Ligazy. Zastosowanie ligazy w inżynierii genetycznej:

Transkrypt

1 Ligazy Katalizują tworzenie wiązań fosfodiestrowych między sąsiednimi grupami 3 OH i 5 PO 4 w kwasach nukleinowych DNA lub RNA. W reakcji tworzą się wysokoenergetyczne pośredniki z udziałem NAD + lub ATP w zależności od typu ligazy. Funkcja in vivo: udział w replikacji opóźnionego pasma DNA, rekombinacja genetyczna, naprawa DNA Zastosowanie ligazy w inżynierii genetycznej: Rekombinacja DNA in vitro łączenie cząsteczek kwasów nukleinowych lepkich lub tępych końców oraz szereg innych bardzo specyficznych zastosowań.

2 Własności ligaz używanych w rekombinacji in vitro Ligazy Substraty kofaktory temperatura lepkie tępe końce DNA-RNA RNA-RNA E. coli tak tak* nie nie NAD + Mg 2+ (1-3 mm) C T4 faga tak tak* tak* tak* ATP Mg 2+ (10 mm) 4 C C Bakterii termofilnych tak nie nie nie NAD + Mg 2+ (10 mm) C Ligacja tępych końców jest znacznie mniej efektywna Bakteryjna ligaza jest zależna od NAD + Fagowe i eukariotyczne ligazy są zależne od ATP

3 Fosfataza alkaliczna Usuwa 5 -fosforan z ssdna, dsdna i RNA, rntp i dntp. Metaloenzym (Zn II) Bakteryjna fosfataza alkaliczna (BAP) najbardziej efektywna, ale jest oporna na ogrzewanie i detergenty. Z tego powodu trudno zakończyć reakcję defosforylacji. Peryplazmatyczny enzym, działa w buforze Tris ph w obecności niskich stężeń Zn +2 (poniżej 1 mm). Alkaliczna fosfataza cielęca (CIAP calf intestinal alkaline phosphatase) mniejsza aktywność niż BAP, ale łatwiejsza do usunięcia (ogrzewanie 65 C 30 min lub 75 C 10 min) w obecności 10 mm EDTA. Alkaliczna fosfataza z arktycznych krewetek (SAP shrimp alkaline phosphatase) aktywność podobna do CIAP, ale inaktywacja 65 C 15 min (zalecane 70 C 20 min).

4 Zastosowanie fosfatazy alkalicznej w inżynierii genetycznej: defosforylacja tj. usuwanie 5 fosforanów z wektorów trawionych enzymami restrykcyjnymi jeżeli DNA wektora zostało strawione jednym enzymem restrykcyjnym defosforylacja zapobiega jego zamykaniu się (autoligacji) wektora bez wstawki traktowanie DNA fosfatazą zmniejsza niestety wydajność klonowania

5 Polimerazy DNA Polimerazy są enzymami, których główną funkcją jest kataliza tworzenia polimerów kwasów nukleinowych RNA i DNA na matrycy istniejących jednoniciowych DNA lub RNA. Proces ten to polimeryzacja. Polimeraza I polimeraza Kornberga (m. cz. 109 kd) Odkryta w 1958 r. Kodowana przez gen pola. Funkcja in vivo: enzym naprawczy Średnia szybkość polimeryzacji 20 nukleotydów/sec, Struktura krystaliczna Taq DNA polimerazy niska procesywność nukleotydów, 400 cząstek na komórkę. 1. Aktywność: 5 3 polimeryzacja DNA Substrat: jednoniciowe DNA i starter z wolną grupą 3 OH. Reakcja: DNA OH DNA- ( p dn) n +PP Wymagania: Mg +2 datp, dttp, dgtp, dctp

6 2. Aktywność: 3 5 egzonukleolityczna-sprawdzająca Substrat: dsdna lub ssdna z wolnym 3 OH końcem. Degraduje DNA od 3 OH. Ta aktywność na dsdna jest blokowana przez aktywność polimeryzacyjną 5 3. Reakcja: dsdna lub ssdna 5 p dn OH Wymagania: Mg Aktywność: 5 3 egzonukleolityczna Substrat: dsdna lub RNA-DNA hybrydy. Degraduje dsdna od 5 końca; degraduje RNA w hybrydzie z DNA - aktywność RNAzy H Wymagania: Mg +2

7 Zasosowanie polimerazy I (holoenzymu) 1. Znakowanie DNA przez przesunięcie przerwy (ang. nick-translation). Tylko ta polimeraza może przeprowadzać tę reakcję ze względu na aktywność egzonukleazy 5 3

8 Fragment Klenowa DNA polimerazy I polimeraza I pozbawiona N-końcowej domeny stanowi tzw. fragment Klenowa. Polimeraza 3 5 egzo- 5 3 egzo (46 kd) nukleaza (22 KD) nukleaza C N Fragment Klenowa (605 aa)

9 Zastosowanie polimerazy Klenowa: 1. Synteza dsdna na matrycy ssdna: Warunki reakcji: matryca ssdna, startery - oligonukleotydy 6-20 n komplementarne do określonego fragmentu DNA z wolną grupą OH, bufor, dntps, Reakcja może z powodzeniem służyć do znakowania sond molekularnych, jeśli do buforu reakcyjnego doda się nukleotydów radioaktywnych lub znakowanych innymi markerami.

