiedzi immunologicznej przeciwko komórkom nowotworowym. [0076] Korzystnie, ssakiem leczonym szczepionką według wynalazku jest człowiek. Immunizacja szczepionkami według niniejszego wynalazku może być korzystna dla

33 1 20 2 30 pacjenta cierpiącego na nowotwór, taki jak rak płuca lub rak okrężnicy, nowotwory sutka lub nowotwory prostaty i tym podobne nowotwory. [0077] Preparaty szczepionek według niniejszego wynalazku korzystnie wytwarza się z użyciem farmaceutycznie dopuszczalnych nośników lub zaróbek, takich jak woda, sól fizjologiczna, dekstroza, glicerol i tym podobne, jak również ich połączenia. Szczepionki mogą również zawierać substancje pomocnicze, takie jak środki zwilżające, środki emulgujące, bufory, środki konserwujące, adiuwanty i tym podobne. [0078] Szczepionki według niniejszego wynalazku korzystnie podaje się doustnie ssakowi, takiemu jak człowiek, w postaci roztworu lub zawiesiny w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku, przy czym stężenie DNA wynosi od około 1 do około mikrogramów na mililitr. Odpowiednie dawkowanie będzie zależało od szczepionego pacjenta i po części od uznania lekarza lub innego specjalisty podającego lub zlecającego podanie szczepionki. [0079] Szczepionki według niniejszego wynalazku można pakować w odpowiednio wyjaławiane pojemniki, takie jak ampułki, butelki lub fiolki, w postaci wielodawkowej lub w postaci dawek jednostkowych. Pojemniki korzystnie po napełnieniu preparatem szczepionki zamyka się hermetycznie. Korzystnie, szczepionki pakuje się do pojemnika, na który naklejona jest etykieta, identyfikująca szczepionkę i zawierająca notatkę w formie ustalonej przez agendę rządową, taką jak Agencja ds. Żywności i Leków (Food and Drug Administration FDA) Stanów Zjednoczonych, informującą o

34 1 20 2 30 zarejestrowaniu szczepionki zgodnie z obowiązującym ustawodawstwem, informacje o dawkowaniu i tym podobne. Etykieta korzystnie zawiera informacje o szczepionce użyteczne dla pracownika ochrony zdrowia podającego szczepionkę pacjentowi. Opakowanie również korzystnie zawiera drukowane materiały informacyjne dotyczące podawania szczepionki, instrukcje, wskazania i wszelkie niezbędne, wymagane ostrzeżenia. [0080] Sekwencję DNA surwiwiny ludzkiej i odpowiadającą jej sekwencję białkową opisał Strausberg w bazie danych EMBL European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB 1SD, Wielka Brytania; nr akcesyjny DNA BC034148; publikację tę włącza się do niniejszego opisu przez przywołanie. Sekwencję DNA i odpowiadającą jej sekwencję białkową mysiego TIAP opisali Kobayashi i wsp. w. Natl. Acad. Sci. 1999; 96:147-62; nr akcesyjny DNA AB01389 w bazie danych EMBL European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB 1SD, Wielka Brytania; treść tej publikacji włącza się do niniejszego opisu przez przywołanie. [0081] Sekwencję kwasu nukleinowego kodującego surwiwinę ludzką przedstawiono na Fig. 1 (SEQ ID nr 1), a odpowiadającą jej sekwencję reszt aminokwasowych (SEQ ID nr 2) przedstawiono na Fig. 2. Sekwencję kwasu nukleinowego kodującą surwiwinę mysią (to znaczy TIAP) przedstawiono na Fig. 3 (SEQ ID nr 3), a odpowiadającą jej sekwencję reszt aminokwasowych (SEQ ID nr 4) przedstawiono na Fig. 4. [0082] Homologię białkową między surwiwiną ludzką a jej mysim odpowiednikiem TIAP zilustrowano na Fig..

3 1 20 2 30 Istnieje około 83% tożsamość sekwencji reszt aminokwasowych między surwiwiną ludzką (SEQ ID nr 2) a mysim TIAP (SEQ ID nr 4), jak przedstawiono na Fig.. [0083] Mahotka i wsp. zidentyfikowali dwa warianty splicingowe surwiwiny ludzkiej, oznaczone nazwami surwiwina AEx3 i surwiwina 2B, które również nadają się do zastosowania według niniejszego wynalazku. Mahotka i wsp. Cancer Res., 1999; 9:6097-62; istotne fragmenty tej publikacji włącza się do niniejszego opisu przez przywołanie. Sekwencje reszt aminokwasowych surwiwiny 2B (SEQ ID nr 23) i surwiwiny AEx3 (SEQ ID nr 24) przedstawiono na Fig. 37. Hirohashi i wsp. zidentyfikowali silny epitop limfocytu T surwiwiny 2B o sekwencji reszt aminokwasowych AYACNTSTL (SEQ ID nr 2), oznaczony symbolem surwiwina 2B80-88, wywołujący cytotoksyczną odpowiedź limfocytu T przeciwko surwiwinie 2B. Hirohashi i wsp. Clinical Cancer Res., 2002; 8: 1731-39; publikację tę włącza się do niniejszego opisu przez przywołanie. Epitop ten jest fragmentem surwiwiny zdolnym do wiązania z cząsteczką MHC klasy I i rozpoznawanym przez cytotoksyczne limfocyty T i nadaje się do zastosowania jako białko z rodziny IAP-składowa szczepionki według niniejszego wynalazku. [0084] Innym wariantem splicingowym surwiwiny ludzkiej jest wariant surwiwina 3B, opisany przez Badran i wsp., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2004; 314(3):902-907. Sekwencję polinukleotydową, kodującą surwiwinę 3B, i odpowiadającą jej sekwencję reszt aminokwasowych, opisano w bazie danych EMBL European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton,

36 1 20 2 30 Cambridge CB 1SD, Wielka Brytania; nr akcesyjny DNA AB 14416; zapis ten włącza się do niniejszego opisu przez przywołanie. [008] Pełnej długości liwina ludzka (znana jako wariant alfa) jest białkiem z rodziny IAP, zawierającym pojedynczą domenę BIR i złożonym z 298 reszt aminokwasowych. Sekwencję DNA i odpowiadającą jej sekwencję białkową wariantu alfa liwiny ludzkiej opisali Clark i wsp. w bazie danych EMBL European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB 1SD, Wielka Brytania; nr akcesyjny DNA NM 139317; zapis ten włącza się do niniejszego opisu przez przywołanie. Sekwencję DNA i odpowiadającą jej sekwencję białkową wariantu beta liwiny ludzkiej opisano pod nr. akcesyjnym NM 022161 w bazie danych EMBL European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB 1SD, Wielka Brytania; treść tej publikacji włącza się do niniejszego opisu przez przywołanie. [0086] Sekwencję kwasu nukleinowego kodującą pełnej długości liwinę ludzką (wariant alfa) przedstawiono na Fig. 39 (SEQ ID nr 26), a odpowiadającą jej sekwencję reszt aminokwasowych (SEQ ID nr 27) przedstawiono na Fig. 40. Sekwencję kwasu nukleinowego kodującą wariant beta liwiny ludzkiej przedstawiono na Fig. 41 (SEQ ID nr 28), a odpowiadającą jej sekwencję reszt aminokwasowych (SEQ ID nr 29) przedstawiono na Fig. 42. Wariant beta liwiny ludzkiej jest pozbawiony reszt aminokwasowych 216-233 wariantu splicingowego alfa liwiny ludzkiej o pełnej długości (SEQ ID nr 27). Pod każdym innym względem wariant beta jest identyczny z

37 1 20 2 30 wariantem alfa liwiny ludzkiej. Domena BIR zarówno wariantu alfa, jak i wariantu beta liwiny ludzkiej znajduje się w regionie od reszty aminokwasowej R90 do reszty aminokwasowej L1 SEQ ID nr 27 i SEQ ID nr 29. [0087] W korzystnym wykonaniu, szczepionki według niniejszego wynalazku zawierają konstrukty DNA, kodujące jedno lub więcej niż jedno białko surwiwinę, takie jak surwiwina ludzka, TIAP (surwiwina mysia) i ich homologi immunogenne. Homologi immunogenne korzystnie wykazują co najmniej około 80% tożsamość sekwencji reszt aminokwasowych z surwiwiną ludzką, korzystniej co najmniej około 90% tożsamość sekwencji reszt aminokwasowych, najkorzystniej co najmniej około 9% tożsamość sekwencji reszt aminokwasowych z SEQ ID nr 2. Zamiast tego szczepionka może zawierać konstrukt DNA kodujący jeden lub więcej niż jeden epitopy limfocytu T białka surwiwiny ludzkiej. [0088] Ze względu na nieuchronną degenerację kodu genetycznego w szczepionkach według wynalazku można stosować sekwencje DNA, kodujące sekwencję reszt aminokwasowych w zasadzie tę samą lub funkcjonalnie równoważną z sekwencją natywną (to znaczy występującą naturalnie) związanych z nowotworami białek z rodziny IAP, takich jak surwiwina ludzka, surwiwina mysia i warianty splicingowe liwiny ludzkiej. Do takich sekwencji DNA należą sekwencje zdolne do hybrydyzacji z natywnymi sekwencjami DNA surwiwiny, jak również warianty alleliczne i tym podobne. Korzystnie DNA funkcjonalnie równoważnych homologów wykazuje co najmniej około 70% tożsamość sekwencji nukleotydowej z DNA kodującym wyżej wymienione natywne białko

38 1 20 2 30 surwiwinę, korzystniej co najmniej około 80% tożsamość sekwencji nukleotydowej. [0089] Immunoaktywnymi produktami genowymi kodowanymi przez konstrukty DNA szczepionek według niniejszego wynalazku są korzystnie cytokiny lub ligandy receptorów powierzchniowych komórek NK. Szczególnie korzystnymi cytokinami są chemokiny CC. Szczególnie użytecznymi chemokinami CC są ligandy receptora chemokiny CCR7. Do wybiórczych ligandów CCR7 należą CCL19 (znana również jako exodus 3, ELC, MIP-3P i CKP11) i CCL21 (znana również jako exodus 2, SLC, 6Ckina, TCA4 i CKP9). Szczególnie korzystnymi chemokinami są ludzka CCL21 i jej mysi odpowiednik 6Ckina/SLC (muccl21) i chemokiny w zasadzie im odpowiadające. [0090] DNA i sekwencje białkowe ludzkiego SLC opisali Nishimura i wsp. w bazie danych EMBL European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB 1SD, Wielka Brytania nr akcesyjny DNA AB002409; publikację tę włącza się do niniejszego opisu przez przywołanie. DNA i sekwencje białkowe mysiego wariantu CCL21a 6Ckiny/SLC i opisali Hromas i wsp. J. Immunol. 1997; 19(6):24-28, nr akcesyjny DNA NM01133 w bazie danych EMBL European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB 1SD, Wielka Brytania; zapis ten włącza się do niniejszego opisu przez przywołanie. DNA i sekwencje białkowe mysiego wariantu CCL21b 6Ckiny/SLC i opisali Hedrick i wsp., J. Immunol. 1997; 19(4):189-193, nr akcesyjny DNA NM011124 w bazie danych EMBL European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB 1SD,

39 1 20 2 30 Wielka Brytania; publikację tę włącza się do niniejszego opisu przez przywołanie. [0091] Sekwencję kwasu nukleinowego kodującą ludzki CCL21 (SLC) przedstawiono na Fig. 6 (SEQ ID nr ), a odpowiadającą jej sekwencję reszt aminokwasowych (SEQ ID nr 6) przedstawiono na Fig. 7. Sekwencję kwasu nukleinowego kodującą mysi CCL21 (wariant CCL21b) przedstawiono na Fig. 8 (SEQ ID nr 7), a odpowiadającą jej sekwencję aminokwasową (SEQ ID nr 8) przedstawiono na Fig. 9. [0092] Homologię białkową między ludzkim CCL21 (SLC) a jego mysim odpowiednikiem (mysia 6Ckina/SLC, CCL21b) zilustrowano na Fig.. Jak przedstawiono na Fig., istnieje około 73% tożsamość sekwencji reszt aminokwasowych między ludzkim CCL21 (SEQ ID nr 6) a mysim CCL21 (SEQ ID nr 8). [0093] Sekwencję kwasu nukleinowego kodującą wariant CCL21a mysiego SLC przedstawiono na Fig. 2 (SEQ ID nr 11), a odpowiadającą jej sekwencję aminokwasową (SEQ ID nr 12) przedstawiono na Fig. 26. [0094] Korzystnymi ligandami receptorów powierzchniowych komórek NK są ligandy mysiego receptora powierzchniowego NKG2D. Korzystnymi ligandami receptorów powierzchniowych NKG2D są MICA, MICB, ULBP1, ULBP2 i ULBP3 i tym podobne, najkorzystniej MICA i MICB. Do innych znanych ligandów receptorów powierzchniowych NKG2D należą mysi Rea-1p i mysi peptyd antygenu mniejszego układu zgodności tkankowej H60. [009] DNA i sekwencje białkowe mysiego peptydu antygenu mniejszego układu zgodności tkankowej H60 opisali Malarkannan i wsp., J. Immunol. 1998;

40 1 20 2 30 161(7):301-309, nr akcesyjny DNA AF084643 w bazie danych EMBL European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB 1SD, Wielka Brytania; treść tej publikacji włącza się do niniejszego opisu przez przywołanie. Częściową sekwencję kwasu nukleinowego kodującego mysi peptyd antygenu mniejszego układu zgodności tkankowej H60 przedstawiono na Fig. 11 (SEQ ID nr 9), a odpowiadającą mu częściową sekwencję reszt aminokwasowych (SEQ ID nr ) przedstawiono na Fig. 12. [0096] DNA i sekwencje białkowe ludzkiego MICA opisali Zwirner i wsp., nr akcesyjny DNA AY20447 w bazie danych EMBL European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB 1SD, Wielka Brytania; treść tej publikacji włącza się do niniejszego opisu przez przywołanie. Sekwencję kwasu nukleinowego kodującą ludzki MICA przedstawiono na Fig. 27 (SEQ ID nr 13), a odpowiadającą jej sekwencję reszt aminokwasowych (SEQ ID nr 14) przedstawiono na Fig. 28. [0097] DNA i sekwencje białkowe ludzkiego MICB opisali Bahram i wsp. Immunogenetics 1996; 4 (2):161-162, nr akcesyjny DNA U6416 w bazie danych EMBL European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB 1SD, Wielka Brytania; treść tej publikacji włącza się do niniejszego opisu przez przywołanie. Sekwencję kwasu nukleinowego kodującą ludzki MICB przedstawiono na Fig. 29 (SEQ ID nr 1), a odpowiadającą jej sekwencję reszt aminokwasowych (SEQ ID nr 16) przedstawiono na Fig. 30. Warianty alleliczne MICB opisano w GENBANK, nr akcesyjny NP 00922; publikację tę włącza się do niniejszego opisu przez

41 1 20 2 30 przywołanie. Fig. 38 stanowi reprodukcję zapisu w GENBANK dla nr. akcesyjnego NP 00922. [0098] DNA i sekwencje białkowe ludzkiego ULBPI opisali Cosman i wsp., Immunity 2001; 14(2): 123-133, nr akcesyjny DNA AF304377 w bazie danych EMBL European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB 1SD, Wielka Brytania; treść tej publikacji włącza się do niniejszego opisu przez przywołanie. Sekwencję kwasu nukleinowego kodującą ludzki ULBP1 przedstawiono na Fig. 31 (SEQ ID nr 17), a odpowiadającą jej sekwencję reszt aminokwasowych (SEQ ID nr 18) przedstawiono na Fig. 32. [0099] DNA i sekwencje białkowe ludzkiego ULBP2 opisali Cosman i wsp., Immunity 2001; 14(2): 123-133, nr akcesyjny DNA AF304378 w bazie danych EMBL European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB 1SD, Wielka Brytania; treść tej publikacji włącza się do niniejszego opisu przez przywołanie. Sekwencję kwasu nukleinowego kodującą ludzki ULBP2 przedstawiono na Fig. 33 (SEQ ID nr 19), a odpowiadającą jej sekwencję reszt aminokwasowych (SEQ ID nr 20) przedstawiono na Fig. 34. [00] DNA i sekwencje białkowe ULBP3 opisali Cosman i wsp., Immunity 2001; 14(2):123-133, nr akcesyjny DNA AF304379 w bazie danych EMBL European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB 1SD, Wielka Brytania; treść tej publikacji włącza się do niniejszego opisu przez przywołanie. Sekwencję kwasu nukleinowego kodującą ludzki ULBP3 przedstawiono na Fig. 3 (SEQ ID nr 21), a

42 1 20 2 30 odpowiadającą jej sekwencję reszt aminokwasowych (SEQ ID nr 22) przedstawiono na Fig. 36. [01] Do szczególnie korzystnych ligandów receptora powierzchniowego komórek NK należą ligandy receptora NKG2D, takie jak MICA, MICB, ULBP1, ULBP2, ULBP3 i funkcjonalne równoważniki. Równoważniki funkcjonalne korzystnie wykazują tożsamość co najmniej około 80% sekwencji reszt aminokwasowych z wyżej wymienionymi polipeptydami immunomodulującymi, korzystniej tożsamość co najmniej około 90% sekwencji reszt aminokwasowych, najkorzystniej tożsamość co najmniej około 9% sekwencji reszt aminokwasowych. [02] Ze względu na nieuchronną degenerację kodu genetycznego w szczepionkach według wynalazku można stosować sekwencje DNA, kodujące sekwencję reszt aminokwasowych w zasadzie taką samą lub funkcjonalnie równoważną sekwencjom użytecznych natywnych immunoaktywnych produktów genowych, takich jak ludzki CCL21, mysi CCL21, MICA, MICB, ULBP1, ULBP2, ULBP3 i tym podobne, w zasadzie odpowiadające im materiały. Do takich sekwencji DNA należą sekwencje zdolne do hybrydyzacji z sekwencjami DNA polipeptydów immunomodulujących, jak również warianty alleliczne i tym podobne. Korzystnie DNA funkcjonalnie równoważnych homologów wykazuje co najmniej około 70% tożsamość sekwencji nukleotydowej z DNA kodującym wyżej wymienione natywne polipeptydy immunomodulujące. [03] Zmienione sekwencje DNA, które można stosować według niniejszego wynalazku, mogą obejmować delecje, addycje lub substytucje różnych reszt nukleotydowych w natywnych sekwencjach polinukleotydowych, kodujących

43 związane z nowotworami białko z rodziny IAP typu dzikiego; poprzez ich zastosowanie uzyskuje się sekwencję kodującą białko typu dzikiego lub jego homolog immunogenny. Zmienione sekwencje DNA, które można stosować według niniejszego wynalazku, mogą również obejmować delecje, addycje lub substytucje różnych reszt nukleotydowych w natywnym polinukleotydzie kodującym immunogenny produkt genowy typu dzikiego; w wyniku tych zmian powstaje sekwencja kodująca immunoaktywny produkt genowy typu dzikiego lub jego funkcjonalny równoważnik. Funkcjonalnie równoważny immunoaktywny produkt genowy może zawierać delecje, addycje lub substytucje reszt aminokwasowych w obrębie cytokiny typu dzikiego lub ligandu receptora 1 powierzchniowego komórki NK, powodujące zmianę niemą, w wyniku której powstaje cząsteczka funkcjonalnie równoważna. Takie substytucje aminokwasowe (na przykład substytucje konserwatywne) można wytwarzać, opierając się na podobieństwie polarności, ładunku, 20 rozpuszczalności, hydrofobowości, hydrofilowości i(lub) amfipatyczności danych reszt. Na przykład do aminokwasów o ładunku ujemnym należą kwas asparaginowy i kwas glutaminowy, do aminokwasów o ładunku dodatnim należą lizyna i arginina, do aminokwasów o 2 nienaładowanych polarnych główkach (ang. head groups) o podobnych wartościach hydrofilowości należą następujące aminokwasy: leucyna, izoleucyna, walina; glicyna, alanina; asparagina, glutamina; seryna, treonina; fenyloalanina, tyrozyna. 30 [04] W rozumieniu niniejszego opisu, określenie funkcjonalnie równoważny immunoaktywny produkt

44 1 20 2 30 genowy, taki jak cytokina lub ligand receptora powierzchniowego komórki NK, odnosi się do polipeptydu wykazującego aktywność immunomodulującą w zasadzie taką samą, jak odpowiadający mu, występujący naturalnie immunoaktywny produkt genowy. [0] Można wytwarzać sekwencje DNA, kodujące w sposób umożliwiający działanie białko surwiwinę i immunoaktywne produkty genowe użyteczne w szczepionkach według wynalazku, żeby zmieniać sekwencje kodujące, w wielu celach, w tym między innymi można dokonywać zmian modyfikujących obróbkę i ekspresję produktu genowego. Można na przykład wprowadzać mutacje za pomocą technik dobrze znanych ze stanu techniki, takich jak na przykład mutageneza ukierunkowana na miejsce, w celu insercji nowych miejsc restrykcyjnych, żeby zmienić wzorce glikozylacji, fosforylacji i tym podobne. [06] Innym aspektem niniejszego wynalazku jest sposób szczepienia ssaka przeciwko chorobie nowotworowej. Sposób obejmuje podanie ssakowi opisywanej tu szczepionki według niniejszego wynalazku w ilości wystarczającej do wywołania odpowiedzi immunologicznej przeciwko komórkom nowotworowym. Korzystnie, ssakiem jest człowiek. [07] W innym aspekcie niniejszy wynalazek obejmuje również transformowane komórki gospodarza, które transfekowano wektorem zawierającym konstrukt DNA, kodujący w sposób umożliwiający działanie opisywane tu białko z rodziny inhibitorów apoptozy i immunoaktywny produkt genowy. Komórka gospodarza może być komórką prokariotyczną lub eukariotyczną.

