Katedra Mikrobiologii PG Publikacja współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Transkrypt

1 Hybrydyzacja w diagnostyce molekularnej drhab Beata Krawczyk dr hab. Beata Krawczyk Katedra Mikrobiologii PG Publikacja współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

2 Techniki wykorzystujące własności kwasów nukleinowych Nukleotydowy skład genomu bakterii bk Określanie procentowego molowego składu guaniny i cytozyny (mol% G+C) w chromosomie bakterii. Wartość ta dla wszystkich bakterii waha się w przedziale od mol%. Sposoby określania wartości mol% G+C Kwasowa hd hydroliza DNA, rozdzielanie dil i zasad nukleotydów przy użyciu ż chromatografii bibułowej, a następnie elucja i określenie poszczególnych zasad Metoda pomiaru gęstości dynamicznej (ang. buoyant density method) poprzez wirowanie w gradiencie chlorku cezu Metodapomiarutermicznej termicznej denaturacjidna!!!

3 Genomowa hybrydyzacja jako narzędzie taksonomiczne (70.) Stopień hybrydyzacji odzwierciedla względny stopień podobieństwa Stopień reasocjacji RBR Relative Binding Ratio (80% komplementarności)

4 Ten sam gatunek Ten sam rodzaj, ale różny gatunek Różne rodzaje 1 X 1 1 X % 25% % hybrydyzacji Te same szczepy (kontrola) Różne gatunki w tym samum rodzaju

5 Gatunek w sensie genetycznym Analiza hybrydowego DNA stopień homologii jest tworzony na podstawie ilości ś i tworzonych hb hybrydów i ich termicznej stabilności (ΔTm Tm) 1% zmienności powoduje spadek T m o 1 1,5 C

6 Początek lat 60. XX wieku analiza genetyczna kwasów nukleinowych Określenie zawartości par G+C Bakterie Mol%G+C Eukariota Mol%G+C Clostridia Clostridium haemolyticus Bacillus spp. Staphylococcus spp. Proteus spp. Escherichia spp. Pseudomonas spp. Rhodospirillum ill spp Micrococcus spp. Myxobakterie 21 28% 28% 21% Gallus domesticus (kurczak) Equus caballus (koń) Homo sapiens Saccharomyces cerevisiae Aspergillus niger

7 Skład zasad G+C Maksymalna różnica w składzie zasad G+C wśród szczepów tego samego gatunku może wynosić 5 mol%, zaś wśród gatunków tego samego rodzaju mol%. Gdy występują większe różnice, to drobnoustroje nie należą do tego samego rodzaju.

8 Monitoring denaturacji DNA i renaturacji 1. DNA absorbuje światło ultrafioletowe (UV) przy 260 nm (A 260 ). 2. Denaturacja i renaturacja może być monitorowana przez zmiany w A ssdna wykazuje wyższą ą absorbancję A 260 niż dsdna natywne Tm zdenaturowane Temperatura

9 HYBRYDYZACJA KWASÓW NUKLEINOWYCH W ROZTWORZE

10 Różnice w stopniu renaturacji DNA homologicznego i heterologicznego służą do obliczania % podobieństwa (homologii) 2 różnych molekuł kwasów nukleinowych A A B B A B VA=ΔA/Δt VB=ΔA/Δt VAB=ΔA/Δt Stopieńp renaturacji (V) jest monitorowany spadkiem absorpcji przy A 260 nm. Homologiczne nici VA, VB renaturują szybciej niż nici heterologiczne VH. wg. wzoru podanego przez De Ley % podobieństwa = 4VH (VA + VB) x 100/2(VAVB) 1/2

11 Analiza hybrydowego DNA stopień homologii jest tworzony na podstawie ilości tworzonych hybrydów y i ich stabilności Stabilność hetrodupleksów Stabilność powstającego dwuniciowego kompleksu jest tym większa, im dłuższe odcinki nukleotydów wykazują komplementarność. Stabilność powstałego heterologicznego dupleksu określana jest na podstawie pomiaru Tm. Wartość ΔTm stosowana jest do oszacowania stopnia homologii DNA heterodupleksów (ang. mismatching base pair)

