Hybrydyzacja kwasów nukleinowych metodą Southerna

Transkrypt

1 Hybrydyzacja kwasów nukleinowych metodą Southerna

2

3 ENZYMY SŁUŻĄCE DO MANIPULACJI DNA KATEGORIA FUNKCJA CHARAKTERYSTYKA PRZYKŁADY POLIMERAZY synteza nowych polinukleotydów komplementarnych do istniejącej matrycy DNA lub RNA Posiadane aktywności: 5 3 polimerazy 3 5 egzonukleazy (korektorska) 5 3 egzonukleazy DNA polimeraza I E.coli Fragment Klenowa Sekwenaza Taq polimeraza Odwrotna transkryptaza NUKLEAZY degradacja cząsteczki DNA przez rozrywanie wiązań fosfodiestrowych łączących jeden nukleotyd z drugim - egzonukleazy - endonukleazy (przykład: endonukleazy restrykcyjne) Enzymy restrykcyjne zostawiają: - końce tępe - końce lepkie jednoniciowe fragm. na końcu 5 (np. Sau3AI, HinfI) lub 3 (np. PstI) LIGAZY łączenie ze sobą cząsteczek DNA przez syntezę wiązań fosfodiestrowych między nukleotydami na końcach dwóch różnych cząsteczek lub na dwóch końcach pojedynczej cząsteczki Ligacja wymaga energii, której dostarcza się dodając ATP lub NAD do mieszaniny reakcyjnej, zależnie od typu używanej ligazy. ligaza DNA E.coli ligaza DNA z faga T4 ENYZMY MODYFIKUJĄC E KOŃCE zmienianie końców cząsteczek DNA lub RNA Fosfataza alkaliczna - usuwa gr. fosforanowe z końca 5 DNA (zapobieganie ligacji cząst. ze sobą) i RNA, nt-ów Kinaza polinukleotydowa T4 (z E.coli infekowanych T4): -5' kinaza, przenosząca g-fosforan z ATP na koniec 5'-OH cząsteczek ssdna, dsdna, ssrna lub dsrna -3' fosfataza, usuwająca grupy fosforanowe z końców 3' cząsteczek ssdna, dsdna, ssrna lub dsrna Deoksynukleotydylotransferaza terminalna (TdT) - matryco-niezależna polimeraza DNA, dosyntetyzująca deoksynukleotydy do końców 3'-OH na ssdna lub dsdna

4 Enzymy modyfikujące końce fragmentów kwasów nukleinowych Fosfataza alkaliczna Źródło: jelito cielęce (fosfataza CIP, ang. Calf Intestine Phosphatase), E. coli (fosfataza BAP, ang. Bacterial Alkaline Phosphatase) lub krewetek. Budowa: dimeryczny glikoproteid, złożony z dwóch identycznych podjednostek o masie cząsteczkowej 69 kda. Zawiera cztery atomy cynku na cząsteczkę. CIP może być inaktywowany termicznie przez inkubację w 68 C, fosfatazę z krewetek w 65 C, natomiast BAP jest w tych warunkach stabilny. BAP jest również oporny na ekstrakcję fenolową. Właściwości: 5' fosfataza, usuwająca 5' grupę fosforanową z ssdna i dsdna, ssrna i dsrna oraz trifosforanów deoksy-/rybonukleotydów Zastosowanie: 1)defosforylacja końców dsdna przy przygotowywaniu wektorów do klonowania (fragmenty pozbawione grup fosforanowych na końcach nie mogą zamykać się w kółko w reakcji ligacji; zapobieganie autoligacji) 2) defosforylacja DNA lub RNA przed znakowaniem końców 5 za pomocą kinazy polinukleotydowej T4 3) defosforylacja białek 4) Jako składnik w systemie immunodetekcji

