Stowarzyszenie na Rzecz Dzieci z Zaburzeniami Genetycznymi Badania molekularne

Transkrypt

1 Techniki molekularne z przykładami Jedną z podstawowych technik wykorzystywanych w genetyce molekularnej jest RFLP (ang. restriction fragments length polymorphism, czyli polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych). RFLP polega na analizie polimorfizmu, czyli różnic długości fragmentów DNA powstałych na skutek oddziaływania enzymu restrykcyjnego na cząsteczkę badanego DNA. Genomowy DNA badanej osoby przecinany jest przez enzym restrykcyjny z grupy endonukleaz w określonych miejscach restrykcyjnych, o charakterystycznej sekwencji nukleotydów, precyzyjnie rozpoznawanej przez enzym restrykcyjny. W zależności od liczby miejsc restrykcyjnych w DNA i odległości między nimi, po analizie restrykcyjnej otrzymujemy określoną liczbę fragmentów restrykcyjnych o adekwatnej długości. Zastosowanie RFLP polega na analizie polimorfizmu badanego DNA, jak również pośrednio na wykrywaniu mutacji. W przypadku mutacji dotyczącej miejsca restrykcyjnego może nastąpić zmiana w sekwencji DNA, której konsekwencją jest zanik lub pojawienie się dodatkowego miejsca restrykcyjnego, w zależności od typu mutacji. Obserwujemy to w postaci zmienionej liczby fragmentów DNA powstałych po analizie restrykcyjnej. Gdy mutacja nie dotyczy miejsca restrykcyjnego i ma charakter dużej (powyżej 50 pz) insercji lub delecji, można ją wyodrębnić na podstawie zmienionej długości fragmentu, w obrębie którego miała miejsce. Długość fragmentów DNA otrzymanych po działaniu enzymu restrykcyjnego na cząsteczkę DNA określa się na podstawie rozdziału elektroforetycznego w żelach agarozowych, w obecności markerów wielkości. Technika RFLP stanowi pierwszy etap techniki Southerna (ang. Southern blotting). Jest to hybrydyzacja, zastosowana po raz pierwszy przez Southerna w 1975 r. w celu identyfikacji określonego fragmentu DNA w materiale badanym. Polega na rozdziale fragmentów restrykcyjnych DNA w żelu agarozowym, przeniesieniu na filtr nitrocelulozowy i denaturacji in situ. Jednoniciowe fragmenty DNA na filtrze zostają poddane hybrydyzacji (tworzą stabilną dwuniciową strukturę) z wyznakowaną sondą, a następnie po odpłukaniu i wysuszeniu filtru przeprowadza się autoradiografię. Sondy molekularne stosowane w badaniach genomowego DNA są to oligonukleotydy (jednoniciowe fragmenty DNA) komplementarne do sekwencji, którą zamierzamy zidentyfikować. Sonda molekularna przed hybrydyzacją zostaje wyznakowana radioaktywnie izotopami 32P lub 35S. Stosuje się również nieradioaktywne znakowanie biotyną lub związkami fluoryzującymi. Miejsca gdzie przyłączyła się sonda molekularna są widoczne na kliszy fotograficznej w postaci prążków. Ważnym momentem w diagnostyce molekularnej stało się opracowanie reakcji PCR (ang. polymerase chain reaction, czyli łańcuchowa reakcja polimerazy), która pozwala przy użyciu enzymu - termostabilnej polimerazy DNA - zamplifikować, czyli zwielokrotnić odcinek DNA znajdujący się między parą starterów (ang. primers). Startery są krótkimi, jednoniciowymi fragmentami DNA, komplementarnymi do obydwu nici matrycy, którą stanowi cząsteczka badanego DNA. Reakcja PCR przebiega przy nadmiarze starterów, które hybrydyzują ze zdenaturowaną matrycą w temperaturze 55-65oC, wydłużanie starterów (dobudowywanie kolejnych nukleotydów komplementarnych do matrycy) zachodzi w 72oC, natomiast denaturacja (zerwanie wiązań wodorowych i uzyskanie pojedynczych nici) matrycy i powstałych produktów zachodzi w temperaturze 94oC. Reakcja PCR składa się najczęściej z 30 powtarzających się cykli i przeprowadzana jest w urządzeniu zwanym termocyklerem. Pojedynczy cykl trwa zwykle nie dłużej niż 3 minuty, a powstające produkty służą jako matryce w cyklu następnym. Metoda PCR pozwala na zwielokrotnienie (nawet miliardkrotne) niewielkich ilości DNA przed dalszą analizą i jest metodą wyjściową dla większości badań. Można między innymi w obrębie zamplifikowanych fragmentów poszukiwać mutacji czyli zmian w sekwencji DNA, które stanowią podłoże wielu chorób dziedzicznych. Podstawową zaletą tej metody jest szybkość (około 2,5 godziny) i pełna automatyzacja, ponadto nie wymaga ona stosowania radioizotopów. Warunkiem jej zastosowania jest znajomość sekwencji fragmentu DNA, który chcemy zamplifikować przynajmniej w strona 1 / 8