12 HYBRYDYZACJA NA PODŁOŻU STAŁYM

13 HYBRYDYZACJA Hybrydyzacja y y standardowa: Reverse nucleic hybridization sonda wyznakowana w assay znakowany target w roztworze, niewyznakowany roztworze, nieznakowana sonda target związany z fazą stałą związana ą z podłożem stałym

14 Rodzaj hybrydyzacji Dot blot Znakowana sonda w roztworze DNA lub RNA, często oligonukleotydy Niewyznakowany target związany z fazą stałą DNA czy RNA związane z podłożem (membraną) Southern blot Dowolne sondy Często genomowe DNA, trawione enzymem restrykcyjnym, rozdzielone elektroforetycznie i przeniesione na membranę (transfer) Northern blot Dowolne sondy Populacja RNA, może być rozdzielana Hybrydyzacja do chromosomu in situ Hybrydyzacja do tkanki in situ Przeważnie wyznakowane klony genomowego DNA Przeważnie wyznakowana antysensowna sonda rybosomalnegorna lub oligonukleotydy elektroforetycznie, transfer na membranę DNA chromosomu (często w metafazie) lizowanych komórek na szkiełku mikroskopowym RNA wewnątrz komórek budujących tkanki związane ze szkiełkiem mikroskopowym Hybrydyzacja do koloni in situ Dowolne sondy Komórki kolonie przeniesione na agar, potem na membranę Hybrydyzacja do łysinki in situ Dowolne sondy Łysinki z agaru przeniesione na membranę

15 Kwas nukleinowy UV lub temp. Immobilizacja do podłoża stałego Błony nylonowe lub nitrocelulozowe Zasada (DNA), formalina Denaturacja (RNA) chemiczna Albumina, homogenne mleko Pre hybrydyzacja Zdenaturowana sonda hybrydyzacja Płukanie membrany

16 target mieszanina różnych fragmentów Sonda DNA, homogenna i wyznakowana denaturacja Mixi i renaturacja Renaturacja hybrydowego DNA Heterodupleksy target sonda Renaturacja sondy

17 Sondy genetyczne Sondy olingonukleotydowe Sondy polinukleotydowe Sondy jednego locus Sondy wielu loci Środowisko hybrydyzacji ma większy wpływ na Środowisko hybrydyzacji ma większy wpływ na krótsze sondy niż na sondy dłuższe

18 Charakterystyka sond i ich wielkość Sondy hybrydyzacyjne typ DNA RNA oligonukleotydy Źródło pochodzenia DNA komórkowe klonowanie lub PCR Transkrypcja insertu po klonowaniu do odpowiedniego d wektora Syntez chemiczna charakterystyka ds DNA; od 0,1 do kilkuset kpz dla konwencjonalnych klonów DNA; 0,1 do 20 i > kpzdla produktów PCR ssdna ; długość do kilku tysięcy zasad ssdna; nt znakowanie Synteza DNA przez polimerazę DNA Transkrypcja z klonowanego DNA Wyznakowane końce ń przez kinazę polinukleotydową

19 Znakowanie sonddna i RNA Znakowanie nowych nici podczas syntezy in vitro DNA lub RNA przemieszczanie i pęknięć ć (ang.nick translation) ikt ti znakowanie metodą wydłużania startera (ang. random primed labeling) za pośrednictwem PCR fotoznakowanie znakowanie RNA w systemie transkrypcji in vitro

20 Znakowanie sonddna i RNA Znakowanie końców 5 Z użyciem alkalicznej fosfatazy Metodą wymiany 5 końcowego fosforanu Znakowanie końców 3 Z użyciem terminalnej transferazy dla krótkich oligonukleotydów

21 Hybrydyzacja kanapkowa B A M I A B H A sonda nieznakowana; B sonda znakowana; Hybryd (A B) przyłączony do identyfikowanego kwasu nukleinowego; M membrana; I identyfikowany kwas nukleinowy

22 Hybrydyzacja w wyniku konkurencji między sondami B A M I B I A Z A sonda nieznakowana; B sonda znakowana; Z Hybryd (A I) ; M membrana; I identyfikowany kwas nukleinowy

