KŁOPOTY Z POLIMERAZĄ KŁOPOTY Z POLIMERAZĄ KŁOPOTY Z POLIMERAZĄ. SPECYFICZNOŚĆ (Specificity)

Transkrypt

1 - Specyficzność (specyficzne wiązanie się TYLKO do startera- wcześniej związanego z matrycą) - Termostabilność (utrzymanie aktywności pomimo powtarzającego się cyklicznie wzrostu temperatury) - Wierność (przyłączanie DOKŁADNIE tych nukleotydów, które odpowiadają matrycy- zdolność do dokładnego replikowania sekwencji) - Wydajność (wydłużanie nici w niezmienionym tempie podczas całej reakcji) Ilość polimerazy podawana jest w jednostkach (unitach) 1U- ilość enzymu, która wbuduje 10 nmoli dntp w cząsteczkę kwasu nukleinowego w ciągu 30 minut w temperaturze 74 o C SPECYFICZNOŚĆ (Specificity) Polimeraza umieszczona w probówce razem z matrycą i wszystkimi pozostałymi substratami wykazuje aktywność enzymatyczną i może w sposób nieprecyzyjny dołączać kolejne nukleotydy. Kiedy ma to miejsce? Przed wstawieniem reakcji: do termocyklera, podczas pracy w komorze lamineranej przy zbyt wysokiej temperaturzepodczas przygotowywania trzymaj całą reakcję i wszystkie odczynniki NA LODZIE!!! W czasie trwania reakcji: gdy zmiany temperatur w zakresie hybrydyzacja- elongacja w termocyklerze zachodzą zbyt wolno korzystaj z dobrych (walidowanych) termocyklerów W 1994r opracowano pierwszy system blokujący polimerazę przed denaturacją matrycy. Blokada enzymatyczna (przeciwciała) Polimeraza złączona z ze specyficznymi przeciwciałami. Aby usunąć przeciwciało potrzebne jest wydłużenie czasu pierwszej denaturacji w temperaturze >90 o C Przeciwciała są niszczone przy pierwszej denaturacjinie mają możliwości powtórnego związania się z enzymem Wydłużenie wstępnej denaturacji z 3 do 10 (15min) może uszkodzić matrycę słabej jakości 1

2 Polimeraza Taq standard Polimeraza Taq Hot-start Właściwy amplikon Produkty niespecyficzne Blokada enzymatyczna (pirofosfataza) - Pirofosforan to dwie reszty fosforanowe. W Warunkach naturalnych jest uwalniany w stosunku jedna cząsteczka pirofosforanu na jeden włączany do łańcucha nukleozydotrójfosforan - Ma wysokie powinowactwo do jonów magnezu MgCl 2 - Dodany do mieszaniny reakcyjnej PRZED syntezą wiąże jony magnezu uniemożliwiając włączanie (inkorporację) nowych nukleotydów - Pirofosfataza to enzym, który hydrolizuje pirofosforan na dwie reszty fosforanowe i uwalniając MgCl 2 umożliwiając polimerazie syntezę - Aktywność pirofosfatazy to temperatura >70 o C - Ten sposób blokowania polimerazy nie wymaga przedłużonego czasu denaturacji wstępnej - Nie nadaje się do reakcji PCR wykorzystującej pomiar uwalnianych cząsteczek pirofosforanu Aktywna pirofosfataza hydrolizuje cząsteczkę pirofosforanu uwalniając jony magnezu Pirofosforan (PPi) z jonami magnezu Denaturacja wstępna 2

3 Anty Taq DNA aptamery - Aptamery to oligonukleotydy, które wiążą się specyficznie z określoną cząsteczką - W warunkach naturalnych stanowią część łańcucha mrna, która wiąże się z metabolitem - Do reakcji PCR aptamery syntezowane są in vitro, mają niską masę cząsteczkową, nie ulegają zniszczeniu (jak przeciwciała) przy denaturacji i wiążą się specyficznie z cząsteczką Taq polimerazy - Aptamery stanowią składnik mieszaniny reakcyjnej. Są związane z polimerazą zmieniając trzeciorzędową strukturę zależną od temperatury- hamują jej aktywność - Dysocjują w temperaturze >50 o C WIERNOŚĆ (Fidelity) Odwrotność współczynnika błędu 1/ wskaźnik błędu Wskaźnik błędu- liczba błędnie wprowadzonych nukleotydów na całkowitą liczbę spolimeryzowanych nukleotydów- długość amplikonu Wierne polimerazy otrzymywane są na drodze ukierunkowanej ewolucji. Wierność polimerazy obniża jej wydajność! 3