5 Enzymy modyfikujące końce fragmentów kwasów nukleinowych Kinaza Polinukleotydowa T4 (PNK) Źródło: bakterie E. coli zakażone fagiem T4 lub rekombinant E. coli. Budowa: tetramer, złożony z identycznych podjednostek o masie cząsteczkowej 33 kda. Właściwości: 1) 5' kinaza - przenosi g-fosforan z ATP na koniec 5'-OH cząsteczek ssdna, dsdna, ssrna lub dsrna 2) 3' fosfataza - usuwa gr. fosforanowe z końców 3' cząsteczek ssdna, dsdna, ssrna lub dsrna Zastosowanie: 1) Znakowanie końców 5' DNA lub RNA, szczególnie przed reakcjami sekwencjonowania metodą Maxama-Gilberta, enzymatycznym sekwencjonowaniem RNA, mapowaniem restrykcyjnym i " footprintingem" 2) Fosforylowanie syntetycznych oligonukleotydów 3) Usuwanie grup fosforanowych z końców 3'.

6 Kinaza Polinukleotydowa T4 (PNK) Kinaza polinukleotydowa katalizuje dwa typy reakcji: 1) Transfer fosforanu z ATP na koniec 5 cząsteczki DNA (lub RNA), która nie posiada reszty fosforanowej, ponieważ powstała w procesie chemicznej syntezy lub uległa defosforylacji (ang. "forward reaction"). 2) Wymiana fosforanu polega na przeniesieniu reszty fosforanowej z 5 końca cząsteczki DNA (lub RNA) na ADP przez enzym kinazę polinukleotydową. W kolejnym etapie PNK katalizuje przeniesienie fosforanu na inną cząsteczkę DNA (lub RNA), która nie posiada na 5 końcu reszty fosforanowej. (ang."exchange reaction") Częstotliwość katalizowania reakcji "forward" jest znacznie większa niż reakcji "exchange".

7 Kinaza polinukleotydowa (PNK) efektywność znakowania

8 Enzymy modyfikujące końce fragmentów kwasów nukleinowych Deoksynukleotydylotransferaza terminalna (TdT) Źródło enzymu: trzustka cielęca. Budowa: białkiem dimeryczne, złożone z dwóch niejednakowych podjednostek o masach cząsteczkowych 80 i 26 kda. Właściwości: 1) Matryco-niezależna polimeraza DNA, dosyntetyzująca deoksynukleotydy do końców 3'-OH na ssdna lub dsdna z uwolnieniem nieorganicznego fosforanu 2) Polimeryzacja rybonukleotydów (mała wydajność). Zastosowanie: 1) Tworzenie homopolimerowych ogonów na końcach fragmentów 2) Znakowanie końców 3' znakowanym 3'-dNTP, 3'-NTP lub dideoksy-ntp

9 Hybrydyzacja kwasów nukleinowych: łączenie się na zasadzie komplementarności zasad nici DNA lub RNA pochodzących z dwóch różnych źródeł

10 Zastosowanie hybrydyzacji wyszukiwanie specyficznej sekwencji DNA - przeszukiwanie bibliotek (np. hybrydyzacja różnicowa, subtrakcja, SSH), wykrywanie i identyfikacja czynnika chorobotwórczego (dot blot), analiza porównawcza różnych szczepów bakteryjnych, w diagnostyce chorób genetycznych, oszacowania poziomu ekspresji genów poprzez specyficzną detekcję mrna (Nothern), globalnej analizy różnic w ekspresji genów pomiędzy dwiema próbkami (mikromacierze), wizualizacji regionów ekspresji genów w organizmie (hybrydyzacja in situ), ustalenie wzoru polimorfizmu miejsc restrykcyjnych, np. ustalenie ojcostwa (Southern, RFLP).