4 1 20 2 30 [08] Przedmiotem niniejszego wynalazku są również izolowane wektory plazmidowe, zawierające konstrukt DNA, kodujący w sposób umożliwiający działanie białko z rodziny inhibitorów apoptozy i immunoaktywny produkt genowy. Wektory są użyteczne do transfekcji komórek gospodarza, takich jak atenuowane komórki bakteryjne, przy wytwarzaniu szczepionek według wynalazku. [09] Poniższe przykłady podano celem dokładniejszej ilustracji cech i wykonań niniejszego wynalazku; nie mają one na celu jego ograniczenia. Materiały, metody i przykłady [01] Materiały. Myszy C7/BL/6J i Balb/C uzyskano z zakładu hodowlanego Scripps Research Institute. DNA kodujące TIAP (mysią postać surwiwiny) klonowano przez PCR z cdna MC3P. DNA kodujące mysią 6Ckinę (mysi CCL21) klonowano z komórek śledziony. DNA kodujące peptyd H60 antygenu mniejszego układu zgodności tkankowej (mysią postać MICA i MICB) było darem dr. Davida H. Ranleta z University of California (Berkeley). DNA szczepionki kodujące mysi CCL21 (muccl21, znane również jako 6Ckina/SLC) i surwiwinę mysią (mu-surwiwina, znana również jako TIAP) klonowano do eukariotycznych wektorów ekspresyjnych pbudce4.1, nabytych w firmie Invitrogen, Inc., z wykorzystaniem miejsc restrykcyjnych HindIII i BamHI do MuCCL21 i XhoI do obu końców musurwiwiny. DNA szczepionki kodującej H60 i TIAP klonowano do eukariotycznych wektorów ekspresyjnych pbudce4.1, nabytych w firmie Invitrogen, Inc., z wykorzystaniem miejsc restrykcyjnych HindIII i XbaI (H60) i miejsc restrykcyjnych KpnI i XhoI (musurwiwina). Atenuowany szczep Salmonella typhimurium

46 1 20 2 30 (SL2707) AroA - i podwójnie atenuowany szczep Salmonella typhimurium AroA -, dam - (RE88) uzyskano z firmy Remedyne, Santa Barbara, CA, USA. Przeciwciała uzyskano z firmy BD Biosciences, Bedford, MA, USA. Izotiocyjanian fluoresceiny (FITC) i R-fikoerytrynę (PE) uzyskano z firmy Molecular bes, Eugene, OR, USA. Przeciwciała wyznakowane FITC i wyznakowane PE wytworzono według protokołów zalecanych przez producenta. Część A. Szczepionki z transformowanego AroA - atenuowanego Salmonella typhimurium Przykład 1. Wytwarzanie szczepionki DNA kodującej musurwiwinę i muccl21 [0111] Wektor pbudce4.1, zawierający DNA musurwiwiny i muccl21 (około 1- μg pdna) poddano elektroporacji do świeżo wytworzonej, atenuowanej Salmonella typhimurium (SL2707), stosując urządzenie Bio-Rad Pulser przy 2, kv, 2 μf i 200 omach według procedur zalecanych przez producenta. Dokonano selekcji Salmonella zawierających wektor na płytkach zawierających zeocynę. Kolonie zbierano następnego dnia i hodowano przez noc w bulionie LB (EM Science, Gibbstown, NJ, USA) z dodatkiem zeocyny. Bakterie izolowano i przepłukano w soli fizjologicznej zbuforowanej fosforanem (PBS). Przepłukane bakterie zawieszono następnie w pożywce PBS w stężeniu około 1x 9 rekombinowanych Salmonella na mililitr PBS, tworząc roztwór szczepionki do późniejszego użycia. [0112] Wytworzono także szczepionki kontrolne, o następującym składzie: Salmonella transformowana samym wektorem, wektor zawierający tylko DNA musurwiwiny i

47 1 20 2 30 wektor zawierający tylko DNA muccl21, według takiej samej procedury. Na Fig. 13 schematycznie przedstawiono konstrukty ekspresyjne. [0113] Szczepionki przechowywano w zamkniętych szczelnie ampułkach do użycia. DNA plazmidowe przed transformacją Salmonella przechowywano w temperaturze około -80 C. Przykład 2. Szczepienie myszy szczepionkami DNA z przykładu 1 [0114] Myszy Balb/C (około 8 myszy na grupę terapeutyczną) zaszczepiono szczepionkami DNA z przykładu 1 (około 1x 8 rekombinowanej Salmonella w około 0 μl PBS) przez sondę do żołądka, 3 razy, co 2 tygodnie. Przykład 3. Ocena oporności na nowotwory zaszczepionych myszy [011] Około 1 tygodnia po ostatnim szczepieniu myszom Balb/C z przykładu 2 (około 8 myszy na grupę terapeutyczną) podano około 1x komórek raka płuca Lewisa D121 (podskórnie). Rozwijające się podskórnie guzy utworzone z komórek raka płuca Lewisa usuwano chirurgicznie po około 2 tygodniach wzrostu, żeby umożliwić samoistny rozsiew do płuc. Wzrost podskórnego guza mierzono w dwóch wymiarach co drugi dzień i obliczano objętość guza według wzoru: objętość = (szerokość 2 )(długość 2) dla każdego guza. Około 24-28 dni po usunięciu podskórnego guza pierwotnego oceniano ilościowo samoistne przerzuty D121 do płuc. Myszy uśmiercano, wykonywano sekcję i oceniano obciążenie płuc nowotworem na podstawie odsetka powierzchni płuca zajętego przez

48 1 20 guz. Skala oceny była następująca: 0 guz nieobecny, 1 guz pokrywa mniej niż około 20%, 2 guz pokrywa od około 20 do około 30% i 3 guz pokrywa ponad około 0%. [0116] Wyniki oceny obciążenia guzem u myszy zaszczepionych szczepionkami z przykładu 1 podano w tabeli 1. Fig. 14 przedstawia obrazy płuc myszy zaszczepionych szczepionkami z przykładu 1. Objętość guzów podano w tabeli 1 i na Fig. 14. Na Fig. 14 słupek A przedstawia średnią objętość guza płuca (w milimetrach sześciennych) u myszy zaszczepionych szczepionką musurwiwina/muccl21 według wynalazku; słupek B przedstawia średnią objętość guza u myszy zaszczepionych szczepionką zawierającą tylko DNA musurwiwiny; słupek C przedstawia średnią objętość guza u myszy zaszczepionych szczepionką zawierającą tylko DNA muccl21; słupek D przedstawia średnią objętość guza u myszy zaszczepionych szczepionką zawierającą tylko pusty wektor; słupek E przedstawia średnią objętość guza u myszy zaszczepionych buforem PBS. Na Fig. 14 przedstawiono również obrazy reprezentatywnych wyciętych płuc z poszczególnych grup terapeutycznych, przedstawione poniżej odpowiednich słupków z Fig. 14.

49 1 Tabela 1. Przerzuty guza u myszy Balb/C eksponowanych na komórki raka płuca Lewisa D121 Grupa szczepienia myszy A. Szczepionka musurwiwina/muccl21 średnia objętość guza płuca: B. Kontrola szczepionka musurwiwina średnia objętość guza płuca: C. Kontrola - szczepionka muccl21 średnia objętość guza płuca: D. Kontrola - szczepionka zawierająca pusty wektor średnia objętość guza płuca: E. Kontrola - szczepienie PBS średnia objętość guza płuca: Ocena punktowa przerzutów 0,0,0,1,1,1,2,2 (0,242 ± 0,06 mm 3 ) 1,1,2,3,3,3,3,3 (0,483 ± 0, mm 3 ) 2,2,2,3,3,3,3,3 (0,626 ± 0,06 mm 3 ) 2,3,3,3,3,3,3,3 (1,12 ± 0,24 mm 3 ) 2,3,3,3,3,3,3,3 (1,212 ± 0,3 mm 3 ) [0117] Wyniki podane w tabeli 1 i Fig. 14 (diagramy A i B) dowodzą, że szczepionka DNA zawierająca konstrukt DNA kodujący białko z rodziny IAP (to znaczy musurwiwinę) i immunoaktywny produkt genowy (to znaczy muccl21) może skutecznie immunizować myszy przeciwko przerzutom guza płuca i hamować wzrost guzów płuca. Przykład 4. Zależna od limfocytów T cytotoksyczność przeciwko komórkom raka płuca D121 indukowana przez szczepionkę DNA według wynalazku [0118] Myszy C/7BL/6J (około 8 myszy na grupę terapeutyczną) zaszczepiono szczepionkami DNA z przykładu 1 w sposób opisany w przykładzie 2. Około 4 dni po szczepieniu izolowano splenocyty i analizowano je pod kątem aktywności litycznej w 4-godzinnym teście uwalniania 1 Cr, jak opisano w Current tocols in

0 1 20 2 30 Immunology w podrozdziale 3.11.4, Coligan i wsp. (red.), John Wiley & Sons, Inc. (1994). Jako komórki docelowe dla splenocytów zastosowano komórki D121. [0119] Fig. 1 ilustruje graficznie zależną od limfocytów T cytotoksyczność przeciwko komórkom raka płuca D121 indukowaną przez szczepionki DNA według niniejszego wynalazku. Punkty danych oznaczone niezamalowanymi kółkami odpowiadają danym z testów hamowania, w których do komórek podawano 0 μg/ml przeciwciał przeciwko antygenom MHC klasy I H-2K b /H-2D b (klon SF1-1.1; 34-2-12 IgG2a, Κ), a zamalowane czarne kwadraty odpowiadają danym uzyskanym w nieobecności przeciwciał hamujących. Sporządza się wykres odsetka lizy komórek nowotworowych (oś Y) dla trzech różnych stosunków komórek efektorowych do komórek docelowych (E/T) dla każdej grupy szczepienia (to znaczy E/T wynoszący 0:1 1 dla pierwszego punktu danych, 0:1 1 dla drugiego punktu danych i 2:1 dla trzeciego punktu danych). Wyniki dowodzą, że szczepionka musurwiwina/muccl21 według wynalazku (wyznakowana SLC/TIAP) indukuje niemal -krotne zwiększenie lizy przy stosunku E/T 0:1 w porównaniu ze szczepionkami kontrolnymi, zawierającymi PBS, pusty wektor i DNA muccl21 i około 2-krotne zwiększenie w porównaniu ze szczepionką zawierającą samo DNA musurwiwiny. Przykład. Regulacja w górę markerów aktywacji CD2, CD69 i CD28 w splenocytach (limfocyty T CD8+) zaszczepionych myszy [0120] Myszy C/7BL/6J (około 4 myszy na grupę terapeutyczną) zaszczepiono szczepionkami DNA z przykładu 1 w sposób opisany w przykładzie 2. Od myszy

1 1 immunizowanych i kontrolnej grupy myszy izolowano splenocyty około 1 tygodnia po ostatnim szczepieniu. Następnie komórki zabarwiono sprzężonym z FITC przeciwciałem CD8+ i sprzężonymi z PE przeciwciałami CD2, CD69 i CD28. Zawiesiny komórek oceniano za pomocą dwubarwnego badania cytometrii przepływowej Becton Dickinson FAC w celu określenia odsetka limfocytów T CD8+ dodatnich pod kątem CD2, CD 28 i CD69, dla każdego splenocytu. Wyniki przedstawiono na Fig. 16. Wartości liczbowe w prawym górnym kwadrancie każdego wykresu FACS oznaczają odsetek komórek prezentujących zarówno antygen CD8+, jak i CD2, CD28 lub CD69, w zależności od przypadku. Wyniki liczbowe przedstawiono w tabeli 2. Wyniki te dowodzą zwiększenia ekspresji markerów limfocytów T przy stosowaniu szczepionki według niniejszego wynalazku, wskazującego na zwiększenie aktywacji limfocytów T. Tabela 2. Regulacja w górę markerów aktywacji CD2, CD69 i CD28 w splenocytach zaszczepionych myszy Leczenie %CD2 i %CD69 i %CD28i DC8+ DC8+ DC8+ 7,3 11,2 1,62 Szczepionka kontrolna/pbs Szczepionka 8,2 11,4 1,7 kontrolna/pusty wektor Szczepionka,2 12,9 2,3 kontrolna/muccl21 Szczepionka 9, 13,3 2,21 kontrolna/musurwiwina musurwiwina/muccl21 szczepionka 12,4 17,7 3,8

2 1 20 2 30 [0121] Dane w tabeli 2 i na Fig. 16 dowodzą, że szczepionka według niniejszego wynalazku z przykładu 1, zawierająca konstrukt DNA kodujący musurwiwinę i muccl21, powoduje regulację w górę ekspresji cząsteczek aktywacji limfocytów T. Przykład 6. Zwiększenie ekspresji cząsteczek kostymulujących na komórkach dendrytycznych zaszczepionych myszy [0122] Myszy C/7BL/6J (około 4 myszy na grupę terapeutyczną) zaszczepiono szczepionkami DNA z przykładu 1 w sposób opisany w przykładzie 2. Około 1 tygodnia po ostatnim szczepieniu od myszy immunizowanych i myszy z grupy kontrolnej izolowano splenocyty. Następnie komórki zabarwiono sprzężonym z FITC przeciwciałem CD11c w skojarzeniu ze sprzężonymi z PE przeciwciałami cząsteczek kostymulujących B7 (CD80), ICAM-1 i DEC20. Zawiesiny komórek oceniano metodą dwubarwnej cytometrii przepływowej Becton Dickinson FAC. Fig. 17 ilustruje graficznie średnie wartości fluorescencji komórek, wykazujące zwiększenie ekspresji ICAM-1 (na górze), CD80 (w środku) i DEC20 (na dole) dla splenocytów izolowanych od myszy zaszczepionych szczepionką musurwiwina/muccl21 według wynalazku w stosunku do szczepionek kontrolnych. Przykład 7. Indukcja wewnątrzkomórkowego uwalniania cytokin [0123] Myszy immunizowane w sposób opisany w przykładzie 2 (8 myszy na grupę) eksponowano na komórki raka płuca D121, jak opisano w przykładzie 3. Od wszystkich myszy pobierano splenocyty około jednego tygodnia po ekspozycji na komórki nowotworowe.

3 1 20 2 30 Splenocyty zabarwiono przeciwciałem FITC-anty-CD3, po czym utrwalono, permeabilizowano i następnie zabarwiono sprzężonym z PE przeciwciałem anty-ifn-γ. Zabarwione dwubarwnie komórki analizowano metodą cytometrii przepływowej FACS. Wyniki zilustrowano na Fig. 18. Komórki utrwalono, stosując zestaw startowy do barwienia wewnątrzkomórkowego firmy BD Pharmingen, La Jolla, CA, USA. [0124] Wyniki przedstawione na wykresie na Fig. 18 dowodzą, że odsetek komórek uwalniających cytokinę IFNγ zwiększał się do około 3,17% dla splenocytów izolowanych od myszy zaszczepionych szczepionką według wynalazku, w porównaniu z wartością zaledwie 0,41% dla myszy otrzymujących szczepionkę kontrolną PBS, około 0,38% dla myszy otrzymujących szczepionkę kontrolną z pustym wektorem, około 0,96% dla myszy otrzymujących szczepionkę kontrolną SLC i około 1,3% dla myszy otrzymujących szczepionkę kontrolną musurwiwinę. Przykład 8. Zwiększenie apoptozy komórek raka płuca u myszy zaszczepionych [012] Myszy immunizowane w sposób opisany w przykładzie 2 (8 myszy na grupę) eksponowano na komórki raka płuca D121, jak w przykładzie 3. Od wszystkich myszy pobierano splenocyty około jednego tygodnia po ekspozycji na komórki nowotworowe. Splenocyty inkubowano z komórkami nowotworowymi D121 w temperaturze około 37 C przez około 3 godziny. Następnie komórki nowotworu izolowano i analizowano metodą FACS. Do ilościowego oznaczenia w obrębie populacji odsetka komórek ulegających aktywnie apoptozie zastosowano aneksynę V-FITC. Do odróżnienia

4 komórek żywotnych od komórek nieżywotnych zastosowano jodek propidyny (PI) i zestaw do wykrywania apoptozy Apoptosis Detection Kit, dostępny w firmie BD Pharmingen, La Jolla, CA, USA. [0126] Fig. 19 ilustruje graficznie wyniki analizy FACS, oceniane po około 3 godzinach (górna grupa wykresów) i po około 24 godzinach (dolna grupa wykresów). Liczba w dolnym prawym kwadrancie każdego wykresu odpowiada odsetkowi komórek ulegających apoptozie w każdej grupie terapeutycznej. Po 3 godzinach około,39% nienaruszonych komórek D121 (to znaczy komórek niepoddanych ekspozycji na splenocyty) uległo apoptozie. Apoptozie uległo około 2,28% komórek D121 inkubowanych ze splenocytami od myszy 1 zaszczepionych szczepionką kontrolną, zawierającą tylko bufor PBS. Apoptozie uległo zaledwie około,19% komórek D121 inkubowanych ze splenocytami od myszy zaszczepionych szczepionką kontrolną, zawierającą pusty wektor DNA. Podobnie około,1% komórek D121 uległo 20 apoptozie po inkubacji ze splenocytami od myszy zaszczepionych szczepionką kontrolną, zawierającą samo DNA muccl21, natomiast około 11,46% komórek D121 uległo apoptozie po inkubacji splenocytami od myszy zaszczepionych szczepionką kontrolną, zawierającą samo 2 DNA musurwiwiny. Co ciekawe, po 3 godzinach uległo apoptozie około 18,44% komórek D121 inkubowanych ze splenocytami od myszy zaszczepionych szczepionką według wynalazku, zawierającą zarówno muccl21, jak i DNA musurwiwiny. 30 [0127] Podobnie, po 24 godzinach, w bramkowanej analizie FACS (bramkowanie pod kątem komórek, które

1 20 2 30 uległy apoptozie), żadna z nienaruszonych komórek D121 (to znaczy komórek niepoddanych ekspozycji na splenocyty) nie uległa apoptozie. Apoptozie uległo około 8,46% komórek D121 inkubowanych ze splenocytami od myszy zaszczepionych szczepionką kontrolną zawierającą tylko bufor PBS. Apoptozie uległo zaledwie około 4,78% komórek D121 inkubowanych ze splenocytami od myszy zaszczepionych szczepionką kontrolną, zawierającą pusty wektor DNA. Nieoczekiwanie, po 24 godzinach, apoptozie uległo około 9,2% komórek D121 inkubowanych ze splenocytami od myszy zaszczepionych szczepionką według wynalazku, zawierającą zarówno muccl21, jak i DNA musurwiwiny. Przykład 9. Wytwarzanie szczepionki DNA, kodującej TIAP i mysi peptyd H60 antygenu mniejszego układu zgodności tkankowej [0128] Wektor pbudce4.1, zawierający TIAP i mysi antygen H60 mniejszego układu zgodności tkankowej DNA (około 1 μg pdna) poddano elektroporacji do świeżo sporządzonej, atenuowanej Salmonella typhimurium (SL2707), stosując urządzenie Bio-Rad Pulser przy 2,0 kv, 2 μf i 0 omach według procedur zalecanych przez producenta. Na Fig. 20 przedstawiono schematyczny diagram wektorów ekspresji H60 i musurwiwiny włączonych do wektora. [0129] Wyselekcjonowano Salmonella zawierającą wektor na płytce zawierającej zeocynę. Następnego dnia zebrano kolonie i hodowano je przez noc w bulionie LB (EM Science, Gibbstown, NJ, USA) z dodatkiem zeocyny. Bakterie izolowano i przepłukano w soli fizjologicznej zbuforowanej fosforanem (PBS). Przepłukane bakterie

6 1 20 2 30 zawieszono następnie w pożywce PBS w stężeniu około x 9 rekombinowanej Salmonella na mililitr PBS, uzyskując roztwór szczepionki do późniejszego użytku. [0130] Według tej samej procedury wytworzono także szczepionki kontrolne, składające się z Salmonella transformowanej samym wektorem, wektora, w skład którego wchodził tylko DNA mu-surwiwiny oraz wektora, w skład którego wchodził tylko DNA antygenu H60 mniejszego układu zgodności tkankowej. [0131] Do czasu użycia szczepionki przechowywano w szczelnie zamkniętych ampułkach. DNA plazmidu przechowywano w temperaturze około -20 C przed przekształceniem Salmonella. Przykład. Szczepienie myszy szczepionkami DNA z przykładu 9 [0132] Myszy Balb/C (około 8 myszy na grupę terapeutyczną) zaszczepiono szczepionkami DNA z przykładu 9 (około x 8 rekombinowanej Salmonella w około 0 μl PBS) przez sondę do żołądka, trzy razy w odstępach dwutygodniowych. Przykład 11. Testy cytotoksyczności splenocytów izolowanych od myszy zaszczepionych szczepionkami DNA z przykładu [0133] Od myszy zaszczepionych w przykładzie izolowano splenocyty i stymulowano je napromieniowanymi komórkami CT-26. Po dniach splenocyty zbierano i przeprowadzano testy cytotoksyczności wobec komórek CT- 26 i komórek Yac-1 (limfocyty T wrażliwe na NK) w punktach docelowych. Określono stopień lizy swoistej komórek przy stosunku E/T 2:1, 0:1 i 0:1 poprzez 4- godzinny test uwalniania 1 Cr, według opisu w Current

7 1 20 2 30 tocols in Immunology, podrozdział 3.11,4, Coligan i wsp. (red), John Wiley & Sons, Inc. (1994). Wyniki zilustrowano graficznie na Fig. 21. [0134] Wyniki wskazują, że splenocyty od myszy zaszczepionych szczepionką według niniejszego wynalazku, zawierającą musurwiwinę i DNA H60, wykazywały co najmniej dwukrotne zwiększenie lizy komórek raka jelita grubego CT-26 w porównaniu ze splenocytami izolowanymi od myszy zaszczepionych szczepionkami kontrolnymi składającymi się z pustego wektora, H60 i musurwiwiny w stosunku E/T 0:1. W przypadku wszystkich szczepionek i każdego stosunku E/T obserwowano tylko bardzo niewielką lizę komórek Yac-1, co wskazuje, że obserwowane zabijanie było prawdopodobnie zależne od limfocytów T. Przykład 12. Ocena oporności zaszczepionych myszy na nowotwór [013] Około 2 tygodni po trzecim szczepieniu myszy Balb/C z przykładu (około 8 myszy na grupę terapeutyczną) eksponowano na działanie około 1x mysich komórek raka jelita grubego CT-26 (dożylnie i.v.). [0136] Po około 2 dniach po ekspozycji na komórki CT- 26 i.v. oceniano ilościowo samoistne przerzuty komórek CT-26 do płuc. Myszy uśmiercano, wykonywano sekcję i oceniano obciążenie płuc guzem przez odnotowanie średniej masy płuc w poszczególnych grupach. Masa płuca prawidłowego wynosi około 0,2 gramów. Fig. 22 ilustruje typowe płuca (na górze), usunięte od zaszczepionych, eksponowanych na CT-26 myszy. Fig. 22 obejmuje również wykres (na dole) średniej masy płuca w poszczególnych