4 WYDAJNOŚĆ (Processivity) Liczba nukleotydów przetwarzanych w pojedynczym zdarzeniu wiążącym (cyklu). Odzwierciedla szybkość syntezy i powinowactwo do substratów. Polimerazy o dużej wydajności wykorzystywane są do amplifikacji: długich matryc struktur drugorzędowych bogatych w pary GC (wysoka kinetyka łączenia zasad) matryc, w których mogą wystąpić naturalne inhibitory enzymówgłównie polisacharydy: - heparyna (polisacharyd- składnik krwi) - ksylan (polisacharyd- składnik ściany komórkowej) - kwas huminowy rozpuszczalny w alkoholu związek organicznygleba, woda o W reakcji PCR powiela się fragment, który zostanie zamknięty między dwoma starterami hybrydyzującymi do obu nici o W standardowej i optymalnej reakcji PCR używa się dwóch różnych starterów- każdy starter powinien mieć TYLKO JEDNO specyficzne miejsce hybrydyzacji TYLKO Z JEDNĄ nicią o Aby zaprojektować starter trzeba znać sekwencję (kolejność zasad) fragmentu, który chcemy zamplifikować o Aby poznać sekwencję danego fragmentu musimy go najpierw zamplifikować. - Oligonukleotydy Długość: zasad Procent zasad G/C: (optimum- 50) Temperatura topnienia (Tm) Melting Temperature to temperatura dysocjacji dupleksu starter-matryca- powinna być identyczna lub bardzo zbliżona Temperaturę topnienia oligonukleotydu można obliczyć wg różnych reguł: reguła 2+4 Tm=2 o C(A+T)+4 o C(G+C) 5 -ATA GGT CTA ACC TGG TTC CAG-3 A+T=11; G+C=10 Tm= 2*11+4*10=22+40=66 o C reguła fizyczna (termodynamiczna), uwzględniająca zjawiska entalpii i entropii oraz stężenie soli poszczególnych jonów (Na+) oraz % poszczególnych zasad 5 -ATA GGT CTA ACC TGG TTC CAG-3 Tm=59,5 o C 4

5 Dopasowanie do matrycy (maximum complementarity) Mamy 4 możliwe nukleotydy A,C,G,T Prawdopodobieństwo przyłączenia do matrycy każdego z nich wynosi tyle samo:0.25 (1/4) zdarzenie Prawdopodobieństwo A 0.25 = 0.25 AT 0.25 x 0.25 = ATA 0.25 x 0.25 x 0.25 = ATAGG (0.25) 5 = ATAGGTCTAAC (0.25) 11 = ATAGGTCTAACCTGGT (0.25) 16 = Wraz z wydłużaniem się sekwencji startera spada prawdopodobieństwo jego przyłączenia w miejscu innym, niż zaplanowane Dopasowanie do matrycy (maximum complementarity) 5 -AGCGCTTCATCCTAAGAAGC-3 3 -TCGCGAAGTAGGATTCTTCGTAGGCATAGCAC-3 oligonukleotyd matryca 5 -AGCACTTCATCCTACGAAGC-3 3 -TCGCGAAGT-GGATTCTTCGTAGGCATAGCAC-3 5 -AGCRCTTCATCCTAAGAAGC-3 3 -TCGCGAAGT-GGATTCTTCGTAGGCATAGCAC-3 oligonukleotyd matryca oligonukleotyd zdegenerowany matryca 5 -AGCRCTTCATCCTAAGAAGC-3 5 -AGCACTTCATCCTAAGAAGC-3 5 -AGCGCTTCATCCTAAGAAGC-3 Komplementarność końców 3 (3 -maximum complementarity)- startery muszą wykazywać dopasowanie na końcu 3 do matrycy, ale nie mogą wykazywać dopasowania do drugiego startera z pary! Tworzą wtedy struktury dimeryczne (primer dimer) 5 -AGCGCTTCATCCTAAGAAGC-3 3 -TCGCGAAGTAGGATTCTTCTTAGGCATAGCAC-3 Starter F: 5 -GCTTAGCTTTGCATG-3 Starter R: 5 -AGCATGCAAAGCTTA-3 Starter R: 5 -AGCATGCAAAGCTTA-3 Starter F: 5 -GCTTAGCTTTGCATG-3 5

6 Stabilność końców 3 (3 -terminal stability)- dotyczy pięciu ostatnich zasad od końca 3, które determinują dopasowanie startera do matrycy. Stabilność określa parametr δg (kcal/mol)- tabela parametrów termodynamicznych i pokazuje siłę wiązania się startera z matrycą. Koniec (GCGCG) będzie wykazywał zawsze ok 6x większą stabilność od końca (TATAT) i może wiązać się z matrycą niespecyficznie! Dlatego należy unikać nagromadzenia zasad G/C na końcach 3 starterów nie mogą tworzyć struktur spinki do włosów (hairpin) 5 -AGCGCTTCCCCCCCCCAGCGCT-3 5 -AGCGCT CCCC C C 3 -TCGCGA CCC C - modyfikacje MODYFIKATORY UŁATWIAJĄCE PRZYŁĄCZANIE Modyfikatory aminowe (koniec 5 ). Są stosowane do mocowania ligandów do oligonukleotydów i łączenia oligonukleotydów ze stałymi powierzchniami, powinny być łatwo usuwalne Dodatkowa grupa fosforanowa (koniec 5 ). 5'-fosforan stosuje się do ligacji, jako łącznik i adapter, i ułatwia pobieranie komórkowe oligonukleotydów MODYFIKATORY UŁATWIAJĄCE WIĄZANIE Biotyna (koniec 3 ), Digoxygenina (koniec 5 lub 3 ). Wiążą się ściśle ze streptawidyną lub aodpowiednimi przeciwciałami (stosowane w testach, takich jak ELISA) INNE Barwniki fluorescencyjne (koniec 5 ). Ich zadaniem jest emitowanie światła o określonej długości fali, które pozwoli na detekcję produktu PCR Analogi zasad (koniec 3 ). Ich zadaniem jest hamowanie polimerazy DNA lub topoizomerazy 6