Metody: PCR, MLPA, Sekwencjonowanie, PCR-RLFP, PCR-Multiplex, PCR-ASO

Transkrypt

1 Diagnostyka molekularna Dr n.biol. Anna Wawrocka Strategia diagnostyki genetycznej: Aberracje chromosomowe: Metody:Analiza kariotypu, FISH, acgh, MLPA, QF-PCR Gen(y) znany Metody: PCR, MLPA, Sekwencjonowanie, PCR-RLFP, PCR-Multiplex, PCR-ASO Gen(y) nieznany Metody: Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS), Analiza sprzężeń, Klonowanie pozycyjne, Klonowanie funkcjonalne Źródła DNA/RNA: Krew obwodowa Fibroblasty Płyn owodniowy Kosmówka Szpik kostny Plemniki Włosy Fragmenty tkanek Metody izolacji RNA: Izolacja specyficznego RNA poprzez frakcjonowanie całkowitego RNA komórki Bezpośrednia izolacja specyficznego RNA, ograniczona do komórek syntetyzujących określony RNA w zwiększonej ilości Izolacja poli(a)rna Izolacja RNA z polirybosomów Izolacja całkowitego RNA komórki a następnie uzyskanie określonego RNA (cdna) metodą PCR. PCR-Łańcuchowa reakcja polimerazy: 1. Matryca DNA 2. Primery (primer forward, primer revers) 3. Polimeraza DNA

2 4. dntp s 5. Buffor Real Time PCR-PCR w czasie rzeczywistym Jest to metoda ilościowego oznaczania DNA. Pozwala na monitorowanie zmian stężenia produktu PCR poprzez pomiar fluorescencji proporcjonalnej do jego ilości w czasie trwania reakcji Zastosowania aplikacji real-time PCR: Ilościowe określanie ekspresji genów Testowanie stabilności genetycznej Wydajność terapii lekowych/monitorowanie leków Ilościowe określanie DNA wirusowego Detekcja patogenów Uszkodzenia DNA (niestabilność mikrosatelitarna) Określanie czasu ekspozycji na promieniowanie Obrazowanie in vivo procesów komórkowych Studia nad DNA mitochondrialnym Detekcja metylacji Detekcja inaktywacji chromosomu X Genotypowanie, analiza krzywej topnienia kwasów nukleinowych Wykrywanie trisomii, poszczególnych kopii jednogenowych Wykrywanie mikrodelecji Droplet Digital PCR PCR w wodno-emulsyjnej kropli. Analiza 8 pacjentów jednocześnie, dla każdej rekcji kropli o objętości 1 nanolitra. Zastosowanie: - Wykrywanie biomarkerów nowotworowych - Wykrywanie patogenów - Analiza CNV (copy numer variation) - Analiza ekspresji MLPA - Zależna od ligacji multipleksowa amplifikacja sond Detekcja zmian liczby kopii 45 genomowych sekwencji DNA w jednej, prostej do przeprowadzenia reakcji PCR.

3 Minimum 20 ng ludzkiego DNA lub ng RNA Analiza częściowo zdegradowanego DNA DNA ze skrawków parafinowych Tkanek w formalinie Płodowy DNA uzyskany z plazmy krwi matczynej. Rozróżnienie sekwencji które różnią się pojedynczym nukleotydem, detekcja znanych mutacji oraz SNP 45 różnych mrna Identyfikacja statusu metylacji promotorów wszystkie fragmenty są amplifikowane z wykorzystaniem pojedynczej pary starterów w reakcji PCR Wyjątkowość tej techniki polega na tym, że w reakcji nie jest amplifikowany DNA badanej próby, ale sondy, które są dodawane do próbki Sondy SALSA MLPA Pojedyńcza sonda MLPA zawiera dwa różne oligonukleotydy, każdy z nich zawiera sekwencje startera oraz sekwencje komplementarną do sekwencji docelowej. 4 etapy MLPA: 1. Hybrydyzacja Mieszanina sond MLPA jest dodawana do zdenaturowanego genomowego DNA Dwie części każdej sondy hybrydyzują do sekwencji docelowych (komplementarnych) 2. Ligacja Połączone w ten sposób sondy ulegaja ligacji (sondy, które nie uległy ligacji nie musza byc usuwane), wykorzystując termostabilną ligazę, a nastepnie amplifikację PCR. Liczba otrzymanych w ten sposób produktów wydłużonych sond zależy od liczby odpowiadajacych sobie docelowych sekwencji w próbce 3. Amplifikacja Do amplifikacji wszystkich sond została użyta uniwersalna para starterów. Produkt amplifikacji każdej sondy posiada unikalną wielkość ( pz). 4. Separacja i ocena ilościowa za pomocą elektroforezy kapilarnej Każdy pik jest produktem amplifikacji poszczególnych sond. Próby porównuje się do prób kontrolnych. Różnice w relatywnej wielkości piku (wysokość lub powierzchnia) wskazują zmianę liczby kopii badanej sekwencji.