8 1 20 2 30 grupach terapeutycznych. Obserwowano wybitne zmniejszenie obciążenia guzem u myszy zaszczepionych szczepionką H60/muSurwiwina według wynalazku w porównaniu ze szczepionkami kontrolnymi. [0137] Fig. 23 obejmuje wykres odsetka myszy pozostających przy życiu po 26 dniach w poszczególnych grupach terapeutycznych. Obserwowano znamienne zwiększenie przeżycia u myszy zaszczepionych szczepionką H60/muSurwiwina według wynalazku w porównaniu ze szczepionkami kontrolnymi. Przykład 13. Ocena ekspresji H60 i musurwiwiny w komórkach 293T [0138] Fig. 24A ilustruje ekspresję H60. Komórki 293T transfekowano pustym wektorem (V) lub ph60 (H) przez 24 godziny, zebrano, zabarwiono tetramerem NKG2D i analizowano metodą cytometrii przepływowej. Skuteczność transfekcji, oceniano metodą transfekcji pgfp (zielone białko fluorescencyjne) wynosiła około 4%. Fig. 24B ilustruje ekspresję musurwiwiny. Komórki 293 T transfekowano pustym wektorem lub pmusurwiwiną przez 24 godziny, zebrano, poddano lizie i analizowano metodą Western blot. Wynik Western blot wskazuje, że musurwiwina jest wykrywalna w komórkach transfekowanych, lecz nie w komórkach natywnych. Część B. Szczepionki z transformowanej podwójnie atenuowanej Salmonella typhimurium AroA -, dam - Przykład 14. Wytwarzanie szczepionki DNA kodującej musurwiwinę i muccl21 [0139] Powielono pełnej długości regiony kodujące surwiwiny mysia (musurwiwina) i mysiego CCL21 (muccl21) metodą odwrotnej transkrypcji-polimerazowej reakcji

9 1 20 2 30 łańcuchowej, stosując 1 μg RNA całkowitego, ekstrahowanego, odpowiednio, z komórek nowotworowych mysiego raka płuca Lewisa D121 i aktywowanych splenocytów mysich. RNA całkowite ekstrahowano zestawem RNEASY Mini kit (Qiagen, Valencia, CA, USA); wykonywano RT-PCR z użyciem ilościowego, jednoetapowego systemu RT-PCR ThermoScript TM Platinum (Gibco/BRL) według instrukcji producenta. Wytworzono kilka konstruktów na bazie wektora pbudce4.1 (Invitrogen) przez zastosowanie produktów PCR przeznaczonych do niezależnej ekspresji dwóch genów z pojedynczego plazmidu w wektorach ekspresji ssaków. Pierwszy konstrukt, musurwiwina/muccl21, zawierający pełnej długości surwiwinę mysią i mysie CCL21, wprowadzono do polilinkera A między miejsca restrykcyjne HindIII i BamHI. Wytworzono chemokinę muccl21 przez insercję genu do polilinkera B między miejscami restrykcyjnymi, odpowiednio, XhoI i NotI. Inne wektory stosowane do szczepienia DNA były oparte na pierwszym konstrukcie, nie zaś na nieobecności muccl21 lub musurwiwiny. Wytworzono pusty wektor jako kontrolę. [0140] Wykazano ekspresję białek musurwiwiny i muccl21 metodą Western blot z użyciem lizatów komórkowych, uzyskanych po transfekcji plazmidów do komórek COS-7 z zastosowaniem przeciwciał, odpowiednio, anty-surwiwiny i anty-ccl21. Ekspresję aktywności EGFP w kępkach Peyera myszy C7BL/6J wykrywano u myszy po doustnym podaniu 8 Salmonella typhimurium (szczep RE88 AroA -, dam - ) transformowanych pegfp. Myszy uśmiercano w punktach czasowych 8, 16 i 36 godzin i pobierano świeże próbki jelita cienkiego do analizy po dokładnym

60 1 20 2 30 wypłukaniu PBS. Wykrywano ekspresję fluorescencji EGFP metodą mikroskopii konfokalnej. [0141] Ewentualne działania toksyczne wywierane przez atenuowane bakterie na organizm gospodarza oceniano przez porównanie podwójnie atenuowanego szczepu RE88 AroA -, dam - z pojedynczo atenuowanym szczepem SL2707 AroA -. Zastosowanie szczepu RE88 skutkowało przeżyciem wszystkich 16 myszy bez żadnych toksycznych objawów niepożądanych, natomiast z 16 myszy immunizowanych szczepem SL2707 dwie padły z powodu toksyczności i zakażeń. Mutacja dim - szczepu RE88, odpowiedzialnego za wirulencję bakterii, sprawia zatem ewidentnie, że szczep ten jest szczególnie użyteczny jako nośnik szczepionki DNA. Przykład 1. Szczepienie i ekspozycja na nowotwór myszy szczepionką z Przykładu 14 za pomocą sondy do żołądka [0142] Myszy C7BL/6J podzielono na pięć grup i immunizowano 3 razy w odstępach 2 tygodni przez sondę do żołądka, podając około 0 μl PBS, zawierającego około 1 x 8 podwójnie atenuowanej S. typhimurium (RE88), w której znajdował się albo pusty wektor pbud, albo indywidualne wektory ekspresji pbudmusurwiwiny/muccl21, pbud-musurwiwiny lub pbud-muccl21; piąta grupa otrzymywała PBS. Wszystkie myszy otrzymujące leczenia profilaktyczne eksponowano przez wstrzyknięcia i.v. około 1 x komórek mysiego raka płuca Lewisa D121 około 1 tygodnia po ostatniej immunizacji. W warunkach terapeutycznych myszom najpierw wstrzykiwano i.v. około 1 x komórek mysiego raka płuca Lewisa D121 i 1 tydzień później poddawano je 3 szczepieniom transformowaną S.

61 1 20 2 typhimurium. Myszy codziennie badano, po czym uśmiercano i oceniano pod kątem przerzutów do płuc około 28 dni po ekspozycji komórkami nowotworu w modelu profilaktycznym lub 63 dni po pierwszej inokulacji komórkami nowotworowymi w modelu terapeutycznym. [0143] W tabeli 3 ukazano wyniki oceny punktowej przerzutów guza po immunizacji, odpowiednio, szczepionką z PBS, pustym wektorem, CCL21, surwiwiną lub CCL21/surwiwinę, przeprowadzonej celem profilaktycznego leczenia szczepionkami. Wyniki w tabeli 3 przedstawiono jako ocenę punktową przerzutów, wyrażoną jako % powierzchni płuca pokrytej rozlanymi ogniskami przerzutowymi: 0=brak; 1=poniżej %; 2=od do 0% i 3= >0%. Różnice w ocenie punktowej przerzutów między grupami myszy leczonych szczepionką CCL21/surwiwina a wszystkimi grupami kontrolnymi były statystycznie znamienne (P=<0,001). W tym modelu terapeutycznym obserwowano również hamowanie wzrostu guza. Tabela 3. Przerzuty guza u myszy Balb/C eksponowanych po szczepieniu na komórki raka płuca Lewisa D121 Grupa szczepienia myszy Ocena punktowa przerzutów A. Szczepionka 0,0,0,0,0,0,1,1 musurwiwina/muccl21 B. Kontrola - szczepionka 0,1,1,2,2,3,3,3 musurwiwina C. Kontrola - szczepionka muccl21 2,2,2,2,3,3,3,3 D. Kontrola - szczepionka z 3,3,3,3,3,3,3,3 pustym wektorem E. Kontrola - szczepienie PBS 3,3,3,3,3,3,3 [0144] W tym modelu profilaktycznym obserwowano zdecydowane zahamowanie rozsianych przerzutów do płuc mysiego raka płuca Lewisa D121 u myszy zaszczepionych 3 razy w odstępach 2 tygodni i następnie eksponowanych 1

62 1 20 2 30 tydzień później przez wstrzyknięcie i.v. komórek nowotworowych. W istocie u 6 z 8 myszy nastąpiło całkowite odrzucenie wszystkich przerzutów guza do płuca, u pozostałych zwierząt zaś znaczne zahamowanie przerzutów guza (zob. tabela 3). Przeciwnie, oparta na surwiwinie szczepionka DNA bez muccl21 indukowała całkowite zahamowanie przerzutów u zaledwie 8 zwierząt; dwie myszy wykazywały mniejszy niż % wzrost przerzutów guza, natomiast u wszystkich pozostałych myszy stwierdzano rozległy wzrost przerzutów guza. Dodatkowe zwierzęta, leczone tylko szczepionkami kontrolnymi z PBS lub pustym wektorem nie wykazywały żadnej ochrony przed rozwojem nowotworu i padały w ciągu 4 tygodni od ekspozycji na komórki nowotworowe, z powodu rozległych przerzutów. Mimo, że immunizacja podwójnie atenuowaną Salmonella, zawierającą tylko wydzielniczy plazmid muccl21, nie dawała wybitnego hamowania przerzutów guza, powodowała jednak statystycznie znamienne opóźnienie powstawania przerzutów w porównaniu do kontroli. [014] Co istotne, oparta na musurwiwinie/muccl21 szczepionka DNA była również skuteczna w zakresie znacznego zahamowania wzrostu już dobrze rozwiniętych przerzutów do płuc u wszystkich zwierząt doświadczalnych w warunkach terapeutycznych. Przeciwnie, u wszystkich myszy otrzymujących tylko szczepionki oparte na samej musurwiwinie lub samym muccl21 i u wszystkich myszy kontrolnych, otrzymujących pusty wektor lub PBS, występowały w tym modelu doświadczalnym rozległe, rozlane przerzuty do płuc niedrobnokomórkowego raka płuca D121. Masę płuc w

63 1 20 poszczególnych grupach doświadczalnych modelu terapeutycznego ukazano w tabeli 4. Masa płuca prawidłowego wynosiła około 0,3 g. Tabela 4. Przerzuty guza u myszy Balb/C uprzednio eksponowanych na komórki raka płuca Lewisa D121 - masa płuca Grupa szczepienia myszy Masa płuca (g) A. Szczepionka musurwiwina/muccl21 0,6 ± 0,09 B. Kontrola szczepionka musurwiwina 0,34 ±0,06 C. Kontrola szczepionka muccl21 0,86 ± 0,11 D. Kontrola szczepionka z pustym wektorem 1,29 ± 0,4 E. Kontrola - szczepienie PBS 1,2 ± 0,34 Przykład 16. Określanie wpływu antyangiogennego u zaszczepionych myszy z przykładu 1 [0146] Dwa tygodnie po ostatnim szczepieniu myszom wstrzykiwano podskórnie (s.c.) w okolicę mostka około 00 ml Matrigel o obniżonej zawartości czynników wzrostu (BD Biosciences), zawierającego około 400 ng/ml mysiego FGF-2 (PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA) i komórek nowotworowych D121 (1 x 4 /ml), które napromieniowano 00 Gy. U wszystkich myszy, z wyjątkiem 2 zwierząt kontrolnych, tkankę śródbłonka zabarwiano 6 dni później przez wstrzyknięcie do żyły ogonowej bocznej 200 ml fluorescencyjnej lektyny I Bandeiraea simplicifolia w stężeniu 0,1 mg/ml, Isolectin B4 (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA); około 30 minut później myszy uśmiercano, wycinano wstrzyknięty uprzednio element Matrigel i oceniano go makroskopowo. Następnie z 0 ml każdego elementu ekstrahowano lektynę-fitc w 00 ml buforu litycznego

64 1 20 2 30 RIPA i oznaczano ilościowo przez fluorymetrię przy długości fali 490 nm. W każdym przypadku odejmowano fluorescencję tła, stwierdzaną u dwóch myszy kontrolnych, które nie otrzymały wstrzyknięcia. [0147] Szczepionka oparta na musurwiwinie/muccl21 zdecydowanie hamowała angiogenezę w naczyniach guza. Obserwowano znamienne zmniejszenie tworzenia nowych naczyń w guzie, na co wskazują testy z użyciem Matrigel i oznaczenia ilościowe na podstawie fluorescencji względnej mierzonej po barwieniu in vivo śródbłonka myszy lektyną sprzężoną z FITC. Przy badaniu reprezentatywnych elementów Matrigel, usuwanych 6 dni po wstrzyknięciu s.c. lektyny sprzężonej z FITC, obserwowano ewidentne makroskopowo różnice w unaczynieniu guza pomiędzy grupami leczonymi szczepionką musurwiwina/muccl212 a grupami kontrolnymi myszy. Myszy zaszczepione szczepionką według wynalazku wykazywały znamiennie mniejsze unaczynienie guza w porównaniu z grupami kontrolnymi. Przykład 17. Test cytotoksyczności [0148] dni po ekspozycji na komórki nowotworowe od skutecznie zaszczepionych myszy izolowano splenocyty. Cytotoksyczność oceniano na podstawie standardowego testu uwalniania 1 Cr, przy czym cel stanowiły komórki nowotworowe D 121 lub mysie komórki śródbłonkowe, wykazujące nadmierną ekspresję surwiwiny. W celu określenia swoistej cytotoksyczności restrykcji, przeprowadzono ocenę hamowania z zastosowaniem μg/ml skierowanych przeciwciał H-2Kb/Db klasy I MHC przeciwko antygenom mysim (Pharmingen, San Diego, CA, USA).

6 1 20 2 30 [0149] Test uwalniania 1 Cr wykazał zaznaczoną cytotoksyczność indukowaną przez swoiste limfocyty T CD8+ uzyskane od myszy poddanych szczepieniu i następnie ekspozycji na komórki raka płuca Lewisa D121. Limfocyty T CD8+ izolowane ze splenocytów myszy immunizowanych szczepioną musurwiwina/muccl21 lub szczepionką musurwiwina same przez się wywoływały skuteczną lizę, odpowiednio, 0% i 30% komórek guza D121. Przeciwnie, limfocyty T CD8+ izolowane od zwierząt kontrolnych były nieskuteczne w zakresie wywoływania jakiegokolwiek zauważalnego zabijania komórek nowotworowych, ponieważ wykazywały tylko aktywność cytotoksyczną odpowiadającą tłu. Co charakterystyczne, obserwowana cytotoksyczność zależna od limfocytów CD8+ była ograniczana przez MHC klasy 1 antygen, ponieważ cytotoksyczność ulegała całkowitemu wyeliminowaniu po dodaniu przeciwciał anty-h2kb/h2db. Przykład 18. Analiza metodą cytometrii przepływowej i test uwalniania cytokin [0] Oznaczano markery aktywacji limfocytów T i ekspresję cząsteczek kostymulujących na CD11c i DC dodatnich pod kątem antygenów MHC klasy II poprzez analizy metodą 2 lub 3-barwnej cytometrii przepływowej, stosując cytometr FACScan firmy BD Biosciences. Aktywację limfocytów T określano przez barwienie splenocytów świeżo izolowanych od skutecznie zaszczepionych myszy wyznakowanymi FITC przeciwciałami anty-cd3e w skojarzeniu ze sprzężonymi z PE przeciwciałami anty- CD2, CD28 lub CD69. Aktywację cząsteczek kostymulujących na APC mierzono za pomocą wyznakowanego FITC przeciwciała anty-cd11c i

66 1 20 2 30 biotynylowanego przeciwciała anty-iab, następnie z użyciem streptawidyny-allofikocyjaniny i w skojarzeniu ze sprzężonymi z PE przeciwciałami anty-icam-1, CD80 lub DEC20. Wszystkie doświadczenia z zakresu cytometrii przepływowej przeprowadzono w obecności 0,1 μg/ml jodku propidyny w celu wykluczenia komórek martwych. Wszystkie odczynniki do tych testów uzyskano z firmy BD Pharmingen (La Jolla, CA, USA). [011] Cytometrię przepływową zastosowano do wykrywania cytokin wewnątrzkomórkowych. W tym celu około 2 tygodni po ekspozycji na guz D121 od myszy B7BL/6J pobrano splenocyty i hodowano je przez około 24 godziny w kompletnej pożywce dla limfocytów T wraz z napromieniowanymi komórkami D121, jak opisano uprzednio. Poddane wstępnej inkubacji komórki zawieszono w około 1 mg oczyszczonego przeciwciała 2.4G2 (BD Pharmingen) w celu zablokowania barwienia nieswoistego. Komórki przepłukano i zabarwiono 0, mg sprzężonego z FITC przeciwciała anty-cd3+. Po 2-krotnym przepłukaniu komórki utrwalono i zabarwiono 1 mg/ml PE sprzężonego z przeciwciałem anty-il2 lub anty-ifn-g w celu przeprowadzenia analizy metodą cytometrii przepływowej. Wszystkie przeciwciała uzyskano z firmy BD Pharmingen (La Jolla, CA, USA). [012] Tylko szczepionka musurwiwina/muccl21 była sama przez się optymalnie skuteczna w zakresie zaznaczonej regulacji w górę ekspresji markerów aktywacji limfocytów T CD2, CD28 i CD69. Regulacja CD28 w górę ma szczególne znaczenie, ponieważ wiadomo, że jego interakcje z cząsteczkami kostymulującymi B7 na DC mają zasadnicze znaczenie dla uzyskania wielu krytycznych

67 1 20 2 30 interakcji między uprzednio nieeksponowanymi limfocytami T a DC prezentującymi antygen. Przeciwnie, szczepionki DNA kodujące tylko musurwiwinę lub muccl21 same przez się tylko jednokrotnie zwiększały ekspresję markerów aktywacji limfocytów T. Na aktywacja limfocytów T, zarówno CD4+, jak i CD8+ przez szczepionkę musurwiwina/muccl21 wskazywało również zdecydowane zwiększanie przez nie ilości obecnych wewnątrzkomórkowo prozapalnych cytokin IFN-g i IL-2. Dla porównania, stwierdzono, że kontrole (PBS i pusty wektor), jak również szczepionki DNA kodujące tylko musurwiwinę lub muccl21 wykazują znacząco mniejszą skuteczność w indukowaniu tych cytokin. [013] Regulacja w górę ekspresji ICAM-1, CD80 i DEC20 na DC, uzyskiwana przez zastosowanie opartej na musurwiwinie/muccl21 szczepionki DNA, jest szczególnie istotna, ponieważ wiadomo, że aktywacja limfocytów T krytycznie zależy od silnych interakcji międzykomórkowych z tymi cząsteczkami kostymulującymi, ulegającymi ekspresji na DC, w zakresie osiągania optymalnego połączenia z receptorami limfocytów T. Ponownie, immunizacja podwójnie atenuowaną Salmonella typhimurium, zawierającą plazmidy eukariotyczne kodujące musurwiwinę/muccl21, indukowała najskuteczniejszą regulację w górę tych markerów aktywacji; regulacja osiągała poziom 2-3-krotnie wyższy niż w przypadku kontroli. Przykład 19. Analiza apoptozy komórek nowotworowych [014] Indukowaną przez szczepienie apoptozę w komórkach nowotworu D121 mierzono, odpowiednio, po 3 godzinach i około 24 godzinach po szczepieniu. Zarówno

68 1 20 2 30 zwierzęta kontrolne, jak i doświadczalne eksponowano i.v. na około 1 x komórek D121 1 tydzień po ostatniej z 3 immunizacji. Od poszczególnych myszy pobierano splenocyty 1 tydzień po ekspozycji na nowotwór, po czym 2, x 7 splenocytów hodowano jednocześnie przez 4 godziny z około x komórek D121 na 6-studzienkowych płytkach. Do potwierdzenia wczesnego stadium apoptozy zastosowano zestaw ANNEXIN V-FITC Apoptosis Detection Kit II (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA, USA). W celu potwierdzenia późniejszego stadium apoptozy komórek nowotworowych, około x komórek D121 i około 2, x 7 splenocytów hodowano jednocześnie przez około 24 godziny, po czym analizowano metodą FACS pod kątem apoptozy testem TUNEL, stosując zestaw APO-DIRECT Kit (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA, USA) według instrukcji producenta. [01] Apoptozę obserwowano już po 3 godzinach, z istotnym dalszym zwiększeniem po 24 godzinach, na co wskazują wyniki analizy metodą cytometrii przepływowej danych uzyskanych z użyciem testów z Annexin V lub testów TUNEL. I tak apoptoza wczesnego stadium była 3-4-krotnie większa w grupach myszy immunizowanych szczepionką musurwiwina/muccl21 niż u zwierząt kontrolnych, gdy splenocyty pobrane od takich myszy poddano jednoczesnej inkubacji z komórkami nowotworowymi. Szczepionka kodująca tylko musurwiwinę wyzwalała w pewnym stopniu apoptozę, lecz tylko jednokrotnie większą niż u kontroli. U myszy immunizowanych szczepionką musurwiwina/muccl21 obserwowano natomiast wybitne 8% zwiększenie apoptozy

69 1 20 2 30 po 24 godzinach, co sugeruje, że zdarzenie to wyzwolone zostało przez silną odporność na komórki nowotworowe indukowane przez CTL. Przykład 20. Wytwarzanie szczepionek DNA kodujących musurwiwinę i H60 [016] Plazmid zawierający pełnej długości mysi ligand NKG2D-H60 był darem dr. A. Diefenbacha i dr. D. H. Rauleta (University of California, Berkeley, CA, USA). Wektory ekspresji skonstruowano na rdzeniu pbudce4.1 (Invitrogen), jak opisano powyżej. [017] Podwójnie atenuowaną S. typhimurium (AroA -, dam - ) transformowano plazmidami ze szczepionką DNA przez elektroporację, jak opisano powyżej. Pokrótce, świeżo przygotowane bakterie (około 1 x 8 ), w średniej fazie wzrostu, zmieszano z plazmidem DNA (1-2 μg) na lodzie w 0,1-cm kuwecie i poddano elektroporacji przy około 2,0 KV, 2 μf i 0 Q. Kolonie oporne, w których znajdowały się wektory ze szczepionką DNA, hodowano i przechowywano w temperaturze -80 C po potwierdzeniu sekwencji kodujących. Przykład 21. Szczepienie dojelitowe i ekspozycja myszy na nowotwór z użyciem szczepionki z przykładu 20 [018] Grupy myszy BALB/c A2Kb (n=4-12) immunizowano dwukrotnie w odstępie 2 tygodni sondą dożołądkową 0 μl PBS, zawierającego około x 8 podwójnie atenuowanej S. typhimurium, w której znajdowały się wektory ekspresji. W modelach profilaktycznych myszy BALB/c eksponowano i.v. na około 1x CT-26 komórek 2 tygodnie po ostatnim szczepieniu, a w modelach terapeutycznych dni przed pierwszym szczepieniem. Myszy uśmiercano 2 lub 28 dni po ekspozycji na

