Hybrydyzacja kwasów nukleinowych
Jaka jest lokalizacja tego genu na chromosomie? Jakie jest jego sąsiedztwo?
Hybrydyzacja - powstawanie stabilnych struktur dwuniciowych z cząsteczek jednoniciowych o komplementarnych sekwencjach nukleotydów Hybrydyzacja zachodzi już przy komplementarnych odcinkach długości kilkunastu (17) nt W hybrydyzacji kwasów nukleinowych mogą powstawać struktury hybrydowe różnego typu: DNA:DNA RNA:RNA DNA:RNA
Żeby wykorzystać hybrydyzację (jako narzędzie badawcze) należy spełnić przynajmniej dwa warunki: 1. Dysponować tzw. sondą molekularną czyli odpowiednio przygotowanym fragmentem DNA (lub RNA) 2. Umieścić docelowy kwas nukleinowy (np. chromosomalne DNA, w którym szukamy odcinka komplementarnego do sondy molekularnej) na specjalnym stałym nośniku - filtrze (membranie) (prawie zawsze konieczne.)
Sonda molekularna Sonda molekularna musi być wyznakowana czyli wyposażona w znacznik (radioaktywny lub nieradioaktywny), który umożliwi jej uwidocznienie a zarazem zlokalizowanie docelowej (czyli zhybrydyzowanej z nią) sekwencji
Sondy można znakować : radioaktywnie - do sondy włączany jest nukleotyd znakowany radioaktywnym izotopem 32 P, 35 S. Detekcja opiera się na autoradiografii przy zastosowaniu filmów wrażliwych na promieniowanie. znacznikami nieradioaktywnymi Związkami fluorescencyjnymi - emisja światła o określonej długości fali, wykorzystywane są związki tj. Rodamina, kumaryna czy fluoresceina. Detekcja odbywa się odpowiednich przyrządów optycznych np. kamer lub mikroskopów fluorescencyjnych. immunochemicznie, cytochemicznie - do sondy włączany jest nukleotyd sprzężony z haptenem (biotyną, digoksygeniną). Detekcja odbywa się przy pomocy przeciwciał specyficznych dla danego haptenu. Przeciwciała są sprzężone z umożliwiającymi ich uwidocznienie cząsteczkami: alkaliczną fosfatazą, peroksydazą. Sondy molekularne wyznakowane radioaktywnie mają największą czułość
Sposoby znakowania sond molekularnych reakcja przesunięcia pęknięć w DNA (ang. nick translation) W reakcji wykorzystuje się aktywność DNA polimerazy I E. coli, która dodaje nukleotydy do wolnego końca 3' OH utworzonego wcześniej w dwuniciowym DNA przez działanie DNazy I. W tym samym czasie, polimeraza I egzonukleolitycznie usuwa nukleotydy od końca 5' pęknięcia. Równoczesna eliminacja nukleotydów z końca 5' i dodatek nukleotydów do końca 3' powoduje przesuwanie się przerwy wzdłuż DNA, w kierunku 5' - 3'. Jeśli jeden z nukleotydów obecnych w reakcji zostanie zastąpiony nukleotydem radioaktywnym lub znakowanym nieizotopowo, to w wyniku reakcji uzyskuje się DNA wyznakowany z wysoką specyficzną aktywnością reakcja przypadkowego startu replikacji (ang. random priming) Reakcję wykorzystuje się do znakowania sond molekularnych. W pierwszym etapie denaturuje się dwuniciowe DNA i hybrydyzuje do 6-12 nukleotydowych oligonukleotydów, spełniających funkcję przypadkowych starterów syntezy DNA. Po związaniu starterów z jednoniciową matrycą, synteza DNA rozpoczynana się od końców 3 starterów z udziałem fragmentu Klenowa DNA polimerazy I.