11

12 Southern-blot Northern-blot Western-blot 1. Izolacja DNA 1. Izolacja RNA 1. Izolacja białka 2. Cięcie enzymem restrykcyjnym 2. Denaturacja (podgrzanie próbki 65ºC, formaldehyd, glioksal ) 2. Denaturacja w roztworze z SDS 3. Rozdzielanie na żelu (najczęściej agarozowym) 3.1. Denaturacja DNA w środowisku alkalicznym 3. Rozdzielanie na żelu (najczęściej agarozowym z formaldehydem) 3. Rozdział na żelu (zwykle poliakrylamidowym tzw. SDS- PAGE) Transfer na membranę nylonową lub nitrocelulozową (zwykle kapilarny) 5. Blokowanie niespecyficznie wiążących miejsc używając nadmiaru losowych fragm. DNA 6. Hybrydyzacja z wyznakowaną sondą DNA-ową lub RNA-ową 7. Odpłukanie niespecyficznie związanej sondy (przy dobranej ostrości płukania) 4. Transfer na membranę nylonową lub nitrocelulozową (zwykle kapilarny) 5. Blokowanie niespecyficznie wiążących miejsc używając nadmiaru losowych fragm. DNA lub trna oraz poli(t) 6. Hybrydyzacja z wyznakowaną sondą DNA-ową lub RNA-ową 7. Odpłukanie niespecyficznie związanej sondy (przy dobranej ostrości płukania) 4. Transfer na membranę nylonową lub nitrocelulozową (zwykle elektroforetyczny) 5. Blokowanie niespecyficznie wiążących miejsc używając nadmiaru niespecyficznego białka (np. BSA) 6. Hybrydyzacja z przeciwciałem 7. Odpłukanie niespecyficznie związanego przeciwciała 8. Autoradiografia lub phosphoimager 8. Autoradiografia lub phosphoimager 8. Autoradiografia lub enzymatyczna reakcja barwna

13 TRANSFER Southern-blot Northern-blot Neutralny Alkaliczny Neutralny Denaturacja: 1.5M NaCl 0.5N NaOH - - Depurynacja: 0.25N HCl Neutralizacja: 1.0M Tris HCl 1.5M NaCl Depurynacja: 0.25N HCl - Denaturacja: 0.4N NaOH - Transfer: 10xSSC lub 10xSSPE Transfer: 0.4N NaOH Transfer: 10xSSC lub 10xSSPE Płukanie membr.: (resztki agarozy) 2xSSC lub 2xSSPE Płukanie membr.: (resztki agarozy, zobojętnienie) 0.5M TrisHClpH 7.2, 1.0M NaCl Płukanie membr.: (resztki agarozy) 2xSSC lub 2xSSPE zapiekanie zapiekanie (nawet nie konieczne) zapiekanie (lepszy UV-crosslinking)

14

15 Oznaczenie orientacji żelu przed transferem

16 Różne rodzaje transferów Kapilarny do góry Kapilarny do dołu Kapilarny w obie strony Próżniowy Elektroforetyczny

17 Transfer kapilarny do góry 1kg glass plate tissue Whatman 3MM membrane inverted gel Whatman 3MM saturated glass plate solution

18 Transfer kapilarny do dołu cover bridge (wet blotting paper) tray with transfer solution blotting papers (3 wet) gel membrane blotting papers (4 dry and 1 wet on top) paper towels (2-3 cm)

19 Rodzaje membran Nitroceluloza Nylonowa Nylonowa + Pojemność μg/cm2 Wielkość fragmentów >400bp >50bp >50bp Bufor do transferu Neutralny, wysoka siła jonowa Niska siła jonowa, różne ph Niska siła jonowa, różne ph Wiązanie DNA do membrany Zapiekanie 2 godz. 80C, próżnia, Zapiekanie, UV, kuchenka mikrofalowa, zbędne przy transferze alkalicznym Zapiekanie, UV, kuchenka mikrofalowa, zbędne przy transferze alkalicznym

20 Izotopy stosowane do znakowania DNA 32 P (włączany w pozycji α lub γ): emituje promieniowanie β o energii 1,709 MeV (najwyższa energia spośród izotopów wykorzystywanych w doświadczeniach biologicznych), stosunkowo krótki okres półtrwania (14,3 dnia), sonda o wysokiej aktywności specyficznej - wysoka czułość i szybka detekcja, wykorzystywany w hybrydyzacjach, badaniach aktywności transkrypcji. ŚRODKI OSTROŻNOŚCI: ekrany ochronne z pleksiglasu, rękawiczki, fartuch, dozymetr osobisty, próbki w ołowiankach, pojemnikach z pleksi

21 Izotopy stosowane do znakowania DNA 35 S energia promieniowania β 0,167 MeV, powstają związki organiczne o wysokiej lotności, łatwo wchłanialne i akumulowane (praca pod wyciągiem), okres półtrwania 87,4 dnia, ekrany ani osłony ołowiane nie wymagane, używany do sekwencjonowania DNA, w postaci siarczanu do badania metabolizmu białek, a w postaci metioniny do badań translacji.