4 Sekwencjonowanie 1. Sekwencjonowanie metodą Sangera 2. Sekwencjonowanie nowej generacji: Next generation sequencing (NGS)/Whole exome sequencing (WES) Zastosowanie NGS: - Wykrywanie mutacji - Analiza transkryptomu RNA seq - Badanie interakcji białko-dna/rna - Sprawdzanie stopnia metylacji - Sekwencjonowanie genomu Zalety NGS: Masowe równoległe sekwencjonowanie wielu próbek jednocześnie Niższy koszt analizy w stosunku do sekwencjonowania metodą Sangera Krótki czas uzyskania wyników QF-PCR - Quantitative fluorescence polymerase chain reaction Amplifikacja specyficznych regionów mikrosatelitarnych (wysoce polimorficznych krótkich powtórzeń tandemowych typu STR) z zastosowaniem fluorescencyjnych starterów w reakcji PCR Ilościowa ocena produktów po amplifikacji Szybka diagnostyka najczęstszych aneuploidii, np. 13, 18, 21 acgh - Technologia mikromacierzy arraycgh Stanowi przełom w diagnostyce genetycznej Umożliwia w jednym badaniu wykrycie wszystkich niezrównoważonych aberracji chromosomowych oraz submikroskopowych mikrodelecji i mikroduplikacji Nie wymaga hodowli komórek Krótki czas oczekiwania na wynik Hybrydyzacja wyznakowanego fluorescencyjnie DNA pacjenta do płytki mikromacierzy z naniesionymi sekwencjami DNA w postaci klonów BAC lub fragmentów oligonukleotydowych Rozdzielczość od 1Mpz do <100 kpz (?) Nie identyfikuje zmian zrównoważonych oraz poliploidii Czasami trudna interpretacja uzyskanych wyników Przykazania dobrej diagnostyki w genetyce klinicznej 1. U kobiety >35 roku życia nie wykonujemy kariotypu z racji wieku 2. U mężczyzny z pary po poronieniach nie wykonujemy rutynowo analizy CFTR ani AZF, badania te wykonujemy tylko w przypadkach oligozoospermii/azoospermii 3. U pary spokrewnionej nie wykonujemy kariotypów z racji spokrewnienia 4. Jeśli chcemy wykonać diagnostykę prenatalną w kierunku choroby jednogenowej musimy znać chorobę, gen i konkretną mutację 5. W przypadku aberracji liczby chromosomów u dziecka nie wykonujemy badań kariotypów u rodziców

5 6. W przypadku aberracji struktury u dziecka zawsze wykonujemy badania u rodziców (kariotyp lub FISH do chromosomów metafazowych) 7. FISH nie wykrywa zmian w genach 8. Mikromacierze nie wykrywają translokacji zrównoważonych. Nie stosujemy ich u zdrowych osób z niepowodzeniami rozrodu 9. Z martwej tkanki (martwo urodzonego płodu, kosmówki poronionego zarodka) nie robimy kariotypu (tylko mikromacierze, QF-PCR, MLPA)