WYBRANE RODZAJE REAKCJI PCR. RAPD PCR Nested PCR Multipleks PCR Allelo-specyficzny PCR Real Time PCR

Transkrypt

1 RAPD PR Nested PR Allelo-specyficzny PR Real Time PR RAPD PR (Random Amplification of Polymorphic DNA) wykorzystywany gdy nie znamy sekwencji starterów; pozwala namnożyć losowe fragmenty o różnej długości; w reakcji stosuje się tylko jeden (losowy) starter. długość około 10 nukleotydów, zawartość par / musi być w granicach 50-80% nie może zawierać sekwencji palindromowych* 5 AATT 3 RAPD PR Tube A-08 -TATA- Tube A-09 -TAA- Tube A-10 -TATA- Tube A-11 -AATT- Tube A-12 -TATA- Tube A-13 -AAA- Tube A-14 -TTTT- Tube A-15 -TTAA- Tube A-16 -AAAA- Tube A-17 -ATTT- Tube A-18 -ATAT- 1

2 RAPD PR starter A-11 DNA starter A-11 RAPD PR SM Po amplifikacji z wybranym starterem otrzymujemy od kilku do kilkunastu fragmentów różnej długości dla danego osobnika (charakterystyczny wzór prążkowy) RAPD PR 2

3 Wewnętrzny/ Zagnieżdżony PR (Nested PR) wykorzystywany przy niespecyficznej amplifikacji fragmentu; pozwala namnożyć w dwuetapowej reakcji PR ściśle określony fragment; w reakcji stosuje się cztery lub trzy (semi-nested) startery. Nested PR Produkt niespecyficzny Produkt po drugiej reakcji PR Nested PR 3

4 Nested PR 1 2 M wykorzystywany do jednoczesnej amplifikacji wielu fragmentów w tej samej reakcji PR; w reakcji stosuje się do 20 par starterów znakowanych fluorescencyjnie; stosowany również jako kontrola w reakcjach bez produktu 4

5 1 M 1 M 5

6 M 1 M 6

7 Allelo-specyficzny PR (Allele Specific PR) wykorzystywany do wykrywania mutacji punktowych SNP; pozwala na selektywne przyłączanie się starterów w zależności od sekwencji matrycy w reakcji stosuje się trzy startery, w tym dwa znakowane fluorescencyjnie Allelo-specyficzny PR A allel 1 primer 1 produkt PR allel 2 primer 1 primer 1 brak produktu PR B allel 1 primer 2 brak produktu PR primer 2 allel 2 produkt PR primer 2 Allelo-specyficzny PR AA AB BB 7

8 PR w czasie rzeczywistym (Real Time PR) wykorzystywany obserwowania przyrostu produktu PR w czasie; pozwala na wykrycie amplifikacji na kilku kopiach matrycy; w reakcji stosuje się barwniki fluorescencyjne uwalniane lub włączane do nowopowstałych cząsteczek SYBR green- interkalacja SYBR reen Specyficzność reakcji zależna od starterów Nie umożliwia przeprowadzenia reakcji typu multipleks Umożliwia zaobserwowanie dodatkowych produktówprzy niespecyficznych starterach Zafałszowania w odczycie fluorescencji (dimery, wszystkie dwuniciowe konformacje)- wielkość wykrywanych produktów dla różnych genów musi być BARDZO ZBLIŻONA BARDZO TANIA! Aktywne fluorochromy Transfer energii rezonansu fluorescencji (Fluorescence Resonance Enetgy Transfer- FRET) 1. Przeniesienie emisji: fluorochrom pierwszy (zwany reporterem lub donorem) w wyniku wzbudzenia falą świetlą o odpowiedniej długości, przenosi energię na fluorochrom drugi (wygaszacz lub akceptor), który następnie emituje kwant światła o innej długości 8

9 Sondy- TaqMan TaqMan Specyficzność reakcji zależna od starterów i sondy Umożliwia przeprowadzenie reakcji typu multipleks Nie umożliwia zaobserwowania dodatkowych produktówprzy niespecyficznych starterach* NIE JEST TANIA ale przy zoptymalizowanej reakcji opłacalna 2. Wygaszenie emisji: Fluorochrom pierwszy (zwany reporterem lub donorem) jest wygaszany przez fluorochrom drugi (wygaszacz lub akceptor), który pochłania emisję fali reportera. Wzbudzenie emisji nastąpi dopiero po odłączeniu reportera od wygaszacza Rodzaje kontroli PR nazwa NT bez matrycy (No Target ontrol) efekt Kontrola czystości odczynników do reakcji PR P- Kontrola pozytywna (Positive ontrol) Kontrola właściwego przebiegu reakcji PR * IP wewnętrzna kontrola pozytywna (Internal Positive ontrol) Kontrola właściwego przebiegu reakcji PR ** Stosowana alternatywnie do P NA bez amplifikacji- (No Amplification ontrol) Kontrola z inhibitorem (wszystkie reagenty oraz matryca +inhibitor reakcji np. etanol)- kontrola jakości matrycy, czystości plastików oraz sprzętu 9