22 Izotopy stosowane do znakowania DNA 33 P energia promieniowania β 0,0248 MeV, okres półtrwania 25,5 dnia, bardzo drogi.

23 Znakowanie sond DNA i RNA znakowanie końców 5 i 3 przemieszczanie pęknięć (nick translation) znakowanie metodą wydłużania startera (random primed labeling) za pośrednictwem PCR fotoznakowanie znakowanie RNA w systemie transkrypcji in vitro

24 METODY ZNAKOWANIA KWASÓW NUKLEINOWYCH IN VITRO METODA TYP SONDY POZYCJA ZNACZNIKA WIELKOŚĆ SONDY GŁÓWNE ZASTOSOWANIA Random priming na matrycy DNA dsdna wewnętrzna nt Southern blot, Northern blot, przeglądanie bibliotek Random priming na matrycy RNA Oligo(dT) primining syntezy cdna na matrycy RNA ssdna lub hybrydy DNA- RNA ss cdna lub hybrydy cdna- RNA wewnętrzna nt Przeglądanie różnicowe bibliotek cdna; sondy odejmujące, DD - RT PCR (differential display), mapowanie mrna za pomocą nukleaz wewnętrzna nt sondy odejmujące, DD - RT PCR (differential display) PCR ssdna lub dsdna wewnętrzna zależna od wielkości produktu PCR Southern blot, Northern blot, przeglądanie bibliotek za pomocą hybrydyzacji; sonda reprezentuje specyficzną część genu docelowego Nick translation dsdna wewnętrzna 400 nt Southern blot, Northern blot, przeglądanie bibliotek Primer extension Startery uniwersalne (su) lub specyficzne (sp) Matryca ssdna Primer extension 2 pary starterów Matryca ssdna Transkrypcja in vitro na matrycy dsdna dsdna wewnętrzna określona długość, kiedy matrycą DNA bφ M13 lub fagemidu (su); Długość zależna od wielkości produktu PCR (sp; 150bp-2kb) dsdna wewnętrzna Zróżnicowana (zwykle nt) ssrna wewnętrzna Znakowane RNA określonej długości mapowanie mrna za pomocą nukleaz, Southern blot, Northern blot, przeglądanie bibliotek za pomocą hybrydyzacji; sonda reprezentuje specyficzną część genu docelowego Southern blot, Northern blot, przeglądanie bibliotek Southern blot, Northern blot, przeglądanie bibliotek, hybrydyzacja in situ, mapowanie mrna za pomocą RNaz

25 Sposoby znakowania sond Znakowanie końców 5 Przeniesienie grupy fosforanowej z pozycji γ ATP na zdefosforylowany (przy użyciu alkalicznej fosfatazy) koniec 5 fragmentu RNA lub DNA za pomocą kinazy polinukleotydowej z faga T4. Jeżeli ATP jest wyznakowany w pozycji γ, to można w ten sposób znakować oligonukleotydy i fragmenty DNA. Metoda używana głównie do znakowania syntetycznych oligonukleotydów.

26 Sposoby znakowania sond Znakowanie końców 3 Przy użyciu fragmentu Klenowa polimerazy DNA I uzupełnianie lepkich końców we fragmentach DNA, które powstały w wyniku cięcia endonukleazami restrykcyjnymi, pozostawiającymi wystające jednoniciowe końce 5. Przy użyciu enzymu terminalnej transferazy, która dołącza deoksyrybonukleotydy na końcu 3 jedno- lub dwuniciowych cząsteczek DNA.