10 2. Wypełnianie cofniętych 3 - końców we fragmentach DNA (fill-in reaction): Stosuje się w celu tworzenia tępych końców we fragmentach powstałych po trawieniu enzymami restrykcyjnymi tworzącymi 5 -wystające końce. 3 Reakcja może z powodzeniem służyć do znakowania sond molekularnych, jeśli do buforu reakcyjnego doda się nukleotydów radioaktywnych lub znakowanych innymi markerami.

11 3. Wytrawianie wystających 3 końców: Stosuje się również w celu tworzenia tępych końców we fragmentach powstałych po trawieniu enzymami restrykcyjnymi tworzącymi 3 -wystające końce. Aktywność egzonukleazowa 3 5 polimerazy Klenowa wytrawia wystające nadmierności.

12 DNA polimeraza bakteriofaga T7 zawiera dwie podjednostki, o aktywnościach takich samych jak polimeraza Klenowa. Szczególnie użyteczna ponieważ charakteryzuje się znacznie większą procesywnością i wysoką wiernością (~1000 x większą niż polimeraza Klenowa). Używana jest do sekwencjonowania DNA metodą Sangera, także pod nazwą Sequenase lub Sequenase 2.0 (bez aktywności 3 5 egzonukleolitycznej)

13 DNA-zależna polimeraza DNA Termostabilne DNA polimerazy - mają podobne aktywności jak polimeraza I, ale maksymalną aktywność katalityczną wykazują w C (Taq polimeraza ma tylko 10% maks. aktywności w 37 C). -szybkość reakcji w optymalnej temp. 150 dntp/sec/cząsteczkę enzymu. Polimeraza 3 5 egzo- Żródło i własności nukleaza Taq nie Termus aquaticus. Okres półtrwania 95 C h; wierność 1x x10 5 ; procesywność: 42 n Pfu tak Pyrococcus furiosus. Największa wierność: 1.5x10-6 Vent tak Thermococcus litoralis. Okres półtrwania 95 C - 7 h; wierność pośrednia Zastosowanie polimeraz: Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR) w różnych odmianach.

14 Odwrotna transkryptaza RNA-zależna polimeraza DNA Obecna w retrowirusach, gdzie kopiuje wirusowe RNA przed integracją do genomu. Ma dwie aktywności: -RNA zależnej DNA polimerazy w warunkach laboratoryjnych syntetyzuje DNA na matrycy ssrna i ssdna z jednakową wydajnością. W obu przypadkach wymaga startera RNA lub DNA. Nie ma aktywności 3 5 egzonukleazy (1/500 n jest błędny). - Rnazy H - jest rybonukleazą, która degraduje RNA z RNA-DNA hybrydów. Funkcjonuje zarówno jako endo- i egzonukleaza. Najczęściej wykorzystuje się dwa różne enzymy najczęściej otrzymywane jako białka rekombinowane w E. coli. z wirusa mysiej białaczki Moloneya z wirusa ptasiej mieloblastozy

15 Zastosowanie odwrotnej transkryptazy: 1. Kopiowanie RNA na DNA: szczególnie przydatna podczas przepisywania eukariotycznych transkryptów mrna eukariotycznych genów na tzw. cdna (komplementarne DNA). Funkcję starterów pełnią wówczas krótkie n polimery (oligo dt), komplementarne z ogonkami polia mrna. 2. Tworzenie kopii cdna z mrna przed amplifikacją PCR, w reakcji zwanej RT-PCR, w której używa się starterów komplementarnych do sekwencji kodującej mrna

16 Bakteriofagowe polimerazy RNA Są to RNA polimerazy zależne od DNA. Są używane do transkrypcji in vitro w celu syntezy RNA komplementarnych do jednego z pasm DNA sklonowanego w wektorze do transkrypcji in vitro, z udziałem silnego promotora. Syntetyzowane RNA może być znakowane np. radioaktywnie Komercyjnie dostępne RNA polimerazy: T7 (fag E. coli) rozpoznaje promotor TAATACGACTCACTATAGGG T3 (fag E. coli) rozpoznaje promotor AATTAACCCTCACTAAAGGG SP6 (fag Salmonella typhimurium) rozpoznaje protmotor AATTTAGGTGACACTATAGAA Wiele wektorów przeznaczonych do klonowania DNA ma wbudowane promotory dla różnych polimeraz RNA w sąsiedztwie miejsca wielokrotnego klonowania (MCS). To pozwala na syntezę RNA w sensownej i antysensownej orientacji ze sklonowanej wstawki