23 Radioaktywna Fluorymetryczna Kolorymetryczna Komórkizwiązane związanedo do Komórki filtra filtra Liza komórek i denaturacja DNA Liza komórek Związaniei izolacja wyznakowanej DNA Pomiar hybrydyzacji sondy Wykorzystanie klinicznej W k t i hybrydyzacji h b d ji w diagnostyce di t kli i j

24 Legenda: Sonda reporterowa (ang.reporter probe) AAAA Sonda wychwytująca (ang. Capture probe) Test paskowy Liza i denaturacja próbki w NaOH Sonda AAAA AAAA Region komplementarny do targetu DNA Hybrydyzacja DNA z próbki do sondy w roztworze Niszczenie niezhybrydyzowanych sond przez nukleazy Target DNA T T T T AAAA T T T T AAAA T T T T AAAA Zastosowanie sond kwasów nukleinowych w diagnostyce klinicznej na przykładzie testu paskowego (ang. dipstick assay). Sonda zawiera część reporterową i część wychwytującą interesujący nas target. Sonda wychwytującą posiada ogon poli-da, który hybrydyzuje z oligonukleotydem poli-dt związanym z paskiem.

25 Hybrydyzacja do koloni Hbrd Hybrydyzacja acjado pojedynczej ej komórki bakterii

26 Techniki blottingu DOT kropka SPLOT plamka, punkcik SLOT szczelina, otwór Southern blotting northern blotting Reakcje hybrydyzacji blotting są wysoce swoiste, ich zasada polega na zastosowaniu jednoniciowego kwasu nukleinowego (DNA, RNA) sondy, który komplementarnie wiąże się z DNA lub RNA znajdującym się w próbie badanej.

27 1 2 3 Cięcie restryktazą Rozdział elektroforetyczny (agaroza) Transfer lub Blot fragmentów DNA na membranę Sonda Membrana z fragmentami DNA Inkubacja membrany z radioaktywną sondą Ekspozycja na kliszę RTG

28 Zastosowanie technik hybrydyzacyjnych 1. Wk Wykrywanie specyficznych fragmentów DNA do: Analizy porównawczej róznych szczepów bakteryjnych W diagnostyce chorób genetycznych 2. Do ustalenia sekwencji ulegającej ekspresji (northern hybrydyzacja) 3. Hybrydyzacja zoo do badania pokrewieństwa międzygatunkowego 4. Hybrydyzacja in situ do określenia miejsca genów na chromosomie (mapowanie) do wizualizacji komórek, w których dochodzi do syntezy określonego rodzaju mrna 5. Hybrydyzacja in situ FISH

29 Sonda molekularna Zasada sondowania DNA Wynik hybrydyzacji DNA pocięte enzymem restrykcyjnym c C Allelel 1.1 Układ homoalleliczny a b a b Układ homoalleliczny Allele 2.2 a b Układ c hetroalleliczny b Allele c 1.2 b

30 matki ojca Hybrydyzacja in situ Określanie miejsca genów na chromosomie; użyto 6 sond do oznaczenia komplementarnych do nichsekwencji na chromosomie piątym. Każda sonda daje 2 plamki, bo chromosomy zakończyły replikację. Wizualizacja komórek, w których doszło do syntezy mrna cyklin białek wyzwalających podziały komórkowe Rys. Bruce Alberts Podstawy biologii komórki

31 Fiber FISH Wykorzystuje chemiczne i fizyczne działania na chromosomach interfazalnych, rozluźniające i prostujące włókna chromatyny, obrazowane mogą być pojedyncze pętle DNA (ok pz). Może odróżnić sondy oddalone od siebie o kilkakpz kpz. Widmowa analiza chromosomowa

32 Porównawcza hybrydyzacjagenomowa (CGH) Technika, w której w sposób zróżnicowany oznakowane DNA, pochodzące ą ze źródła badanego i kontrolnego hybrydyzuje do prawidłowych chromosomów w metafazie pozwala to na wykrywanie duplikacji i delecji

33 Technologie miniaturyzacji

34 Mikromacierze DNA 1999 rpowstały ł mikromacierze i dotyczą analizy ekspresji genów np. w zmienionej chorobowo i w zdrowej tkance W odróżnieniu od tradycyjnych technik, na podłożu stałym (np. szklana płyta, plastikowa) umieszczane są sondy (kilkadziesiąt ą tys.) DNA reprezentujące interesujące nas geny. Znakowana jest z kolei próba pochodząca z badanego materiału biologicznego.