27 Sposoby znakowania sond Znakowanie końców 3

28 Sposoby znakowania sond Reakcja przemieszczania pęknięć (nick translation) Nacięcie DNA z wytworzeniem 3 końcowej grupy OH przy użyciu DNazy I. DNA polimerazy I E. coli dodaje nukleotydy do wolnego końca 3' OH. W tym samym czasie, polimeraza I usuwa nukleotydy od końca 5' pęknięcia. Równoczesna eliminacja nukleotydów z końca 5' i dodatek nukleotydów do końca 3' powoduje przesuwanie się przerwy wzdłuż DNA, w kierunku 5' -> 3'.

29 Sposoby znakowania sond Znakowanie z wykorzystaniem starterów losowych (random priming)

30 Sposoby znakowania sond Transkrypcja in vitro Wykorzystuje się polimerazy RNA z bakteriofagów SP6, T3, T7, które wymagają obecności specyficznego fagowego promotora w wektorze, w którym znajduje się fragment DNA będący matrycą do produkcji sondy. Sondy tak wyprodukowane są niciowospecyficzne może być orientacja sens i antysens. Wektor do transkrypcji musi być zlinearyzowany za fragmentem aby zapobiec syntezie sondy z sekwencji wektora.

31 Związek Detekcja radioizotop fosforu 32 P w postaci znakowanych w pozycji α i γ trójfosforanów nukleozydów: np. najczęściej stosowany [γ] 32 P -dctp 1. zaczernienie filmu 2. akumulacja promieniowania na ekranie fosforowym - ekspozycja, uwolnienie nagrom.energii przez naświetlenie czerw. światłem i odczyt niebieskiej emisji digoksygenina (DIG) w postaci DIG-11-dUTP biotyna w postaci Biotin-11-dUTP 1. przeciwciało specyficzne do digoksygeniny z: - - alkaliczną fosfatazą, która min.rozkłada CSPD wyzwalając chemiluminescencję dającą zaczernienie filmu - - czymś innym np. fluoresceiną 1. streptavidyna z alkaliczną fosfatazą - czymś innym np. fluoresceiną fluoresceina w postaci Fluorescein-12-dUTP 1. wyznakowany kwas nukleinowy daje żółą fluorescencję (in situ hybrydyzacja) 2. przeciwciało specyficzne do fluoresceiny z alkaliczną fosfatazą tetrametylorodamina w postaci Tetramethyl-rhodamine-6-dUTP 1. wyznakowany kwas nukleinowy daje czerwoną fluorescencję, stosowana w in situ hybrydyzacji 2. przeciwciało specyficzne do tetrametylorhodaminy z alkaliczną fosfatazą

32 Czynniki wpływające na stopień hybrydyzacji temperatura optymalna dla hybrydyzacji hybrydów DNA-DNA w temp C niższej niż Tm, dla DNA-RNA C poniżej Tm; siła jonowa optymalna przy 1,5 M Na + ; skład zasad w wodnych roztworach AT są mniej stabilne niż GC; czynniki destabilizujące zwiększenie stężenia formamidu o 1% obniża Tm o 0,6 C; 6M mocznik obniża Tm o 30 C; niesparowane zasady każdy 1% niesparowania to 10 C spadek Tm, długość dupleksów efekt niekorzystny w przypadku sond dłuższych niż 500 pz. Tm - temperatura topnienia, która wyraża termiczną stabilność hybrydów kwasów nukleinowych

33 Warunki hybrydyzacji temp. 65ºC, około 1M NaCl temp.42ºc, około 1M NaCl i 50% formamid formamid destabilizuje wiązania wodorowe między łańcuchami kwasów nukleinowych stąd możliwe jest prowadzenie hybrydyzacji w niższej temperaturze Takie warunki pozwalają na uzyskanie stabilnych hybryd pomiędzy cząsteczkami kwasów nukleinowych o przeciętnej zawartości par G-C, o 100% komplementarności i na długich, kilkusetnukleotydowych odcinkach. Hybrydyzację krótkich fragmentów lub nie w pełni komplementarnych (od 100 do 65% zasad identycznych) prowadzi się w warunkach łagodniejszych tzn. w niższej temperaturze lub w wyższym stężeniu soli. Podobne zasady rządzą etapem odpłukiwania sondy.