70 1 20 2 30 nowotwór, określano, odpowiednio, przerzuty do płuc lub masę guza i porównywano je z analogicznymi wartościami u kontroli. Znamienność statystyczną różnic między grupami doświadczalnymi a zwierzętami kontrolnymi określano testem t-studenta. Różnice uznawano za znamienne, jeżeli dwustronne wartości P miały wartość <0,0. [019] Ekspresję H60 i musurwiwiny potwierdzono przez transfekowanie komórek 293T i sprawdzenie metodą cytometrii przepływowej lub analizą Western blot. Ekspresję H60 potwierdzono przez dodatni wynik barwienia tetrameru NKG2D. Komórki transfekowane surwiwiną dały wynik dodatni, na co wskazuje obecność pojedynczego prążka przy oczekiwanej masie cząsteczkowej około 16,KDa. Poziom ligandu NKG2D, którego ekspresję wykazują CT-26, jest względnie niski w porównaniu z kontrolą dodatnią komórkami Yac-1. Uprzednio opisywano, że komórki nowotworowe z niskim poziomem ekspresji ligandu NKG2D nie powodują odrzucenia guza. W modelu profilaktycznym określano masę płuca i wynik punktowy oceny przerzutów (jak opisano powyżej) po uśmierceniu myszy, 2 dni po ekspozycji na nowotwór. Wyniki przedstawiono w tabeli i tabeli 6. Dane wskazują, że szczepionki H60 i musurwiwina indywidualnie chroniły myszy w pewnym stopniu, natomiast skojarzenie H60 i musurwiwiny (szczepionka musurwiwina/h60) znacznie zwiększało ochronę przed ekspozycją na nowotwory, czego dowodzą znamiennie niższe wyniki punktowe oceny przerzutów i zmniejszenie obciążenia guzem w płucach. Wyniki te były statystycznie znamienne w porównaniu z grupami

71 1 20 kontrolnymi: PBS, pbud, ph60 i pmusurwiwiną (odpowiednio, p<0,0001, 0,002, 0,01 i 0,00). [0160] W modelu terapeutycznym, to znaczy przeciwko obecnym już przerzutom raka okrężnicy, obciążenie płuc guzem oceniano po uśmierceniu w dniu 28. Znamiennie, przeżyło 8 z 12 myszy leczonych szczepionką H60/muSurwiwina; co ważniejsze, u 2 z tych zwierząt, które przeżyły, nie było żadnych przerzutów, natomiast u 2 innych poniżej % powierzchni płuc było pokryte rozlanymi przerzutami guza. Dla porównania, w grupie kontrolnej, otrzymującej wektor pbud, przeżyły tylko 2 myszy; u myszy, które przeżyły, ponad 0% powierzchni płuca było pokryte rozlanymi przerzutami guza. Szczepienie samą szczepionką musurwiwina nie dawało żadnej znamiennej ochrony w modelu terapeutycznym, natomiast leczenie samą szczepionką H60 miało tylko marginalny efekt terapeutyczny. Na to ostatnie wskazuje niewielka poprawa współczynnika przeżycia i to, że u jednej z myszy, które przeżyły, tylko <% powierzchni płuca było pokryte rozlanymi przerzutami guza. Tabela. Przerzuty guza u myszy Balb/C eksponowanych na komórki CT-26 po immunizacji Grupa szczepienia myszy A. Szczepionka musurwiwina/h60 B. Kontrola szczepionka musurwiwina C. Kontrola szczepionka H60 D. Kontrola szczepionka z pustym wektorem E. Kontrola - szczepienie PBS Ocena w skali Liczba myszy, przerzutów które przeżyły 0,0,1,1,1,2 6 1,1,1,1,2,2 6 0,1,1,1,3,3 6 3,3,3,3 4 2,3,3,3 4

72 1 20 Tabela 6. Przerzuty guza u myszy Balb/C eksponowanych na komórki CT-26 przed immunizacją Grupa szczepienia myszy Ocena w skali przerzutów Liczba myszy, które przeżyły A. Szczepionka 0,1,1,2,3,3,3 8 musurwiwina/h60 B. Kontrola 3,3 2 szczepionka musurwiwina C. Kontrola 1,3,3 3 szczepionka H60 D. Kontrola szczepionka z pustym wektorem 2,3 2 Przykład 22. Test cytotoksyczności [0161] Oznaczano cytotoksyczność standardowym testem uwalniania 1 Cr, jak opisano powyżej. Pokrótce, pobierano splenocyty 2 tygodnie po ostatniej immunizacji i stymulowano je in vitro napromieniowanymi (00 Gy) komórkami CT-26 w temperaturze 37 C przez dni w RPMI 1640 uzupełnionym % FBS, L-glutaminy, 1mM HEPES, nieniezbędnymi aminokwasami, pirogronianem sodu, 2-ME i rekombinowaną IL-2 w stężeniu 20 j/ml (PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA). Splenocyty zebrano i rozdzielono, stosując pożywkę do rozdzielania komórek Lympholyte-M (Cedarlane Laboratories Limited, Hornby, Ontario, Kanada). Komórki docelowe znakowano 1 Cr przez około 1, godziny w temperaturze pokojowej i inkubowano z komórkami efektorowymi w różnym stosunku efektor:komórki docelowe w temperaturze około 37 C przez około 4 godziny. Obliczano odsetek lizy swoistych komórek docelowych ze wzoru [(E-S)/(T-S)]x0, gdzie E jest to średnie

73 1 20 2 uwalnianie doświadczalne, S średnie uwalnianie samoistne, a T średnie uwalnianie całkowite. [0162] Stwierdzono znamienne zwiększenie aktywności NK u myszy immunizowanych szczepionką H60; jeszcze znaczniejsze zabijanie NK obserwowano u myszy immunizowanych szczepionką musurwiwina/h60. Splenocyty od myszy immunizowanych szczepionką musurwiwina/h60 wykazywały największą cytotoksyczność przeciwko komórkom docelowym CT-26. Przeciwnie, takie splenocyty izolowane od zwierząt kontrolnych immunizowanych pbud wykazywały minimalne zabijanie cytotoksyczne, podczas gdy splenocyty od myszy zaszczepionych samą szczepionką H60 lub musurwiwina wykazywały cokolwiek znaczniejsze zabijanie cytotoksyczne. Po dniach hodowli komórkowej, komórki NK, jak się wydaje, nie odgrywały większej roli w tym teście cytotoksyczności, ponieważ nie obserwowano znamiennych różnic przy zastosowaniu jako komórek docelowych komórek NK Yac-1, co sugeruje, że wykrywana cytotoksyczność była zależna głównie od CTL. [0163] Można dokonywać różnych zmian i modyfikacji wykonań opisanych powyżej. Niniejszy opis nie zawiera intencji ograniczeń w odniesieniu do konkretnych przedstawionych w nim wykonań i nie należy z niego wyciągać wniosku, że jakiekolwiek takie ograniczenia istnieją. 30 3 WYKAZ SEKWENCJI [164] <1> Xiang, Rong Zhou, Ile Reisfeld, Ralph A. The Scripps Research Institute <120> Szczepionki DNA przeciwko wzrostowi nowotworów i sposoby ich stosowania

74 <130> TSRI-874.1PC <> 60/47,009 <11> 2003-03-24 <160> 29 <170> FastSEQ for Windows wersja 4.0 <2> 1 <211> 1643 <212> DNA <213> HOMO SAPIENS <400> 1 agatttgaat cgcgggaccc gttggcagag gtggcggcgg cggcatgggt gccccgacgt 60 tgccccctgc ctggcagccc tttctcaagg accaccgcat ctctacattc aagaactggc 120 ccttcttgga gggctgcgcc tgcaccccgg agcggatggc cgaggctggc ttcatccact 180 gccccactga gaacgagcca gacttggccc agtgtttctt ctgcttcaag gagctggaag 240 gctgggagcc agatgacgac cccatagagg aacataaaaa gcattcgtcc ggttgcgctt 300 tcctttctgt caagaagcag tttgaagaat taacccttgg tgaatttttg aaactggaca 360 gagaaagagc caagaacaaa attgcaaagg aaaccaacaa taagaagaaa gaatttgagg 420 aaactgcgaa gaaagtgcgc cgtgccatcg agcagctggc tgcc.atggat tgaggcctct 480 ggccggagct gcctggtccc agagtggctg caccacttcc agggtttatt ccctggtgcc 40 accagccttc ctgtgggccc cttagcaatg tcttaggaaa ggagatcaac attttcaaat 600 tagatgtttc aactgtgctc ttgttttgtc ttgaaagtgg caccagaggt gcttctgcct 660 gtgcagcggg tgctgctggt aacagtggct gcttctctct ctctctctct tttttggggg 720 ctcatttttg ctgttttgat tcccgggctt accaggtgag aagtgaggga ggaagaaggc 780 agtgtccctt ttgctagagc tgacagcttt gttcgcgtgg gcagagcctt ccacagtgaa 840 tgtgtctgga cctcatgttg ttgaggctgt cacagtcctg agtgtggact tggcaggtgc 900 ctgttgaatc tgagctgcag gttccttatc tgtcacacct gtgcctcctc agaggacagt 960 ttttttgttg tgtttttttt tttttttttt ggtagatgca tgacttgtgt gtgatgagag 20 aatggagaca gagtccccgg ctcctctact gtttaacaac atggctttct tattttgttt 80 gaattgttaa ttcacagaat agcacaaact acaattaaaa ctaagcacaa agccattcta 1140 agtcattggg gaaacggggt gaacttcagg tggatgagga gacagaatag agtgatagga 1200 agcgtctggc agatactcct tttgccactg ctgtgtgatt agacaggccc agtgagccgc 1260 ggggcacatg ctggccgctc ctccctcaga aaaaggcagt ggcctaaatc ctttttaaat 1320 gacttggctc gatgctgtgg gggactggct gggctgctgc aggccgtgtg tctgtcagcc 1380 caaccttcac atctgtcacg ttctccacac gggggagaga cgcagtccgc ccaggtcccc 1440 gctttctttg gaggcagcag ctcccgcagg gctgaagtct ggcgtaagat gatggatttg 0 attcgccctc ctccctgtca tagagctgca gggtggattg ttacagcttc gctggaaacc 160 tctggaggtc atctcggctg ttcctgagaa ataaaaagcc tgtcatttca aataaaaaaa 1620 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 1643 1 <2> 2 <211> 142 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 2 Met Gly Thr Trp Gln Phe Lys Asp 1 1 His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Phe Gly Cys 20 2 30 Cys Thr Arg Met Gly Phe Ile His Cys Thr 3 40 4 Asn Asp Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys 0 60

7 Gly Trp Asp Asp Asp Ile His Lys Lys His 6 70 7 80 Ser Ser Gly Cys Phe Ser Val Lys Lys Gln Phe 8 90 9 Thr Gly Phe Lys Asp Arg Arg Lys Asn Lys 0 1 Ile Lys Thr Asn Asn Lys Lys Lys Phe Thr 11 120 12 Lys Lys Val Arg Arg Ile Gln Met Asp 130 13 140 <2> 3 <211> 9 <212> DNA <213> MUS MUSCULUS <400> 3 ggcacgaggg ggccggggct ctcccggcat gctctgcggc gcgcctccgc ccgcgcgatt 60 tgaatcctgc gtttgagtcg tcttggcgga ggttgtggtg acgccatcat gggagctccg 120 gcgctgcccc agatctggca gctgtacctc aagaactacc gcatcgccac cttcaagaac 180 tggcccttcc tggaggactg cgcctgcacc ccagagcgaa tggcggaggc tggcttcatc 240 cactgcccta ccgagaacga gcctgatttg gcccagtgtt ttttctgctt taaggaattg 300 gaaggctggg aacccgatga caacccgata gaggagcata gaaagcactc ccctggctgc 360 gccttcctca ctgtcaagaa gcagatggaa gaactaaccg tcagtgaatt cttgaaactg 420 gacagacaga gagccaagaa caaaattgca aaggagacca acaacaagca aaaagagttt 480 gaagagactg caaagactac ccgtcagtca attgagcagc tggctgccta atgctgagcc 40 tttgctgaga taacttggac ctgagtgaca tgccacatct aagccacgca tcccagcttt 600 tccagccagg gcctcctagc aggatcttag agaaggagac agtggtattt tgaaactgga 660 tatcaaatat ttttggtttt gctttaaagt ggctacctct ctttggtttt gtggctttgc 720 tctattgtga cgtggactta agcaataagg aagtgatgaa gggacagtgt tctctgacag 780 gacctgtggg ggtcggggtg cctgtgcaag gtcttggttc tgattgtgat atttccatac 840 agggctgcta atgcagccca tgggtaagtg tggttatatg tgtttgtgct gataattttg 900 tcctgatgag ttttcctacc acggggtaac ggaataaaat cacttgaaaa agtgg 9 <2> 4 <211> 140 <212> PRT <213> MUS MUSCULUS <400> 4 Met Gly Gln Ile Trp Gln Tyr Lys Asn 1 1 Tyr Arg Ile Thr Phe Lys Asn Trp Phe Asp Cys 20 2 30 Cys Thr Arg Met Gly Phe Ile His Cys Thr 3 40 4 Asn Asp Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys 0 60 Gly Trp Asp Asp Asn Ile His Arg Lys His 6 70 7 80 Ser Gly Cys Phe Thr Val Lys Lys Gln Met 8 90 9 Thr Val Ser Phe Lys Asp Arg Gln Arg Lys Asn Lys 0 1

76 Ile Lys Thr Asn Asn Lys Gln Lys Phe Thr 11 120 12 Lys Thr Thr Arg Gln Ser Ile Gln 130 13 140 <2> <211> 82 <212> DNA <213> HOMO SAPIENS <400> cttgcagctg cccacctcac cctcagctct ggcctcttac tcaccctcta ccacagacat 60 ggctcagtca ctggctctga gcctccttat cctggttctg gcctttggca tccccaggac 120 ccaaggcagt gatggagggg ctcaggactg ttgcctcaag tacagccaaa ggaagattcc 180 cgccaaggtt gtccgcagct accggaagca ggaaccaagc ttaggctgct ccatcccagc 240 tatcctgttc ttgccccgca agcgctctca ggcagagcta tgtgcagacc caaaggagct 300 ctgggtgcag cagctgatgc agcatctgga caagacacca tccccacaga aaccagccca 360 gggctgcagg aaggacaggg gggcctccaa gactggcaag aaaggaaagg gctccaaagg 420 ctgcaagagg actgagcggt cacagacccc taaagggcca tagcccagtg agcagcctgg 480 agccctggag accccaccag cctcaccaac gcttgaagcc tgaacccaag atgcaagaag 40 gaggctatgc tcaggggccc tggagcagcc accccatgct ggccttgcca cactctttct 600 cctgctttaa ccaccccatc tgcattccca gctctaccct gcatggctga gctgcccaca 660 gcaggccagg tccagagaga ccgaggaggg agagtctccc agggagcatg agaggaggca 720 gcaggactgt ccccttgaag gagaatcatc aggaccctgg acctgatacg gctccccagt 780 acaccccacc tcttccttgt aaatatgatt tatacctaac tgaataaaaa gctgttctgt 840 cttcccaccc gc 82 1 <2> 6 <211> 134 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 6 Met Gln Ser Ser Ile Val Phe 1 1 Gly Ile Arg Thr Gln Gly Ser Asp Gly Gly Gln Asp Cys Cys 20 2 30 Lys Tyr Ser Gln Arg Lys Ile Lys Val Val Arg Ser Tyr 3 40 4 Arg Lys Gln Ser Gly Cys Ser Ile Ile Phe 0 60 Arg Lys Arg Ser Gln Cys Asp Lys 6 70 7 80 Trp Val Gln Gln Met Gln His Asp Lys Thr Ser 8 90 9 Gln Lys Gln Gly Cys Arg Lys Asp Arg Gly Ser Lys Thr 0 1 Gly Lys Lys Gly Lys Gly Ser Lys Gly Cys Lys Arg Thr Arg Ser 11 120 12 Gln Thr Lys Gly 130 <2> 7 <211> 61

77 <212> DNA <213> MUS MUSCULUS <400> 7 gaattcggcc aaagaggcct acggccaaag agggctaaac ttgcggctgt ccatctcacc 60 tacagctctg gtctcatcct caactcaacc acaatcatgg ctcagatgat gactctgagc 120 ctccttagcc tggtcctggc tctctgcatc ccctggaccc aaggcagtga tggagggggt 180 caggactgct gccttaagta cagccagaag aaaattccct acagtattgt ccgaggctat 240 aggaagcaag aaccaagttt aggctgtccc atcccggcaa tcctgttctc accccggaag 300 cactctaagc ctgagctatg tgcaaaccct gaggaaggct gggtgcagaa cctgatgcgc 360 cgcctggacc agcctccagc cccagggaaa caaagccccg gctgcaggaa gaaccgggga 420 acctctaagt ctggaaagaa aggaaagggc tccaagggct gcaagagaac tgaacagaca 480 cagccctcaa gaggatagcc cagtagcccg cctggagccc aggagatccc ccacgaactt 40 caagctgggt ggttcacggt ccaactcaca ggcaaagagg gagctagaaa acagactcag 600 gagccgctag tcgag 61 <2> 8 <211> 133 <212> PRT <213> MUS MUSCULUS <400> 8 Met Gln Met Met Thr Ser Ser Val 1 1 Cys Ile Trp Thr Gln Gly Ser Asp Gly Gly Gly Gln Asp Cys Cys 20 2 30 Lys Tyr Ser Gln Lys Lys Ile Tyr Ser Ile Val Arg Gly Tyr 3 40 4 Arg Lys Gln Ser Gly Cys Ile Ile Phe 0 60 Ser Arg Lys His Ser Lys Cys Asn 6 70 7 80 Gly Trp Val Gln Asn Met Arg Arg Asp Gln 8 90 9 Gly Lys Gln Ser Gly Cys Arg Lys Asn Arg Gly Thr Ser Lys Ser 0 1 Gly Lys Lys Gly Lys Gly Ser Lys Gly Cys Lys Arg Thr Gln Thr 11 120 12 Gln Ser Arg Gly 130 1 <2> 9 <211> 746 <212> DNA <213> MUS MUSCULUS <400> 9 tgagggaaga ccatggcaaa gggagccacc agcaagagca accattgcct gattctgagc 60 cttttcattc tgctgagcta tctggggacc atactggcag atggtacaga ctctctaagt 120 tgtgaattaa ctttcaacta tcgtaatcta catggacagt gctcagtgaa tggaaagact 180 ctccttgatt ttggtgataa aaaacatgag gaaaatgcta ctaagatgtg tgctgatttg 240 tcccaaaacc tgagagagat ttcagaagag atgtggaagt tacaatcagg taatgatacc 300 ttgaatgtca caacacaatc tcagtataat caaggaaaat tcattgatgg attctgggcc 360 atcaacactg atgaacagca tagcatctac ttttatccac ttaatatgac ctggagagaa 420 agtcattctg ataacagcag tgccatggag cagtggaaga acaagaacct agagaaagat 480

78 atgaggaatt tcctcatcac atatttcagt cactgcctca acaaatcgtc atcacacttt 40 agagaaatgc caaaatcaac attaaaggtg ccggatacca cccaacgtac aaatgccact 600 cagattcatc ctacagtgaa taacttccga cataattctg acaaccaggg tctgagtgtc 660 acctggattg tgattatatg tataggagga ttagtgtctt tcatggcatt catggtattc 720 gcttggtgta tgctgaagaa aaaaaa 746 <2> <211> 244 <212> PRT <213> MUS MUSCULUS <400> Met Lys Gly Thr Ser Lys Ser Asn His Cys Ile Ser 1 1 Phe Ile Ser Tyr Gly Thr Ile Asp Gly Thr 20 2 30 Asp Ser Ser Cys Thr Phe Asn Tyr Arg Asn His Gly 3 40 4 Gln Cys Ser Val Asn Gly Lys Thr Asp Phe Gly Asp Lys Lys 0 60 His Asn Thr Lys Met Cys Asp Ser Gln Asn 6 70 7 80 Arg Ile Ser Met Trp Lys Gln Ser Gly Asn Asp Thr 8 90 9 Asn Val Thr Thr Gln Ser Gln Tyr Asn Gln Gly Lys Phe Ile Asp 0 1 Gly Phe Trp Ile Asn Thr Asp Gln His Ser Ile Tyr Phe Tyr 11 120 12 Asn Met Thr Trp Arg Ser His Ser Asp Asn Ser Ser 130 13 140 Met Gln Trp Lys Asn Lys Asn Lys Asp Met Arg Asn Phe 14 1 160 Ile Thr Tyr Phe Ser His Cys Asn Lys Ser Ser Ser His Phe 16 170 17 Arg Met Lys Ser Thr Lys Val Asp Thr Thr Gln Arg 180 18 190 Thr Asn Thr Gln Ile His Thr Val Asn Asn Phe Arg His Asn 19 200 20 Ser Asp Asn Gln Gly Ser Val Thr Trp Ile Val Ile Ile Cys Ile 2 21 220 Gly Gly Val Ser Phe Met Phe Met Val Phe Trp Cys Met 22 230 23 240 Lys Lys Lys <2> 11 <211> 878 <212> DNA <213> MUS MUSCULUS <400> 11 atcccagccc acgcacagac ccccaacttg cagctgccca cctcaccctc agctctggcc 60 tcttactcac cctctaccac agacatggct cagtcactgg ctctgagcct ccttatcctg 120 gttctggcct ttggcatccc caggacccaa ggcagtgatg gaggggctca ggactgttgc 180 ctcaagtaca gccaaaggaa gattcccgcc aaggttgtcc gcagctaccg gaagcaggaa 240

79 ccaagcttag gctgctccat cccagctatc ctgttcttgc cccgcaagcg ctctcaggca 300 gagctatgtg cagacccaaa ggagctctgg gtgcagcagc tgatgcagca tctggacaag 360 acaccatccc cacagaaacc agcccagggc tgcaggaagg acaggggggc ctccaagact 420 ggcaagaaag gaaagggctc caaaggctgc aagaggactg agcggtcaca gacccctaaa 480 gggccatagc ccagtgagca gcctggagcc ctggagaccc caccagcctc accagcgctt 40 gaagcctgaa cccaagatgc aagaaggagg ctatgctcag gggccctgga gcagccaccc 600 catgctggcc ttgccacact ctttctcctg ctttaaccac cccatctgca ttcccagctc 660 taccctgcat ggctgagctg cccacagcag gccaggtcca gagagaccga ggagggagag 720 tctcccaggg agcatgagag gaggcagcag gactgtcccc ttgaaggaga atcatcagga 780 ccctggacct gatacggctc cccagtacac cccacctctt ccttgtaaat atgatttata 840 cctaactgaa taaaaagctg ttctgtcttc ccacccaa 878 <2> 12 <211> 134 <212> PRT <213> MUS MUSCULUS <400> 12 Met Gln Ser Ser Ile Val Phe 1 1 Gly Ile Arg Thr Gln Gly Ser Asp Gly Gly Gln Asp Cys Cys 20 2 30 Lys Tyr Ser Gln Arg Lys Ile Lys Val Val Arg Ser Tyr 3 40 4 Arg Lys Gln Ser Gly Cys Ser Ile Ile Phe 0 60 Arg Lys Arg Ser Gln Cys Asp Lys 6 70 7 80 Trp Val Gln Gln Met Gln His Asp Lys Thr Ser 8 90 9 Gln Lys Gln Gly Cys Arg Lys Asp Arg Gly Ser Lys Thr 0 1 Gly Lys Lys Gly Lys Gly Ser Lys Gly Cys Lys Arg Thr Arg Ser 11 120 12 Gln Thr Lys Gly 130 <2> 13 <211> 11 <212> DNA <213> HOMO SAPIENS <400> 13 atggggctgg gcccggtctt cctgcttctg gctggcatct tcccttttgc acctccggga 60 gctgctgctg agccccacag tcttcgttat aacctcacgg tgctgtcctg ggatggatct 120 gtgcagtcag ggtttctcac tgaggtacat ctggatggtc agcccttcct gcgctgtgac 180 aggcagaaat gcagggcaaa gccccaggga cagtgggcag aagatgtcct gggaaataag 240 acatgggaca gagagaccag agacttgaca gggaacggaa aggacctcag gatgaccctg 300 gctcatatca aggaccagaa agaaggcttg cattccctcc aggagattag ggtctgtgag 360 atccatgaag acaacagcac caggagctcc cagcatttct actacgatgg ggagctcttc 420 ctctcccaaa acctggagac taaggaatgg acaatgcccc agtcctccag agctcagacc 480 ttggccatga acgtcaggaa tttcttgaag gaagatgcca tgaagaccaa gacacactat 40 cacgctatgc atgcagactg cctgcaggaa ctacggcgat atctaaaatc cggcgtagtc 600 ctgaggagaa cagtgccccc catggtgaat gtcacccgca gcgaggcctc agagggcaac 660

