REPLIKACJA, NAPRAWA i REKOMBINACJA DNA

Transkrypt

1 REPLIKACJA, NAPRAWA i REKOMBINACJA DNA 1) Replikacja DNA 2) Replikacja całych chromosomów 3) Replikacja telomerów 4) Naprawa DNA przy jego syntezie 5) Naprawa DNA poza jego syntezą 6) Naprawa DNA system SOS 7) Rekombinacja homologiczna DNA

2 1) Replikacja DNA konieczność odsłonięcia jednoniciowego DNA Rozdzielenie podwójnej nici powoduje odsłonięcie lepkich pojedynczych nici, które maja tendencję do ponownego łączenia się. Zapobiegają temu białka SSBs (single strand binding).

3 1) Replikacja DNA inna przeszkodą jest skręcenie helisy Nić helisy jest skręcona i to skręcenie się nasila w miarę przesuwania się kompleksu replikacyjnego. Rozwiązaniem jest działanie topoizomerazy, która nacina jedną z nici, przepuszcza drugą przez powstałą przerwę i doprowadza do powtórnego złączenia.

4 1) Replikacja jeszcze inny problem, przeciwbieżność nici DNA Kopiowanie musi przebiegać w jednym kierunku podwójnej nici DNA (od 5 do 3 nowej nici), ale nici stare są przeciwbieżne

5 1) Replikacja DNA rozwiązaniem jest normalna replikacja w przypadku nici wiodącej i odcinkowa replikacja (fragmenty Okazaki) spóźniającej się nici DNA (polimeraza RNA może syntetyzować krótkie odcinki na pojedynczej nici DNA, polimeraza DNA może wtedy zacząć od nici podwójnej)

6 1) Replikacja DNA - helikaza rozdziela starą podwójną nić DNA - polimeraza DNA dokłada komplementarne zasady do starej nici DNA - topoizomeraza likwiduje naprężenia powstające - primaza RNA tworzy krótkie komplementarne odcinki RNA - ligaza DNA łączy fragmenty Okazaki w ciągłą nową nić

7 2) Replikacja chromosomu bakteryjnego - chromosomy bakterii (a także plazmidy i koliste genomy wirusów) mają jeden początek replikacji eukarionty

8 2) Replikacja chromosomu eukariotycznego U organizmów eukariotycznych występuje wiele początków replikacji w każdym z chromosomów

9 3) Replikacja telomerów Przy replikacji liniowych chromosomów eukariontów na ostatnim fragmencie nici opóźniającej się (lagging) nie można utworzyć starteru RNA i dlatego ta nić skracałaby się o ten fragment po replikacji.

10 3) Replikacja telomerów Okazuje się, że w końcowych odcinkach chromosomu jest po kilkuset kopii sekwencji 5 - TTAGGG-3. Jest to wynik działania telomerazy, enzymu mającego za zadanie wydłużanie skracającego się końca chromosmu. To białko o aktywności odwrotnej transkryptazy, które ma własną matrycę RNA.

11 3) Telomery a starzenie się komórek Telomeraza jest aktywna w komórkach linii generatywnej i komórkach progenitorowych (stem cells). W tkankach normalnie nie działa. Dlatego tam telomery się skracają i jest to zegar starzenia się. Po odliczonej liczbie podziałów, zwykle kilkudziesięciu, komórka nie może się dalej dzielić.

12 4) Naprawa DNA przy jego syntezie Polimeraza DNA działa tak by nie popełniać błędów. Selekcja nukleotydów jest imponująco dokładna, pomyłki występują raz na 10,000 sparowań.

13 4) Naprawa DNA przy jego syntezie Jeśli polimeraza DNA się pomyli, to potrafi sama naprawić swój błąd ponieważ jest też egzonukleazą Ta forma naprawy nazywana jest naprawą korekcyjną (proofreading). Pomyłki następują tu około 1/1000.

14 4) Naprawa DNA tuż po jego syntezie mismatch repair Tuż po syntezie można jeszcze rozróżnić nić starą od nowe. U bakterii tylko stara nić jest zmetylowana (rycina). U eukariontów rozróznianie jest inne i gorzej poznane. Można wtedy usuwać niedopasowania (mismatches) tylko z nowej nici.

15 4) Naprawa DNA tuż po jego syntezie mismatch repair naprawa niedopasowań U bakterii dwa białka, MutH i MutS, skanują DNA. Po natrafieniu na źle sparowane nukleotydy przywołują egzonukleazę wycinającą fragment nowej nici i polimerazę, która zapełnia ubytek. Białka homologiczne do MutS i MutH wykrywające złe sparowania są także u eukariontów. Ta naprawa pozostawia około 1/1000 niepoprawnych sparowań.