17 2. System transkrypcji faga T7 jest używany do ekspresji sklonowanych genów w bakteriach (UWAGA!!! Polimeraza RNA T7 jest tutaj wykorzystywana in vivo) Do bakterii z wbudowanym do chromosomu genem dla T7 polimerazy RNA (pod indukcyjnym promotorem lac) wprowadza się badany gen (sklonowany na wektorze plazmidowym) pod promotorem faga T7. Indukcja systemu następuje po dodaniu IPTG

18 Terminalna transferaza Katalizuje dodawanie nukleotydów dntp do 3 OH końca DNA. Działa na ssdna, dsdna z wystającymi końcami (preferuje wystający koniec 3 ), jest mniej efektywna w przypadku cząsteczek z tępymi końcami. Jest to jedyna polimeraza DNA, która nie wymaga matrycy. Niezbędny jest kobalt jako kofaktor w reakcji dodawania pirymidyn lub Mg +2 w dodawaniu puryn. W odpowiednich warunkach terminalna transferaza może dodać wiele tysięcy dntp lub tylko jeden nukleotyd jeśli jest odpowiednio zmodyfikowany np. ddntp 3 3 Zastosowanie: 1. Znakowanie 3 końców DNA np. znacznikami radioaktywnymi (takie fragmenty DNA wyznakowane tylko na końcach są często wykorzystywane w technice pozwalającej na wizualizację oddziaływania DNA białko technika EMSA)

19 2. Dodawanie homopolimerowych ogonków do DNA: Stosowany np. do rekombinowania i klonowania cdna w wktorach plazmidowych Terminalna transferaza pozwala na tworzenie homopolimerowych ogonków komplementarnych do siebie w liniowych fragmentach DNA.

20 Kinaza polinukleotydowa (PNK) PNK jest enzymem, który katalizuje przeniesienie - fosforanu z ATP na 5 koniec DNA lub RNA. Najczęściej stosuje się rekombinowany enzym faga T4 nadprodukowany w E. coli. Zwykle są stosowane dwa typy reakcji : forward - w której - fosforan z ATP jest przenoszony na 5 koniec defosforylowanego DNA. W reakcji wymiany exchange, w obecności nadmiaru ADP, PNK przenosi terminalny fosforan z ufosforylowanego DNA na ADP i ponownie przenosi radioaktywny - fosforan z [ - 32 P] ATP. Reakcja typu wymiany jest mniej wydajna. Zastosowanie: głównie znakowanie np. radioaktywne cząsteczek DNA używanych jako sond w hybrydyzacji oraz w technice EMSA

21 Nukleazy (inne niż ER) DNazy i RNazy Dzielą się na endo- i egzonukleazy. Ich specyficzność substratowa zależy wyłącznie od stężenia enzymu im większe stężenie tym niższa specyficzność. Dnazy 1. DNaza I - endonukleaza, tnie dsdna i ssdna preferencyjnie w sąsiedztwie C lub T tworząc 5 -fosforylowane di-, tri-, i tetranukleotydy. Nie trawi RNA Zastosowanie: 1. Usuwanie DNA z preparatów RNA; 2. Analiza interakcji DNA-białko (tzw. footprinting); 3. Nadtrawianie DNA w reakcji przesunięcia przerwy 2. Egzonukleaza III (E. coli) - usuwa nukleotydy z 3 końca dsdna - najlepiej działa na DNA z tępymi końcami i 5 wystającymi. Nie działa na ssdna. - używana w tworzeniu określonych delecji liniowych fragmentów DNA.

22 3. Nukleaza Mung Bean endonukleaza specyficzna dla ssdna które trawi do 5 - fosforylowanych mono- i oligonukleotydów. Zastosowanie: usuwanie jednoniciowych końcówek i konwersja na tępe końce 4. Nukleaza BAL 31 egzonukleaza, która trawi 3 -końce ssdna i dsdna zarówno tępych jak i lepkich. Działa też jak endonukleaza na ssdna. Kombinacja tych dwóch aktywności umożliwia progresywne skracanie DNA z obu końców- np. do usuwania zbędnych fragmentów przed klonowaniem. Nukleaza S1 (Aspergillus) - W niskich stężeniach trawi ssdna lub RNA; w wyższych stężeniach trawi dsdna i dsrna oraz DNA:RNA. RNazy 1. Rybonukleaza A endorybonukleaza, trawi ssrnaw 3 końcu reszty pirymidynowej Degraduje RNA do 3 ufosforylowanych mono- i oligonukleotydów Zastosowanie rybonukleaz: 1. Usuwanie kontaminacji RNA w preparatach plazmidowego DNA 2. Mapowanie mutacji w DNA lub RNA przez cięcie niedopasowanych nukleotydów (mismatch cleavage).