80 attaccgtga catgcagggc ttctggcttc tatccctgga atatcacact gagctggcgt 720 caggatgggg tatctttgag ccacgacacc cagcagtggg gggatgtcct gcctgatggg 780 aatggaacct accagacctg ggtggccacc aggatttgcc aaggagagga gcagaggttc 840 acctgctaca tggaacacag cgggaatcac agcactcacc ctgtgccctc tgggaaagtg 900 ctggtgcttc agagtcattg gcagacattc catgtttctg ctgttgctgc tgctgctgct 960 atttttgtta ttattatttt ctatgtccgt tgttgtaaga agaaaacatc agctgcagag 20 ggtccagagc tcgtgagcct gcaggtcctg gatcaacacc cagttgggac gagtgaccac 80 agggatgcca cacagctcgg atttcagcct ctgatgtcag atcttgggtc cactggctcc 1140 actgagggcg cctag 11 <2> 14 <211> 384 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 14 Met Gly Gly Val Phe Gly Ile Phe Phe 1 1 Gly His Ser Arg Tyr Asn 20 2 30 Thr Val Ser Trp Asp Gly Ser Val Gln Ser Gly Phe Thr 3 40 4 Val His Asp Gly Gln Phe Arg Cys Asp Arg Gln Lys Cys 0 60 Arg Lys Gln Gly Gln Trp Asp Val Gly Asn Lys 6 70 7 80 Thr Trp Asp Arg Thr Arg Asp Thr Gly Asn Gly Lys Asp 8 90 9 Arg Met Thr His Ile Lys Asp Gln Lys Gly His Ser 0 1 Gln Ile Arg Val Cys Ile His Asp Asn Ser Thr Arg 11 120 12 Ser Ser Gln His Phe Tyr Tyr Asp Gly Phe Ser Gln Asn 130 13 140 Thr Lys Trp Thr Met Gln Ser Ser Arg Gln Thr 14 1 160 Met Asn Val Arg Asn Phe Lys Asp Met Lys Thr 16 170 17 Lys Thr His Tyr His Met His Asp Cys Gln Arg 180 18 190 Arg Tyr Lys Ser Gly Val Val Arg Arg Thr Val Met 19 200 20 Val Asn Val Thr Arg Ser Ser Gly Asn Ile Thr Val Thr 2 21 220 Cys Arg Ser Gly Phe Tyr Trp Asn Ile Thr Ser Trp Arg 22 230 23 240 Gln Asp Gly Val Ser Ser His Asp Thr Gln Gln Trp Gly Asp Val 24 20 2 Asp Gly Asn Gly Thr Tyr Gln Thr Trp Val Thr Arg Ile 260 26 270 Cys Gln Gly Gln Arg Phe Thr Cys Tyr Met His Ser Gly 27 280 28 Asn His Ser Thr His Val Ser Gly Lys Val Val Gln 290 29 300

81 Ser His Trp Gln Thr Phe His Val Ser Val 30 3 31 320 Ile Phe Val Ile Ile Ile Phe Tyr Val Arg Cys Cys Lys Lys Lys Thr 32 330 33 Ser Gly Val Ser Gln Val Asp Gln 340 34 30 His Val Gly Thr Ser Asp His Arg Asp Thr Gln Gly Phe 3 360 36 Gln Met Ser Asp Gly Ser Thr Gly Ser Thr Gly 370 37 380 <2> 1 <211> 238 <212> DNA <213> HOMO SAPIENS <400> 1 gggccatggg gctgggccgg gtcctgctgt ttctggccgt cgccttccct tttgcacccc 60 cggcagccgc cgctgagccc cacagtcttc gttacaacct catggtgctg tcccaggatg 120 gatctgtgca gtcagggttt ctcgctgagg gacatctgga tggtcagccc ttcctgcgct 180 atgacaggca gaaacgcagg gcaaagcccc agggacagtg ggcagaagat gtcctgggag 240 ctgagacctg ggacacagag accgaggact tgacagagaa tgggcaagac ctcaggagga 300 ccctgactca tatcaaggac cagaaaggag gcttgcattc cctccaggag attagggtct 360 gtgagatcca tgaagacagc agcaccaggg gctcccggca tttctactac aatggggagc 420 tcttcctctc ccaaaacctg gagactcaag aatcgacagt gccccagtcc tccagagctc 480 agaccttggc tatgaacgtc acaaatttct ggaaggaaga tgccatgaag accaagacac 40 actatcgcgc tatgcaggca gactgcctgc agaaactaca gcgatatctg aaatccgggg 600 tggccatcag gagaacagtg ccccccatgg tgaatgtcac ctgcagcgag gtctcagagg 660 gcaacatcac cgtgacatgc agggcttcca gcttctatcc ccggaatatc acactgacct 720 ggcgtcagga tggggtatct ttgagccaca acacccagca gtggggggat gtcctgcctg 780 atgggaatgg aacctaccag acctgggtgg ccaccaggat tcgccaagga gaggagcaga 840 ggttcacctg ctacatggaa cacagcggga atcacggcac tcaccctgtg ccctctggga 900 aggcgctggt gcttcagagt caacggacag actttccata tgtttctgct gctatgccat 960 gttttgttat tattattatt ctctgtgtcc cttgttgcaa gaagaaaaca tcagcggcag 20 agggtccaga gcttgtgagc ctgcaggtcc tggatcaaca cccagttggg acaggagacc 80 acagggatgc agcacagctg ggatttcagc ctctgatgtc agctactggg tccactggtt 1140 ccactgaggg cgcctagact ctacagccag gcggccagga ttcaactccc tgcctggatc 1200 tcaccagcac tttccctctg tttcctgacc tatgaaacag aaaataacat cacttattta 1260 ttgttgttgg atgctgcaaa gtgttagtag gtatgaggtg tttgctgctc tgccacgtag 1320 agagccagca aagggatcat gaccaactca acattccatt ggaggctata tgatcaaaca 1380 gcaaattgtt tatcatgaat gcaggatgtg ggcaaactca cgactgctcc tgccaacaga 1440 aggtttgctg agggcattca ctccatggtg ctcattggag ttatctactg ggtcatctag 0 agcctattgt ttgaggaatg cagtcttaca agcctactct ggacccagca gctgactcct 160 tcttccaccc ctcttcttgc tatctcctat accaataaat acgaagggct gtggaagatc 1620 agagcccttg ttcacgagaa gcaagaagcc ccctgacccc ttgttccaaa tatactcttt 1680 tgtctttctc tttattccca cgttcgccct ttgttcagtc caatacaggg ttgtggggcc 1740 cttaacagtg ccatattaat tggtatcatt atttctgttg tttttgtttt tgtttttgtt 1800 tttgtttttg agacagagtc tcactctgtc acccaggctg cagttcactg gtgtgatctc 1860 agctcactgc aacctctgcc tcccaggttc aagcacttct cgtacctcag actcccgaat 1920 agctgggatt acagacaggc accaccacac ccagctaatt tttgtatttt ttgtagagac 1980 ggggtttcgc caagttgacc agcccagttt caaactcctg acctcaggtg atctgcctgc 2040 cttggcatcc caaagtgctg ggattacaag aatgagccac cgtgcctggc ctattttatt 20 atattgtaat atattttatt atattagcca ccatgcctgt cctattttct tatgttttaa 2160 tatattttaa tatattacat gtgcagtaat tagattatca tgggtgaact ttatgagtga 2220

82 gtatcttggt gatgactcct cctgaccagc ccaggaccag ctttcttgtc accttgaggt 2280 cccctcgccc cgtcacaccg ttatgcatta ctctgtgtct actattatgt gtgcataatt 2340 tataccgtaa atgtttactc tttaaataga aaaaaaaaaa aaaaa 238 <2> 16 <211> 383 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 16 Met Gly Gly Arg Val Phe Val Phe Phe 1 1 His Ser Arg Tyr Asn 20 2 30 Met Val Ser Gln Asp Gly Ser Val Gln Ser Gly Phe 3 40 4 Gly His Asp Gly Gln Phe Arg Tyr Asp Arg Gln Lys Arg 0 60 Arg Lys Gln Gly Gln Trp Asp Val Gly 6 70 7 80 Thr Trp Asp Thr Thr Asp Thr Asn Gly Gln Asp 8 90 9 Arg Arg Thr Thr His Ile Lys Asp Gln Lys Gly Gly His Ser 0 1 Gln Ile Arg Val Cys Ile His Asp Ser Ser Thr Arg 11 120 12 Gly Ser Arg His Phe Tyr Tyr Asn Gly Phe Ser Gln Asn 130 13 140 Thr Gln Ser Thr Val Gln Ser Ser Arg Gln Thr 14 1 160 Met Asn Val Thr Asn Phe Trp Lys Asp Met Lys Thr 16 170 17 Lys Thr His Tyr Arg Met Gln Asp Cys Gln Lys Gln 180 18 190 Arg Tyr Lys Ser Gly Val Ile Arg Arg Thr Val Met 19 200 20 Val Asn Val Thr Cys Ser Val Ser Gly Asn Ile Thr Val Thr 2 21 220 Cys Arg Ser Ser Phe Tyr Arg Asn Ile Thr Thr Trp Arg 22 230 23 240 Gln Asp Gly Val Ser Ser His Asn Thr Gln Gln Trp Gly Asp Val 24 20 2 Asp Gly Asn Gly Thr Tyr Gln Thr Trp Val Thr Arg Ile 260 26 270 Arg Gln Gly Gln Arg Phe Thr Cys Tyr Met His Ser Gly 27 280 28 Asn His Gly Thr His Val Ser Gly Lys Val Gln 290 29 300 Ser Gln Arg Thr Asp Phe Tyr Val Ser Met Cys Phe 30 3 31 320 Val Ile Ile Ile Ile Cys Val Cys Cys Lys Lys Lys Thr Ser 32 330 33 Gly Val Ser Gln Val Asp Gln His 340 34 30

83 Val Gly Thr Gly Asp His Arg Asp Gln Gly Phe Gln 3 360 36 Met Ser Thr Gly Ser Thr Gly Ser Thr Gly 370 37 380 <2> 17 <211> 73 <212> DNA <213> HOMO SAPIENS <400> 17 atggcagcgg ccgccagccc cgccttcctt ctgtgcctcc cgcttctgca cctgctgtct 60 ggctggtccc gggcaggatg ggtcgacaca cactgtcttt gctatgactt catcatcact 120 cctaagtcca gacctgaacc acagtggtgt gaagttcaag gcctggtgga tgaaaggcct 180 tttcttcact atgactgtgt taaccacaag gccaaagcct ttgcttctct ggggaagaaa 240 gtcaatgtca caaaaacctg ggaagaacaa actgaaacac taagagacgt ggtggatttc 300 cttaaagggc aactgcttga cattcaagtg gagaatttaa tacccattga gcccctcacc 360 ctgcaggcca ggatgtcttg tgagcatgaa gcccatggac acggcagagg atcttggcag 420 ttcctcttca atggacagaa gttcctcctc tttgactcaa acaacagaaa gtggacagca 480 cttcatcctg gagccaagaa gatgacagag aagtgggaga agaacaggga tgtgaccatg 40 ttcttccaga agatttcact gggggattgt aagatgtggc ttgaagaatt tttgatgtac 600 tgggaacaaa tgctggatcc aacaaaacca ccctctctgg ccccaggcac aacccaaccc 660 aaggccatgg ccaccaccct cagtccctgg agccttctca tcatcttcct ctgcttcatt 720 ctagctggca gatga 73 <2> 18 <211> 244 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 18 Met Ser Phe Cys 1 1 His Ser Gly Trp Ser Arg Gly Trp Val Asp Thr His Cys 20 2 30 Cys Tyr Asp Phe Ile Ile Thr Lys Ser Arg Gln 3 40 4 Trp Cys Val Gln Gly Val Asp Arg Phe His Tyr 0 60 Asp Cys Val Asn His Lys Lys Phe Ser Gly Lys Lys 6 70 7 80 Val Asn Val Thr Lys Thr Trp Gln Thr Thr Arg Asp 8 90 9 Val Val Asp Phe Lys Gly Gln Asp Ile Gln Val Asn 0 1 Ile Ile Thr Gln Arg Met Ser Cys 11 120 12 His His Gly His Gly Arg Gly Ser Trp Gln Phe Phe Asn 130 13 140 Gly Gln Lys Phe Phe Asp Ser Asn Asn Arg Lys Trp Thr 14 1 160 His Gly Lys Lys Met Thr Lys Trp Lys Asn Arg 16 170 17 Asp Val Thr Met Phe Phe Gln Lys Ile Ser Gly Asp Cys Lys Met 180 18 190

84 Trp Phe Met Tyr Trp Gln Met Asp Thr 19 200 20 Lys Ser Gly Thr Thr Gln Lys Met 2 21 220 Thr Thr Ser Trp Ser Ile Ile Phe Cys Phe Ile 22 230 23 240 Gly Arg <2> 19 <211> 741 <212> DNA <213> HOMO SAPIENS <400> 19 atggcagcag ccgccgctac caagatcctt ctgtgcctcc cgcttctgct cctgctgtcc 60 ggctggtccc gggctgggcg agccgaccct cactctcttt gctatgacat caccgtcatc 120 cctaagttca gacctggacc acggtggtgt gcggttcaag gccaggtgga tgaaaagact 180 tttcttcact atgactgtgg caacaagaca gtcacacctg tcagtcccct ggggaagaaa 240 ctaaatgtca caacggcctg gaaagcacag aacccagtac tgagagaggt ggtggacata 300 cttacagagc aactgcgtga cattcagctg gagaattaca cacccaagga acccctcacc 360 ctgcaggcaa ggatgtcttg tgagcagaaa gctgaaggac acagcagtgg atcttggcag 420 ttcagtttcg atgggcagat cttcctcctc tttgactcag agaagagaat gtggacaacg 480 gttcatcctg gagccagaaa gatgaaagaa aagtgggaga atgacaaggt tgtggccatg 40 tccttccatt acttctcaat gggagactgt ataggatggc ttgaggactt cttgatgggc 600 atggacagca ccctggagcc aagtgcagga gcaccactcg ccatgtcctc aggcacaacc 660 caactcaggg ccacagccac caccctcatc ctttgctgcc tcctcatcat cctcccctgc 720 ttcatcctcc ctggcatctg a 741 <2> 20 <211> 246 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 20 Met Thr Lys Ile Cys 1 1 Ser Gly Trp Ser Arg Gly Arg Asp His Ser 20 2 30 Cys Tyr Asp Ile Thr Val Ile Lys Phe Arg Gly Arg 3 40 4 Trp Cys Val Gln Gly Gln Val Asp Lys Thr Phe His Tyr 0 60 Asp Cys Gly Asn Lys Thr Val Thr Val Ser Gly Lys Lys 6 70 7 80 Asn Val Thr Thr Trp Lys Gln Asn Val Arg 8 90 9 Val Val Asp Ile Thr Gln Arg Asp Ile Gln Asn 0 1 Tyr Thr Lys Thr Gln Arg Met Ser Cys 11 120 12 Gln Lys Gly His Ser Ser Gly Ser Trp Gln Phe Ser Phe Asp 130 13 140 Gly Gln Ile Phe Phe Asp Ser Lys Arg Met Trp Thr Thr 14 1 160

8 Val His Gly Arg Lys Met Lys Lys Trp Asn Asp Lys 16 170 17 Val Val Met Ser Phe His Tyr Phe Ser Met Gly Asp Cys Ile Gly 180 18 190 Trp Asp Phe Met Gly Met Asp Ser Thr Ser 19 200 20 Gly Met Ser Ser Gly Thr Thr Gln Arg 2 21 220 Thr Thr Thr Ile Cys Cys Ile Ile Cys 22 230 23 240 Phe Ile Gly Ile 24 <2> 21 <211> 73 <212> DNA <213> HOMO SAPIENS <400> 21 atggcagcgg ccgccagccc cgcgatcctt ccgcgcctcg cgattcttcc gtacctgcta 60 ttcgactggt ccgggacggg gcgggccgac gctcactctc tctggtataa cttcaccatc 120 attcatttgc ccagacatgg gcaacagtgg tgtgaggtcc agagccaggt ggatcagaag 180 aattttctct cctatgactg tggcagtgac aaggtcttat ctatgggtca cctagaagag 240 cagctgtatg ccacagatgc ctggggaaaa caactggaaa tgctgagaga ggtggggcag 300 aggctcagac tggaactggc tgacactgag ctggaggatt tcacacccag tggacccctc 360 acgctgcagg tcaggatgtc ttgtgagtgt gaagccgatg gatacatccg tggatcttgg 420 cagttcagct tcgatggacg gaagttcctc ctctttgact caaacaacag aaagtggaca 480 gtggttcacg ctggagccag gcggatgaaa gagaagtggg agaaggatag cggactgacc 40 accttcttca agatggtctc aatgagagac tgcaagagct ggcttaggga cttcctgatg 600 cacaggaaga agaggctgga acccacagca ccacccacca tggccccagg cttagctcaa 660 cccaaagcca tagccaccac cctcagtccc tggagcttcc tcatcatcct ctgcttcatc 720 ctccctggca tctga 73 <2> 22 <211> 244 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 22 Met Ser Ile Arg Ile 1 1 Tyr Phe Asp Trp Ser Gly Thr Gly Arg Asp His 20 2 30 Ser Trp Tyr Asn Phe Thr Ile Ile His Arg His Gly Gln 3 40 4 Gln Trp Cys Val Gln Ser Gln Val Asp Gln Lys Asn Phe Ser 0 60 Tyr Asp Cys Gly Ser Asp Lys Val Ser Met Gly His 6 70 7 80 Gln Tyr Thr Asp Trp Gly Lys Gln Met Arg 8 90 9 Val Gly Gln Arg Arg Asp Thr 0 1 Asp Phe Thr Ser Gly Thr Gln Val Arg Met Ser Cys

86 11 120 12 Cys Asp Gly Tyr Ile Arg Gly Ser Trp Gln Phe Ser Phe 130 13 140 Asp Gly Arg Lys Phe Phe Asp Ser Asn Asn Arg Lys Trp Thr 14 1 160 Val Val His Gly Arg Arg Met Lys Lys Trp Lys Asp 16 170 17 Ser Gly Thr Thr Phe Phe Lys Met Val Ser Met Arg Asp Cys Lys 180 18 190 Ser Trp Arg Asp Phe Met His Arg Lys Lys Arg 19 200 20 Thr Thr Met Gly Gln Lys Ile 2 21 220 Thr Thr Ser Trp Ser Phe Ile Ile Cys Phe Ile 22 230 23 240 Gly Ile <2> 23 <211> 16 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 23 Met Gly Thr Trp Gln Phe Lys Asp 1 1 His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Phe Gly Cys 20 2 30 Cys Thr Arg Met Gly Phe Ile His Cys Thr 3 40 4 Asn Asp Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys 0 60 Gly Trp Asp Asp Asp Ile Gly Gly Thr Val 6 70 7 80 Tyr Cys Asn Thr Ser Thr Gly Gly Arg Gly Gly Arg Ile Thr 8 90 9 Arg His Lys Lys His Ser Ser Gly Cys Phe Ser Val 0 1 Lys Lys Gln Phe Thr Gly Phe Lys Asp 11 120 12 Arg Arg Lys Asn Lys Ile Lys Thr Asn Asn Lys Lys 130 13 140 Lys Phe Thr Lys Lys Val Arg Arg Ile Gln 14 1 160 Met Asp 16 <2> 24 <211> 137 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 24 Met Gly Thr Trp Gln Phe Lys Asp 1 1

87 His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Phe Gly Cys 20 2 30 Cys Thr Arg Met Gly Phe Ile His Cys Thr 3 40 4 Asn Asp Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys 0 60 Gly Trp Asp Asp Asp Met Gln Arg Lys Thr Ile 6 70 7 80 Arg Arg Lys Asn Arg Lys Arg Arg Lys Cys Val Ser 8 90 9 Ser Ser Trp Trp Ile Ser Gly Arg Ser Cys Val 0 1 Trp His His Phe Gln Gly Phe Gly Thr Ser 11 120 12 Val Gly Met Ser 130 13 <2> 2 <211> 9 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 2 Tyr Cys Asn Thr Ser Thr 1 <2> 26 1 <211> 1322 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <221> CDS <222> (174)... (70) <400> 26 ccctgggata ctcccctccc agggtgtctg gtggcaggcc tgtgcctatc cctgctgtcc 60 ccagggtggg ccccgggggt caggagctcc agaagggcca gctgggcata ttctgagatt 120 ggccatcagc ccccatttct gctgcaaacc tggtcagagc cagtgttccc tcc atg 176 Met 1 gga cct aaa gac agt gcc aag tgc ctg cac cgt gga cca cag ccg agc 224 Gly Lys Asp Ser Lys Cys His Arg Gly Gln Ser 1 cac tgg gca gcc ggt gat ggt ccc acg cag gag cgc tgt gga ccc cgc 272 His Trp Gly Asp Gly Thr Gln Arg Cys Gly Arg 20 2 30 tct ctg ggc agc cct gtc cta ggc ctg gac acc tgc aga gcc tgg gac 320 Ser Gly Ser Val Gly Asp Thr Cys Arg Trp Asp 3 40 4 cac gtg gat ggg cag atc ctg ggc cag ctg cgg ccc ctg aca gag gag 368 His Val Asp Gly Gln Ile Gly Gln Arg Thr

