Podstawy inżynierii genetycznej

Transkrypt

1 Metody bioinformatyki Podstawy inżynierii genetycznej prof. dr hab. Jan Mulawka

2

3 Czym jest inżynieria genetyczna Zbiór technik rekombinowania i klonowania DNA Wydzielanie i charakteryzowanie pojedyńczych genów Poznaje się strukturę i działanie genów

4 Fragmentowanie DNA Gdy poszukujemy pojedynczych genów w genomie danego organizmu Narzędziem są na ogół enzymy restrykcyjne Można też użyć ultradźwięków przepuszczając DNA przez wąską kapilarę

5 Enzymy restrykcyjne (restryktazy) Enzymy klasy II endonukleazy Tną dwuniciowe DNA w specyficznym miejscu wyznaczonym przez charakterystyczny dla tego enzymu ciąg nukleotydów. Np. enzym EcoRI wytwarzany przez E. coli tnie pomiędzy G oraz A (w nici wiodącej) oraz pomiędzy A oraz G (w nici opóźniającej), jeśli napotka następującą sekwencję: 5' : : : GAATTC : : : 3' 3' : : : CTTAAG : : : 5'

6

7 Rekombinowanie DNA in vitro to łączenie fragmentów DNA Enzym ligazy DNA wytwarza wiązania fosfodiestrowe Wektory to niewielkie cząsteczki DNA mające zdolność do samodzielnej replikacji w komórce

8 Klonowanie DNA Podłączony do wektora fragment DNA będzie po wprowadzeniu zrekombinowanej cząsteczki do komórki ulegał powielaniu Podczas klonowania strawione przy pomocy enzymów restrykcyjnych fragmenty DNA ligujemy z wektorami a następnie wprowadzamy je do komórek w procesie transformacji

9 Wektory plazmidowe Plazmid to mała kolista cząstka DNA, która nie jest związana z żadnym chromosomem. Może być wprowadzona do komórki bakterii, od której się wywodzi. Często używa się plazmidów E. coli. Plazmid musi zawierać miejsce startu replikacji (aby mógł się replikować, gen lub kilka genów odpowiedzialnych za odporność na pewne anybiotyki.

10 Pozostaje jeszcze pewna część w DNA plazmidu, w którą można wstawić fragment obcego DNA (o długości do kbp) Następnie hoduje się bakterie, dodając antybiotyk. Te bakterie, które zawierają plazmidy z genem odporności na ten antybiotyk przeżywają Powstaje w ten sposób kolonia klonów

11 Wektory fagów Fagi są wirusami atakującymi bakterie E.coli Ich genom ma rozmiar 50 kbp, z czego 25 kpb można usunąć, wymieniając na obcy DNA, bez wpływu na proces infekowania bakterii Fag namnaża się w zainfekowanej komórce, produkując nawet więcej niż 100 kopii w jednej komórce Zabija przy tym bakterię, uwalniając zreplikowane nowe kopie wirusa Przygotowanie zmutowanych fagów można przeprowadzać in vitro

12 Inne wektory Kosmidy: połączenie techniki wykorzystania plazmidów z techniką fagów Tworzy się duże plazmidy, które są wprowadzane do bakterii przy pomocy obudowy" od fagów Dzięki temu pomysłowi można tworzyć wstawki o długości 45 kbp Wektory P1: 100 kbp

13

14

15 Mapa restrykcyjna Jest to obraz cząsteczki DNA, na którym zaznaczone są miejsca rozpoznawane przez różne enzymy restrykcyjne z uwzględnieniem odległości między nimi wyrażonej w nukleotydach.

16 Elektroforetogram dla wektorów puc19 i pms02

17 Mapa restrykcyjna wektora pms02

18 Mapa plazmidu pbr322 Podkreślono symbole enzymów przecinających cząsteczkę tylko w jednym miejscu Liczby oznaczają numer kolejny nukleotydu od EcoRI

19

20 Zastosowanie plazmidu pbr322 do klonowania DNA Wyróżnianie klonów zawierających zrekombinowane wektory

21

22 Mapa restrykcyjna plazmidowego wektora puc19

23 Wytwarzanie krótkich delecji i insercji w sklonowanych genach

24 Wytwarzanie serii delecji genowych

25 Metody sekwencjonowania Metoda chemiczna Maxama-Gilberta (1977) Przeprowadza się cztery reakcje chemiczne, które tną nić DNA w miejscach A+G (puryny), C+T (pirymidyny), C Reakcja jest tak przeprowadzana, aby każdą nić przeciąć tylko w jednym miejscu Używając elektroforezy na żelu, porównuje się długości pociętych fragmentów(radioaktywnie zaznacza się jeden koniec nici i przeprowadza autoradiografię prążków powstałych w żelu). Ta metoda jest pracochłonna i kosztowna

