Substancje stosowane do osadzania enzymu na stałym podłożu Biotyna (witamina H, witamina B 7 ) Tworzenie aktywnej powierzchni biosensorów

Transkrypt

1 SEKWECJWAIE ASTĘPEJ GEERACJI- GS Losowa fragmentacja nici DA Dołączanie odpowiednich linkerów (konstrukcja biblioteki) Amplifikacja biblioteki na podłożu szklanym lub plastikowym biosensory Wielokrotnie przeprowadzone reakcje równocześnie odczytywane przez instrument parallel processing dczyty ilościowe ie wymagają elektroforezy Substancje stosowane do osadzania enzymu na stałym podłożu Biotyna (witamina H, witamina B 7 ) H S Awidyna, Streptawidyna białka silnie wiążące się z biotyną Biotynylowane fosfolipidy P - H S H H Tworzenie aktywnej powierzchni biosensorów a b c biotyna a- awidyna osadzona na stałym, hydrofobowym podłożu połączenie biotyny z enzymem połączenie biotyny z fosfolipidem awidyna 1

2 PIRSEKWECJWAIE Sekwencjonowanie przez syntezę Każdemu włączeniu do nici odpowiedniego nukleozydotrójfosforanu towarzyszy uwolnienie pirofosforanu (PPi) w ilości równomolowej do ilości włączonego nukleotydu Reakcja wymaga obecności następujących enzymów: Polimerazy I DA Sulfurylazy Apyrazy oraz Adenozyno 5-fosfosulfatu(APS) Lucyferyny Trawienie DA na małe fragmentyz lepkimi końcami Przyłączanie linkerów: biotyna + adapter do startera (biblioteka) Łączenie się biotyny z kulką powleczoną streptawidyną Hybrydyzacja adapterów ze starterami- ok milion cząsteczek na jednej kulce (biosensorze) Kulki opłaszczane są enzymami 2

3 Kulki umieszczane są pojedynczo w specjalnych komorach, w których przemywane są kolejno poszczególnymi nukleozydo-trójfosforanami (dtp); datp zastąpiona jest datpαs (alfa-tio-trójposforan) ATP-sulfurylaza katalizuje powstanie ATP z pirofosforanu w obecności APS becność ATP katalizuje zmianę lucyferyny w oksylucyferynę, która generuje światło w ilościach proporcjonalnych do ATP Apyraza degraduje wszystkie niewbudowane nukleotydy oczyszczając próbkę i pozwala na przemycie próby porcją nowych nukleotydów Ilość pirofosforanu zależna od ilości wbudowanych dtp Ilość ATP zależna od ilości pirofosforanu Ilość oksylucyferyny zależna od ilości ATP Sekwencja Dodany nukleotyd 3

4 SEKWECJWAIE MSTKWE Sekwencjonowanie przez syntezę Każdemu włączeniu do nici odpowiedniego terminacyjnego nukleozydo- trójfosforanu towarzyszy sygnał świetlny emitowany przez fluorochrom Reakcja wymaga obecności enzymów usuwających barwnik fluorescencyjny oraz nukleozydo-trójfosforanów z możliwością odwracalnej terminacji syntezy łańcucha Łączenie się adaptorów z dwuniciowymi fragmentami DA Losowe przyłączanie jednoniciowych fragmentów DA do płytki z adaptorami 4

5 Tworzenie dwuniciowych mostków poprzez dodanie nieznakowanych nukleotydów i enzymu Denaturacja i kolejne wytwarzanie mostków powoduje powielenie pojedynczego fragmentu DA na powierzchni płytki klaster Amplifikacja z użyciem nukleotydów terminacyjnych Laserowy odczyt fluorescencji dłączenie fluorochromu i kolejna amplifikacja z innym nukleotydem terminacyjnym Laserowy odczyt fluorescencji 5

6 dczyt wyników Metoda pozwala na sekwencjonowanie odcinków 100 x krótszych i w ilościach 100x mniejszych niż pirosekwencjonowanie! szukaj video po lewej stronie SEKWECJWAIE WEJ GEERACJI- SEKWECJWAIE RA Tworzenie bibliotek cda na bazie linkerów łączących się z ogonkami adeninowymi i odwrotnej transkrypcji Amplifikacja mostkowa Wydłużanie fragmentów długości pz (w zależności od technologii) SEKWECJWAIE RA tkanka Izolat RA Biblioteka cda z linkerami kontrola rak Chip do sekwencjonowania dczyt transkryptomu i przewidywanie miejsc łączenia eksonów Analiza 6

7 RA-seq Alternatywny splicing Różnice w ekspresji genów 7