88 0 60 6 gaa gag gag gag ggc gcc ggg gcc acc ttg tcc agg ggg cct gcc ttc 416 Gly 70 Gly Thr 7 Ser Arg Gly 80 Phe ccc ggc Gly atg Met ggc Gly 8 tct Ser gag gag ttg cgt Arg 90 ctg gcc tcc Ser ttc Phe tat Tyr 9 gac Asp tgg Trp 464 ccg ctg act Thr 0 gct gag gtg Val cca ccc gag ctg ctg gct gct 1 gcc ggc Gly ttc Phe 12 ttc Phe cac His 11 aca Thr ggc Gly cat His cag Gln gac Asp 120 aag Lys gtg Val agg Arg tgc Cys ttc Phe 12 ttc Phe tgc Cys tat Tyr ggg Gly 60 ggc Gly 130 ctg cag Gln agc Ser tgg Trp aag Lys 13 cgc Arg ggg Gly gac Asp gac Asp ccc 140 tgg Trp acg Thr gag cat His gcc 14 608 aag Lys tgg Trp ttc Phe ccc agc Ser tgt Cys cag Gln ttc Phe ctg ctc 1 cgg Arg tca Ser aaa Lys gga Gly aga Arg 160 gac Asp 66 ttt Phe gtc Val cac His agt Ser 16 gtg Val cag Gln gag act Thr cac His 170 tcc Ser cag Gln ctg ctg ggc Gly 17 tcc Ser tgg Trp 704 gac Asp ccg tgg Trp 180 gaa gaa ccg gaa gac Asp 18 gca gcc cct gtg Val gcc 190 ccc tcc Ser gtc Val 72 cct gcc 19 tct Ser ggg Gly tac Tyr cct gag 200 ctg ccc aca Thr ccc agg Arg 20 aga Arg gag gtc Val cag Gln 800 tct Ser 2 gaa agt Ser gcc cag Gln gag 21 cca gga Gly ggg Gly gtc Val agt Ser 220 cca gcc gag gcc cag Gln 22 848 agg Arg gcg tgg Trp tgg Trp gtt Val 230 ctt gag ccc cca gga Gly 23 gcc agg Arg gat Asp gtg Val gag 240 gcg 896 cag Gln ctg cgg Arg cgg Arg 24 ctg cag Gln gag gag agg Arg 20 acg Thr tgc Cys aag Lys gtg Val tgc Cys 2 ctg gac Asp 944 cgc Arg gcc gtg Val 260 tcc Ser atc Ile gtc Val ttt Phe gtg Val 26 ccg tgc Cys ggc Gly cac His ctg 270 gtc Val tgt Cys gct 992

89 gag tgt Cys gcc ccc ggc Gly ctg cag Gln ctg tgc Cys ccc atc Ile 27 280 28 tgc Cys aga Arg gcc ccc gtc Val 40 cgc agc Arg Ser 290 cgc Arg gtg Val cgc Arg acc Thr 29 ttc Phe ctg tcc Ser tag * gccaggtgcc atggccggcc 90 aggtgggctg cagagtgggc tccctgcccc tctctgcctg ttctggactg tgttctgggc 1 ctgctgagga tggcagagct ggtgtccatc cagcactgac cagccctgat tccccgacca 12 ccgcccaggg tggagaagga ggcccttgct tggcgtgggg gatggcttaa ctgtacctgt 1270 ttggatgctt ctgaatagaa ataaagtggg ttttccctgg aggtacccag ca 1322 <2> 27 <211> 298 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 27 Met Gly Lys Asp Ser Lys Cys His Arg Gly Gln 1 1 Ser His Trp Gly Asp Gly Thr Gln Arg Cys Gly 20 2 30 Arg Ser Gly Ser Val Gly Asp Thr Cys Arg Trp 3 40 4 Asp His Val Asp Gly Gln Ile Gly Gln Arg Thr 0 60 Gly Gly Thr Ser Arg Gly 6 70 7 80 Phe Gly Met Gly Ser Arg Ser Phe Tyr Asp 8 90 9 Trp Thr Val Gly 0 1 Phe Phe His Thr Gly His Gln Asp Lys Val Arg Cys Phe Phe Cys Tyr 11 120 12 Gly Gly Gln Ser Trp Lys Arg Gly Asp Asp Trp Thr His 130 13 140 Lys Trp Phe Ser Cys Gln Phe Arg Ser Lys Gly Arg 14 1 160 Asp Phe Val His Ser Val Gln Thr His Ser Gln Gly Ser 16 170 17 Trp Asp Trp Asp Val Ser 180 18 190 Val Ser Gly Tyr Thr Arg Arg Val 19 200 20 Gln Ser Ser Gln Gly Gly Val Ser 2 21 220 Gln Arg Trp Trp Val Gly Arg Asp Val 22 230 23 240 Gln Arg Arg Gln Arg Thr Cys Lys Val Cys 24 20 2 Asp Arg Val Ser Ile Val Phe Val Cys Gly His Val Cys 260 26 270 Cys Gly Gln Cys Ile Cys Arg 27 280 28

90 Val Arg Ser Arg Val Arg Thr Phe Ser 290 29 <2> 28 <211> 128 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <221> CDS <222> (174)... (16) <400> 28 ccctgggata ctcccctccc agggtgtctg gtggcaggcc tgtgcctatc cctgctgtcc 60 ccagggtggg ccccgggggt caggagctcc agaagggcca gctgggcata ttctgagatt 120 ggccatcagc ccccatttct gctgcaaacc tggtcagagc cagtgttccc tcc atg 176 Met gga cct Gly cac His tgg Trp aaa Lys gca 20 gac Asp gcc agt Ser ggt Gly gcc gat Asp aag Lys ggt Gly tgc Cys ccc 2 ctg acg Thr cac His cag Gln cgt Arg gag gga Gly cgc Arg cca tgt Cys 30 cag Gln 1 gga Gly 1 ccg ccc agc Ser cgc Arg 224 272 tct Ser cac His 0 gaa ctg 3 gtg Val gag ccc ggc Gly ccg ttc Phe ctg cac His 11 ggc Gly gat Asp gag atg Met act Thr 0 aca Thr agc Ser ggg Gly gag ggc Gly 8 gct ggc Gly cct cag Gln ggc Gly 70 tct Ser gag cat His gtc Val atc Ile gcc gag gtg Val cag Gln cta 40 ctg ggg Gly gag cca gac Asp 120 ggc Gly ggc Gly gcc ttg ccc aag Lys ctg cag Gln acc Thr cgt Arg 90 gag gtg Val gac Asp ctg ttg 7 ctg ctg agg Arg acc Thr cgg Arg 60 tcc Ser gcc ctg tgc Cys tgc Cys 4 ccc agg Arg tcc Ser gct ttc Phe 12 aga Arg ctg ggg Gly ttc Phe gct 1 ttc Phe gcc aca Thr cct tat Tyr 9 gcc tgc Cys tgg Trp gag gcc 80 gac Asp ggc Gly tat Tyr gac Asp gag 6 ttc Phe tgg Trp ttc Phe ggg Gly 320 368 416 464 12 60 ggc ctg cag agc tgg aag cgc ggg gac gac ccc tgg acg gag cat gcc 608 Gly 130 Gln Ser Trp Lys 13 Arg Gly Asp Asp 140 Trp Thr His 14

91 aag Lys ttt Phe gac Asp cct tct Ser 2 cgg Arg gtg Val gcc tgg Trp gtc Val ccg gcc 19 gaa cgg Arg tcc Ser ccc ttc Phe cac His tgg Trp 180 tct Ser agt Ser ctg atc Ile ggc Gly 260 ccc agt Ser 16 gaa ggg Gly gcc cag Gln gtc Val 24 ctg agc Ser gtg Val gaa tac Tyr cag Gln gag 230 ttt Phe cag Gln tgt Cys cag Gln ccg cct gag 21 gag gtg Val ctg cag Gln gag gaa gag 200 cca agg Arg ccg tgc Cys ttc Phe act Thr gac Asp 18 ctg gga Gly acg Thr tgc Cys ccc 26 ctg cac His 170 gca ccc gcc tgc Cys ggc Gly 20 atc Ile ctc 1 tcc Ser gcc aca Thr agg Arg aag Lys 23 cac His tgc Cys cgg Arg cag Gln cct ccc gat Asp 220 gtg Val ctg aga Arg tca Ser ctg gtg Val agg Arg 20 gtg Val tgc Cys gtc Val gcc aaa Lys ctg gcc 190 aga Arg gag ctg tgt Cys ccc 270 gga Gly ggc Gly 17 ccc gag gcg gac Asp gct 2 gtc Val aga Arg 160 tcc Ser tcc Ser gtc Val cag Gln cgc Arg 240 gag cgc Arg gac Asp tgg Trp gtc Val cag Gln ctg 22 gcc tgt Cys agc Ser 66 704 72 800 848 896 944 992 cgc Arg gtg Val 27 cgc Arg acc Thr ttc Phe ctg tcc Ser 280 tag * gccaggtgcc atggccggcc aggtgggctg 46 cagagtgggc tccctgcccc tctctgcctg ttctggactg tgttctgggc ctgctgagga 16 tggcagagct ggtgtccatc cagcactgac cagccctgat tccccgacca ccgcccaggg 1166 tggagaagga ggcccttgct tggcgtgggg gatggcttaa ctgtacctgt ttggatgctt 1226 ctgaatagaa ataaagtggg ttttccctgg aggtacccag ca 1268 <2> 29 <211> 280 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 29 Met Gly Lys Asp Ser Lys Cys His Arg Gly Gln 1 1 Ser His Trp Gly Asp Gly Thr Gln Arg Cys Gly 20 2 30 Arg Ser Gly Ser Val Gly Asp Thr Cys Arg Trp 3 40 4

92 Asp His Val Asp Gly Gln Ile Gly Gln Arg Thr 0 60 Gly Gly Thr Ser Arg Gly 6 70 7 80 Phe Gly Met Gly Ser Arg Ser Phe Tyr Asp 8 90 9 Trp Thr Val Gly 0 1 Phe Phe His Thr Gly His Gln Asp Lys Val Arg Cys Phe Phe Cys Tyr 11 120 12 Gly Gly Gln Ser Trp Lys Arg Gly Asp Asp Trp Thr His 130 13 140 Lys Trp Phe Ser Cys Gln Phe Arg Ser Lys Gly Arg 14 1 160 Asp Phe Val His Ser Val Gln Thr His Ser Gln Gly Ser 16 170 17 Trp Asp Trp Asp Val Ser 180 18 190 Val Ser Gly Tyr Thr Arg Arg Val 19 200 20 Gln Ser Ser Gln Gly Arg Asp Val Gln 2 21 220 Arg Arg Gln Arg Thr Cys Lys Val Cys Asp Arg 22 230 23 240 Val Ser Ile Val Phe Val Cys Gly His Val Cys 24 20 2 Cys Gly Gln Cys Ile Cys Arg Val Arg 260 26 270 Ser Arg Val Arg Thr Phe Ser 27 280 1 WYKAZ SEKWENCJI [16] <1> The Scripps Research Institute <120> Szczepionki DNA przeciwko wzrostowi nowotworów i sposoby ich stosowania <130> 18-193 <140> EP 04 749 42.7 <141> 2004-03-24 <> 60/47,009 <11> 2003-03-24 <160> 29 <170> FastSEQ for Windows wersja 4.0 <2> 1 <211> 1643 <212> DNA <213> HOMO SAPIENS <400> 1 agatttgaat cgcgggaccc gttggcagag gtggcggcgg cggcatgggt gccccgacgt 60 tgccccctgc ctggcagccc tttctcaagg accaccgcat ctctacattc aagaactggc 120 ccttcttgga gggctgcgcc tgcaccccgg agcggatggc cgaggctggc ttcatccact 180 gccccactga gaacgagcca gacttggccc agtgtttctt ctgcttcaag gagctggaag 240 gctgggagcc agatgacgac cccatagagg aacataaaaa gcattcgtcc ggttgcgctt 300

93 tcctttctgt caagaagcag tttgaagaat taacccttgg tgaatttttg aaactggaca 360 gagaaagagc caagaacaaa attgcaaagg aaaccaacaa taagaagaaa gaatttgagg 420 aaactgcgaa gaaagtgcgc cgtgccatcg agcagctggc tgcc.atggat tgaggcctct 480 ggccggagct gcctggtccc agagtggctg caccacttcc agggtttatt ccctggtgcc 40 accagccttc ctgtgggccc cttagcaatg tcttaggaaa ggagatcaac attttcaaat 600 tagatgtttc aactgtgctc ttgttttgtc ttgaaagtgg caccagaggt gcttctgcct 660 gtgcagcggg tgctgctggt aacagtggct gcttctctct ctctctctct tttttggggg 720 ctcatttttg ctgttttgat tcccgggctt accaggtgag aagtgaggga ggaagaaggc 780 agtgtccctt ttgctagagc tgacagcttt gttcgcgtgg gcagagcctt ccacagtgaa 840 tgtgtctgga cctcatgttg ttgaggctgt cacagtcctg agtgtggact tggcaggtgc 900 ctgttgaatc tgagctgcag gttccttatc tgtcacacct gtgcctcctc agaggacagt 960 ttttttgttg tgtttttttt tttttttttt ggtagatgca tgacttgtgt gtgatgagag 20 aatggagaca gagtccccgg ctcctctact gtttaacaac atggctttct tattttgttt 80 gaattgttaa ttcacagaat agcacaaact acaattaaaa ctaagcacaa agccattcta 1140 agtcattggg gaaacggggt gaacttcagg tggatgagga gacagaatag agtgatagga 1200 agcgtctggc agatactcct tttgccactg ctgtgtgatt agacaggccc agtgagccgc 1260 ggggcacatg ctggccgctc ctccctcaga aaaaggcagt ggcctaaatc ctttttaaat 1320 gacttggctc gatgctgtgg gggactggct gggctgctgc aggccgtgtg tctgtcagcc 1380 caaccttcac atctgtcacg ttctccacac gggggagaga cgcagtccgc ccaggtcccc 1440 gctttctttg gaggcagcag ctcccgcagg gctgaagtct ggcgtaagat gatggatttg 0 attcgccctc ctccctgtca tagagctgca gggtggattg ttacagcttc gctggaaacc 160 tctggaggtc atctcggctg ttcctgagaa ataaaaagcc tgtcatttca aataaaaaaa 1620 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 1643 <2> 2 <211> 142 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 2 Met Gly Thr Trp Gln Phe Lys Asp 1 1 His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Phe Gly Cys 20 2 30 Cys Thr Arg Met Gly Phe Ile His Cys Thr 3 40 4 Asn Asp Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys 0 60 Gly Trp Asp Asp Asp Ile His Lys Lys His 6 70 7 80 Ser Ser Gly Cys Phe Ser Val Lys Lys Gln Phe 8 90 9 Thr Gly Phe Lys Asp Arg Arg Lys Asn Lys 0 1 Ile Lys Thr Asn Asn Lys Lys Lys Phe Thr 11 120 12 Lys Lys Val Arg Arg Ile Gln Met Asp 130 13 140 <2> 3 <211> 9 <212> DNA <213> MUS MUSCULUS

94 <400> 3 ggcacgaggg ggccggggct ctcccggcat gctctgcggc gcgcctccgc ccgcgcgatt 60 tgaatcctgc gtttgagtcg tcttggcgga ggttgtggtg acgccatcat gggagctccg 120 gcgctgcccc agatctggca gctgtacctc aagaactacc gcatcgccac cttcaagaac 180 tggcccttcc tggaggactg cgcctgcacc ccagagcgaa tggcggaggc tggcttcatc 240 cactgcccta ccgagaacga gcctgatttg gcccagtgtt ttttctgctt taaggaattg 300 gaaggctggg aacccgatga caacccgata gaggagcata gaaagcactc ccctggctgc 360 gccttcctca ctgtcaagaa gcagatggaa gaactaaccg tcagtgaatt cttgaaactg 420 gacagacaga gagccaagaa caaaattgca aaggagacca acaacaagca aaaagagttt 480 gaagagactg caaagactac ccgtcagtca attgagcagc tggctgccta atgctgagcc 40 tttgctgaga taacttggac ctgagtgaca tgccacatct aagccacgca tcccagcttt 600 tccagccagg gcctcctagc aggatcttag agaaggagac agtggtattt tgaaactgga 660 tatcaaatat ttttggtttt gctttaaagt ggctacctct ctttggtttt gtggctttgc 720 tctattgtga cgtggactta agcaataagg aagtgatgaa gggacagtgt tctctgacag 780 gacctgtggg ggtcggggtg cctgtgcaag gtcttggttc tgattgtgat atttccatac 840 agggctgcta atgcagccca tgggtaagtg tggttatatg tgtttgtgct gataattttg 900 tcctgatgag ttttcctacc acggggtaac ggaataaaat cacttgaaaa agtgg 9 1 <2> 4 <211> 140 <212> PRT <213> MUS MUSCULUS <400> 4 Met Gly Gln Ile Trp Gln Tyr Lys Asn 1 1 Tyr Arg Ile Thr Phe Lys Asn Trp Phe Asp Cys 20 2 30 Cys Thr Arg Met Gly Phe Ile His Cys Thr 3 40 4 Asn Asp Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys 0 60 Gly Trp Asp Asp Asn Ile His Arg Lys His 6 70 7 80 Ser Gly Cys Phe Thr Val Lys Lys Gln Met 8 90 9 Thr Val Ser Phe Lys Asp Arg Gln Arg Lys Asn Lys 0 1 Ile Lys Thr Asn Asn Lys Gln Lys Phe Thr 11 120 12 Lys Thr Thr Arg Gln Ser Ile Gln 130 13 140 <2> <211> 82 <212> DNA <213> HOMO SAPIENS <400> cttgcagctg cccacctcac cctcagctct ggcctcttac tcaccctcta ccacagacat 60 ggctcagtca ctggctctga gcctccttat cctggttctg gcctttggca tccccaggac 120 ccaaggcagt gatggagggg ctcaggactg ttgcctcaag tacagccaaa ggaagattcc 180 cgccaaggtt gtccgcagct accggaagca ggaaccaagc ttaggctgct ccatcccagc 240

9 tatcctgttc ttgccccgca agcgctctca ggcagagcta tgtgcagacc caaaggagct 300 ctgggtgcag cagctgatgc agcatctgga caagacacca tccccacaga aaccagccca 360 gggctgcagg aaggacaggg gggcctccaa gactggcaag aaaggaaagg gctccaaagg 420 ctgcaagagg actgagcggt cacagacccc taaagggcca tagcccagtg agcagcctgg 480 agccctggag accccaccag cctcaccaac gcttgaagcc tgaacccaag atgcaagaag 40 gaggctatgc tcaggggccc tggagcagcc accccatgct ggccttgcca cactctttct 600 cctgctttaa ccaccccatc tgcattccca gctctaccct gcatggctga gctgcccaca 660 gcaggccagg tccagagaga ccgaggaggg agagtctccc agggagcatg agaggaggca 720 gcaggactgt ccccttgaag gagaatcatc aggaccctgg acctgatacg gctccccagt 780 acaccccacc tcttccttgt aaatatgatt tatacctaac tgaataaaaa gctgttctgt 840 cttcccaccc gc 82 <2> 6 <211> 134 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 6 Met Gln Ser Ser Ile Val Phe 1 1 Gly Ile Arg Thr Gln Gly Ser Asp Gly Gly Gln Asp Cys Cys 20 2 30 Lys Tyr Ser Gln Arg Lys Ile Lys Val Val Arg Ser Tyr 3 40 4 Arg Lys Gln Ser Gly Cys Ser Ile Ile Phe 0 60 Arg Lys Arg Ser Gln Cys Asp Lys 6 70 7 80 Trp Val Gln Gln Met Gln His Asp Lys Thr Ser 8 90 9 Gln Lys Gln Gly Cys Arg Lys Asp Arg Gly Ser Lys Thr 0 1 Gly Lys Lys Gly Lys Gly Ser Lys Gly Cys Lys Arg Thr Arg Ser 11 120 12 Gln Thr Lys Gly 130 <2> 7 <211> 61 <212> DNA <213> MUS MUSCULUS <400> 7 gaattcggcc aaagaggcct acggccaaag agggctaaac ttgcggctgt ccatctcacc 60 tacagctctg gtctcatcct caactcaacc acaatcatgg ctcagatgat gactctgagc 120 ctccttagcc tggtcctggc tctctgcatc ccctggaccc aaggcagtga tggagggggt 180 caggactgct gccttaagta cagccagaag aaaattccct acagtattgt ccgaggctat 240 aggaagcaag aaccaagttt aggctgtccc atcccggcaa tcctgttctc accccggaag 300 cactctaagc ctgagctatg tgcaaaccct gaggaaggct gggtgcagaa cctgatgcgc 360 cgcctggacc agcctccagc cccagggaaa caaagccccg gctgcaggaa gaaccgggga 420 acctctaagt ctggaaagaa aggaaagggc tccaagggct gcaagagaac tgaacagaca 480 cagccctcaa gaggatagcc cagtagcccg cctggagccc aggagatccc ccacgaactt 40 caagctgggt ggttcacggt ccaactcaca ggcaaagagg gagctagaaa acagactcag 600 gagccgctag tcgag 61

96 <2> 8 <211> 133 <212> PRT <213> MUS MUSCULUS <400> 8 Met Gln Met Met Thr Ser Ser Val 1 1 Cys Ile Trp Thr Gln Gly Ser Asp Gly Gly Gly Gln Asp Cys Cys 20 2 30 Lys Tyr Ser Gln Lys Lys Ile Tyr Ser Ile Val Arg Gly Tyr 3 40 4 Arg Lys Gln Ser Gly Cys Ile Ile Phe 0 60 Ser Arg Lys His Ser Lys Cys Asn 6 70 7 80 Gly Trp Val Gln Asn Met Arg Arg Asp Gln 8 90 9 Gly Lys Gln Ser Gly Cys Arg Lys Asn Arg Gly Thr Ser Lys Ser 0 1 Gly Lys Lys Gly Lys Gly Ser Lys Gly Cys Lys Arg Thr Gln Thr 11 120 12 Gln Ser Arg Gly 130 1 20 <2> 9 <211> 746 <212> DNA <213> MUS MUSCULUS <400> 9 tgagggaaga ccatggcaaa gggagccacc agcaagagca accattgcct gattctgagc 60 cttttcattc tgctgagcta tctggggacc atactggcag atggtacaga ctctctaagt 120 tgtgaattaa ctttcaacta tcgtaatcta catggacagt gctcagtgaa tggaaagact 180 ctccttgatt ttggtgataa aaaacatgag gaaaatgcta ctaagatgtg tgctgatttg 240 tcccaaaacc tgagagagat ttcagaagag atgtggaagt tacaatcagg taatgatacc 300 ttgaatgtca caacacaatc tcagtataat caaggaaaat tcattgatgg attctgggcc 360 atcaacactg atgaacagca tagcatctac ttttatccac ttaatatgac ctggagagaa 420 agtcattctg ataacagcag tgccatggag cagtggaaga acaagaacct agagaaagat 480 atgaggaatt tcctcatcac atatttcagt cactgcctca acaaatcgtc atcacacttt 40 agagaaatgc caaaatcaac attaaaggtg ccggatacca cccaacgtac aaatgccact 600 cagattcatc ctacagtgaa taacttccga cataattctg acaaccaggg tctgagtgtc 660 acctggattg tgattatatg tataggagga ttagtgtctt tcatggcatt catggtattc 720 gcttggtgta tgctgaagaa aaaaaa 746 <2> <211> 244 <212> PRT <213> MUS MUSCULUS <400> Met Lys Gly Thr Ser Lys Ser Asn His Cys Ile Ser 1 1 Phe Ile Ser Tyr Gly Thr Ile Asp Gly Thr 20 2 30