Sondy molekularne możemy uzyskać przez wyznakowanie końców cząsteczek kwasów nukleinowych 5 przez przeniesienie grupy fosforanowej z ATP na zdefosforylowany koniec 5 fragment RNA lub DNA za pomocą np. T4 PNK (Kinazy Polinukleotydowej z bakteriofaga T4). Jeżeli ATP jest wyznakowany w pozycji γ, to można w ten sposób znakować oligonukleotydy i fragmenty DNA. Defosforylację DNA można przeprowadzić przy wykorzystaniu Fosfataz BAP (bacterial alkaline phosphatase), CIAP (calf intestine AP), SAP (shrimp AP).
3 przez wypełnienie cofniętego końca 3 na matrycy wystającego końca 5 po strawieniu enzymem restrykcyjnym używamy wyznakowanego nukleotydu oraz fragmentu Klenowa polimerazy DNA I 3 z użyciem terminalnej transferazy
Przygotowanie docelowego DNA (target DNA), w którym za pomocą sondy molekularnej będziemy szukać komplementarnych odcinków Najczęściej wygląda to tak: 1. Izolacja genomowego DNA 2. Podział na mniejsze fragmenty np. przez trawienie 3. Rozdział w żelu agarozowym 4. Transfer na specjalną membranę (stały nośnik)
1975 Edwin Southern Southern blotting Proces przenoszenia DNA z żelu na membranę to blotting Transfer na membranęblotting
SOUTHERN blotting
zdenaturowany kwas nukleinowy sonda molekularna musi być zdenaturowana!
W którym z wielu fragmentów restrykcyjnych dużej cząsteczki DNA znajduje się sklonowany przez nas gen? sklonowany przez nas gen
Odmiany hybrydyzacji kwasów nukleinowych w zależności od rodzaju materiału genetycznego na nośniku i użytej sondy molekularnej: 1. DNA:DNA Hybrydyzacja Southerna (od nazwiska Edwina Southerna) 2. RNA-DNA (lub RNA-RNA- rzadko) typu northern (zupełnie inne zastosowanie niż hybrydyzacja Southerna!!!)
Warunki hybrydyzacji muszą być odpowiednio dobrane Tworzenie hybryd pomiędzy ssdna lub RNA zależy od: Stężenia kwasów nukleinowych (dużo DNA lub RNA na filtrze, mało sondy molekularnej) Temperatury Siły jonowej - (niższe stężenie soli - niższa stabilność) optymalna przy stężeniu 1.5 M NaCl czasu hybrydy powstają powoli (kilkanaście godzin)
Operując tymi parametrami możemy uzyskiwać hybrydyzację cząsteczek, których homologia (identyczność sekwencji) nie przekracza 50%.
Do czego jeszcze możemy wykorzystać różne odmiany hybrydyzacji kwasów nukleinowych????
Hybrydyzacja fluorescencyjna in situ FISH- pozwala bezpośrednio uwidocznić pozycję markera w cząsteczce DNA np. chromosomie po hybrydyzacji z sondą fluorescencyjną.
Techniki hybrydyzacyjne można stosować także jako metody screeningu przeszukiwania dużej ilości rekombinantów/klonów w celu znalezienia właściwego, zawierającego poszukiwany odcinek DNA do potwierdzenia obecności zrekombinowanych fragmentów DNA w komórkach gospodarza
Hybrydyzacja kolonijna wykonujemy np. po transformacji komórek bakteryjnych bankiem plazmidowym. Po wysianiu na płytki replikuje się kolonie na filtr. Wykonuje się szereg czynności, które mają na celu przytwierdzenie bakterii, ich lizę i denaturację in situ a następnie poddaje się hybrydyzacji i autoradiografii. Dzięki zachowaniu szalki wzorcowej jesteśmy w stanie określić dokładnie kolonię, w której znajduje się hybrydyzujący fragment.
Hybrydyzacja łysinkowa - po transformacji komórek bakteryjnych populacją fagów i wysianiu ich na płytki, łysinki replikuje się na filtr. Przytwierdza się przeniesione fagi do filtru, hybrydyzuje z sondą i poddaje autoradiografii. Także w tym przypadku dzięki szalce wzorcowej jesteśmy w stanie zidentyfikować łysinki, których pozycje odpowiadają zaczernieniom na kliszy.