34 Zastosowanie hybrydyzacji Southern blot sprawdzanie ilości kopii genu, transgenu, jego architektury, sprawdzanie liczby miejsc integracji transgenu, sprawdzanie czy do genomu roślinnego trafiły inne niż T- DNA obszary plazmidu binarnego, sprawdzanie poprawności integracji transgenu, ocena polimorfizmu (RFLP), ocena poziomu metylacji genu, transgenu.

35 Transgen i miejsce jego integracji ptdna ycf15 orf92 orf79 orf115 trnl ndhb EcoRI 587pz 240pz 689pz EcoRI MroI TOPO ptdna aada 1300pz P. Brągoszewski, sonda z pbluescript z aada (odp. na Spec) z prom. rrna i term. psba - DNA z roślin transgenicznych i nietrangenicznych strawione EcoRI daje prążek 2200bp (podwójny) od prom. rrna i term. psba (prażek mocny - wszystkie plastydy dają taki obraz) - DNA z roślin transgenicznych daje dodatkowy prażek 3500 bp siła zależy od stopnia homoplazmiczności

36 Przykładowy wynik:

37 Analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP) locus D7S21 (MS31) DNA wyizolowany z próbek krwi został hydrolizowany enzymem restrykcyjnym Hinf1, rozdzielony w żelu agarozowym i poddany hybrydyzacji z sondą molekularną MS31. Wszystkie osoby poddane badaniu są heterozygotami. ścieżki 1-3, rodzina I (matka, dziecko, domniemany ojciec)

38 Analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP) ścieżki 1-3, rodzina I (matka, dziecko, domniemany ojciec) Ścieżka 4-6, rodzina II (matka, dziecko, domniemany ojciec)

39 Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) to metoda, która pozwala na wykrycie specyficznej sekwencji DNA w chromosomach, tkankach oraz pojedynczych komórkach.

40 Mikromacierze

41 Zastosowania mikromacierzy Mierzenie ilości transkryptu Genotypowanie Mierzenie liczby kopii DNA Identyfikowanie miejsc wiążących białka Etc.

42 Podstawowe rodzaje mikromacierzy Mikromacierze oligonukleotydowe (ang. oligo array) - na płytce naniesione są krótkie, na ogół nukleotydowe sekwencje sond. Mikromacierze cdna (ang. cdna array) - sondy znacznie dłuższe, zazwyczaj odpowiadające pełnym sekwencjom mrna. Mikromacierze o układzie dachówkowym (ang. tiled microarrays). ChIP on Chip Etc.

43 Tiled microarrays So-called tiled microarrays cover a genomic region (or the whole genome!) at high coverage. Probes are designed to cover virtually every basepair of the sequence, usually excluding only simple sequence repeats. In this way, there is no bias toward known transcribed regions. genomic sequence probes on array probe size and spacing determines the resolution

44 NSF Soybean Functional Genomics Steve Clough / Vodkin Lab Printing Arrays on 50 slides

45 GeneChip Probe Arrays nechip Probe Array Hybridized Probe Cell Single stranded, labeled RNA target Oligonucleotide probe * * * * * 24µm 1.28cm Millions of copies of a specific oligonucleotide probe >200,000 different complementary probes Image of Hybridized Probe Array

46 Hybridization chamber 3XSSC HYB CHAMBER ARRAY LIFTERSLIP SLIDE LABEL SLIDE LABEL Humidity Temperature Formamide (Lowers the Tm)

47 Szczegóły doświadczenia

48 Cy5 Cy3

49 Cy5 Cy3

50 Analiza danych

51 Przykład arkuszu z wynikami

52 Roślinne bazy danych mikromacierzy The Nottingham Arabidopsis Stock Centre's Stress Genomics Consortium The Arabidopsis Functional Genomics Consortium Soybean genomics and microarray database Complete Arabidopsis Transcriptome MicroArray database Tomato Expression Database Genevestigator