16 4) Naprawa DNA przy jego syntezie efekt łączny Badania kultur bakteryjnych w laboratorium wykazały, że: - przy dobieraniu nukleotydów tempo błędu wynosi 1 x z tego po naprawie korekcyjnej pozostaje 1 x z tego po naprawie niedopasowań pozostaje 1 x 10-3 Łącznie daje to tempo błędów zaledwie 1 x na nukleotyd Jak to się ma do tempa mutacji u człowieka szacowanego na podstawie porównywania sekwencji rodziców i dzieci?

17 Bakteryjne tempo na jeden nukleotyd na jeden podział komórkowy to około 10-8 na jeden nukleotyd na jedno pokolenie ludzkie zakładając około 10 2 podziałów komórkowych w linii generatywnej człowieka - zgadza się z danymi z sekwencjonowania -. czyli większość mutacji powstaje przy powielaniu DNA

18 5) Naprawa DNA poza jego syntezą DNA w komórce nie dzielącej się może zostać uszkodzone w pojedynczym nukleotydzie w taki sposób, który nie wymaga (A) lub wymaga (B) wycięcia w starej nici. Niedopasowanie (C) z definicji wymaga wycięcia. Pęknięcie obu nici (D) wymaga złączenia, co może odbywać się bez względu na sekwencję pękniętych końców (nonhomologous).

19 5) Naprawa DNA poza jego syntezą naprawa bezpośrednia Naprawa bezpośrednia to np. naprawa pęknięcia (nick) jednej nici DNA przez ligazę.

20 5) Naprawa DNA poza jego syntezą wycięcie jednego nukleotydu Uszkodzona zasada jest odnajdywana przez glikozylazę DNA i odcinana od cukru. Następnie cały nukleotyd, ale tylko ten jeden, jest usuwany a potem zapełniany prawidłowym.

21 5) Naprawa DNA poza jego syntezą wycięcie wielu nukleotydów Gdy uszkodzenie lub brak sparowania powoduje lokalne zaburzenie struktury helisy, najpierw następuje rozdzielenie nici (melting) przez helikazę. Potem nić zawierająca uszkodzenie jest wycinana, polimeraza dobudowuje drugą nić, a ligaza łączy ją kowalencyjnie.

22 5) Naprawa DNA poza jego syntezą łączenie końców Gdy podwójna nić pęknie istnieją systemy szybkiego łączenia wolnych końców. U eukariontów pośredniczy w tym białko Ku i szereg innych białek. W ten sposób złączeniu ulec mogą końce, które niedawno się przełamały lub nie odpowiadające sobie (nonhomologous).

23 6) Naprawa DNA bakteryjny system SOS Gdy w czasie replikacji normalna polimeraza III natrafi na zbyt uszkodzone DNA nie może posuwać się dalej. Wtedy przywoływane są białka RecA, które pozwalają na odłączenie polimerazy III i umożliwiają pracę mniej wymagającej polimerazie V. Synteza postępuje, ale z błędami. U eukariontów także istnieją takie ratunkowe polimerazy pomostowe, zdolne do przejścia przez uszkodzone DNA.

24 7) Rekombinacja homologiczna Rekombinacja między dwiema chromatydami z chromosomów homologicznych jest molekularną podstawą procesów - crossing over, - konwersji genów - naprawy dwuniciowych uszkodzeń DNA

25 7) Rekombinacja homologiczna Początkiem rekombinacji jest (niekiedy celowe) przecięcie obu nici (A). (A) Potem każda z nici jest skracana tak by wystawał koniec 3 (B) (B)

26 7) Rekombinacja homologiczna (B) Następnie jeden z końców 3 dokonuje inwazji powodując miejscowe rozejście się w drugiej nici połączone z odszukaniem sekwencji homologicznej (C). Ten koniec 3 ma już matrycę. Rozejście przesuwa się i drugi koniec 3 zyskuje matrycę. Oba końce 3 mogą się wydłużać (D). (C) (C) (D)

27 7) Rekombinacja homologiczna Po zapełnieniu odcinków jednoniciowych drugą nicią tworzy się struktura z dwóch różnych chromatyd (heterodupleks) Połączone są dwoma przejścia nici między chromatydami homologicznymi - Holliday junctions (E) (D) (E)

28 7) Rekombinacja homologiczna Heterodukpleks musi być przecięty. (E) Możliwe są różne kombinacje cięć (F) Prowadzą one albo tylko do lokalnej wymiany materiału genetycznego (konwersja genu) lub do wymiany ramion chromatyd (crossover) konwersja (F) cross-over

29 7) Rekombinacja homologiczna Powtórzenie całego szlaku. Ten proces jest inicjowany celowo na początku mejozy by chromosomy homologiczne na pewno się odnalazły. Jest także używany do reperacji dwuniciowych uszkodzeń DNA (pęknięcia, połączenia kowalencyjne) by zreperować poprawnie, korzystając z sekwencji innej chromatydy.

30