26 Sekwencjonowanie DNA metodą Maxama i Gilberta

27 Metoda enzymatyczna Sangera (1977) Matrycą jest jednoniciowe DNA. Do niej dołącza się starter (tzw. primer) Jest on syntetycznie wyprodukowany. Jego koniec 5' jest oznakowany radioaktywnie Proces przeprowadza się w 4 probówkach. W każdej z nich znajduje się matryca ze starterem, nukleotydy A, C, G, T oraz jeden z czetrech rodzajów nukleotydów pozbawiony grupy 3'- hydroksylowej (tzw. dideoksy ATP, CTP, GTP, TTP)

28 Do tego dodaje się enzym DNA polimerazy, który powoduje wydłużanie nici zaczynającej sie starterem Dołączenie w danym momencie dideoksy powoduje, że proces wydłużania zostaje zatrzymany (bo nie ma końca 3') Następnie denaturuje się podwójne nici, wykonuje elektroforezę dla porównania długości i przeprowadza autoradiografię prążków powstałych w żelu

29 Sekwencjonowanie DNA metodą Sangera

30 Technika PCR PCR (Polimerase Chain Reaction) reakcja łańcuchowa polimerazy odkryta przez Kary Mullisa (1985) Jest używana do szybkiego kopiowania materiału genetycznego Proces ma charakter wzrostu wykładniczego

31

32 Podstawowe kroki procesu PCR Chcemy powielić materiał genetyczny zawarty w pewnym regionie DNA Wytwarzamy syntetycznie startery (dwa rodzaje), których pozycje będą ograniczały ten region z obu stron Dajemy bardzo dużo starterów oraz wolnych nukleotydów do materiału, który mamy powielić Dodajemy enzym polimerazy (Taq polimerazę z bakterii Thermus aquaticus, żyje w 72C)

33 Powtarzamy cyklicznie trzy kroki: 1. Podgrzewamy roztwór do temperatury 95C. Następuje denaturacja nici materiału genetycznego 2. Ochładzamy do 60C. Wówczas startery łączą się z pojedynczymi nićmi Ponieważ materiału genetycznego jest mało w porównaniu z liczbą starterów, to szansa połączenia nici materiału genetycznego ze sobą jest mała

34 3.Następuje faza budowania nowych (komplementarnych) nici przez enzym polimerazy. Po zakończeniu tej fazy cykl powtarzamy tak długo aż uzyskamy odpowiednią ilość materiału genetycznego. Po każdym cyklu PCR ilość materiału genetycznego podwaja się. W ten sposób można powielać (amplifikować) fragmenty o długości do 20 kbp Przykładowe zastosowanie: wykrywanie wirusa HIV w bardzo wczesnym stadium zarażenia (przed wystąpieniem objawów)

35 Biblioteki genomowe Pobiera się genomowe DNA, tnie na kawałki 20 kbp przy pomocy enzymu, którym się również tnie genom faga Następnie tworzy się zrekombinowane fagi po czym zaraża nimi bakterie, aby wytworzyć dużą liczbę kopii Tak otrzymane kolonie nazywają się bibliotekami genomowymi Zamiast faga używa się również plazmidów czy też sztucznych chromosomów

36 Historia poznawania sekwencji genomów Zsekwencjonowanych jest ponad 180 genomów różnych organizmów. Poniżej przedstawiono chronologię najważniejszych wydarzeń związanych z projektami sekwencjonowania: Bakteriofag X174 (5,4 kbp) pierwszy całkowicie zsekwencjonowany w całości materiał genetyczny (Sanger, 1972) Fag (48,5 kbp), Sanger 1982

37 Bakteria Haemophilus influenze (1 830 kbp), Venter 1995 Bakteria Mycoplasma genitalium (580 kbp), Venter 1995 Drożdże piekarskie Saccharomyces cerevisiae ( kbp) { pierwszy genom eukariota, (współpraca międzynarodowa), 1996 Bakteria Escherichia coli (4600 kbp), 1997 Nicień Caenorhabditis elegans ( kbp) 1998