2 obrębie starterów. Metoda SSCP (ang. single strand conformation polymorphism, czyli polimorfizm konformacji jednoniciowych fragmentów DNA) jest oparta na obserwacji, że nawet mutacja punktowa zmienia konformację (czyli strukturę przestrzenną) pojedynczej nici DNA. W konsekwencji, zmieniona konformacja powoduje, że dany fragment DNA migruje w czasie elektroforezy w żelu poliakrylamidowym odmiennie od fragmentu, w którym nie występuje mutacja. Tak więc, w przypadku analizy produktów reakcji PCR odpowiadających badanemu fragmentowi DNA, migracja jednej z nici DNA danego pacjenta w sposób odmienny od analogicznych nici osób z grupy kontrolnej, wskazuje na obecność mutacji lub na polimorfizm badanego regionu. Głównymi czynnikami wpływającymi na wykrywalność mutacji tą metodą, szacowaną na około 90% są: długość analizowanego fragmentu (która nie powinna przekraczać 200 par zasad) oraz jego struktura. Metoda analizy heterodupleksów (HA - ang. heteroduplex analysis) jest również wykorzystywana do poszukiwania mutacji i stanowi bardzo dobre uzupełnienie metody SSCP. Oparta jest na różnicy w migracji dwuniciowych fragmentów DNA w żelu poliakrylamidowym, związanej z ich odmienną konformacją. Dwuniciowe fragmenty DNA, w przypadku gdy matrycą do reakcji PCR był jednocześnie prawidłowy i zmutowany typ badanego fragmentu DNA, to tzw. homodupleksy i heterodupleksy tworzone podczas ostatniego cyklu PCR między nićmi prawidłowymi i zmutowanymi. W przypadku braku mutacji, heterodupleksy nie tworzą się, a na żelu poliakrylamidowym obserwujemy tylko homodupleksy. Obydwie procedury SSCP i HA użyte jednocześnie do analizy mutacji punktowych zwiększają możliwość ich wykrycia do 99%. Ponadto, w diagnostyce molekularnej stosowanych jest wiele odmian i wariantów technik SSCP i HA, których szczegółowe omówienie przekracza jednak ramy tego opracowania. Sekwencjownowanie DNA jest najdokładniejszą metodą pozwalającą na przeanalizowanie sekwencji nukleotydów w odcinku DNA liczącym par zasad. W diagnostyce medycznej pozwala na detekcję wszystkich mutacji dotyczących sekwencji DNA, a ponadto umożliwia poznanie sekwencji nowych genów. Procedura sekwencjonowania opisana przez zespół F. Sangera polega na analizie produktów syntezy in vitro DNA na jednoniciowej matrycy, począwszy od przygotowanego oligonukleotydowego startera, komplementarnego do końca 3' matrycy. W skład czterech mieszanin reakcyjnych wchodzą cztery różne dideoksytrifosforany nukleotydów (ddntp), powodujące terminację syntezy w pozycji w której zostaną włączone do rosnącej nici. Nukleotydy terminujące dodawane są w takim stężeniu, aby były włączane do syntetyzowanej nici stosunkowo rzadko, co sprawia, że w końcowej mieszaninie reakcyjnej powstaje zestaw fragmentów DNA, kończących się danym nukleotydem terminującym, o długości rosnącej stopniowo po jednym nukleotydzie. Sanger i wsp. wykorzystywali nukleotydy blokujące reakcję znakowane radioaktywnie i odczytywali sekwencję DNA z klisz po autoradiografii. Obecnie coraz częściej stosuje się znakowanie nieradioaktywne i automatyczny odczyt sekwencji przy pomocy czytnika laserowego, który jest sprzężony z komputerem. Dzięki odpowiedniemu oprogramowaniu otrzymujemy gotowy wydruk analizowanej sekwencji. Strategia postępowania Jak wynika z powyższego, skrótowego przedstawienia dostępnych w genetyce molekularnej podstawowych technik diagnostyczno-badawczych, genetyk kliniczny posiada szeroki arsenał środków mogących posłużyć do identyfikacji nieprawidłowości materiału genetycznego. Musi on jednak zawsze przemyśleć strategię postępowania najodpowiedniejszą do danego przypadku klinicznego. Skomplikowanie nowoczesnych metod diagnostyki genetycznej jest jednak tak duże, że genetyk kliniczny na co dzień współpracuje zarówno z cytogenetykami, jak i biologami molekularnymi. W przypadkach podejrzenia aberracji chromosomowych, podejmuje się w pierwszej kolejności standardowe badanie chromosomów metafazowych, barwionych techniką GTG (prążki G). W przypadku niektórych wątpliwości diagnostycznych w aberracjach struktury chromosomów, pomocne bywa zastosowanie innych technik barwienia chromosomów, a przede wszystkim analizy chromosomów prometafazowych, czyli techniki badania cytogenetycznego o wysokiej rozdzielczości (HRBT - ang. high resolution banding technique). Ostatecznym narzędziem badań cytogenetycznych, pozwalającym na pewną identyfikację np. materiału translokacyjnego lub chromosomów strona 2 / 8