97 Asp Ser Ser Cys Thr Phe Asn Tyr Arg Asn His Gly 3 40 4 Gln Cys Ser Val Asn Gly Lys Thr Asp Phe Gly Asp Lys Lys 0 60 His Asn Thr Lys Met Cys Asp Ser Gln Asn 6 70 7 80 Arg Ile Ser Met Trp Lys Gln Ser Gly Asn Asp Thr 8 90 9 Asn Val Thr Thr Gln Ser Gln Tyr Asn Gln Gly Lys Phe Ile Asp 0 1 Gly Phe Trp Ile Asn Thr Asp Gln His Ser Ile Tyr Phe Tyr 11 120 12 Asn Met Thr Trp Arg Ser His Ser Asp Asn Ser Ser 130 13 140 Met Gln Trp Lys Asn Lys Asn Lys Asp Met Arg Asn Phe 14 1 160 Ile Thr Tyr Phe Ser His Cys Asn Lys Ser Ser Ser His Phe 16 170 17 Arg Met Lys Ser Thr Lys Val Asp Thr Thr Gln Arg 180 18 190 Thr Asn Thr Gln Ile His Thr Val Asn Asn Phe Arg His Asn 19 200 20 Ser Asp Asn Gln Gly Ser Val Thr Trp Ile Val Ile Ile Cys Ile 2 21 220 Gly Gly Val Ser Phe Met Phe Met Val Phe Trp Cys Met 22 230 23 240 Lys Lys Lys <2> 11 <211> 878 <212> DNA <213> MUS MUSCULUS <400> 11 atcccagccc acgcacagac ccccaacttg cagctgccca cctcaccctc agctctggcc 60 tcttactcac cctctaccac agacatggct cagtcactgg ctctgagcct ccttatcctg 120 gttctggcct ttggcatccc caggacccaa ggcagtgatg gaggggctca ggactgttgc 180 ctcaagtaca gccaaaggaa gattcccgcc aaggttgtcc gcagctaccg gaagcaggaa 240 ccaagcttag gctgctccat cccagctatc ctgttcttgc cccgcaagcg ctctcaggca 300 gagctatgtg cagacccaaa ggagctctgg gtgcagcagc tgatgcagca tctggacaag 360 acaccatccc cacagaaacc agcccagggc tgcaggaagg acaggggggc ctccaagact 420 ggcaagaaag gaaagggctc caaaggctgc aagaggactg agcggtcaca gacccctaaa 480 gggccatagc ccagtgagca gcctggagcc ctggagaccc caccagcctc accagcgctt 40 gaagcctgaa cccaagatgc aagaaggagg ctatgctcag gggccctgga gcagccaccc 600 catgctggcc ttgccacact ctttctcctg ctttaaccac cccatctgca ttcccagctc 660 taccctgcat ggctgagctg cccacagcag gccaggtcca gagagaccga ggagggagag 720 tctcccaggg agcatgagag gaggcagcag gactgtcccc ttgaaggaga atcatcagga 780 ccctggacct gatacggctc cccagtacac cccacctctt ccttgtaaat atgatttata 840 cctaactgaa taaaaagctg ttctgtcttc ccacccaa 878 <2> 12 <211> 134 <212> PRT <213> MUS MUSCULUS

98 <400> 12 Met Gln Ser Ser Ile Val Phe 1 1 Gly Ile Arg Thr Gln Gly Ser Asp Gly Gly Gln Asp Cys Cys 20 2 30 Lys Tyr Ser Gln Arg Lys Ile Lys Val Val Arg Ser Tyr 3 40 4 Arg Lys Gln Ser Gly Cys Ser Ile Ile Phe 0 60 Arg Lys Arg Ser Gln Cys Asp Lys 6 70 7 80 Trp Val Gln Gln Met Gln His Asp Lys Thr Ser 8 90 9 Gln Lys Gln Gly Cys Arg Lys Asp Arg Gly Ser Lys Thr 0 1 Gly Lys Lys Gly Lys Gly Ser Lys Gly Cys Lys Arg Thr Arg Ser 11 120 12 Gln Thr Lys Gly 130 1 <2> 13 <211> 11 <212> DNA <213> HOMO SAPIENS <400> 13 atggggctgg gcccggtctt cctgcttctg gctggcatct tcccttttgc acctccggga 60 gctgctgctg agccccacag tcttcgttat aacctcacgg tgctgtcctg ggatggatct 120 gtgcagtcag ggtttctcac tgaggtacat ctggatggtc agcccttcct gcgctgtgac 180 aggcagaaat gcagggcaaa gccccaggga cagtgggcag aagatgtcct gggaaataag 240 acatgggaca gagagaccag agacttgaca gggaacggaa aggacctcag gatgaccctg 300 gctcatatca aggaccagaa agaaggcttg cattccctcc aggagattag ggtctgtgag 360 atccatgaag acaacagcac caggagctcc cagcatttct actacgatgg ggagctcttc 420 ctctcccaaa acctggagac taaggaatgg acaatgcccc agtcctccag agctcagacc 480 ttggccatga acgtcaggaa tttcttgaag gaagatgcca tgaagaccaa gacacactat 40 cacgctatgc atgcagactg cctgcaggaa ctacggcgat atctaaaatc cggcgtagtc 600 ctgaggagaa cagtgccccc catggtgaat gtcacccgca gcgaggcctc agagggcaac 660 attaccgtga catgcagggc ttctggcttc tatccctgga atatcacact gagctggcgt 720 caggatgggg tatctttgag ccacgacacc cagcagtggg gggatgtcct gcctgatggg 780 aatggaacct accagacctg ggtggccacc aggatttgcc aaggagagga gcagaggttc 840 acctgctaca tggaacacag cgggaatcac agcactcacc ctgtgccctc tgggaaagtg 900 ctggtgcttc agagtcattg gcagacattc catgtttctg ctgttgctgc tgctgctgct 960 atttttgtta ttattatttt ctatgtccgt tgttgtaaga agaaaacatc agctgcagag 20 ggtccagagc tcgtgagcct gcaggtcctg gatcaacacc cagttgggac gagtgaccac 80 agggatgcca cacagctcgg atttcagcct ctgatgtcag atcttgggtc cactggctcc 1140 actgagggcg cctag 11 <2> 14 <211> 384 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 14

99 Met Gly Gly Val Phe Gly Ile Phe Phe 1 1 Gly His Ser Arg Tyr Asn 20 2 30 Thr Val Ser Trp Asp Gly Ser Val Gln Ser Gly Phe Thr 3 40 4 Val His Asp Gly Gln Phe Arg Cys Asp Arg Gln Lys Cys 0 60 Arg Lys Gln Gly Gln Trp Asp Val Gly Asn Lys 6 70 7 80 Thr Trp Asp Arg Thr Arg Asp Thr Gly Asn Gly Lys Asp 8 90 9 Arg Met Thr His Ile Lys Asp Gln Lys Gly His Ser 0 1 Gln Ile Arg Val Cys Ile His Asp Asn Ser Thr Arg 11 120 12 Ser Ser Gln His Phe Tyr Tyr Asp Gly Phe Ser Gln Asn 130 13 140 Thr Lys Trp Thr Met Gln Ser Ser Arg Gln Thr 14 1 160 Met Asn Val Arg Asn Phe Lys Asp Met Lys Thr 16 170 17 Lys Thr His Tyr His Met His Asp Cys Gln Arg 180 18 190 Arg Tyr Lys Ser Gly Val Val Arg Arg Thr Val Met 19 200 20 Val Asn Val Thr Arg Ser Ser Gly Asn Ile Thr Val Thr 2 21 220 Cys Arg Ser Gly Phe Tyr Trp Asn Ile Thr Ser Trp Arg 22 230 23 240 Gln Asp Gly Val Ser Ser His Asp Thr Gln Gln Trp Gly Asp Val 24 20 2 Asp Gly Asn Gly Thr Tyr Gln Thr Trp Val Thr Arg Ile 260 26 270 Cys Gln Gly Gln Arg Phe Thr Cys Tyr Met His Ser Gly 27 280 28 Asn His Ser Thr His Val Ser Gly Lys Val Val Gln 290 29 300 Ser His Trp Gln Thr Phe His Val Ser Val 30 3 31 320 Ile Phe Val Ile Ile Ile Phe Tyr Val Arg Cys Cys Lys Lys Lys Thr 32 330 33 Ser Gly Val Ser Gln Val Asp Gln 340 34 30 His Val Gly Thr Ser Asp His Arg Asp Thr Gln Gly Phe 3 360 36 Gln Met Ser Asp Gly Ser Thr Gly Ser Thr Gly 370 37 380 <2> 1 <211> 238 <212> DNA <213> HOMO SAPIENS <400> 1

0 gggccatggg gctgggccgg gtcctgctgt ttctggccgt cgccttccct tttgcacccc 60 cggcagccgc cgctgagccc cacagtcttc gttacaacct catggtgctg tcccaggatg 120 gatctgtgca gtcagggttt ctcgctgagg gacatctgga tggtcagccc ttcctgcgct 180 atgacaggca gaaacgcagg gcaaagcccc agggacagtg ggcagaagat gtcctgggag 240 ctgagacctg ggacacagag accgaggact tgacagagaa tgggcaagac ctcaggagga 300 ccctgactca tatcaaggac cagaaaggag gcttgcattc cctccaggag attagggtct 360 gtgagatcca tgaagacagc agcaccaggg gctcccggca tttctactac aatggggagc 420 tcttcctctc ccaaaacctg gagactcaag aatcgacagt gccccagtcc tccagagctc 480 agaccttggc tatgaacgtc acaaatttct ggaaggaaga tgccatgaag accaagacac 40 actatcgcgc tatgcaggca gactgcctgc agaaactaca gcgatatctg aaatccgggg 600 tggccatcag gagaacagtg ccccccatgg tgaatgtcac ctgcagcgag gtctcagagg 660 gcaacatcac cgtgacatgc agggcttcca gcttctatcc ccggaatatc acactgacct 720 ggcgtcagga tggggtatct ttgagccaca acacccagca gtggggggat gtcctgcctg 780 atgggaatgg aacctaccag acctgggtgg ccaccaggat tcgccaagga gaggagcaga 840 ggttcacctg ctacatggaa cacagcggga atcacggcac tcaccctgtg ccctctggga 900 aggcgctggt gcttcagagt caacggacag actttccata tgtttctgct gctatgccat 960 gttttgttat tattattatt ctctgtgtcc cttgttgcaa gaagaaaaca tcagcggcag 20 agggtccaga gcttgtgagc ctgcaggtcc tggatcaaca cccagttggg acaggagacc 80 acagggatgc agcacagctg ggatttcagc ctctgatgtc agctactggg tccactggtt 1140 ccactgaggg cgcctagact ctacagccag gcggccagga ttcaactccc tgcctggatc 1200 tcaccagcac tttccctctg tttcctgacc tatgaaacag aaaataacat cacttattta 1260 ttgttgttgg atgctgcaaa gtgttagtag gtatgaggtg tttgctgctc tgccacgtag 1320 agagccagca aagggatcat gaccaactca acattccatt ggaggctata tgatcaaaca 1380 gcaaattgtt tatcatgaat gcaggatgtg ggcaaactca cgactgctcc tgccaacaga 1440 aggtttgctg agggcattca ctccatggtg ctcattggag ttatctactg ggtcatctag 0 agcctattgt ttgaggaatg cagtcttaca agcctactct ggacccagca gctgactcct 160 tcttccaccc ctcttcttgc tatctcctat accaataaat acgaagggct gtggaagatc 1620 agagcccttg ttcacgagaa gcaagaagcc ccctgacccc ttgttccaaa tatactcttt 1680 tgtctttctc tttattccca cgttcgccct ttgttcagtc caatacaggg ttgtggggcc 1740 cttaacagtg ccatattaat tggtatcatt atttctgttg tttttgtttt tgtttttgtt 1800 tttgtttttg agacagagtc tcactctgtc acccaggctg cagttcactg gtgtgatctc 1860 agctcactgc aacctctgcc tcccaggttc aagcacttct cgtacctcag actcccgaat 1920 agctgggatt acagacaggc accaccacac ccagctaatt tttgtatttt ttgtagagac 1980 ggggtttcgc caagttgacc agcccagttt caaactcctg acctcaggtg atctgcctgc 2040 cttggcatcc caaagtgctg ggattacaag aatgagccac cgtgcctggc ctattttatt 20 atattgtaat atattttatt atattagcca ccatgcctgt cctattttct tatgttttaa 2160 tatattttaa tatattacat gtgcagtaat tagattatca tgggtgaact ttatgagtga 2220 gtatcttggt gatgactcct cctgaccagc ccaggaccag ctttcttgtc accttgaggt 2280 cccctcgccc cgtcacaccg ttatgcatta ctctgtgtct actattatgt gtgcataatt 2340 tataccgtaa atgtttactc tttaaataga aaaaaaaaaa aaaaa 238 <2> 16 <211> 383 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 16 Met Gly Gly Arg Val Phe Val Phe Phe 1 1 His Ser Arg Tyr Asn 20 2 30 Met Val Ser Gln Asp Gly Ser Val Gln Ser Gly Phe 3 40 4 Gly His Asp Gly Gln Phe Arg Tyr Asp Arg Gln Lys Arg

1 0 60 Arg Lys Gln Gly Gln Trp Asp Val Gly 6 70 7 80 Thr Trp Asp Thr Thr Asp Thr Asn Gly Gln Asp 8 90 9 Arg Arg Thr Thr His Ile Lys Asp Gln Lys Gly Gly His Ser 0 1 Gln Ile Arg Val Cys Ile His Asp Ser Ser Thr Arg 11 120 12 Gly Ser Arg His Phe Tyr Tyr Asn Gly Phe Ser Gln Asn 130 13 140 Thr Gln Ser Thr Val Gln Ser Ser Arg Gln Thr 14 1 160 Met Asn Val Thr Asn Phe Trp Lys Asp Met Lys Thr 16 170 17 Lys Thr His Tyr Arg Met Gln Asp Cys Gln Lys Gln 180 18 190 Arg Tyr Lys Ser Gly Val Ile Arg Arg Thr Val Met 19 200 20 Val Asn Val Thr Cys Ser Val Ser Gly Asn Ile Thr Val Thr 2 21 220 Cys Arg Ser Ser Phe Tyr Arg Asn Ile Thr Thr Trp Arg 22 230 23 240 Gln Asp Gly Val Ser Ser His Asn Thr Gln Gln Trp Gly Asp Val 24 20 2 Asp Gly Asn Gly Thr Tyr Gln Thr Trp Val Thr Arg Ile 260 26 270 Arg Gln Gly Gln Arg Phe Thr Cys Tyr Met His Ser Gly 27 280 28 Asn His Gly Thr His Val Ser Gly Lys Val Gln 290 29 300 Ser Gln Arg Thr Asp Phe Tyr Val Ser Met Cys Phe 30 3 31 320 Val Ile Ile Ile Ile Cys Val Cys Cys Lys Lys Lys Thr Ser 32 330 33 Gly Val Ser Gln Val Asp Gln His 340 34 30 Val Gly Thr Gly Asp His Arg Asp Gln Gly Phe Gln 3 360 36 Met Ser Thr Gly Ser Thr Gly Ser Thr Gly 370 37 380 <2> 17 <211> 73 <212> DNA <213> HOMO SAPIENS <400> 17 atggcagcgg ccgccagccc cgccttcctt ctgtgcctcc cgcttctgca cctgctgtct 60 ggctggtccc gggcaggatg ggtcgacaca cactgtcttt gctatgactt catcatcact 120 cctaagtcca gacctgaacc acagtggtgt gaagttcaag gcctggtgga tgaaaggcct 180 tttcttcact atgactgtgt taaccacaag gccaaagcct ttgcttctct ggggaagaaa 240 gtcaatgtca caaaaacctg ggaagaacaa actgaaacac taagagacgt ggtggatttc 300 cttaaagggc aactgcttga cattcaagtg gagaatttaa tacccattga gcccctcacc 360

2 ctgcaggcca ggatgtcttg tgagcatgaa gcccatggac acggcagagg atcttggcag 420 ttcctcttca atggacagaa gttcctcctc tttgactcaa acaacagaaa gtggacagca 480 cttcatcctg gagccaagaa gatgacagag aagtgggaga agaacaggga tgtgaccatg 40 ttcttccaga agatttcact gggggattgt aagatgtggc ttgaagaatt tttgatgtac 600 tgggaacaaa tgctggatcc aacaaaacca ccctctctgg ccccaggcac aacccaaccc 660 aaggccatgg ccaccaccct cagtccctgg agccttctca tcatcttcct ctgcttcatt 720 ctagctggca gatga 73 <2> 18 <211> 244 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 18 Met Ser Phe Cys 1 1 His Ser Gly Trp Ser Arg Gly Trp Val Asp Thr His Cys 20 2 30 Cys Tyr Asp Phe Ile Ile Thr Lys Ser Arg Gln 3 40 4 Trp Cys Val Gln Gly Val Asp Arg Phe His Tyr 0 60 Asp Cys Val Asn His Lys Lys Phe Ser Gly Lys Lys 6 70 7 80 Val Asn Val Thr Lys Thr Trp Gln Thr Thr Arg Asp 8 90 9 Val Val Asp Phe Lys Gly Gln Asp Ile Gln Val Asn 0 1 Ile Ile Thr Gln Arg Met Ser Cys 11 120 12 His His Gly His Gly Arg Gly Ser Trp Gln Phe Phe Asn 130 13 140 Gly Gln Lys Phe Phe Asp Ser Asn Asn Arg Lys Trp Thr 14 1 160 His Gly Lys Lys Met Thr Lys Trp Lys Asn Arg 16 170 17 Asp Val Thr Met Phe Phe Gln Lys Ile Ser Gly Asp Cys Lys Met 180 18 190 Trp Phe Met Tyr Trp Gln Met Asp Thr 19 200 20 Lys Ser Gly Thr Thr Gln Lys Met 2 21 220 Thr Thr Ser Trp Ser Ile Ile Phe Cys Phe Ile 22 230 23 240 Gly Arg 1 <2> 19 <211> 741 <212> DNA <213> HOMO SAPIENS <400> 19 atggcagcag ccgccgctac caagatcctt ctgtgcctcc cgcttctgct cctgctgtcc 60

3 ggctggtccc gggctgggcg agccgaccct cactctcttt gctatgacat caccgtcatc 120 cctaagttca gacctggacc acggtggtgt gcggttcaag gccaggtgga tgaaaagact 180 tttcttcact atgactgtgg caacaagaca gtcacacctg tcagtcccct ggggaagaaa 240 ctaaatgtca caacggcctg gaaagcacag aacccagtac tgagagaggt ggtggacata 300 cttacagagc aactgcgtga cattcagctg gagaattaca cacccaagga acccctcacc 360 ctgcaggcaa ggatgtcttg tgagcagaaa gctgaaggac acagcagtgg atcttggcag 420 ttcagtttcg atgggcagat cttcctcctc tttgactcag agaagagaat gtggacaacg 480 gttcatcctg gagccagaaa gatgaaagaa aagtgggaga atgacaaggt tgtggccatg 40 tccttccatt acttctcaat gggagactgt ataggatggc ttgaggactt cttgatgggc 600 atggacagca ccctggagcc aagtgcagga gcaccactcg ccatgtcctc aggcacaacc 660 caactcaggg ccacagccac caccctcatc ctttgctgcc tcctcatcat cctcccctgc 720 ttcatcctcc ctggcatctg a 741 <2> 20 <211> 246 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 20 Met Thr Lys Ile Cys 1 1 Ser Gly Trp Ser Arg Gly Arg Asp His Ser 20 2 30 Cys Tyr Asp Ile Thr Val Ile Lys Phe Arg Gly Arg 3 40 4 Trp Cys Val Gln Gly Gln Val Asp Lys Thr Phe His Tyr 0 60 Asp Cys Gly Asn Lys Thr Val Thr Val Ser Gly Lys Lys 6 70 7 80 Asn Val Thr Thr Trp Lys Gln Asn Val Arg 8 90 9 Val Val Asp Ile Thr Gln Arg Asp Ile Gln Asn 0 1 Tyr Thr Lys Thr Gln Arg Met Ser Cys 11 120 12 Gln Lys Gly His Ser Ser Gly Ser Trp Gln Phe Ser Phe Asp 130 13 140 Gly Gln Ile Phe Phe Asp Ser Lys Arg Met Trp Thr Thr 14 1 160 Val His Gly Arg Lys Met Lys Lys Trp Asn Asp Lys 16 170 17 Val Val Met Ser Phe His Tyr Phe Ser Met Gly Asp Cys Ile Gly 180 18 190 Trp Asp Phe Met Gly Met Asp Ser Thr Ser 19 200 20 Gly Met Ser Ser Gly Thr Thr Gln Arg 2 21 220 Thr Thr Thr Ile Cys Cys Ile Ile Cys 22 230 23 240 Phe Ile Gly Ile 24 <2> 21 <211> 73