35 Mikromacierze DNA cdna można ang. cdna array fragmenty cdna pełnią rolę sond kilkusetnukleotydowe można wykorzystać do analizy ekspresji genów o nieznanej lub częściowo znanej sekwencji Chip ang. oligo array sondy otrzymane na drodze syntetycznej kóki krótkie (25 70 pz ); DNA wymagają znajomości sekwencji analizowanych genów zastosowanie dla genomów dobrze scharakteryzowanych

36 Mikromacierze oligonukleotydowe firmy Affymetrix

37 Schemat przebiegu eksperymentu z wykorzystaniem mikromacierzy cdna Konstrukcja mikromacierzy cdna Selekcja klonów Amplifikacja A lifik j i oczyszczanie Drukowanie Mikromacierz cdna Znakowanie prób i hybrydyzacja Tkanka kontrolna RNA1 Odwrotna yp j transkrypcja ssdna CY3 + Tkanka badana RNA2 Odwrotna transkrypcja Zbiór i analiza danych ssdna CY5

38 mikromacierz i cdna

39 Schemat przebiegu eksperymentu z wykorzystaniem chipów DNA Konstrukcja Chip DNA Banki sekwencji P j k Projektowanie i sond oligonukleotydowych Synteza na mikromacierzy Przygotowanie próby i hybrydyzacja Badana tkanka Izolacja RNA Odwrotna transkrypcja i amplifikacja cdna Znakowanie zbiór i analiza danych Znakowanie, Chip Streptawidyna + Fikoerytryna Transkrypcja in vitro biotynylacja Antysensowne RNA crna

40 Mikromacierze mają zastosowanie dobadania ekspresji genów najczęściej stosowane sondy w obrębie sekwencji mrna mikromacierze eksonowe (sondy to sekwencje eksonów) mikromacierze pokrywające genom do badania ekspresji obszarów pozagenowych mikromacierze do badania splicingu (ang. splicing array) badamie ekspresji różnych form splicingowych tego samego genu Genom genów Transkryptom: transkryptów Proteom: białek Geny (DNA) Transkrypty genów (mrna) Białka Badania profilu ekspresji genów dotyczą transkryptomu komórki

41 Zastosowanie mikromacierzy dachówkowych Weryfikacja położenia i struktury genów Mapowanie transkryptomów Wykrywanie y nowych miejsc aktywnych y transkrypcyjnie, nie kodujących białka Wykrywanie nowych genów, eksonów, wydłużonych y regionów UTR Wykrywanie genów ulegających aktywacji lub supresji Badanie funkcji genów Badania porównawcze Poszukiwanie genów o wspólnych profilach ekspresji Badanie regulacji ekspresji genów w komórce Wpływ nc RNA Wpływ metylacji DNA Poszukiwanie miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych Wpływ transkryptów antysensownych

42 formaldehyd Ultradźwięki Próba referencyjna Brak Immunoprecypitacji Genomowe DNA Związanie białek z DNA Fragmentacja DNA ( pz) Próba badana Separacja kompleksu DNA białko Immunoprecypitacja specyficznym przeciwciałem Usuwanie białek Usuwanie białek od DNA Znakowanie fluorescencyjne A Hybrydyzacja do mikromacierzy Znakowanie fluorescencyjne B Skanowanie i analiza

43 Wady Problemy z analizą danych z mikromacierzy polegają na ogromnej liczbie sond i badanych genów (zazwyczaj ok tysięcy transkryptów, macierze eksonowe w 2006 r. zawierają 6 milionów sond). Jednocześnie liczba mikromacierzy użytych w eksperymencie jest stosunkowo nieduża (kilka kilkadziesiąt) wysokie koszty