3 markerowych jest flurescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH - ang. fluorescent in situ hybridization). Technika ta łączy klasyczną cytogenetykę z biologią molekularną. Pozwala bowiem, z wykorzystaniem systemów komputerowej analizy obrazu mikroskopowego, na diagnostykę chorób powodowanych większymi mutacjami genowymi - np. duplikacjami lub delecjami dużych fragmentów genów (jak ma to miejsce np. w chorobie Charcot-Marie-Tooth). Tak więc klasyczne narzędzie cytogenetyczne, jakim jest mikroskop optyczny, pozwala w takich okolicznościach na diagnostykę wybranych chorób jednogenowych. Tym niemniej, w większości chorób jednogenowych, jedyną strategią diagnostyczną jest stosowanie technik biologii molekularnej. Obecnie, w przypadkach genów sklonowanych (a więc o znanej sekwencji) rutynowym postępowaniem jest wyizolowanie DNA, a następnie amplifikacja wybranego do diagnostyki fragmentu przy pomocy reakcji PCR. Za optymalne postępowanie zmierzające do identyfikacji nieznanej mutacji uznawane jest łączne wykorzystanie techniki SSCP i analizy heterodupleksów, a następnie sekwencjonowanie fragmentów DNA zidentyfikowanych w powyższy sposób, jako posiadające zmiany w sekwencji DNA. W przypadkach poszukiwania znanych mutacji (np. najpopularniejszych w danej populacji mutacji powodujących daną chorobę) stosowane są często gotowe zestawy diagnostyczne, wykorzystujące często stosunkowo najprostszą technikę PCR-RFLP lub inne spośród wyżej wymienionych technik biologii molekularnej. W przypadkach genów, które nie zostały dotąd sklonowane, a jedynie zmapowane (czyli poznano ich lokalizację chromosomową) możliwe jest jedynie wykorzystanie technik pośrednich, polegających na tzw. analizie sprzężeń występowania choroby u członków kilkupokoleniowej rodziny z obecnością u nich polimorficznych markerów DNA, zlokalizowanych w sąsiedztwie genu powodującego chorobę. Jak dotąd jednak, większość genów powodujących u człowieka choroby jednogenowe, nie zostało sklonowanych, ani zmapowanych. Stąd też, w większości przypadków chorób i zespołów jednogenowych diagnostyka molekularna nadal nie jest dostępna. Sytuacja ta jednak, z całą pewnością zmieni się gwałtownie w ciągu kilku najbliższych lat ze względu na intensywność prowadzonych badań. Ważniejsze zespoły dysmorficzne, dla których sklonowano geny przyczynowe i poznano ich mutacje, wraz z podaniem lokalizacji chromosomowej genów. Gen Lokalizacja chromosomów Achondroplazja i dysplazja tanatoforyczna FGFR3 4p16.3 Dysplazja kamptomeliczna SOX9 17q24.3-q25.1 strona 3 / 8

4 Dysplazja diastroficzna DTDST 5q32-q33.1 Zespoły kraniosynostoz: - Aperta - Crouzona - Pfeiffera - Jackson-Weiss FGFR2 10q26 Pfeiffera FGFR1 8p11.2-p11.1 Saethre-Chotzen TWIST 7p21 Kraniosynostoza typu Boston MSX2 5q43-q35 Marfana FBN1 15q21.1 Sticklera i dysplazja Kniesta COL2A1 strona 4 / 8

5 12q13.11-q13.12 Sticklera i zespół Marshalla COL11A1 1p21 Sticklera i zespół Insley-Astley COL11A2 6p21.3 Angelmana UBE3A 15q11-q13 Martina-Bella (łamliwego chromosomu X) FMR1 Xq27.3 Beckwith-Wiedemann IGF2 11p15.5 Holt-Oram TBX5 12q24.1 WAGR i zespół Denys-Drash WT1 strona 5 / 8

6 11p13 Simpson-Golabi-Behmel GPC3 Xq26 Waardenburg typu I PAX3 2q35 Waardenburg typu II MITF 3p14.1-p12.3 Riegera PITX2 4q25-q26 Aarskog FGD1 Xp11.21 Ellis van Creveld EVC 4p16 Cockayne ERCC3 ERCC5 ERCC6 CKN1 strona 6 / 8

7 2q21 13q33 10q11 chromosom 5 Bloom BLM 15q26.1 Treacher-Collins TCOF1 5q32-q33.1 Greiga i zespół Palister-Hall GLI3 7p13 Smith-Lemli-Opitz DHCR7 11q12-q13 Rubinstein-Taybi CREBBP 16p13.3 Williamsa LIMK1 7q11.23 Chondrodysplasia punctata strona 7 / 8

8 ARSE Xp22.3 Coffin-Lowry RSK2 Xp22.2-p22.1 Wodogłowie sprzężone z chromosomem X L1CAM Xq28 Polisyndaktylia HOXD13 2q31-q32 ręczno-stopowo-genitalny HOXA13 7p15-p14.2 Schizencefalia EMX2 10q26.1 Wybiórcza agenezja zębów MSX1 4p16.1 strona 8 / 8