4 <212> DNA <213> HOMO SAPIENS <400> 21 atggcagcgg ccgccagccc cgcgatcctt ccgcgcctcg cgattcttcc gtacctgcta 60 ttcgactggt ccgggacggg gcgggccgac gctcactctc tctggtataa cttcaccatc 120 attcatttgc ccagacatgg gcaacagtgg tgtgaggtcc agagccaggt ggatcagaag 180 aattttctct cctatgactg tggcagtgac aaggtcttat ctatgggtca cctagaagag 240 cagctgtatg ccacagatgc ctggggaaaa caactggaaa tgctgagaga ggtggggcag 300 aggctcagac tggaactggc tgacactgag ctggaggatt tcacacccag tggacccctc 360 acgctgcagg tcaggatgtc ttgtgagtgt gaagccgatg gatacatccg tggatcttgg 420 cagttcagct tcgatggacg gaagttcctc ctctttgact caaacaacag aaagtggaca 480 gtggttcacg ctggagccag gcggatgaaa gagaagtggg agaaggatag cggactgacc 40 accttcttca agatggtctc aatgagagac tgcaagagct ggcttaggga cttcctgatg 600 cacaggaaga agaggctgga acccacagca ccacccacca tggccccagg cttagctcaa 660 cccaaagcca tagccaccac cctcagtccc tggagcttcc tcatcatcct ctgcttcatc 720 ctccctggca tctga 73 <2> 22 <211> 244 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 22 Met Ser Ile Arg Ile 1 1 Tyr Phe Asp Trp Ser Gly Thr Gly Arg Asp His 20 2 30 Ser Trp Tyr Asn Phe Thr Ile Ile His Arg His Gly Gln 3 40 4 Gln Trp Cys Val Gln Ser Gln Val Asp Gln Lys Asn Phe Ser 0 60 Tyr Asp Cys Gly Ser Asp Lys Val Ser Met Gly His 6 70 7 80 Gln Tyr Thr Asp Trp Gly Lys Gln Met Arg 8 90 9 Val Gly Gln Arg Arg Asp Thr 0 1 Asp Phe Thr Ser Gly Thr Gln Val Arg Met Ser Cys 11 120 12 Cys Asp Gly Tyr Ile Arg Gly Ser Trp Gln Phe Ser Phe 130 13 140 Asp Gly Arg Lys Phe Phe Asp Ser Asn Asn Arg Lys Trp Thr 14 1 160 Val Val His Gly Arg Arg Met Lys Lys Trp Lys Asp 16 170 17 Ser Gly Thr Thr Phe Phe Lys Met Val Ser Met Arg Asp Cys Lys 180 18 190 Ser Trp Arg Asp Phe Met His Arg Lys Lys Arg 19 200 20 Thr Thr Met Gly Gln Lys Ile 2 21 220 Thr Thr Ser Trp Ser Phe Ile Ile Cys Phe Ile 22 230 23 240

Gly Ile <2> 23 <211> 16 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 23 Met Gly Thr Trp Gln Phe Lys Asp 1 1 His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Phe Gly Cys 20 2 30 Cys Thr Arg Met Gly Phe Ile His Cys Thr 3 40 4 Asn Asp Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys 0 60 Gly Trp Asp Asp Asp Ile Gly Gly Thr Val 6 70 7 80 Tyr Cys Asn Thr Ser Thr Gly Gly Arg Gly Gly Arg Ile Thr 8 90 9 Arg His Lys Lys His Ser Ser Gly Cys Phe Ser Val 0 1 Lys Lys Gln Phe Thr Gly Phe Lys Asp 11 120 12 Arg Arg Lys Asn Lys Ile Lys Thr Asn Asn Lys Lys 130 13 140 Lys Phe Thr Lys Lys Val Arg Arg Ile Gln 14 1 160 Met Asp 16 <2> 24 <211> 137 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 24 Met Gly Thr Trp Gln Phe Lys Asp 1 1 His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Phe Gly Cys 20 2 30 Cys Thr Arg Met Gly Phe Ile His Cys Thr 3 40 4 Asn Asp Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys 0 60 Gly Trp Asp Asp Asp Met Gln Arg Lys Thr Ile 6 70 7 80 Arg Arg Lys Asn Arg Lys Arg Arg Lys Cys Val Ser 8 90 9 Ser Ser Trp Trp Ile Ser Gly Arg Ser Cys Val 0 1 Trp His His Phe Gln Gly Phe Gly Thr Ser 11 120 12 Val Gly Met Ser

6 130 13 <2> 2 <211> 9 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 2 Tyr Cys Asn Thr Ser Thr 1 <2> 26 1 <211> 1322 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <221> CDS <222> (174)... (70) <400> 26 ccctgggata ctcccctccc agggtgtctg gtggcaggcc tgtgcctatc cctgctgtcc 60 ccagggtggg ccccgggggt caggagctcc agaagggcca gctgggcata ttctgagatt 120 ggccatcagc ccccatttct gctgcaaacc tggtcagagc cagtgttccc tcc atg 176 Met 1 gga cct aaa gac agt gcc aag tgc ctg cac cgt gga cca cag ccg agc 224 Gly Lys Asp Ser Lys Cys His Arg Gly Gln Ser 1 cac tgg gca gcc ggt gat ggt ccc acg cag gag cgc tgt gga ccc cgc 272 His Trp Gly Asp Gly Thr Gln Arg Cys Gly Arg 20 2 30 tct ctg ggc agc cct gtc cta ggc ctg gac acc tgc aga gcc tgg gac 320 Ser Gly Ser Val Gly Asp Thr Cys Arg Trp Asp 3 40 4 cac gtg gat ggg cag atc ctg ggc cag ctg cgg ccc ctg aca gag gag 368 His Val Asp Gly Gln Ile Gly Gln Arg Thr 0 60 6 gaa gag gag gag ggc gcc ggg gcc acc ttg tcc agg ggg cct gcc ttc 416 Gly 70 ccc ggc Gly atg Met ggc Gly 8 tct Ser Gly Thr 7 gag gag ttg cgt Arg 90 ctg Ser Arg Gly 80 gcc tcc Ser ttc Phe tat Tyr 9 gac Asp Phe tgg Trp 464 ccg ctg act Thr 0 gct gag gtg Val cca ccc gag ctg ctg gct gct 1 gcc ggc Gly ttc Phe 12

7 ttc Phe cac His 11 aca Thr ggc Gly cat His cag Gln gac Asp 120 aag Lys gtg Val agg Arg tgc Cys ttc Phe 12 ttc Phe tgc Cys tat Tyr ggg Gly 60 ggc Gly 130 ctg cag Gln agc Ser tgg Trp aag Lys 13 cgc Arg ggg Gly gac Asp gac Asp ccc 140 tgg Trp acg Thr gag cat His gcc 14 608 aag Lys tgg Trp ttc Phe ccc agc Ser tgt Cys cag Gln ttc Phe ctg ctc 1 cgg Arg tca Ser aaa Lys gga Gly aga Arg 160 gac Asp 66 ttt Phe gtc Val cac His agt Ser 16 gtg Val cag Gln gag act Thr cac His 170 tcc Ser cag Gln ctg ctg ggc Gly 17 tcc Ser tgg Trp 704 gac Asp ccg tgg Trp 180 gaa gaa ccg gaa gac Asp 18 gca gcc cct gtg Val gcc 190 ccc tcc Ser gtc Val 72 cct gcc 19 tct Ser ggg Gly tac Tyr cct gag 200 ctg ccc aca Thr ccc agg Arg 20 aga Arg gag gtc Val cag Gln 800 tct Ser 2 gaa agt Ser gcc cag Gln gag 21 cca gga Gly ggg Gly gtc Val agt Ser 220 cca gcc gag gcc cag Gln 22 848 agg Arg gcg tgg Trp tgg Trp gtt Val 230 ctt gag ccc cca gga Gly 23 gcc agg Arg gat Asp gtg Val gag 240 gcg 896 cag Gln ctg cgg Arg cgg Arg 24 ctg cag Gln gag gag agg Arg 20 acg Thr tgc Cys aag Lys gtg Val tgc Cys 2 ctg gac Asp 944 cgc Arg gcc gtg Val 260 tcc Ser atc Ile gtc Val ttt Phe gtg Val 26 ccg tgc Cys ggc Gly cac His ctg 270 gtc Val tgt Cys gct 992 gag tgt Cys gcc ccc ggc Gly ctg cag Gln ctg tgc Cys ccc atc Ile tgc Cys aga Arg gcc ccc gtc Val 40 27 280 28 cgc Arg 290 agc Ser cgc Arg gtg Val cgc Arg acc Thr 29 ttc Phe ctg tcc Ser tag * gccaggtgcc atggccggcc 90 aggtgggctg cagagtgggc tccctgcccc tctctgcctg ttctggactg tgttctgggc 1 ctgctgagga tggcagagct ggtgtccatc cagcactgac cagccctgat tccccgacca 12 ccgcccaggg tggagaagga ggcccttgct tggcgtgggg gatggcttaa ctgtacctgt 1270 ttggatgctt ctgaatagaa ataaagtggg ttttccctgg aggtacccag ca 1322 <2> 27 <211> 298

8 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 27 Met Gly Lys Asp Ser Lys Cys His Arg Gly Gln 1 1 Ser His Trp Gly Asp Gly Thr Gln Arg Cys Gly 20 2 30 Arg Ser Gly Ser Val Gly Asp Thr Cys Arg Trp 3 40 4 Asp His Val Asp Gly Gln Ile Gly Gln Arg Thr 0 60 Gly Gly Thr Ser Arg Gly 6 70 7 80 Phe Gly Met Gly Ser Arg Ser Phe Tyr Asp 8 90 9 Trp Thr Val Gly 0 1 Phe Phe His Thr Gly His Gln Asp Lys Val Arg Cys Phe Phe Cys Tyr 11 120 12 Gly Gly Gln Ser Trp Lys Arg Gly Asp Asp Trp Thr His 130 13 140 Lys Trp Phe Ser Cys Gln Phe Arg Ser Lys Gly Arg 14 1 160 Asp Phe Val His Ser Val Gln Thr His Ser Gln Gly Ser 16 170 17 Trp Asp Trp Asp Val Ser 180 18 190 Val Ser Gly Tyr Thr Arg Arg Val 19 200 20 Gln Ser Ser Gln Gly Gly Val Ser 2 21 220 Gln Arg Trp Trp Val Gly Arg Asp Val 22 230 23 240 Gln Arg Arg Gln Arg Thr Cys Lys Val Cys 24 20 2 Asp Arg Val Ser Ile Val Phe Val Cys Gly His Val Cys 260 26 270 Cys Gly Gln Cys Ile Cys Arg 27 280 28 Val Arg Ser Arg Val Arg Thr Phe Ser 290 29 <2> 28 <211> 128 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <221> CDS <222> (174)... (16) <400> 28 ccctgggata ctcccctccc agggtgtctg gtggcaggcc tgtgcctatc cctgctgtcc 60 ccagggtggg ccccgggggt caggagctcc agaagggcca gctgggcata ttctgagatt 120 ggccatcagc ccccatttct gctgcaaacc tggtcagagc cagtgttccc tcc atg 176

9 Met 1 gga cct Gly aaa Lys gac Asp agt Ser gcc aag Lys tgc Cys ctg cac His cgt Arg gga Gly cca cag Gln 1 ccg agc Ser 224 cac His tgg Trp gca 20 gcc ggt Gly gat Asp ggt Gly ccc 2 acg Thr cag Gln gag cgc Arg tgt Cys 30 gga Gly ccc cgc Arg 272 tct Ser ctg 3 ggc Gly agc Ser cct gtc Val cta 40 ggc Gly ctg gac Asp acc Thr tgc Cys 4 aga Arg gcc tgg Trp gac Asp 320 cac His 0 gtg Val gat Asp ggg Gly cag Gln atc Ile ctg ggc Gly cag Gln ctg cgg Arg 60 ccc ctg aca Thr gag gag 6 368 gaa gag gag gag ggc Gly 70 gcc ggg Gly gcc acc Thr ttg 7 tcc Ser agg Arg ggg Gly cct gcc 80 ttc Phe 416 ccc ggc Gly atg Met ggc Gly 8 tct Ser gag gag ttg cgt Arg 90 ctg gcc tcc Ser ttc Phe tat Tyr 9 gac Asp tgg Trp 464 ccg ctg act Thr 0 gct gag gtg Val cca ccc gag ctg ctg gct gct 1 gcc ggc Gly ttc Phe 12 ttc Phe cac His 11 aca Thr ggc Gly cat His cag Gln gac Asp 120 aag Lys gtg Val agg Arg tgc Cys ttc Phe 12 ttc Phe tgc Cys tat Tyr ggg Gly 60 ggc ctg cag agc tgg aag cgc ggg gac gac ccc tgg acg gag cat gcc 608 Gly 130 Gln Ser Trp Lys 13 Arg Gly Asp Asp 140 Trp Thr His 14 aag Lys tgg Trp ttc Phe ccc agc Ser tgt Cys cag Gln ttc Phe ctg ctc 1 cgg Arg tca Ser aaa Lys gga Gly aga Arg 160 gac Asp 66 ttt Phe gtc Val cac His agt Ser 16 gtg Val cag Gln gag act Thr cac His 170 tcc Ser cag Gln ctg ctg ggc Gly 17 tcc Ser tgg Trp 704 gac Asp ccg tgg Trp 180 gaa gaa ccg gaa gac Asp 18 gca gcc cct gtg Val gcc 190 ccc tcc Ser gtc Val 72 cct gcc 19 tct Ser ggg Gly tac Tyr cct gag 200 ctg ccc aca Thr ccc agg Arg 20 aga Arg gag gtc Val cag Gln 800

1 tct Ser 2 cgg Arg gtg Val gcc gaa cgg Arg tcc Ser ccc agt Ser ctg atc Ile ggc Gly 260 gcc cag Gln gtc Val 24 ctg cag Gln gag 230 ttt Phe cag Gln gag 21 gag gtg Val ctg cca agg Arg ccg tgc Cys gga Gly acg Thr tgc Cys ccc 26 gcc tgc Cys ggc Gly 20 atc Ile agg Arg aag Lys 23 cac His tgc Cys gat Asp 220 gtg Val ctg aga Arg gtg Val tgc Cys gtc Val gcc gag ctg tgt Cys ccc 270 gcg gac Asp gct 2 gtc Val cag Gln cgc Arg 240 gag cgc Arg ctg 22 gcc tgt Cys agc Ser 848 896 944 992 cgc Arg gtg Val 27 cgc Arg acc Thr ttc Phe ctg tcc Ser 280 tag * gccaggtgcc atggccggcc aggtgggctg 46 cagagtgggc tccctgcccc tctctgcctg ttctggactg tgttctgggc ctgctgagga 16 tggcagagct ggtgtccatc cagcactgac cagccctgat tccccgacca ccgcccaggg 1166 Tggagaagga ggcccttgct tggcgtgggg gatggcttaa ctgtacctgt ttggatgctt 1226 ctgaatagaa ataaagtggg ttttccctgg aggtacccag ca 1268 <2> 29 <211> 280 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 29 Met Gly Lys Asp Ser Lys Cys His Arg Gly Gln 1 1 Ser His Trp Gly Asp Gly Thr Gln Arg Cys Gly 20 2 30 Arg Ser Gly Ser Val Gly Asp Thr Cys Arg Trp 3 40 4 Asp His Val Asp Gly Gln Ile Gly Gln Arg Thr 0 60 Gly Gly Thr Ser Arg Gly 6 70 7 80 Phe Gly Met Gly Ser Arg Ser Phe Tyr Asp 8 90 9 Trp Thr Val Gly 0 1 Phe Phe His Thr Gly His Gln Asp Lys Val Arg Cys Phe Phe Cys Tyr 11 120 12 Gly Gly Gln Ser Trp Lys Arg Gly Asp Asp Trp Thr His 130 13 140 Lys Trp Phe Ser Cys Gln Phe Arg Ser Lys Gly Arg 14 1 160 Asp Phe Val His Ser Val Gln Thr His Ser Gln Gly Ser 16 170 17 Trp Asp Trp Asp Val Ser

111 180 18 190 Val Ser Gly Tyr Thr Arg Arg Val 19 200 20 Gln Ser Ser Gln Gly Arg Asp Val Gln 2 21 220 Arg Arg Gln Arg Thr Cys Lys Val Cys Asp Arg 22 230 23 240 Val Ser Ile Val Phe Val Cys Gly His Val Cys 24 20 2 Cys Gly Gln Cys Ile Cys Arg Val Arg 260 26 270 Ser Arg Val Arg Thr Phe Ser 27 280 1 20 Zastrzeżenia patentowe 1. Szczepionka DNA odpowiednia do wywoływania odpowiedzi immunologicznej przeciwko komórkom nowotworowym, zawierająca konstrukt DNA kodujący w sposób umożliwiający działanie co najmniej jedno białko surwiwinę i co najmniej jeden immunoaktywny produkt genowy w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku, przy czym konstrukt DNA wprowadza się w sposób umożliwiający działanie do atenuowanego wektora bakteryjnego. 2. Szczepionka DNA według zastrz. 1, w którym konstrukt DNA koduje w sposób umożliwiający działanie białko surwiwinę dobrane z grupy obejmującej (a) surwiwinę ludzką typu dzikiego o sekwencji aminokwasowej SEQ ID nr 2, (b) immunogenny homolog surwiwiny ludzkiej typu dzikiego o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 80% tożsamość z SEQ ID nr 2, (c) wariant splicingowy surwiwiny ludzkiej o sekwencji aminokwasowej SEQ ID nr 23, (d) wariant splicingowy surwiwiny ludzkiej o sekwencji aminokwasowej SEQ ID nr 24 i (e) fragment białka

112 1 20 2 30 surwiwiny, wiążący się z cząsteczką MHC klasy I i rozpoznawany przez cytotoksyczne limfocyty T. 3. Szczepionka DNA według zastrz. 1, w której konstrukt DNA koduje w sposób umożliwiający działanie immunogenny homolog surwiwiny ludzkiej typu dzikiego o sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 90%, korzystnie co najmniej 9% tożsamość z SEQ ID nr 2. 4. Szczepionka DNA według zastrz. 1, w której immunoaktywny produkt genowy kodowany w sposób umożliwiający działanie przez konstrukt DNA stanowi cytokina lub ligand receptora powierzchniowego komórki naturalnego zabójcy (NK).. Szczepionka DNA według zastrz. 4, w której cytokina dobrana jest z grupy obejmującej chemokinę, hematopoetynę, interferon, czynnik stymulujący komórki NK i czynnik stymulujący wytwarzanie cytokin. 6. Szczepionka DNA według zastrz., w której cytokiną jest ludzka CCL21. 7. Szczepionka DNA według zastrz. 4, w której ligand receptora powierzchniowego komórki NK jest indukowalnym przez stres białkiem dobranym z grupy obejmującej ludzkie MICA, ludzkie MICB, ludzkie ULBP1, ludzkie ULBP2 i ludzkie ULBP3. 8. Szczepionka DNA według dowolnego z zastrz. 1-7, w której atenuowany wektor bakteryjny jest dobrany z grupy obejmującej atenuowaną Salmonella typhimurium, Salmonella typhi, gatunki Shigella, gatunki Bacillus, gatunki Lactobacillus, BCG,

113 1 20 2 30 Escherichia coli, Vibrio cholerae, gatunki Campylobacter i gatunki Listeria. 9. Szczepionka DNA według zastrz. 8, w której atenuowaną Salmonella typhimurium jest szczep Salmonella typhimurium AroA -.. Szczepionka DNA według zastrz. 8 w której atenuowaną Salmonella typhimurium jest szczep Salmonella typhimurium AroA -, dam. 11. Szczepionka DNA według zastrz. 1, w której konstrukt DNA kodujący w sposób umożliwiający działanie co najmniej jedno białko surwiwinę zawiera sekwencję polinukleotydową dobraną z grupy obejmującej SEQ ID nr 1 i SEQ ID nr 3. 12. Szczepionka DNA według zastrz. 1, w której konstrukt DNA kodujący w sposób umożliwiający działanie co najmniej jeden immunoaktywny produkt genowy zawiera sekwencję polinukleotydową dobraną z grupy obejmującej SEQ ID nr, SEQ ID nr 7, SEQ ID nr 11, SEQ ID nr 13, SEQ ID nr 1, SEQ ID nr 17, SEQ ID nr 19 i SEQ ID nr 21. 13. Szczepionka DNA według zastrz. 11 lub 12, w której konstrukt DNA włącza się w sposób umożliwiający działanie do atenuowanego wektora Salmonella typhimurium. 14. Zastosowanie konstruktu DNA kodującego w sposób umożliwiający działanie białko surwiwinę i immunoaktywny produkt genowy oraz farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika do wytwarzania szczepionki DNA do hamowania wzrostu nowotworu u ssaka, przy czym ta szczepionka DNA ma być podawana doustnie ssakowi w ilości skutecznie wywołującej odpowiedź

114 1 20 2 30 immunologiczną, a ssak wykazuje odpowiedź immunologiczną wywoływaną przez szczepionkę i swoistą dla komórek nowotworowych, przy czym konstrukt DNA włącza się w sposób umożliwiający działanie do atenuowanego wektora bakteryjnego. 1. Zastosowanie konstruktu DNA kodującego w sposób umożliwiający działanie białko surwiwinę i immunoaktywny produkt genowy oraz farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika do wytwarzania szczepionki DNA do szczepienia ssaka przeciwko nowotworowi, przy czym szczepionka DNA ma być podawana doustnie ssakowi w ilości skutecznie wywołującej odpowiedź immunologiczną, a ssak wykazuje odpowiedź immunologiczną wywoływaną przez szczepionkę i swoistą dla komórek nowotworowych, przy czym konstrukt DNA włącza się w sposób umożliwiający działanie do atenuowanego wektora bakteryjnego. 16. Zastosowanie według zastrz. 14 lub 1, w którym immunoaktywnym produktem genowym kodowanym przez konstrukt DNA jest cytokina lub ligand receptora powierzchniowego komórki NK. 17. Zastosowanie według zastrz. 14 lub 1, w którym ssakiem jest człowiek. 18. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 14-17, w którym atenuowany wektor bakteryjny jest dobrany z grupy obejmującej atenuowaną Salmonella typhimurium, Salmonella typhi, gatunki Shigella, gatunki Bacillus, gatunki Lactobacillus, BCG, Escherichia coli, Vibrio cholerae, gatunki Campylobacter i gatunki Listeria.

11 19. Zastosowanie według zastrz. 18, w którym atenuowaną Salmonella typhimurium jest szczep Salmonella typhimurium AroA-. 20. Zastosowanie według zastrz. 18 w którym atenuowaną Salmonella typhimurium jest szczep Salmonella typhimurium AroA-, dam -. 21. Wyrób zawierający szczepionkę według dowolnego z zastrz. 1-13, opakowaną w hermetycznie zamknięty, jałowy pojemnik, opatrzony przyklejoną doń etykietą, zawierającą nadruk z informacjami identyfikującymi szczepionkę i informacjami użytecznymi dla osoby podającej szczepionkę pacjentowi. 1 The Scripps Research Institute Zastępca: 20

116

117

118

119

120

121

122

123

124

12

126

127

128

129

130

131

132

133

134

13

136

137

138

139

140

141

142

143

144

14

146

147

148

149

11

12

13

14

1

16

17

18

19

160