38 Człowiek, chromosom 22, (35600 kbp) 1999 Człowiek, chromosom 21, (34ó00 kbp) 2000 Muszka owocowa Drosophila melanogaster ( kbp) Rzodkiewnik Arabidopsis thaliana ( kbp), 2000 Człowiek, cały genom Homo sapiens ( kbp), 2001

39 Mysz Mus musculus ( kbp), 2002 Kurczak Gallus gallus ( kbp), 2004 Ryż Oryza sativa ( kbp), 2005 Szympans Pan troglodytes ( kbp), 2005

40 Genom człowieka (Human Genome Project) Zapis całego genomu zajmie (używając alfabetu A,C,G,T) około 750 Mb pamięci Inicjatywa projektu powstała w USA pod koniec 1984 Uruchomienie projektu nastąpiło w 1988 Główną rolę przy realizacji przewidziano dla NIH (National Institutes of Health) ale również mocno zaangażowany jest Departament Energii

41 Główny udział w odkodowaniu ludzkiego genomu mają: Francis Collins Craig Venter

42 Projekt zaplanowano na 15 lat i łączny budżet 3 mld USD (po 200 mln USD na rok) Jest to obecnie bardzo duże międzynarodowe przedsięwzięcie, w którym udział biorą m.in.: USA, Francja, Japonia, Niemcy, Rosja, Wielka Brytania W lutym 2001 zaanonsowano ukończenie pierwszego szkicu całego genomu człowieka

43 Francis Collins i Craig Venter na spotkaniu u prezydenta Billa Clintona Spotkaliśmy się, żeby obejrzeć mapę o jeszcze większym znaczeniu dla ludzkości Otwiera się dla nas nowa era Posiedliśmy moc uzdrawiania Genetyka zrewolucjonizuje medycynę Genetyka wyleczy nas z większości, choć nie ze wszystkich chorób

44 Przewidywania Collinsa na rok 2010 Genetyczne testy diagnostyczne na co najmniej 12 różnych chorób będą powszechnie dostępne Będziemy mogli zmniejszyć ryzyko zachorowania na kilka z tych chorób Wielu lekarzy pierwszego kontaktu będzie korzystało z medycyny opartej na genetyce Diagnostyka preimplantacyjna będzie powszechnie dostępna

45 Nie sprawdziły się przewidywania Odnośnie powstania nowych leków dzięki inżynierii genetycznej (zarzuca się koncernom, że często tworzą leki bez zrozumienia biologii) Nie osiągnięto zbyt wiele w dziedzinie genetyki raka, mimo że poświęcono na to wiele czasu i ogromne fundusze Chociaż koszt odczytywania materiału genetycznego spada, to jednak zalewa uczonych fala informacji, która przeciąża ich umysły i dyski komputerów

46 Osiągnięcia w inżynierii genetycznej dokonane przez ostatnie 10 lat Nastąpił ogromny postęp w technologiach odczytujących DNA Drastyczny spadek ceny za te usługi zmniejszyły się one 14 tysięcy razy! Odczytano pełną informację genetyczną wielu organizmów w tym 14 gatunków ssaków Rozwój genetyki zmienił prace ewolucjonistów Udostępniono już genomy 13 osób

47 Dzisiejsza genetyka rozwija się w dwóch kierunkach Odczytywanie jak największej ilości materiału genetycznego, by mieć bazę do porównań Poszukiwanie odpowiedzi na pytanie, jakie jeszcze funkcje pełni w organizmie ludzkim DNA

48 Rola ciemnej materii DNA Nasze skłonności do chorób w większości wcale nie znajdują się w genach Przypuszcza się, że zapisane są one w tzw. ciemnej materii DNA (introny) Materiał ten na pierwszy rzut oka jest śmietnikiem i nie koduje niczego Jak mamy szukać informacji, jeśli nie wiemy, co jest śmieciem, a co nie

49 Sztuczne życie W maju 2010 Craig Venter poinformował o stworzeniu pierwszej komórki, której kod genetyczny został w całości wyprodukowany przez człowieka w laboratorium Opracowanie technologii syntetycznej bakterii Bakteria ta ma przetwarzać dwutlenek węgla na paliwo Venter postanowił opatentować swoją metodę naukową

50 Dalszy postęp inżynierii genetycznej upatruje się w: Ogólnym postępie technologicznym Użyciu superkomputerów działających z szybkością tysiąc razy szybciej do porównań tysięcy DNA Odczytaniu informacji zawartych w bakteriach